Αφηρημένο

της υποξίας επαγώγιμων μεταγραφικού παράγοντα HIF και το ΝΡ ĸB μονοπάτι προωθεί φλεγμονή μεσολάβηση της προόδου του όγκου. Το κυτταρικό ZNF395 παράγοντας μεταγραφής έχει επανειλημμένα βρεθεί υπερεκφράζεται σε διάφορους ανθρώπινους καρκίνους, ιδιαίτερα σε απόκριση σε υποξία, πράγμα που συνεπάγεται μια λειτουργική συνάφεια. Για να κατανοήσουμε τη βιολογική δραστικότητα του ZNF395, προσδιορίσαμε γονίδια στόχους του ZNF395 μέσω ενός πλέγματος έκφραση γονιδιώματος κλίμακα. Επαγόμενη έκφραση ZNF395 οδήγησε στην προς τα πάνω ρύθμιση των γονιδίων που είναι γνωστό ότι παίζουν ένα ρόλο στον καρκίνο, καθώς και ένα υποσύνολο της ιντερφερόνης (IFN) διεγερμένων γονίδια (ISG) που συμμετέχουν στην αντι-ιική αποκρίσεις όπως IFIT1 /ISG56, IFI44 και IFI16. Στα κύτταρα που στερούνται ZNF395, η IFN-α-διαμεσολαβούμενη διέγερση αυτών των παραγόντων ήταν μειωμένη, καταδεικνύοντας ότι ZNF395 απαιτείται για την πλήρη επαγωγή αυτών των αντι-ιική γονιδίων. Παροδικές επιμολύνσεις αποκάλυψε ότι ZNF395-μεσολαβητική ενεργοποίηση του υποκινητή IFIT1 /ISG56 εξαρτάται από τα δύο IFN-διεγερμένα στοιχείων απόκρισης εντός του υποκινητή και με τον τομέα δέσμευσης DNA του ZNF395, λεγόμενο σφιγκτήρα C. Δείχνουμε επίσης ότι IĸBα κινάσης (ΙΚΚ) -signaling είναι αναγκαίο να επιτραπεί ZNF395 να ενεργοποιήσει τη μεταγραφή και ταυτόχρονα ενισχύει την πρωτεολυτική αποδόμηση του. Έτσι, ZNF395 ενεργοποιείται στο επίπεδο της τροποποίησης πρωτεΐνης με ΙΚΚ. Επιπλέον, επιβεβαιώνουν ότι η έκφραση του ZNF395 επάγεται από υποξία. Τα αποτελέσματά μας χαρακτηρίζουν ZNF395 ως νέου παράγοντας που συμβάλλει στην μέγιστη διέγερση ενός υποσυνόλου ISGs. Αυτή η μεταγραφική δραστηριότητα εξαρτάται από το ΙΚΚ σηματοδοτώντας περαιτέρω υποστηρίζοντας ένα ρόλο ZNF395 στην έμφυτη ανοσολογική απόκριση. Λαμβάνοντας υπόψη αυτά τα αποτελέσματα, είναι πιθανό ότι κάτω από συνθήκες υποξίας, αυξημένα επίπεδα ZNF395 μπορεί να υποστηρίξει τη φλεγμονή και την πρόοδο του καρκίνου με την ενεργοποίηση των γονιδίων στόχων που εμπλέκονται στην έμφυτη ανοσοαπόκριση και καρκίνος

Παράθεση:. Γιορντανόβσκι D, Herwartz C, Παβλόφσκι Α, Taute S, Frommolt P, Steger G (2013) Η υποξία Μεταγραφή Factor ZNF395 ελέγχεται από IĸB κινάσης σηματοδότησης και ενεργοποιεί γονίδια που εμπλέκονται στην ειδική ανοσία και καρκίνος. PLoS ONE 8 (9): e74911. doi: 10.1371 /journal.pone.0074911

Επιμέλεια: Karen L. Mossman, Πανεπιστήμιο McMaster του Καναδά

Ελήφθη: 14 Μαρ 2013? Δεκτές: 7, Αυγούστου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 23 Σεπτέμβρη 2013

Copyright: © 2013 Steger et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από την Deutsche Forschungsgemeinschaft (επιχορήγηση Γ Steger, αριθμός STE604 /5-1), η Deutsche Krebshilfe και την Koeln Fortune Πρόγραμμα /Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο της Κολωνίας, Γερμανία, χορηγεί αριθμό 220/2010. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

συστοιχίες γονιδιακή έκφραση βρέθηκε επανειλημμένα την έκφραση του κυτταρικού παράγοντα ZNF395 (που ονομαζόταν παλαιότερα PBF για τον παράγοντα δέσμευσης Θηλωμάτων) αυξήθηκαν σημαντικά σε διάφορους καρκίνους όπως τα καρκινώματα των νεφρικών κυττάρων, οστεοσάρκωμα και σαρκώματα Ewing [ ,,,0],1,2,3,4]. Αξίζει να σημειωθεί ότι, σε γλοιοβλαστώματα και νευροβλάστωμα, ZNF395 ήταν μεταξύ των λίγων ρυθμίζεται προς τα πάνω γονίδια που ήταν χαρακτηριστικό για μια υποξική απόκριση και συνδέονται με την έκβαση της νόσου [5,6]. ZNF395 ανήκε επίσης προς τα γονίδια υπερεκφράζονται σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές γραμμές από την υποξία και από υπερέκφραση του προκαλείται από υποξαιμία μεταγραφής παράγοντα-1α (HIF-1α) [7,8,9]. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι ZNF395 έχει έναν λειτουργικό ρόλο εντός οδών που εμπλέκονται στην υποξία και τον καρκίνο. Ωστόσο, σχεδόν τίποτα δεν είναι γνωστό σχετικά με τη βιολογική δράση του ZNF395 εντός του κυττάρου.

