Οι

Αφηρημένο

τελικών προϊόντων προχωρημένης γλυκοζυλίωσης (AGEs) που παράγονται σε έναν μη αναστρέψιμο μη-ενζυματική αντίδραση των υδατανθράκων και των πρωτεϊνών. Οι ασθενείς με σακχαρώδη διαβήτη (ΣΔ) είναι γνωστό ότι έχουν αυξημένα επίπεδα AGE, η οποία θεωρείται ως παράγοντας κινδύνου των επιπλοκών του διαβήτη που σχετίζονται με. Σε ένα κλινικό περιβάλλον, έχει δειχθεί ότι οι ασθενείς με καρκίνο του στόματος, σε συνδυασμό με DM έχουν υψηλότερη πιθανότητα μετάστασης του καρκίνου και χαμηλότερα ποσοστά επιβίωσης του καρκίνου. AGE-RAGE (υποδοχέας του AGEs) είναι επίσης συσχετίζεται με μετάσταση και την αγγειογένεση. Πρόσφατες μελέτες έχουν προτείνει ότι η κακοήθεια του καρκίνου μπορεί να ενισχυθεί με AGEs γλυκεραλδεϋδο-προερχόμενο? Ωστόσο, ο υποκείμενος μηχανισμός παραμένει ασαφής. Αυτή η μελέτη εξέτασε την προφανώς στενή σχέση μεταξύ AGE-RAGE και την κακοήθεια της SAS τον καρκίνο του στόματος κυτταρική σειρά. Σε αυτή τη μελέτη, AGEs αυξημένη φωσφορυλίωση ERK, ενισχυμένη κυτταρική μετανάστευση, και προώθησε την έκφραση του RAGE, ΜΜΡ2, ΜΜΡ9 και. Χρησιμοποιώντας PD98059, αντίσωμα RAGE, και RNAi RAGE να εμποδίσει μονοπάτι RAGE ως αποτέλεσμα την αναστολή της φωσφορυλίωσης ERK. κυτταρική μετανάστευση, ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 έκφραση μειώθηκαν επίσης με την κατεργασία αυτή. Τα ευρήματά μας καταδεικνύουν τη σημασία της AGE-RAGE όσον αφορά την κακοήθεια του καρκίνου του στόματος, και να βοηθήσει να εξηγήσει την κακή πρόγνωση των ασθενών DM με τον καρκίνο του στόματος

Παράθεση:. Ko SY, Ko ΗΑ, Shieh TM, Chang WC, Τσεν HI, Chang SS, et al. (2014) Η μετανάστευση των κυττάρων ρυθμίζεται από AGE-RAGE Αλληλεπίδραση Ανθρώπων καρκίνο του στόματος κύτταρα

In Vitro

. PLoS ONE 9 (10): e110542. doi: 10.1371 /journal.pone.0110542

Συντάκτης: Barry I. Hudson, του Πανεπιστημίου του Miami, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 23 Απρ 2014? Αποδεκτές: 16 Σεπ, 2014? Δημοσιεύθηκε: 16 Οκτωβρίου 2014

Copyright: © 2014 Ko et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο, την Ταϊβάν (NSC 100-2314-B-309-002-my3). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

τελικών προϊόντων προχωρημένης γλυκοζυλίωσης (AGEs), είναι το αποτέλεσμα μιας αντίδρασης Maillard μεταξύ των υδατανθράκων και των πρωτεϊνών. Γήρανση και μειωμένη λειτουργία του μεταβολισμού έχουν αποδειχθεί ότι αυξάνουν τον σχηματισμό AGEs [1] – [5]. Αυξημένη συσσώρευση AGE έχει επίσης παρατηρηθεί σε ασθενείς με νόσο του Alzheimer (AD) ή σακχαρώδη διαβήτη (DM) [6] – [8]. Επιπλέον, έχουν AGEs δειχθεί ότι παίζουν ένα ρόλο στην παθογένεση της DM, έτσι ώστε η συσσώρευση AGE θεωρείται ως παράγοντας κινδύνου για διάφορες επιπλοκές της νόσου [9] – [14].

Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι AGEs και οργίζεται (υποδοχείς των AGEs) ρυθμίζουν την κυτταρική μετανάστευση [15] – [17]. RAGE υπερέκφραση έχει συνδεθεί με καρκίνους του παχέος εντέρου, του λάρυγγα, της γλώσσας, του στομάχου, και το στόμα [18] – [20], μέσω καρκινογένεση [21], του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, μετάσταση, εισβολή και την αγγειογένεση [22] – [25]. Σε μία κλινική μελέτη που περιελάμβανε ασθενείς που πάσχουν από καρκίνο του στόματος, καθώς και DM, ο καρκίνος έγινε όλο και πιο επεμβατική, με αποτέλεσμα τη μείωση στα ποσοστά επιβίωσης [26]. Η μελέτη αυτή προσδιορίζονται περαιτέρω μια συσχέτιση μεταξύ καρκίνου του στόματος και DM [27]. RAGE έχει αποδειχθεί ότι συνδέεται στενά με την εισβολή στον καρκίνο του στόματος [15], και η κακοήθεια του καρκίνου μπορεί να ενισχυθεί με AGEs αφυδρογονάση που προέρχεται [17]. Ωστόσο, ο υποκείμενος μηχανισμός που είναι υπεύθυνος για τα αποτελέσματα αυτά παραμένει ασαφής.

