Αφηρημένο

Η έλλειψη ανοσογονικότητα των καρκινικών κυττάρων έχει εξεταστεί ένας σημαντικός λόγος για την αποτυχία τους στην επαγωγή μια όγκου ειδική απόκριση Τ κυττάρων. Σε αυτή την εργασία, παρουσιάζουμε στοιχεία ότι Decitabine (DAC), ένας αναστολέας μεθυλίωσης του DNA που χρησιμοποιείται σήμερα για τη θεραπεία του μυελοδυσπλαστικού συνδρόμου (MDS), οξεία μυελοειδή λευχαιμία (AML) και άλλα κακοήθη νεοπλάσματα, είναι ικανό να προκαλεί μια κατά του όγκου κυτταροτοξικών Τ λεμφοκυττάρων (CTL) απόκριση σε μοντέλο όγκου ποντικού EL4. C57BL /6 ποντίκια με καθιερωμένους όγκους EL4 υποβλήθηκαν σε αγωγή με DAC (1,0 mg /kg σωματικού βάρους) μία φορά την ημέρα για 5 ημέρες. Βρήκαμε ότι η θεραπεία είχε ως αποτέλεσμα DAC διείσδυση της ΙΡΝ-γ που παράγουν Τ λεμφοκυττάρων σε όγκους και προκάλεσε απόρριψη όγκου. Η εξάντληση των CD8

+, αλλά όχι CD4

+ Τ κύτταρα επανέλαβε την ανάπτυξη του όγκου. DAC-προκαλούμενη απόκριση CTL φάνηκε να προκαλείται από την επαγωγή της έκφρασης CD80 σε κύτταρα όγκου. Επιγενετικές στοιχεία δείχνουν ότι DAC επάγει την έκφραση CD80 σε κύτταρα EL4 μέσω απομεθυλίωσης των τόπων δινουκλεοτιδίου CpG στον προαγωγέα του γονιδίου CD80. Επιπλέον, δείξαμε επίσης ότι μια παροδική, χαμηλή δόση θεραπεία DAC μπορεί να επάγει την έκφραση του γονιδίου CD80 σε μία ποικιλία ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων. Η μελέτη αυτή παρέχει την πρώτη απόδειξη ότι επιγενετικές διαμόρφωση μπορεί να επάγει την έκφραση ενός μεγάλου μορίου Τ κυττάρου συνδιεγερτικά σε καρκινικά κύτταρα, τα οποία μπορούν να ξεπεράσουν ανοσοανοχής, και επάγουν μια αποτελεσματική αντινεοπλασματική απόκριση CTL. Τα αποτελέσματα έχουν σημαντικές επιπτώσεις στο σχεδιασμό της ΕΑΒ με βάση την ανοσοθεραπεία του καρκίνου

Παράθεση:. Wang L-X, Mei Ζ-Υ, Zhou J-H, Γιάο Υ-S, Li Υ-Η, Xu Y-H, et al. (2013) Low Dose Decitabine Θεραπεία επάγει την έκφραση CD80 σε καρκινικά κύτταρα και υποκινεί Tumor ειδικές αποκρίσεις κυτταροτοξικών λεμφοκυττάρων Τ. PLoS ONE 8 (5): e62924. doi: 10.1371 /journal.pone.0062924