υποξία αντανακλώντας ανεπάρκεια οξυγόνου εμφανίζεται συχνά στην ανάπτυξη όγκων και είναι επίσης ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα της οξείας εστίες της φλεγμονής των ιστών. Προλυλ υδροξυλασών (διδάκτορες) υπομονάδες υδροξυλιωμένο HIF-α και την εστίασή τους σε ουβικιτίνη-εξαρτώμενη αποδόμηση. Κάτω από συνθήκες υποξίας, τα διδακτορικά είναι αναστέλλεται. υπομονάδες HIF-α, στη συνέχεια συσσωρεύονται και μετατοπίζονται στον πυρήνα όπου διμερίζονται με σταθερό εταίρο HIF-1β τους, και συνδέονται με αλληλουχία στόχο τους που είναι γνωστό ως στοιχείο απόκρισης υποξίας (HRE). HIF επάγει την έκφραση περισσότερων από 100 γονίδια που ρυθμίζουν το μεταβολισμό της γλυκόζης, τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την κυτταρική επιβίωση, καθώς και γονίδια που οδηγούν την αγγειογένεση και την επαγωγή ανοσολογικής ανοχής (που επισκοπείται στο [10]). Η ανώμαλη ενεργοποίηση του ΝΡ-ĸB, το κλειδί του ανοσοποιητικού ρυθμιστή απόκρισης, είναι ένα άλλο χαρακτηριστικό πολλών καρκίνων. Είναι προηγείται IĸB κινάσης (ΙΚΚ) μεσολάβηση φωσφορυλίωση των αναστολέων του ΝΡ-ĸB, οι πρωτεΐνες IĸBα, με αποτέλεσμα πρωτεασώματος εξαρτώμενη από την υποβάθμισή τους (που επισκοπείται στο [11,12]). Το συγκρότημα ΙΚΚ αποτελείται από δύο καταλυτικές υπομονάδες ΙΚΚβ και ΙΚΚα και το ρυθμιστικό IKKγ. Το μονοπάτι ΝΡ-ĸB είναι ζωτικής σημασίας για την έμφυτη ανοσολογική απόκριση. Αυτό ξεκινά από την αναγνώριση των μη-εαυτού μοριακών μοντέλων παθογόνο που σχετίζεται με (PAMPs) που ανιχνεύονται από τους υποδοχείς αναγνώρισης προτύπων υποδοχής (PRR), όπως τα διόδια που μοιάζει με υποδοχέα 3 (TLR3). Μετά τη σύνδεση συνδετήρα, δηλ ιικό RNA, TLR3 πυροδοτεί την ενεργοποίηση των κινασών TBK1 και ΙΚΚ, που οδηγεί στην φωσφορυλίωση και ενεργοποίηση των παραγόντων μεταγραφής IRF3 και NF-ĸB, αντίστοιχα. IRF3 και NF-ĸB επάγουν μία αντιική απάντηση με την αύξηση της έκφρασης του ιντερφερονών Ι (IFN) ΙΡΝ-α και ΙΡΝ-β τύπου, οι οποίες εκκρίνονται από τα μολυσμένα κύτταρα. σύνδεσή τους με τον τύπο Ι IFN υποδοχέα διεγείρει το μονοπάτι JAK-STAT για την ενεργοποίηση του παράγοντα μεταγραφής ISGF3. Το συγκρότημα στη συνέχεια μετατοπίζεται εντός του πυρήνα, δεσμεύεται με το στοιχείο απόκρισης ΙΡΝ-διεγερμένα (ISRE) και προωθεί τη μεταγραφή των γονιδίων ΙΡΝ-διεγερμένα (ISGs), τα οποία κωδικοποιούν πρωτεΐνες με αντι-ιική δραστηριότητα (που επισκοπείται στο [13]). Η έμφυτη ανοσοαπόκριση και το υποξικό απόκριση είναι συνδεδεμένα αφού υποξία σταθεροποιεί όχι μόνο HIF1-α, αλλά επίσης διεγείρει την ενεργοποίηση του ΝΡ-ĸB [14]. Ενεργοποιημένος NF-ĸB δείχθηκε να ρυθμίζουν την έκφραση του HIF-1α [15,16,17,18]. ΙΚΚβ αποκαλύπτει επίσης NF-ĸB ανεξάρτητη pro-ογκογόνο λειτουργιών, το οποίο περιλαμβάνει φωσφορυλίωση της ογκοκαταστολείς FOXO3a και p53, αντίστοιχα, η οποία πυροδοτεί την πρωτεολυτική αποικοδόμηση τους [19,20] ΙΚΚβ μεσολάβηση.

Έχουμε απομονώσει την ανοιχτή ανάγνωση πλαίσιο (ORF) για ZNF395 μέσω της ικανότητάς του να δεσμεύεται με ρυθμιστικές αλληλουχίες εντός της περιοχής ελέγχου των διαφόρων τύπων του ιού του θηλώματος (PV) [21]. Διαπιστώθηκε επίσης ότι η πρωτεΐνη δεσμεύεται με την περιοχή ελέγχου του γονιδίου της νόσου του Huntington (HD) και ονομάστηκε HDBP2 (πρωτεΐνη 2 δέσμευσης HD) σε αυτή τη μελέτη [22]. Το ORF για ZNF395 είναι φυλογενετικά συντηρημένη στα σπονδυλωτά. Είναι πολύ παρόμοιο με τον παράγοντα ενισχυτή GLUT4 (GEF, HDBP1), που ενεργοποιεί την έκφραση γονιδίων του GLUT4, ενός μεταφορέα γλυκόζης, και ο ποντικός που προκαλείται από γλυκοκορτικοειδή γονίδιο 1 (GIG1, το ανθρώπινο γονίδιο ZNF704). Ιδιαίτερα, αυτές οι πρωτεΐνες μοιράζονται τις τρεις εξαιρετικά διατηρημένες περιοχές CR1, CR2 και CR3 και έχουν τη δυνατότητα να σχηματίσουν δομή δακτύλου ένα ψευδαργύρου. ZNF395 χαρακτηρίστηκε ως πυρηνο-κυτταροπλασματική πρωτεΐνη παλινδρόμηση [22,23]. Η υπερέκφραση του ZNF395 που προκαλείται από τον κυτταρικό θάνατο [24] και καταστέλλεται τόσο το HD-υποκινητή και το 8 (HPV8) υποκινητής ανθρώπινου τύπου PV, η οποία εξαρτάται από την σύνδεση του ZNF395 DNA και στη στόχευση του Sin3 /HDAC1 /2 συγκρότημα [25,26] . Ήμασταν ενδιαφέρονται για τον εντοπισμό και άλλων γονιδίων στόχων του ZNF395 και κατανόηση του ελέγχου της μεταγραφικής δραστηριότητας του.