Αυτή η μελέτη διερεύνησε την φαινομενικά ισχυρή συσχέτιση μεταξύ AGEs και της κακοήθειας του καρκίνου του στόματος. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι AGEs ενισχύσει τη μετανάστευση των κυττάρων και επίσης να αυξήσει την φωσφορυλίωση της ERK και την έκφραση του RAGE, ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9. Η προεπεξεργασία με PD98059 (αναστολέας ΕΚΚ) βρέθηκε να καταστέλλουν τις επιδράσεις των AGEs? Ωστόσο, η έκφραση RAGE δεν ανεστάλη. αντισώματα RAGE χρησιμοποιήθηκαν επίσης για να μπλοκάρουν την σύζευξη των AGE, η οποία οδήγησε σε μειωμένη φωσφορυλίωση ERK, η έκφραση του ΜΜΡ2, ΜΜΡ9, και μετανάστευση των κυττάρων. Επιπλέον, RAGE RNAi φαίνεται να ρυθμίζει αυτά τα αποτελέσματα, γεγονός που υποδηλώνει ότι το σύστημα AGE-RAGE μεταβάλλει την κυτταρική μετανάστευση μέσω φωσφορυλίωσης της ERK και τη ρύθμιση των επακόλουθων οδών. Τα ευρήματά μας παρέχουν περαιτέρω απόδειξη ότι AGE-RAGE παίζει σημαντικό ρόλο στον καθορισμό της κακοήθειας του καρκίνου του στόματος.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

φαινυλμεθυλσουλφονύλιο φθοριούχες (PMSF), βοοειδών λευκωματίνη ορού (BSA), DL-γλυκεραλδεΰδη, και PD98059 αγοράστηκαν από τη Sigma (St. Louis, ΜΟ, USA). Μέσα DMEM, ορό εμβρύου μόσχου (FBS), πενικιλλίνη, στρεπτομυκίνη, Hanks Balanced Salt Solution (HBSS), trypan blue, και Lipofectamine RNAiMAX αγοράσθηκαν από την Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). GAPDH (Cat Νο .: MAB374) αγοράστηκε από την Chemicon (Temecula, CA, USA). ERK (Cat No .: SC-94), π-ΕΚΚ (Cat No .: SC-7383), RAGE (Cat No .: SC-94), και την οργή siRNA (Cat No .: SC-36374) αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). ΜΜΡ2 (Cat Νο .: 2763-S) και ΜΜΡ9 (Cat Νο .: 2551-S) αγοράστηκαν από Epitomics (Burlingame, CA, USA). μεμβράνες νιτροκυτταρίνης αγοράστηκαν από PALL corp. (Ann Arbor, MI, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). Ενισχυμένη χημειοφωταύγειας (ECL) αγοράστηκε από την Millipore (Billerica, ΜΑ, USA). WST-1 kit αγοράστηκε από Clontech Laboratories, Inc. (Mountain View, CA, USA). Culture-Insert αγοράστηκε από ibidi (Verona, WI, USA).

Παρασκευή AGEs

AGEs παρασκευάστηκαν με επώαση BSA (ρΗ = 7,4) σε PBS με 20 mM DL-γλυκεραλδεΰδη στο 37 ° C για 1 εβδομάδα. Το προϊόν υποβλήθηκε σε διαπίδυση σε PBS στους 4 ° C για 2 ώρες, και αυτός ο κύκλος επαναλήφθηκε 5 φορές. Το προϊόν στη συνέχεια συμπυκνώνεται στους 4 ° C χρησιμοποιώντας ένα σωλήνα συγκέντρωσης Ultra πρωτεΐνης Amicon (Millipore) και φυγοκεντρούνται σε 3000 rpm για 30 λεπτά πριν από την αποθήκευση στους -80 ° C [28].

Κυτταρική καλλιέργεια και θεραπεία

Η καρκίνο του στόματος κυτταρική σειρά SAS (ιαπωνική συλλογή της έρευνας Bioresources Τράπεζας κυττάρων [JCRB], Ιαπωνία) αναπτύχθηκε στους 37 ° C κάτω από 5% CO

2 ατμόσφαιρα. Η καλλιέργεια διατηρήθηκε σε μέσα DMEM (Invitrogen) συνήθως συμπληρωμένο με 10% FBS, 100 μονάδες /ml πενικιλίνης, 2mM L-γλουταμίνη, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη. Τα κύτταρα επωάστηκαν χωρίς ορό για 24 ώρες πριν από τη θεραπεία.