Επιμέλεια: Fabrizio Mattei, Istituto Superiore di Sanità, Ιταλία

Ελήφθη: 5 του Δεκέμβρη 2012? Αποδεκτές: 26 Μαρτίου 2013? Δημοσιεύθηκε: May 9, 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Πρόγραμμα βασικής Έρευνας της Κίνας (2005CB522400), Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (90919044, 30971297, 81000221 και 81170518), υψηλής και νέας Προγράμματος Τεχνολογίας του PLA (2010gxjs091), Capital Ιατρική Ανάπτυξη Επιστημονικής Ταμείο Έρευνας (Αρ 2007-2040). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Μια σημαντική πρόκληση στην ανοσοθεραπεία του καρκίνου είναι το ανοσοποιητικό φοροδιαφυγής από τα καρκινικά κύτταρα [1]. Κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης και της εξέλιξης του όγκου, οι όγκοι δημιουργία μιας ανοσολογικής δίκτυο κατασταλτική, συμπεριλαμβανομένων των συναφών καρκινικά κύτταρα μυελοειδούς και διάφορα ρυθμιστικά Τ κύτταρα [2], [3]. Τα καρκινικά κύτταρα οι ίδιοι είναι γενετικά ασταθής? μπορούν να ρυθμίζουν προς τα κάτω μόρια μείζονος συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας (MHC) τάξης Ι [4], [5] και να χάσουν την έκφραση των αντιγόνων όγκου [6], [7], [8]. Επιπλέον, τα καρκινικά κύτταρα δεν εκφράζουν κανονικά κλειδί συνδιεγερτικά μόρια όπως CD80, αλλά μάλλον εκφράζουν κάποια συν-ανασταλτικών μορίων που καθιστούν αντιγόνο όγκου ανοχή ειδικών Τ κυττάρων [9]. Όλοι αυτοί οι παράγοντες εμποδίζουν την επαγωγή μιας αποτελεσματικής απόκρισης Τ κυττάρου σε όγκους. Έτσι, ξεπερνώντας το ανοσοποιητικό διαφυγή έχει μεγάλη σημασία στην ανοσοθεραπεία του καρκίνου.

Επιγενετικές στοιχεία δείχνουν ότι σε καρκινικά κύτταρα, είναι μερικά βασικά ανοσοδιεγερτικά μόρια DNA ρυθμίζεται από μεθυλίωση σε περιοχή υποκινητή τους. Μερικά πολύ γνωστά αντιγόνα όγκου όπως αντιγόνα καρκίνος όρχεων (CTA) ρυθμίζονται σχεδόν αποκλειστικά από μεθυλίωση του DNA [10], [11], [12], [13], [14], [15]. MHC τάξης Ι και μηχανήματα παρουσίαση αντιγόνου της έχουν επίσης δειχθεί ότι ρυθμίζεται από μεθυλίωση του DNA [16], [17], [18], [19]. Εκτός από CTAs και MHC μόρια, είναι επίσης προφανές ότι τα μόρια προσκόλλησης [16], [20], όπως ICAM-1 και LFA-3, και τα συν-διεγερτικά μόρια [19], [20], όπως CD40 και CD86 μπορεί να ρυθμιστεί με μεθυλίωση του DNA σε καρκινικά κύτταρα. Έτσι, παράγοντες που μπορούν να ρυθμίζουν προς τα πάνω έκφραση αντιγόνων όγκου απομεθυλίωση, MHC κατηγορίας Ι, και την προσκόλληση /συν-διεγερτικών μορίων σε καρκινικά κύτταρα θα πρέπει να είναι χρήσιμες στην ενίσχυση της ανοσογονικότητας του όγκου και την ευαισθησία τους στην ανοσολογική καταστροφή. Πράγματι, υπάρχει ένα σύνολο αποδεικτικών στοιχείων που δείχνουν τη θεραπεία απομεθυλίωση μπορεί να αυξήσει δραματικά την ευαισθησία των κυττάρων του καρκίνου στην καταστροφή από τα Τ κύτταρα [11], [15], [17], [21]. Ωστόσο, δεν υπάρχει άμεση

in vivo

ενδείξεις ότι η θεραπεία απομεθυλίωση του καρκίνου οδηγεί σε μια ειδική αντι-όγκου απόκριση των κυττάρων Τ.

Decitabine (DAC), ένα παράγοντα απομεθυλίωσης DNA [22], έχει πρόσφατα αναδειχθεί ως ένα ισχυρό θεραπευτικό για την θεραπεία των προ-λευχαιμικά αιματολογικής νόσου MDS [23], [24], με έδρα λευχαιμία [25], [26], [27] και τον προχωρημένο καρκίνο του πνεύμονα [28]. Χαμηλή δόση DAC μπορεί να προκαλέσει παρατεταμένη αποτελέσματα κατά του όγκου, ακόμη και μετά τη διακοπή της θεραπείας [24], [29], [30], υποδηλώνοντας ότι μια δραστική ανοσοαπόκριση μπορεί να προκληθεί σε ασθενείς υπό θεραπεία. Για να καθοριστεί εάν θεραπεία DAC μπορεί να επάγει αντινεοπλασματική ανοσοαποκρίσεις