Υλικά και Μέθοδοι

καλλιέργειας κυττάρων

Η ανθρώπινη κυτταρική σειρά καρκίνου του δέρματος RTS3b είναι περιγράφεται στο [27] και παρασχέθηκε ευγενώς από τον Ι Leigh, Λονδίνο, Ηνωμένο Βασίλειο. κύτταρα RTS3b διατηρήθηκαν σε Ε-μέσο, ​​ο μονοκυτταρική γραμμή U937 [28] σε RPMI1640, κύτταρα C33A σε ϋΜΕΜ U87-MG και, όλα τα μέσα συμπληρώθηκαν με 10% FCS και αντιβιοτικά. U937, U87-MG και C33A κύτταρα αγοράστηκαν από την ATCC. Παροδικές επιμολύνσεις διεξήχθησαν με το αντιδραστήριο Χ-tremeGENE (Roche Diagnostics) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. 48 ώρες αργότερα δραστικότητα λουσιφεράσης προσδιορίστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [29]. Οι σχετικές μονάδες φωτός ομαλοποιήθηκαν οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης των δειγμάτων. Όπου ενδείκνυται, ροΙγΙ: C (Invivogen) προστέθηκε σε 10 ng /ml για 24 ώρες, TNFa (Cell Signaling) σε 1 ng /ml για 24 ώρες, BMS-345541 (Sigma-Aldrich) σε 5 μΜ για 24 ώρες, MG132 (Biomol) σε 25μΜ για 24h, και IFN-α (Biomol) σε 1000U /ml για 6 ώρες. Η κυτταρική γραμμή RTS3b-TR-ZNF395 παρήχθη με σταθερώς επιμόλυνση pcDNA6 /TR, που ακολουθείται από ένα pcDNA4 /στο διάνυσμα (και τα δύο από την Invitrogen) που κωδικοποιεί FLAG-tagged ZNF395 υπό έλεγχο στοιχείων tet-χειριστή. Η κυτταρική γραμμή επωάστηκε σε δοξυκυκλίνη (Dox) (1 μg /ml) για 24 ώρες για να επάγει την έκφραση του FLAG-ZNF395. Η υποξική απόκριση παρήχθη με την έγχυση Ν

2 αέριο μέσα στον επωαστήρα για να ληφθεί ένα O

2 συγκέντρωση 2%. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν για 12 ώρες και αμέσως η συγκομιδή.

πλασμίδια

pcDNA3.1-FLAG-ZNF395, pcDNA3.1-FLAG-ZNF395ΔCR1 και pcDNA3.1-FLAG-ZNF395mtCR3 περιγράφηκαν προηγουμένως [ ,,,0],23,25]. pcDNA3.1-FLAG-ZNF395mtNES δημιουργήθηκε με τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση. Το κατασκεύασμα ISG56-pGL3-Luc περιγράφεται από Grandvaux [30]. Διαγραφές και σημειακές μεταλλάξεις εισήχθησαν είτε με κλωνοποίηση κατάλληλα προϊόντα PCR σε pGL3-Luc ή με τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση. IFI44-Luc ελήφθη με κλωνοποίηση ενός θραύσματος PCR που παράγονται από γενωμικό DNA, το οποίο κωδικοποιεί 560 νουκλεοτίδια της προς τα άνω ρυθμιστική περιοχή, συμπεριλαμβανομένης της 1 σε pGL3-Luc. Ο φορέας έκφρασης για IRF3-5D περιγράφεται από τον Lin et al. [31]. HA-ΙΚΚα (Addgene πλασμίδιο 15469), ΗΑ-ΙΚΚβ (Addgene πλασμίδιο 15470) και FLAG-ΙΚΚβ, FLAG-ΙΚΚβ-K44M, FLAG-ΙΚΚβ-S177 /181E (Addgene πλασμιδίων 11103, 11104, 11105), δημοσιεύονται [32, 33].

RT-PCR, μικροσυστοιχιών

Ολικό RNA παρασκευάστηκε από το RNeasy Mini Kit από Qiagen. σύνθεση cDNA και υβριδοποίηση σε Affymetrix εξόνιο 1.0 σειρά ST έγινε από την ομάδα του καθηγητή Νυρεμβέργη (CCG, Κολωνία, Γερμανία). Τα ανεπεξέργαστα δεδομένα που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας Affymetrix Ηλεκτρικά Εργαλεία, έκδοση 1.12.0 και η στιβαρή multiarray Μέση (RMA) αλγόριθμο [34]. Οι μεταγενέστεροι στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση της γλώσσας R για στατιστικούς υπολογισμούς, έκδοση 2.10.0. Για την ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου, 2 μg RNA μεταγράφηκαν ανάστροφα χρησιμοποιώντας τυχαία εκκινητή και το SuperScript Vilo cDNA Synthesis Kit (Invitrogen). ΡΟΚ σε πραγματικό χρόνο έγιναν με SybrGreen και LightCycler συστήματος (Roche Diagnostics). Η σημασία υπολογίστηκε με το t-test με ζευγαρωμένα δείγματα. Οι αλληλουχίες εκκινητών δίνονται στον πίνακα 1. Τα δεδομένα του πειράματος μικροσυστοιχιών μας κατατέθηκαν στη βάση δεδομένων GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) και ανέθεσε τον αριθμό ένταξης GSE44327.

Gene

πρόσθιο εκκινητή (5’to 3′)

Αντίστροφη αστάρι (5’to 3´)

IFI16TGCACCCTCCACAAGCCATGGCTGTGGACATGIFI44TGGCAGTGACAACTCGTTTGACCGCTTCCCTCCAAAAISG56TCATCAGGTCAAGGATAGTCTGGGTGTTTCACATAGGCTAGTAGMEF2CGCCCTGAGTCTGAGGACAAGAGTGAGCTGACAGGGTTGCTPEG10AACAACAACAACAACTCCAAGTCTGCACCTGGCTCTGCAGIFIT2ACTGCAACCATGAGTGAGAACGCCTCGTTTTGCCCTTTGAGZNF395CGAAAAAGAAAGAACTCTGTGCTGTGTCCCCCAGATGGAGHPRTTGACACTGGCAAAACAATGCAGGTCCTTTTCACCAGCAAGCTTable 1. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για qRT-PCR.

CSV Λήψη CSV

Μικρές παρεμβαίνει παρεμβολή RNA

Μικρές παρεμβαλλόμενα RNA (siRNA, siGenome SMARTpool) ελήφθησαν ως ένα σύνολο τεσσάρων ανόπτηση δίκλωνου RNA ( dsRNA) ολιγονουκλεοτίδια: ΙΚΚα (Μ-003473-02) και ΙΚΚβ (Μ-003503-02) από Dharmacon, ZNF395 (sc-77820) από την Santa Cruz Ως μάρτυρας, siRNA κατά της ογκογονιδίου Ε6 του HPV8 (8E6) [35. ] χρησιμοποιήθηκε στις ίδιες ποσότητες όπως τα ειδικά siRNAs, αντίστοιχα. 6 cm-πιάτα κυττάρων U87-MG και RTS3b επιμολύνθηκαν με 150pmol siZNF395, 250 ή 500pmol siIKKα, β ή της κατάλληλης ποσότητας του siRNA ελέγχου χρησιμοποιώντας Lipofectamine RNAiMax (Invitrogen) .