Trypan μπλε χρωστική αποκλεισμού δοκιμασία

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων σε συγκέντρωση 10

5 ανά φρεάτιο και καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε σύμφωνα με την ικανότητά τους να αποκλείουν 0,5% κυανούν τρυπανίου (Invitrogen) μετά από αγωγή με 100-400 μg ηλικίες /ml για 24 και 48 ώρες, αντίστοιχα. Ένας ίσος όγκος του trypan blue διαλύματος βαφής (0,1%, β /ο), HBSS, και πολτός κυττάρων συνδυάστηκαν και διατηρήθηκε σε θερμοκρασία δωματίου για πέντε λεπτά. Τα δείγματα στη συνέχεια φορτώθηκαν σε ένα αιμοκυτταρόμετρο για την κατηγοριοποίηση κυττάρων ως ζωντανά ή νεκρά, σύμφωνα με την πρόσληψη της χρωστικής. Όλα τα στοιχεία που παρουσιάζονται στην παρούσα μελέτη είναι οι μέσες τιμές των πειραμάτων εις τριπλούν.

WST-1 προσδιορισμό

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε συγκέντρωση 5 × 10

3 τοις φρεάτιο και καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων ανιχνεύεται από τον WST-1 κιτ (Clontech) σε ρυθμισμένο μέσο. Τα δείγματα παρασκευάστηκαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο που περιγράφεται από τον κατασκευαστή. Εν συντομία, μετά από αγωγή με AGEs (0-400 μg /ml), το ρυθμισμένο μέσο φυγοκεντρήθηκε στις 2000 rpm για 10 λεπτά. Το υπερκείμενο στη συνέχεια μεταφέρθηκε σε πλάκες 96 φρεατίων (100 μΐ /φρεάτιο). Μίγμα αντίδρασης (100 μΙ) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο, και ακολούθησε επώαση για 30 λεπτά. Κατά τη διάρκεια της περιόδου επώασης, τα δείγματα διατηρήθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου (RT) και να προστατεύεται από το φως. Η απορρόφηση των δειγμάτων μετρήθηκε στα 490 nm. μήκος κύματος αναφοράς θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από 600 nm. Όλα τα στοιχεία που παρουσιάζονται στην παρούσα μελέτη είναι οι μέσες τιμές από πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

RNA Πειράματα Παρεμβολή

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων σε συγκέντρωση 2 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο και καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με RAGE siRNA (μια δεξαμενή 3 ειδικού στόχου 19-25 nt siRNA? Santa Cruz) ή την αλληλουχία κλώνου νόημα του RNAi ως αρνητικός έλεγχος (5′-UUCUCCGCCCGUGUCACGU-3 ‘) [29]. Οι επιμολύνσεις διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Συγκεκριμένα, αραιώστε 40 pmol του RNAi duplex σε 250 μΐ Opti-ΜΕΜ Ι μειώνεται ορού μέσο χωρίς ορό. Στη συνέχεια ανακατεύουμε απαλά το Lipofectamine RNAiMAX και αραιώνεται 4 μΙ του μίγματος σε 50 μΙ Ορίί-ΜΕΜ Ι ελαττωμένη μέσο χωρίς ορό. Το αραιό RNAi duplex συνδυάστηκε με αραιό Lipofectamine RNAiMAX και επωάστηκαν για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τέλος, το RNAi duplex- σύμπλοκα λιποφεκταμίνης RNAiMAX προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Αυτό οδήγησε σε ένα τελικό όγκο 600 μΐ και τελική συγκέντρωση siRNA 20 ηΜ. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 48 ώρες πριν να χρησιμοποιηθούν σε πειράματα.

κηλίδος Western

Πρωτεΐνες (30 μg) αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας 10% πήκτωμα SDS-PAGE και μετά μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (PALL Corp .). Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με χρήση άπαχου γάλακτος και επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα: αντι-ρ-ΕΚΚ (αραίωση 1:1,000)? αντι-ΕΚΚ (αραίωση 1:1,000)? αντι-ΜΜΡ2 (αραίωση 1:1,000)? αντι-ΜΜΡ9 (αραίωση 1:1,000)? αντι-RAGE (αραίωση 1:1,000?.. αντι-GAPDH (αραίωση 1:40,000) Πρωτογενής αντισώματα στη συνέχεια απομακρύνθηκαν και οι μεμβράνες πλύθηκαν με ρυθμιστικό PBST για 30 λεπτά Οι μεμβράνες ακολούθως επωάστηκαν για 45 λεπτά σε RT με την ακόλουθη δευτερογενή αντισώματα:. υπεροξειδάση κοχλιαρίας συζευγμένη αντι-ποντικού (αραίωση 1:4,000) και αντι-κουνελιού (αραίωση 1:4,000) (Chemicon) Τέλος, δευτερογενή αντισώματα απομακρύνθηκαν και οι μεμβράνες πλύθηκαν με ρυθμιστικό PBST δύο φορές για 30 λεπτά. σήματα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ Western Φωτισμός Χημειοφωταύγειας αντιδραστηρίου Plus (Millipore). οι πυκνότητες των σημάτων μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα απεικόνισης, και τα σήματα ποσοτικοποιήθηκαν μετά από κανονικοποιήθηκαν έναντι εκείνων του GAPDH. Όλα τα στοιχεία που παρουσιάζονται στο παρόν έγγραφο είναι οι μέσες τιμές από πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Η μετανάστευση των κυττάρων δοκιμασία

τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων χρησιμοποιώντας Culture-Insert (ibidi) σε συγκέντρωση 6 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο και στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες. Μετά από μία περίοδο 24 ωρών σε συνθήκες άνευ ορού, το Culture-Εισάγει απομακρύνθηκαν και τα κύτταρα πλύθηκαν χρησιμοποιώντας HBSS, πριν κατεργαστεί με AGEs για την ανάλυση της κυτταρικής μετανάστευσης.

Zymorgraphy δοκιμασία

Μετά τη θεραπεία με 200-400 μg AGEs /ml για 4 ή 24 ώρες, τα κύτταρα σπάρθηκαν επί 7 πιάτα εκατοστά σε συγκέντρωση 1 × 10

6 κύτταρα. Ζυμογράφημα χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση της λειτουργίας των ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 σε μέσο υπό όρους. Για να επιτευχθεί αυτό, χρησιμοποιήσαμε 7,5% SDS-PAGE πηκτή που περιέχει 0,1% ζελατίνη (J.T.Baker, Κέντρο Valley, ΡΑ, USA). Η πηκτή στη συνέχεια πλύθηκε με 2,5% Triton Χ 100 για 30 λεπτά σε RT. Triton Χ 100 απομακρύνθηκε και γέλη πλύθηκε με RO H

2O. Στη συνέχεια προσθέσαμε αναμετουσίωσης ρυθμιστικό διάλυμα (50mM Tris-HCl ρΗ 7.2,20% γλυκερόλη) για 30 λεπτά σε RT. Αναμετουσίωσης ρυθμιστικό απομακρύνθηκε και γέλη πλύθηκε με RO H

2O. Στη συνέχεια προσθέσαμε αναπτυσσόμενες ρυθμιστικό διάλυμα (50mM Tris-HCI ρΗ 8,8, 5 mM CaCl2, 1 mM ZnCl2) για 24 ώρες στους 37 ° C. Ανάπτυξη ρυθμιστικό απομακρύνθηκε και γέλη πλύθηκε με RO H

2O. χρώση Gel διεξήχθη επί 1 ώρα σε RT, χρησιμοποιώντας PageBlue Protein χρώσης (Fermentas, Lafayette, CO, USA). αποχρωματισμού Gel διεξήχθη χρησιμοποιώντας RO H

2O σε θερμοκρασία δωματίου. . (Σχ S1)

Στατιστικές αναλύσεις

πραγματοποιήσαμε φοιτητής t-tests, μονόδρομη ANOVA, και σ τιμές των & lt? 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές

Αποτελέσματα.

επίδραση των AGEs για τον καρκίνο του στόματος κύτταρα

Θα αξιολογηθεί πρώτα η επιρροή των AGEs στη βιωσιμότητα των κυττάρων. κύτταρα SAS υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με AGEs (0-400 μg /ml) ή BSA (0-400 μg /ml) για 24 ή 48 ώρες, οπότε ο αριθμός των κυττάρων και ο ρυθμός πολλαπλασιασμού προσδιορίστηκαν σύμφωνα με trypan μπλε χρωστική αποκλεισμού (Εικ. 1Α ) και WST-1 ανιχνεύσεις (Εικ. 1Β). Σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου, τα κύτταρα έλαβαν AGE έδειξαν μια σημαντική μείωση στον αριθμό των κυττάρων (24 ώρες AGEs 100: 2,88 ± 0,16,

P

= 0.006? AGEs 200: 2,6 ± 0,25,

P

= 0,008? AGEs 400: 1,85 ± 0,05,

P

& lt? 0,0001? 48 ώρες AGEs 100: 3,1 ± 0,18,

P

= 0,05? AGEs 200: 2.57 ± 0.17,

P

= 0,01? AGEs 400: 2,03 ± 0,08,

P

= 0,003). Σε αντίθεση, η BSA έχει δειχθεί ότι αυξάνει τον αριθμό των κυττάρων (ως αρνητικός έλεγχος, 24 ωρών: 4,77 ± 0,32, NS? 48 ωρών: 9,25 ± 0,35,

P

= 0,0004) (Εικ 1Α.). Επιπλέον, ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων δείχθηκε ότι αναστέλλεται από AGEs (Εικ. 1Β). Τέλος, κατεργασία κυττάρων με AGEs (400 μg /ml? 0-4 ώρες) ενισχυμένη μετανάστευση? Ωστόσο, η BSA δεν είχε καμία επίδραση στη μετανάστευση (Εικ. 1 C).

κύτταρα SAS υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με AGEs (0-400 μg /ml) ή BSA (0-400 μg /ml) για 24 έως 48 ώρες. Ο αριθμός των κυττάρων και του πολλαπλασιασμού ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας αποκλεισμό μπλε τρυπάνης χρωστικής (Α) και έναν προσδιορισμό WST-1 (Β). AGEs μείωσε σημαντικά τον αριθμό των κυττάρων? BSA (ως αρνητικός έλεγχος) αυξήθηκε βιωσιμότητας (Α). AGEs ανέστειλε επίσης τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων (Β). Η θεραπεία με AGEs (400 μg /ml? 0-4 ώρες). Αυξημένη κυτταρική μετανάστευση, ενώ η θεραπεία με BSA δεν είχε (C)

Η

AGEs ρύθμιση του RAGE, ΜΜΡ2, ΜΜΡ9 και

τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με AGEs (200 και 400 μg /ml) ή BSA (400 μg /ml) για 24 ώρες. Στη συνέχεια χρησιμοποιείται ανάλυση κηλίδος western για την ανίχνευση RAGE, ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9. Σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου, το αποτέλεσμα έδειξε ότι AGEs επεξεργασμένα κύτταρα παρουσίασαν σημαντική αύξηση RAGE (AGEs 400: 1,3 ± 0,03,

P

= 0.0007), ΜΜΡ2 (AGEs 200: 1,28 ± 0,04,

P

= 0.002? AGEs 400: 1,47 ± 0,04,

P

= 0.004), και ΜΜΡ9 (AGEs 400: 1,24 ± 0,03,

P

= 0.0008) (Σχήμα 2).. Επιπλέον, η λειτουργικότητα των ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 αυξήθηκε μετά τη θεραπεία με AGEs για 4 ή 24 ώρες (Σχ S2).

Μετά την αγωγή κυττάρων με AGEs (200 και 400 μg /ml) ή BSA (400 μg /ml ) για 24 ώρες, RAGE, ΜΜΡ2, ΜΜΡ9 και ανιχνεύθηκαν με ανάλυση western blot (Α). AGEs αύξησε σημαντικά την έκφραση του RAGE, ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 (Β).

Η

Κανονισμός της φωσφορυλίωσης της ERK από AGEs

Για να προσδιοριστεί η πορεία των ηλικιών, τα κύτταρα SAS υποβλήθηκαν σε θεραπεία με AGEs ή BSA για 24 ώρες. φωσφορυλίωση ERK στη συνέχεια ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας ανάλυση στυπώματος Western. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η θεραπεία με AGEs αύξησε σημαντικά τη φωσφορυλίωση της ERK (AGEs 400: 1,26 ± 0,06,

P

= 0,01) (Σχήμα 3Α.). φωσφορυλίωση ERK ενισχύθηκε επόμενες 4 ώρες AGEs αγωγή (Σχ S2)? Ωστόσο, προκατεργασία των κυττάρων με PD98059 για 1 ώρα είχε ως αποτέλεσμα μια μείωση στην έκφραση των ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 (σχ. 3Β και C). Φαίνεται ότι PD98059 προκατεργασία μπλοκάρει τις επιδράσεις των AGEs στην κυτταρική μετανάστευση (Σχήμα 3D.)? Ωστόσο, η έκφραση RAGE δεν επηρεάστηκε (AGEs 400: 1,27 ± 0,04,

P

= 0,003) (Σχήμα 3Ε).

ανάλυση κηλίδος Western που δείχνει ότι η θεραπεία κυττάρων με SAS ηλικίες για 24 ώρες. οδήγησε σε αυξημένη φωσφορυλίωση ERK (Α). Προθεραπεία με PD98059 για 1 ώρα μειωμένη ERK φωσφορυλίωση, ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 (Β και Γ) καθώς επίσης και τη μετανάστευση των κυττάρων (D)? Ωστόσο, τα επίπεδα RAGE ακόμα αυξημένη (Ε).