αντισώματα, χρωματίνης Ανοσοκαταβύθιση (μάρκας) Δοκιμασία, μετατόπισης γέλης

το πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού έναντι ZNF395 περιγράφηκε προηγουμένως [21]. το αντίσωμα Μ2 σημαία από την Sigma-Aldrich, η αντι- ΗΑ-αντίσωμα από τη Roche, αντι-ακτίνης αντίσωμα από την Santa Cruz, και αντισώματα έναντι ΙΚΚα και ΙΚΚβ ήταν από τη Cell Signaling. Παρασκευή ολόκληρων κυτταρικών εκχυλισμάτων και συν-ανοσοκαθιζήσεις πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [36]. Αντιδράσεις αποφωσφορυλίωση διεξήχθησαν με λ-φωσφατάση (Santa Cruz) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. ChIP Δοκιμασία έγινε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του προσδιορισμού ChIP από Upstate Biotechnology. Η παρουσία θραυσμάτων ISG56 υποκινητή στο ίζημα αναλύθηκε με qPCR χρησιμοποιώντας το σύστημα LightCycler (Roche Diagnostics) και εκκινητή που πλευρίζουν τις αλληλουχίες από -173 να +1 του προαγωγέα ISG56 (προς τα εμπρός 5′-TGAGATCTGGCTATTCTGTCTTGTGG-3? Αντίστροφη 5′-ATGGTTGCAGGTCTGCAGTTTATCTG 3′). μετατοπίσεις Gel διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25] με την ακόλουθη ds ολιγονουκλεοτίδιο (μόνο η άνω κλώνος δίνεται): ISRE-wt: 5′-TTTAGTTTCACTTTCCCCTTTCGGTTTCCCTAGGT-3′? ISRE-mut114 /101:. 5′-TTTAGTGTCACTTTCCCCTGTCGGTTTCCCTAGGT-3′, οι οποίες επισημάνθηκαν με

32Ρ-γ-ΑΤΡ ή να χρησιμοποιηθούν ως ανταγωνιστές

Αποτελέσματα

ZNF395 ενεργοποιεί γονίδια που σχετίζονται με το έμφυτη ανοσολογική απόκριση και του καρκίνου

Έχουμε απομονωθεί το cDNA για ZNF395 από κύτταρα HaCat [21]. Για το λόγο αυτό, χρησιμοποιήσαμε μια ανθρώπινη κυτταρική σειρά κερατινοκυττάρων για να διερευνήσει τις μεταγραφικές γεγονότα οφείλεται στην έκφραση του ZNF395 από μικροδιατάξεις ολιγονουκλεοτιδίων. Δεδομένου ότι έχουμε παρατηρήθηκε προηγουμένως ότι η υπερέκφραση του ZNF395 επαγόμενης αναστολής της κυτταρικής ανάπτυξης [23], δημιουργήσαμε μία κυτταρική γραμμή, με βάση το καρκίνο του δέρματος που προέρχεται RTS3b γραμμή [27], επιτρέποντας την επαγώγιμη έκφραση των ZNF395 ελέγχεται από δοξυκυκλίνη (Dox). Πέντε ανεξάρτητες καλλιέργειες είτε επωάστηκαν παρουσία ή απουσία Dox. Ενώ ένα συνολικό πρωτεϊνικό εκχύλισμα παρασκευάστηκε από ένα δείγμα που να επιβεβαιώνουν την έκφραση του ZNF395 με ανοσοκηλίδα (ΙΒ) (Σχήμα 1Α), τα απομένοντα τέσσερα σύνολα χρησιμοποιήθηκαν για την απομόνωση του συνολικού RNA, το οποίο μεταγράφηκε σε cDNA που ακολουθείται από υβριδισμό με το GeneChip ανθρώπινο εξόνιο 1.0 ST σειρά από Affymetrix. διαφορές γονιδιακή έκφραση αξιολογήθηκαν με Students t-test. Γονιδίων με ένα ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη p & lt? 0.05 και μια πτυχή της αλλαγής & gt? 1.5 θεωρήθηκαν να εκφράζονται διαφορικά. Δέκα γνωστά γονίδια, τα οποία παρατίθενται στον Πίνακα 2, πέρασαν τα κριτήρια αυτά. Έξι από τα γονίδια ZNF395 επαγόμενη είναι γνωστό ότι ρυθμίζονται από IFN, οι οποίες είναι IFIT1 (ISG56), IFIT2 (ISG54), IFI16, IFI44, CARD6, και SAMD9. Τα γονίδια MACC1, PEG10, CALCOCO1, και MEF2C έχουν βρεθεί ότι εμπλέκονται στον καρκίνο (Πίνακας 2). ZNF395 διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση του IFIT1 /ISG56, IFIT2 /ISG54, IFI44, IFI16, PEG10, και MEF2C σε αυτά τα κύτταρα επιβεβαιώθηκε με ποσοτική (q) RT-PCR με RNA που παρασκευάζεται από Dox-επεξεργασμένα κύτταρα RTS3b-TR-FLAG-ZNF395 σε σύγκριση με RNA από μη επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 1Β). Είναι πολύ περίεργο που δεν είχαμε εντοπίσει κανένα γονίδιο καταστέλλεται από ZNF395 αν και σε δοκιμασίες γονιδίου αναφοράς ZNF395 αποτελεσματικά καταστέλλονται ειδικούς προαγωγούς [25].

(Α) σταθερά επιμολυσμένα κύτταρα RTS3b εκφράζουν τον καταστολέα tet και FLAG-tagged ZNF395 υπό τον έλεγχο του επαγόμενου υποκινητή tet (διαδρομές 3, 4) ή ο κενός φορέας pcDNA4 /TO (διαδρομές 1, 2) είτε αναπτύχθηκαν απουσία (διαδρομές 1, 3) ή παρουσία του Dox (διαδρομές 2, 4) για 24 ώρες . Τα εκχυλίσματα χρησιμοποιήθηκαν για ανοσοστύπωμα (ΙΒ) η οποία αναπτύχθηκε με το αντίσωμα FLAG και ένα αντι-ακτίνης αντίσωμα ως έλεγχο. ns (μη ειδική ζώνη) (Β) Ολικό RNA απομονώθηκε από κύτταρα RTS3b TR-FLAG-ZNF395, είτε καλλιεργούνται με ή χωρίς Dox χρησιμοποιήθηκε για qRT-PCR για να αναλυθεί η έκφραση των παραγόντων που φαίνονται στο γράφημα. Οι αντίστοιχες τιμές κανονικοποιήθηκαν προς τις τιμές για το γονίδιο οικοκυρική τρανσφεράσης φωσφοριβοσυλοτρανσφεράση υποξανθίνης γουανίνης (HPRT) και εκείνων που ελήφθησαν από κύτταρα που αναπτύσσονται απουσία Dox ορίστηκαν ως 1 για κάθε παράγοντα. Η γραφική παράσταση αντιπροσωπεύει τα μέσα του δύο ανεξάρτητα πειράματα έκαστο εκτελέστηκαν εις διπλούν. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν τις τυπικές αποκλίσεις. (C, D) και RTS3b U87-MG κύτταρα επιμολύνθηκαν με siRNA ελέγχου ή siRNA που στοχεύει ZNF395 εις διπλούν. Ένα σετ των δειγμάτων υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διαλύτη και το άλλο με IFN-α, πριν απομονώθηκε ολικό RNA. QRT-PCR εκτελέστηκε με το ειδικό εκκινητή για την ενίσχυση ISG56, IFI44, IFI16 και ZNF395 μεταγραφές. CP-τιμές που λαμβάνονται για τους διάφορους παράγοντες ομαλοποιήθηκαν ενάντια σε εκείνους για το γονίδιο HPRT housekeeping. Η τιμή με RNA από διαλύτη κατεργασμένα κύτταρα επιμολυσμένα με siControl ορίστηκε ως 1 σε κάθε περίπτωση. Οι φορές ενεργοποιήσεις υπολογίστηκαν σύμφωνα με τη μέθοδο συγκριτικής κατώφλι περιγράφεται στο Pfaffl et al. [64]. QPCRs εκτελέστηκαν τέσσερις φορές και οι τυπικές αποκλίσεις δίδονται. Οι τιμές που παρέχονται στο σχήμα αντικατοπτρίζουν την μη προκαλούμενη βασικό επίπεδο έκφρασης απουσία ZNF395 (** ρ & lt? 0,01)