Η

Κανονισμός του ΕΚΚ από AGEs μέσω ΟΡΓΗ

αντισώματα RAGE (10 ng /ml προεπεξεργασίας για 1 ώρα) χρησιμοποιήθηκαν για να εμποδίσει AGE σύζευξη. Η θεραπεία με AGEs οδήγησε σε σημαντική αύξηση στην φωσφορυλίωση ERK και την έκφραση της ΜΜΡ2, ΜΜΡ9 και (ERK: 1,31 ± 0,03,

P

= 0,0008? ΜΜΡ2: 1,38 ± 0,04,

P

= 0.0005? ΜΜΡ9: 1.32 ± 0.09,

P

= 0,02). Σε σύγκριση με κύτταρα κατεργασμένα με AGEs και μόνο, κύτταρα επεξεργασμένα με δύο ηλικιών και αντίσωμα RAGE έδειξαν σημαντικά ανέστειλε φωσφορυλίωση ERK (

P

= 0,009), καθώς και μειωμένη έκφραση του ΜΜΡ2 (

P

= 0.05) και ΜΜΡ9 (

P

= 0.0003) (Σχ. 4 Α και Β). αντισώματα RAGE επίσης δειχθεί ότι καταστέλλουν την κυτταρική μετανάστευση (Εικ. 4C).

Η χρήση του αντισώματος RAGE (10 ng /ml προεπεξεργασία επί 1 ώρα) για να εμποδίσει AGE σύζευξη οδήγησε σε σημαντική αύξηση στη φωσφορυλίωση ERK, ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 λόγω AGEs. Σε σύγκριση με τη θεραπεία με AGEs (#), αντίσωμα RAGE μπλοκάρει φωσφορυλίωση ERK, ΜΜΡ2, ΜΜΡ9 και (Α και Β), καθώς και μετανάστευση κυττάρων (C).

Η

RAGE RNAi (20 ηΜ για 48 ώρες) Στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε για σίγαση της έκφρασης της πρωτεΐνης. Σε σύγκριση με το RNAi αρνητικό μάρτυρα (Ν), RAGE RNAi δείχθηκε να έχει μια έκφραση σημαντικά καταστέλλουν RAGE (0,64 ± 0,07,

P

= 0,006) (Σχ. 5Α). Η καταστολή της κυτταρικής μετανάστευσης από RAGE RNAi βρέθηκε να συμβούν ανεξάρτητα από τις επιπτώσεις των AGE (Εικ. 5Β). Επιπλέον, RAGE RNAi ανέστειλε φωσφορυλίωση ERK (RNAi: 0,64 ± 0,08,

P

= 0,01? Ν + Ηλικίες: 1,26 ± 0,03,

P

= 0.001) ΜΜΡ2 (N + Ηλικίες: 1,28 ± 0.04,

P

= 0,003), και η έκκριση της ΜΜΡ9 (RNAi: 0,58 ± 0,06,

P

= 0,002? Ν + Ηλικίες: 1,36 ± 0,05,

P

= 0,003). Σε σύγκριση με το Ν + AGEs, η θεραπεία με RNAi + AGEshad σημαντική επίδραση σε όλες τις τρεις από αυτές τις διαδικασίες (ΕΚΚ:

P

= 0,02? ΜΜΡ2:

P

& lt? 0,003? ΜΜΡ9:

P

= 0,04) (Εικ. 5C και D). Ο αρνητικός μάρτυρας δεν έδειξε σημαντικές επιδράσεις.

RAGE RNAi (20 nM για 48 ώρες) χρησιμοποιήθηκε για να φιμώσουν την έκφραση της πρωτεΐνης. Σε σύγκριση με το RNAi αρνητικό μάρτυρα (Ν), RAGE RNAi σημαντικά μειωμένη έκφραση RAGE (Α). Η καταστολή της κυτταρικής μετανάστευσης από RNAi RAGE συμβεί ανεξάρτητα από τη θεραπεία με AGEs (Β). RAGE RNAi ανέστειλε επίσης φωσφορυλίωση ERK, ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9. Σε σύγκριση με το Ν + AGEs (#), RNAi + AGEs παρουσίασε σημαντική μείωση (Γ και Δ) και τον αρνητικό έλεγχο δεν είχε καμία επίδραση.

Η

Συζήτηση

Μια σχέση μεταξύ καρκίνου του στόματος και DM έχει αποδειχθεί από τα προηγούμενα ερευνητές [30] – [32]. Οι ασθενείς που πάσχουν από καρκίνο του στόματος, σε συνδυασμό με DM είναι πρόσωπο με ιδιαίτερα επεμβατική τα καρκινικά κύτταρα, και χαμηλά ποσοστά επιβίωσης [26]. Ωστόσο, ο μηχανισμός που υπογραμμίζει τη σχέση μεταξύ του καρκίνου του στόματος και DM δεν έχει διευκρινισθεί. Αυτή είναι η πρώτη μελέτη για να διερευνήσει μια πιθανή σχέση μεταξύ AGEs και τον καρκίνο του στόματος. Πραγματοποιήσαμε αυτή την έρευνα για τον προσδιορισμό του ρόλου του συστήματος AGE-RAGE στον καρκίνο του στόματος, και να διευκρινιστεί η σχέση μεταξύ καρκίνου του στόματος και DM

Οι ερευνητές έχουν αναφερθεί στο παρελθόν ότι AGEs και RAGE ρυθμίζουν τη μετανάστευση των κυττάρων [15]. – [17], [33]. Τα αποτελέσματά μας επιβεβαιώνουν ότι AGEs ενισχύσει τη μετανάστευση των κυττάρων και επίσης δείχνουν ότι AGEs μειώσει τη βιωσιμότητα των κυττάρων. Takino et al. σε παρόμοια ευρήματα χρησιμοποιώντας AGEs αφυδρογονάση που προέρχεται [17]. Επιπλέον, Bhawal et al. ανέφερε ότι RAGE συνδέεται στενά με την εισβολής του καρκίνου του στόματος [15], και τα ευρήματα μας δείχνουν ότι AGEs ρυθμίζουν τη μετανάστευση των κυττάρων μέσω της έκφρασης του RAGE. Σε ένα κλινικό περιβάλλον, η έκφραση των ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 εμφανίστηκε να σχετίζεται στενά με τη μετάσταση του καρκίνου του στόματος [34], [35]. AGEs έχουν περαιτέρω αποδειχθεί ότι αυξάνουν την έκκριση της ΜΜΡ2 [17] και ρυθμίζουν την έκφραση ΜΜΡ9 [36], [37] μέσω της οδού ERK [23], [38]. Τα αποτελέσματά μας υποστηρίζουν αυτά τα προηγούμενα εύρημα? Ειδικότερα, ότι η φωσφορυλίωση ERK και η έκφραση των ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 ρυθμίζονται από AGE. Επιπλέον, CD44 είναι ένας παράγοντας μετανάστευσης που σχετίζονται με RAGE [39]. Ωστόσο, δεν καταφέραμε να παρατηρούμενη σημαντική διαφορά στην έκφραση CD44 μετά από αγωγή AGEs (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Μια παρόμοια έκθεση επιβεβαίωσε ότι η έκφραση του CD44 δεν επηρεάζεται από AGEs [40]. Αυτό υποδηλώνει ότι AGEs-RAGE ρυθμίζουν την κυτταρική μετανάστευση μέσω ενός μονοπατιού που δεν είναι CD44 εξαρτώμενη

Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι RAGE είναι πολλαπλάσιο του υποδοχέα που ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μέσω συνδέτη του (S100 ή HMGB1) [41]. – [43]. Xu et al. και Meghnani et al. δείχνουν επίσης ότι RAGE αυξάνει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και των σχετικών οδών [44], [45]. Επιπλέον, η HMGB1 έχει βρεθεί να ρυθμίζουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη μετάσταση μέσω RAGE και δραστικότητα μελανώματος ανασταλτική (MIA) οδού στον καρκίνο του στόματος [46]. Στη μελέτη μας, AGEs και BSA φαίνεται να διαφέρουν ως προς τις επιπτώσεις τους στα κύτταρα SAS. AGEs δείχθηκαν να μειώσει τον αριθμό των κυττάρων? Ωστόσο, BSA αυξήθηκε. Πιο συγκεκριμένα, σε αυτή τη μελέτη κύτταρα επωάστηκαν χωρίς ορό για 24 ώρες πριν από τη θεραπεία? έτσι BSA μπορεί να ενεργήσει ως παράγοντας ανάπτυξης. Το εύρημά μας ότι AGEs μείωσε τον αριθμό των κυττάρων, αυξάνοντας παράλληλα την φωσφορυλίωση ERK δείχνει σαφώς ότι AGEs διαφέρουν ως προς τα αποτελέσματά τους επί των κυττάρων. Βαλένθια et al. έδειξαν επίσης ότι οι αποκλίνουσες πορείες της γονιδιακής έκφρασης ενεργοποιείται από το πρόσδεμα RAGE S100 και AGEs [47]. Ως εκ τούτου, τα αποτελέσματα του συστήματος AGE-RAGE διαφέρουν από εκείνες των άλλων συνδετών