Η Gene όνομα.? προσχώρηση

φορές ind

t-test

πλήρες όνομα.? λειτουργία

ιντερφερόνη ρυθμίζονται: IFIT1 /ISG56? NM_0186602.940.0087Interferon επαγόμενη πρωτεΐνη με tetratricopeptide επαναλήψεις 1, αντι-ιική δράση [38] IFI16? NM_0055311.510.0278Interferon επαγόμενη πρωτεΐνη 16, (Hin200), έμφυτη αισθητήρα για DNA, προκαλεί γήρανση [43] IFI44? NM_0064172.890.0280Interferon επαγόμενη πρωτεΐνη 44, αντι-πολλαπλασιαστική και αντι-ιική δράση [42] IFIT2 /ISG54? NM_0015471.60.044Interferon επαγόμενη πρωτεΐνη με επαναλήψεις tetratricopeptide 2, προκαλεί απόπτωση, αντι-ιική δράση [60] CARD6? NM_0325871.580.058Caspase προσλήψεις οικογένεια τομέα, μέλος 6, NF-ĸB ενεργοποιητή, που συνδέονται με καρκινώματα [61] SAMD9? NM_0176541.60.066Sterile τομέα άλφα μοτίβο που περιέχει 9? έμφυτη αντι-ιική παράγοντας, TNFα ανταποκρίνεται [62] Ο καρκίνος που σχετίζεται με: CALCOCO1? NM_0208981.670.0087Calcium δεσμευτική και διπλής ελίκωσης τομέα 1, μεταγραφικό συνενεργοποιητή με TCF /LEF και β-κατενίνης [58] MEF2C? NM_0023971.640.0087Myocyte 2C παράγοντας ενισχυτή, το δυναμικό ογκογονίδιο σε Τ οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία κυττάρων [57] PEG10? NM_0150681.570.0278Paternally εκφράζεται 10, συμμετοχή σε ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [63] MACC1? NM_1827621.590.0352Metastasis συνδέονται σε καρκίνο του παχέος εντέρου 1? συνδέεται με τη μετάσταση του καρκίνου του παχέος εντέρου [59] Άγνωστο: ARMCX6? NM_0190071.660.0435Armadillo επανάληψη περιέχουν, φυλοσύνδετη 6? unknownTable 2. ZNF395 επαγόμενη γονίδια, που προσδιορίζονται από μικροσυστοιχιών, εμπλέκονται στην έμφυτη ανοσοαπόκριση και του καρκίνου πρόοδο.

RNA καθαρίστηκε από τέσσερα επεξεργασμένα και μη επεξεργασμένα δείγματα κυττάρων, αντίστοιχα, αντίστροφη μεταγραφή και υβριδοποιήθηκαν με οκτώ ανεξάρτητες συστοιχίες ολιγονουκλεοτιδίων. Η μέση μεταβολή φορές και η τιμή q FDR για έλεγχος τ παρέχονται. Γονίδια στα οποία προκλήθηκε έκφραση περισσότερο από 1,5 φορές με ένα Q & lt? 0.05 παρατίθενται, συμπεριλαμβανομένου του αριθμού προσχώρησή τους και γνωστές λειτουργίες. CSV Λήψη CSV