Η χρήση του PD98059 να μπλοκάρουν την οδό ERK είχε ως αποτέλεσμα την καταστολή της κυτταρικής μετανάστευσης και μείωσε επίσης την έκφραση της ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9.? Ωστόσο, δεν παρατηρήθηκε διαφορά όσον αφορά την επίδραση των ηλικιών σε αύξηση της έκφρασης RAGE. Η χρήση του αντισώματος RAGE και RNAi για να μπλοκάρουν την οδό AGEs-RAGE ως αποτέλεσμα ανέστειλε φωσφορυλίωση της ERK και της μετανάστευσης των κυττάρων και επίσης μείωσε την έκφραση της ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9. Τα ευρήματα αυτά αποδεικνύουν ότι οι επιδράσεις των AGEs για τη μετανάστευση των κυττάρων συμβαίνουν μέσω φωσφορυλίωσης της ERK. Είναι ενδιαφέρον ότι, μια προηγούμενη κλινική μελέτη αναφέρθηκε ότι η αύξηση των επιπέδων RAGE στον καρκίνο συσχετίζεται με μετάσταση [15], [33]. Σε άλλα μοντέλα κυττάρων, RAGE φάνηκε να ρυθμίζει τη μετανάστευση των κυττάρων [15], [48], [49]. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι οι επιδράσεις του RAGE RNAi μετανάστευσης επιρροή των κυττάρων, φωσφορυλίωσης της ERK, και την έκφραση ΜΜΡ9 ανεξάρτητα. Αυτό το εύρημα παρέχει πρόσθετη υποστήριξη για τον ισχυρισμό ότι RAGE μεσολαβεί μετάσταση μέσω της έκφρασης της ΜΜΡ9 μέσω του μονοπατιού ERK.

Στην έκθεση αυτή, AGEs μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων και αυξημένη μετανάστευση των κυττάρων, καθώς και η προώθηση της φωσφορυλίωσης της ERK και την ενίσχυση της έκφρασης ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9. PD98059, αντίσωμα RAGE, και RNAi έδειξαν να μεσολαβούν ρύθμιση AGE. Αυτή είναι η πρώτη μελέτη που δείχνει ότι RAGE ρυθμίζει την έκφραση ΜΜΡ9 μέσω της οδού ERK. Το πιο σημαντικό, αποδείξαμε το ρόλο που AGE-RAGE παίζει στην κακοήθεια του καρκίνου του στόματος μέσω της ρύθμισης ERK και κατάντη οδούς, τελικά επηρεάζουν τη μετανάστευση των κυττάρων στον καρκίνο του στόματος. Ο μηχανισμός με τον οποίο το σύστημα λειτουργεί AGE-RAGE εις μας

in vitro

μοντέλο καρκίνου του στόματος παρουσιάζεται στο Σχ. 6. AGEs αύξηση της έκφρασης RAGE, η οποία διεγείρει την κατάντη μονοπάτι φωσφορυλίωσης ERK και έχει ως αποτέλεσμα την ρύθμιση προς τα επάνω των ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9. Αυτό με τη σειρά της ενισχύει την κυτταρική μετανάστευση, η οποία εκδηλώνεται με την κακοήθεια του καρκίνου. Τα ευρήματα αυτά εξηγούν γιατί περιπτώσεων τον καρκίνο του στόματος ταυτόχρονα με ΣΔ παρουσιάζουν αυξημένη εισβολή του καρκίνου και τη μείωση των ποσοστών επιβίωσης. Τα αποτελέσματα δείχνουν επίσης ότι η συσσώρευση των AGEs λόγω γήρανσης ή γερμανικά μάρκα αυξάνει την πιθανότητα ανάπτυξης κακοήθους καρκίνου.

AGEs αυξάνουν την έκφραση RAGE και να τονωθεί η κατάντη της οδού της φωσφορυλίωσης ERK. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την πλειορύθμιση ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 έκφραση και την ενίσχυση της κυτταρικής μετανάστευσης, η οποία εκδηλώνεται ως κακοήθεια.

Η

Υποστήριξη Πληροφορίες

Σχήμα S1.

Λήξη της περιοχής κυτταρικής μετανάστευσης. περιοχή μετανάστευσης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ImageJ και ποσοτικά καταγράφοντας τις αλλαγές στην περιοχή του τραύματος. AGEs μείωσε σημαντικά το μέγεθος της περιοχής του τραύματος, ενώ PD98059, αντίσωμα RAGE, και RAGE RNAi καταστέλλεται μετανάστευση στις 4 ώρες. Η ανάλυση ήταν η συμπεριφορά με μονόδρομη ANOVA, και το αποτέλεσμα ήταν στατιστικά σημαντική (p & lt? 0.0001)

doi: 10.1371 /journal.pone.0110542.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2..

Λειτουργικά ΜΜΡ 2 και ΜΜΡ 9. Μετά την αγωγή των κυττάρων SAS με AGEs (400 μg /ml) για 0,5-4 ώρες, η έκφραση της φωσφορυλίωσης ERK ανιχνεύθηκε. Το λειτουργικά ΜΜΡ 2 και ΜΜΡ 9 ανιχνεύθηκαν με zymorgraphy μετά από θεραπεία AGEs για 4 ή 24 ώρες. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι AGEs αυξημένη φωσφορυλίωση ERK (Α). MMP 2 και ΜΜΡ 9 αυξήθηκαν κατά AGEs στις 4 ώρες, αλλά μόνο ΜΜΡ 2 αυξήθηκε στις 24 ώρες (Β)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0110542.s002

(TIF)