Το εύρημα ότι έξι από τα γονίδια που προσδιορίζονται στην μικροσυστοιχία είναι γνωστές ρυθμιζόμενες γονίδια IFN συνεπαγόταν ρόλος του ZNF395 στην IFN-α-διαμεσολαβούμενη διέγερση αυτών των γονιδίων στόχων. Προκειμένου να αναλυθεί η συμβολή των ZNF395 εμείς παροδικά επιμολυσμένα κανονική RTS3b κυττάρων με έλεγχο siRNA (siControl), το οποίο κατευθύνεται έναντι του ογκογονιδίου HPV8E6 που δεν εκφράζεται σε αυτά τα κύτταρα, ή siRNA που στοχεύει ZNF395 (siZNF395) και επωάστηκαν τα κύτταρα 40h αργότερα με IFN-α για 6 ώρες. QRT-PCR αποκάλυψε ότι η έκφραση του ZNF395 δεν αλλοιώθηκε στα siControl επιμολυσμένα κύτταρα λόγω ΙΡΝ-α, υποδεικνύοντας ότι ZNF395 δεν ρυθμίζεται από αυτό το σήμα. Η ZNF395 ειδικό siRNA μειώνεται η έκφραση ZNF395 περισσότερο από 90% (Σχήμα 1 C). ΙΡΝ-α που προκαλείται από την έκφραση του ISG56 190 φορές στα κύτταρα ελέγχου. Μετά την επιμόλυνση του siRNA που στοχεύει ZNF395, η IFN-α-μεσολαβητική ενεργοποίηση επιτεύχθηκε μόνο 43-φορές. Το επίπεδο του mRNA για IFI44 αυξήθηκε 20 φορές από την ΙΡΝ-α, ενώ η καταστολή της ZNF395 έδωσε 7,4-φορές επαγωγή με ΙΡΝ-α. Αναλύσαμε επίσης την έκφραση του IFI16, η οποία μόνο ασθενώς προκαλείται στο μικροσυστοιχία παρουσιάζονται στον πίνακα 2. IFI16 μεταγραφές αυξήθηκαν 5-φορές σε απόκριση σε ΙΡΝ-α σε siControl επιμολυσμένα κύτταρα και σε κύτταρα όπου κατεστάλη ZNF395, ΙΡΝ-α ενεργοποιημένων 2,2 φορές σε (Σχήμα 1 C). Έτσι, η έλλειψη ZNF395 απομείωση έντονα την IFN-α-διαμεσολαβούμενη επαγωγή της ISG56, IFI44 και IFI16 στα επιθηλιακά κύτταρα RTS3b. Επιβεβαιώσαμε τη συμβολή της ZNF395 στην IFN-α-εξαρτώμενη διέγερση της έκφρασης ISG56 και IFI44 στο αστροκύτωμα κυτταρική γραμμή U87-MG. Επιλέξαμε αυτό το κυτταρική γραμμή από το Μουράτ et al. ανέφεραν ότι ZNF395 επάγεται μετά από υποξία σε κύτταρα U87-MG [5]. Η καταστολή των ZNF395 με siRNA μείωσε το βασικό επίπεδο μεταγραφημάτων για ISG56 και IFI44 κατά περίπου 40 και 50%, αντίστοιχα, στα μη διεγερμένα κύτταρα (Σχήμα 1 D). Η έκφραση ISG56 επάχθηκε 15 φορές στα κύτταρα ελέγχου και 12-φορές σε siZNF395-επιμολυσμένα κύτταρα με ΙΡΝ-α, ενώ η έκφραση IFI44 αυξήθηκε μόνο 2-φορές, λόγω ΙΡΝ-α, και 1,6 φορές όταν ZNF395 χτυπήθηκε κάτω . IFI16 ήταν μόλις ενεργοποιηθεί ανεξάρτητα αν ZNF395 ήταν παρών ή όχι. Έτσι, οι συνολικές επιδράσεις της ΙΡΝ-α, καθώς και η knockdown του ZNF395 ήταν ασθενέστερη σε U87-MG σύγκριση με τα κύτταρα RTS3b. Παρ ‘όλα αυτά, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι ZNF395 απαιτείται για την πλήρη απόκριση IFN-α για να επάγει την έκφραση του IFI44, ISG56 και IFI16.

ZNF395 απαιτεί περιοχή CR3 δέσμευσης DNA του και τα δύο ISREs να διεγείρει τον προαγωγό ISG56

Για να ερευνηθεί ο ρόλος του ZNF395 στην επαγωγή ISG56, αναλύσαμε ανασυνδυασμένη ZNF395 σε δοκιμές μεταβατικής μεταμόλυνσης με ένα κατασκεύασμα ανταποκριτή που περιέχει 654bp της περιοχής ανάντη έλεγχο των ISG56 που περιλαμβάνει τον προαγωγό. Η υπερέκφραση του ZNF395 προκάλεσε την ISG56 προαγωγό 4 φορές, το οποίο είναι στην περιοχή που παρατηρείται στην μικροσυστοιχία (Εικόνα 2Α). Εμείς προσδιορίζονται οι περιοχές στις ZNF395 που απαιτούνται για την ενεργοποίηση του υποκινητή ISG56. Η CR3 του ZNF395 είναι απαραίτητη για ειδικής αλληλουχίας DNA-δέσμευσης σε ένα CG-πλούσιο στοιχείο παρόν σε HPV8 και στο γονίδιο της νόσου Huntington υποκινητή [22,23]. ZNF395mtCR3, με σημειακές μεταλλάξεις κατάργηση σύνδεση με τον υποκινητή HPV8 DNA [23] χάσει την ικανότητά του να ενεργοποιεί την έκφραση ISG56-Luc. Επιπλέον, ZNF395ΔCR1, που δεν έχει την περιοχή CR1, απέτυχε να ενεργοποιήσει. Πυρηνική-κυτταροπλασματική παλινδρόμηση των ZNF395 φάνηκε να απαιτούν ένα σήμα πυρηνικής εξαγωγής (NES) που βρίσκεται εντός του CR1 [22,23]. Προκειμένου να γίνει διάκριση μεταξύ του ρόλου του NES και το CR1, εισαγάγαμε δύο σημειακές μεταλλάξεις για να καταστρέψει τα NES. ZNF395mtNES ενεργοποιημένο τον υποκινητή ISG56 έως 10 φορές (Σχήμα 2Α). Έτσι, τα υπολείμματα παρόν σε CR1 που ασχολούνται με ZNF395 μεσολάβηση της ενεργοποίησης της μεταγραφής η οποία δεν εξετάστηκε περαιτέρω εδώ. Όσο υψηλότερη είναι η ενεργοποίηση του ZNF395mtNES συσχετίζεται με την αποκλειστική πυρηνική εντόπιση του ZNF395mtNES (μη δημοσιευμένα αποτελέσματα) [22]. Η έκφραση των μεταλλαγμένων πρωτεϊνών έχει προηγουμένως δειχθεί [23,25]. Για να επιβεβαιώσει αυτές τις ενεργοποιήσεις, θα αποκαλύψει μια επίδραση των ενδογενών ZNF395 σχετικά με τη δραστηριότητα υποκινητή που λαμβάνεται με ISG56-Luc με παροδικά συν-επιμόλυνση siZNF395 ή siControl με το κατασκεύασμα αναφοράς ISG56 Luc. Η καταστολή των ZNF395 οδήγησε σε μείωση κατά 20% της δραστικότητας Luc σε RTS3b και κύτταρα C33A, αντίστοιχα (Σχήμα 2Β). Εκτοπικά εξέφρασε ZNF395 ήταν επίσης σε θέση να ενεργοποιήσει την παρούσα υποστηρικτής IFI44 σε ένα κατασκεύασμα ανταποκριτή. Αυτό περιλαμβάνεται 590bp ανοδικά της θέσης έναρξης με δύο επικαλυπτόμενα ISREs από pos. -46 Έως -64 που είχαν χαρτογραφηθεί προηγουμένως να μεσολαβήσει στην επαγωγή με ΙΡΝ-α και ΙΡΝ-β [37]. Και πάλι, ZNF395mtNES έδειξαν αυξημένη ενεργοποίηση, αν και τα συνολικά αποτελέσματα ήταν μικρότερα σε σύγκριση με ISG56-Luc (Σχήμα 2C).

(Α) κύτταρα RTS3b σπάρθηκαν σε έξι φρεατίων και επιμολύνθηκαν παροδικά με 500ng του ISG56- Luc κατασκεύασμα ανταποκριτή και αυξανόμενες ποσότητες (5, 10, 20 ng) του φορέα έκφρασης για FLAG-ZNF395 ή τις διάφορες μεταλλάξεις ανά φρεάτιο, όπως υποδεικνύεται. Η δομή του ZNF395 με διατηρημένες περιοχές του CR1, CR2 και CR3 απεικονίζεται κάτω από τις γραφικές παραστάσεις που περιλαμβάνουν την αλληλουχία των Ο-τερματικών 25 αμινοξέων, τα οποία διατηρούνται στην Ε-ουρά του TCF-1Ε και TCF-4E [52]. Ο Μ σε θέση. 169 και 172 αλλάχθηκαν σε Α σε mtNES ενώ σε ΔCR1 διαγράφηκαν τα αμινοξέα από 165 έως 188. Τα αμινοξέα που μεταλλάχθηκαν σε mtCR3 και οδηγεί σε απώλεια της δέσμευσης DNA υποδεικνύονται. (Β) RTS3b και C33A κύτταρα επιμολύνθηκαν με πρώτα siControl ή siZNF395 και 24 ώρες αργότερα με το κατασκεύασμα ανταποκριτή ISG56-Luc. Όλες οι γραφικές παραστάσεις αντιπροσωπεύουν τα αποτελέσματα από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. Οι τυπικές αποκλίσεις δίνονται. κύτταρα (C) RTS3b διαμολύνθηκαν παροδικά με το κατασκεύασμα ανταποκριτή λουσιφεράσης που περιέχει τον προαγωγό IFI44-συμπεριλαμβανομένων βάσεων 560bp ανοδικά της θέσης έναρξης. Το τμήμα φιλοξενεί δύο επικαλυπτόμενα ISREs, τα οποία έχει αποδειχθεί ότι προκαλεί την IFN-εξαρτώμενη επαγωγή IFI44. Ο φορέας έκφρασης για ZNF395 και ZNF395mtNES συν-επιμολύνθηκαν όπως στο Α

Η

Στη συνέχεια καθορίζονται οι απαιτήσεις αλληλουχίας ZNF395 στον υποκινητή ISG56. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, αν και μειώνει ελαφρώς δραστικότητα, η απομάκρυνση των αλληλουχιών έως -117 δεν εξαλειφθεί η ενεργοποίηση από ZNF395. Η διαγραφή του τμήματος από -117 έως -93 δραματικά μείωσε την βασική δραστικότητα του υποκινητή, και εξάλειψε κάθε διέγερση από υπερεκφρασμένο ZNF395. Αυτό το τμήμα DNA φιλοξενεί τα στοιχεία ΙΡΝ-διεγερμένα-απόκρισης (ISRE) I και ISREII που μεσολαβούν επαγωγή ISG56 από IRF3 και ΙΡΝ-α ευαίσθητος παράγοντας μεταγραφής ISGF3 [38]. Δύο σημειακές μεταλλάξεις εντός των ISREs, οι οποίες φαίνεται να εξαλείψουν την δυνατότητα ανταπόκρισης σε IRF3 [30] και σε ΙΡΝ-α (τα δεδομένα δεν φαίνονται) κατήργησε την ενεργοποίηση από υπερέκφραση ZNF395 (Σχήμα 3Β), αποδεικνύοντας ότι ZNF395 δρα μέσω ενός ή αμφοτέρων ISRE στοιχεία. Με δύο τροποποιημένα κατασκευάσματα περιέχουν είτε δύο αντίγραφα του ISREII (ISG56-2x ISREII) ή δύο αντίγραφα του ISREI (ISG56-2x ISREI), ZNF395 λαμβάνεται το ήμισυ της ενεργοποίησης σε σύγκριση με τον υποκινητή wt. Οι τροποποιήσεις αυτές δεν επηρεάζουν σημαντικά IRF3-5D, μια συστατική ενεργό μεταλλαγμένο της IRF3 [31], υπό την ιδιότητά της να αυξήσει λουσιφεράσης-δραστηριότητα (Σχήμα 3C). Έτσι, η σύνθεση αλληλουχίας του ISREI και -II που υπάρχουν στον υποκινητή wt είναι η βέλτιστη για ZNF395 για ενεργοποίηση. Για να ελεγχθεί αν ZNF395 βρίσκεται στην ενδογενή υποκινητή ISG56, εκτελέστηκε ένας προσδιορισμός τσιπ με κύτταρα RTS3b-TR-FLAG-ZNF395. Η ποσότητα του θραύσματος που περιέχει τα ISG56 ειδικά ISREs οποίο τραβιέται προς τα κάτω από την FLAG-αντισώματος από τα εκχυλίσματα προσδιορίστηκε με qPCR. Με εκχυλίσματα από κύτταρα που αναπτύσσονται παρουσία του Dox να επάγει την έκφραση του FLAG-ZNF395, το αντίσωμα FLAG καταβυθίζεται 288% της εισόδου (+ Dox, Σχήμα 3D), που αντιπροσωπεύει ένα 2,3-πλάσια αύξηση σε σύγκριση με τον μάρτυρα IgG που ανακτήθηκε 127 % των εισροών. Για να επιβεβαιώσετε ότι ZNF395 μπορεί να συνδεθεί άμεσα με τις ISREs, πραγματοποιήσαμε αλλαγές gel. καθαρίστηκε ZNF395-tagged His μετατοπίζεται ένα ραδιοσημασμένο ολιγονουκλεοτίδιο που κωδικοποιεί τις δυο ISREs του υποκινητή ISG56 (ISRE-κ.β.). Παραδόξως, το ολιγονουκλεοτίδιο που κωδικοποιεί αυτά τα δύο ISREs με τις μεταλλάξεις Τ-G σε POS. 114 και 101 (ISRE-mut) ήταν εξίσου καλά δεσμευμένο και ήταν σε θέση να ανταγωνιστούν για την σύνδεση όταν προστεθεί σε περίσσεια (Σχήμα 3Ε). Η άμεση σύνδεση του ZNF395 επιβεβαιώθηκε με πυρηνικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν από τα κύτταρα RTS3b-TR-FLAG-ZNF395 είτε καλλιεργούνται με ή χωρίς Dox και ροΙγΙ: C, ένα μιμητικό του dsRNA, αντίστοιχα. Μια εξέχουσα ζώνη ήταν ορατή με όλα τα εκχυλίσματα, ανεξάρτητα από ροΙγΙ: C και Dox. Τα ομόλογα ISG56-ISRE-wt ολιγονουκλεοτίδιο, αλλά όχι η μεταλλαγμένη ISRE-mut ολιγονουκλεοτίδιο ήταν σε θέση να ανταγωνιστεί αυτή την πολύπλοκη. Κατά την επαγωγή της έκφρασης ZNF395 με Dox, ένα πρόσθετο αμυδρή ζώνη μεταναστεύει μόλις πάνω από το μείζον σύμπλεγμα εμφανίστηκε (Σχήμα 3Ε, διαδρομές 9, 12). Αυτό το συγκρότημα εξαφανίστηκε με την παρουσία μιας περίσσειας μη επισημασμένου ISRE WT-καθώς ολιγονουκλεοτίδιο ISRE-mut. Δεδομένου ότι αυτή η μπάντα μόνο ανιχνεύθηκε με εκχυλίσματα από κύτταρα που υπερεκφράζουν ανασυνδυασμένο ZNF395 και συμπεριφέρθηκε σαν καθαρίζεται ZNF395 σχετικά με την ιδιαιτερότητα ακολουθία, θα μπορούσε να αντιπροσωπεύει ZNF395 δεσμεύεται στους ISREs. Οι παρατηρήσεις αυτές υποδηλώνουν ότι ZNF395 βρίσκεται ακριβώς στα ISREs. Ωστόσο, η ιδιαιτερότητα ακολουθία που παρατηρείται με τις μεταβατικές επιμολύνσεις, δεν μπορεί να στηριχθεί σε δεσμευτικές ZNF395.

(Α) Διαδοχική διαγραφές ξεκινώντας από το 5 ‘άκρο του ανοδικού ρυθμιστική περιοχή ISG56 εισήχθησαν στο ISG56-Luc κατασκευή, όπως αναφέρεται στο σχήμα. Οι αντίστοιχες λουσιφεράσης κατασκευάσματα αναφοράς συν-επιμολύνθηκαν με 5, 10 και 20 ng του φορέα έκφρασης FLAG-ZNF395. Η σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης του πλήρους μήκους ISG56-Luc (= ISG56-654) κατασκεύασμα ορίστηκε ως 1. Οι αριθμοί πάνω από κάθε σετ αντιπροσωπεύουν τις ενεργοποιήσεις φορές επάγεται από ZNF395 με τη σχετική δραστικότητα εκάστου μεταλλαγμένου κατασκεύασμα ανταποκριτή οριστεί ως 1. (Β ) Η ISG56Δ117-93 κατασκεύασμα περιέχει μία διαγραφή των δύο ISREs στο πλαίσιο του πλήρους μήκους ISG56-Luc κατασκεύασμα που φιλοξενεί το ανάντη περιοχή μέχρι -654bp ενώ σε ISG56-mtISRE I /II ένα Τ σε κάθε ISRE έχει αλλάξει σε G, όπως αναφέρεται κάτω από τη γραφική παράσταση. Όλα τα κατασκευάσματα αναφοράς συν-επιμολύνθηκαν και πάλι με 5, 10 ή 20 ng του φορέα έκφρασης για FLAG-ZNF395. Η αλληλουχία των δύο ISREs υπάρχουν στον υποκινητή ISG56 με τις σημειακές μεταλλάξεις που έχουν εισαχθεί παρέχεται. (Γ) Παροδικές επιμολύνσεις με ISG56-Luc κατασκευάσματα ανταποκριτή που είχαν τροποποιηθεί ώστε να περιέχει είτε δύο αντίγραφα του ISRE Ι (ISG56-2x ISRE Ι) ή δύο αντίγραφα του ISRE II (ISG56-2x ISRE II) και 5ng του φορέα έκφρασης για ZNF395 ή IRF3-5D, αντίστοιχα. (D) τσιπ προσδιορισμού. κύτταρα RTS3b-TR-FLAG-ZNF395 αναπτύχθηκαν σε απουσία ή παρουσία Dox, διασυνδεδεμένη και υποβλήθηκαν σε μια δοκιμασία τσιπ με αντίσωμα έναντι του FLAG-tag και τον έλεγχο IgG ποντικού. Οι κατακρημνισθέντες τμήματα DNA ενισχύθηκαν με LightCycler χρησιμοποιώντας εναρκτήρες που πλευρίζουν τις ISREs του υποκινητή ISG56. Το κατασκεύασμα αναφοράς ISG56-Luc συμπεριλήφθηκε ως πρότυπο για να καταστεί δυνατή η ποσοτικοποίηση. Ο αριθμός αντιγράφων που λαμβάνονται για την είσοδο ορίστηκε ως μία για κάθε εκχύλισμα και ο εμπλουτισμός φορές υπολογίστηκε. Οι PCRs εκτελέστηκαν εις τριπλούν (* ρ = 0.05). ανάλυση μετατόπιση (Ε) Gel. Βακτηριακά εκφρασμένο επισύναψη His καθαρισμένων ΔΝ-ZNF395 (απουσιάζουν τα αμινοξέα 1-114) επωάστηκε με 200pg ISREI-wt (διαδρομές 1-4) ή ISRE-mut ολιγονουκλεοτιδίου (διαδρομές 5-7), και οι δύο ραδιενεργά σημασμένα με

32Ρ -γ-ΑΤΡ και η σύνδεση αναλύθηκε με ένα φυσικό ΡΑΑ πηκτή. Στις διαδρομές 3 και 6, 250-πλάσια περίσσεια μη επισημασμένου ISRE-wt και στις λωρίδες 4 και 7, του ISRE-mut ολιγονουκλεοτιδίου προστέθηκαν ως ανταγωνιστές. Στο μετατόπισης γέλης που απεικονίζεται δεξιά, πυρηνικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν από κύτταρα RTS3b-TR-FLAG-ZNF395, είτε επωάζεται απουσία ή παρουσία Dox και ροΙγΙ: C, όπως υποδεικνύεται, επωάστηκαν με σημασμένο ISRE-wt ολιγονουκλεοτιδίου και 250 φορές σε περίσσεια μη επισημασμένου ISRE-wt ή ISRE-mut ολιγονουκλεοτίδιο. Η θέση του υποτιθέμενου συγκρότημα ZNF395-ISRE υποδεικνύεται με ένα βέλος.

Η

σήματα ΙΚΚ ZNF395 για την υποβάθμιση του πρωτεασώματος

Τα αποτελέσματα που περιγράφηκαν μέχρι τώρα δείχνουν ότι ZNF395 απαιτείται για την πλήρη επαγωγή της ISG56, IFI44 και IFI16. Αυτοί οι παράγοντες IFN-διεγερμένα είναι γνωστό ότι είναι μέρος ενός αντι-ιικού έμφυτη ανοσοαπόκριση. Επιπλέον, ISG56 μπορεί να ενεργοποιηθεί άμεσα από IRF3 κατόπιν TLR3 σηματοδότησης σε απόκριση dsRNA. TLR3 εκφράζεται σε κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος και των επιθηλιακών κυττάρων, όπως είναι RTS3b (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Θελήσαμε να αναλυθεί η μοίρα του ZNF395 εντός αυτής της οδού από παροδικές επιμολύνσεις.