in vivo

, μελετήσαμε την επίδραση της θεραπείας χαμηλής δόσης DAC σε ποντίκια με καθιερωμένους όγκους EL4 λεμφώματος κυττάρων Τ. Βρήκαμε ότι παροδικές και χαμηλής δόσης θεραπεία DAC είχε ως αποτέλεσμα την επαγωγή μιας αντικαρκινικής κυτταροτοξικών Τ λεμφοκυττάρων (CTL) απόκριση που διαμεσολαβείται υποχώρηση του όγκου. DAC-προκαλούμενη απόκριση CTL φαίνεται να προκαλείται από την επαγωγή της έκφρασης CD80 σε κύτταρα EL4. Επιπλέον, βρήκαμε επίσης ότι μια παροδική, χαμηλή δόση θεραπεία DAC μπορεί να επάγει την έκφραση του γονιδίου CD80 σε μία ποικιλία ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων. Η μελέτη αυτή παρέχει την πρώτη απόδειξη ότι επιγενετικές διαμόρφωση μπορεί να επάγει την έκφραση ενός μεγάλου μορίου Τ κυττάρου συνδιεγερτικά σε καρκινικά κύτταρα, τα οποία μπορούν να ξεπεράσουν ανοσοανοχής, και επάγουν μια αποτελεσματική αντινεοπλασματική απόκριση CTL.

Μέθοδοι

ποντίκια

C57BL /6 και CBF1 ποντίκια αγοράστηκαν από το Πεκίνο Vital-River Lab Animal Technology Co. Ltd. C57BL /6 συγγενή ποντίκια στέλεχος B6.SJL-Ptprc

α pepC

β /Boy-M (CD45.1

+) δόθηκαν από τον Dr. Chunfeng Qu (μέλος Βασικά Εργαστήριο Μοριακής Ογκολογίας, Cancer Institute /Νοσοκομείο, κινεζική Ακαδημία Ιατρικών Επιστημών, Πεκίνο, Κίνα). Όλοι οι ποντικοί διατηρήθηκαν σε κινέζικα PLA Γενικό Νοσοκομείο (CPGH) σε συγκεκριμένες συνθήκες χωρίς παθογόνα. Όλα τα πειράματα σε ζώα πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις εθνικές και τις κατευθυντήριες οδηγίες για τη φροντίδα των ζώων και εγκρίθηκαν από τη χρήση των ζώων και τη φροντίδα επιτροπής, CPGH.

Cell Culture και EL4 υποκλώνος Ίδρυση

Όλες οι κυτταρικές σειρές αρχικά ελήφθη από την American Type Culture Collection (ATCC). κύτταρα EL4 (λέμφωμα κυττάρων Τ /κυτταρική γραμμή λευχαιμίας ποντικού) καλλιεργήθηκαν και διατηρήθηκαν σε Μέσο Eagle Τροποποιημένο Μέσο (DMEM) συμπληρωμένο με 10% ορό ίππου απενεργοποιημένου με θερμότητα (Hyclone), 100 μg /ml πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη και L-γλουταμίνη. Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C σε 5% CO

2. EL4 υποκλώνοι με τη χρησιμοποίηση περιοριστικής αραιώσεως σε πλάκες καλλιέργειας των 96 φρεατίων με στρογγυλό πυθμένα ιστός με βάση την έκφραση CD80. Δύο EL4 υποκλώνοι, δηλ EL4 C45 με υψηλή έκφραση του CD80, και EL4 C3 χωρίς έκφραση του CD80, χρησιμοποιήθηκαν για αυτή τη μελέτη. Το ανθρώπινες κυτταρικές σειρές λευχαιμίας Κ562 (κυτταρική γραμμή που λαμβάνεται από έναν ασθενή με χρόνια μυελογενή λευχαιμία σε βλαστική κρίση), υ937 (οξεία μυελογενής λευχαιμία, Μ5), ΤΗΡ-1 (οξεία μυελογενής λευχαιμία, Μ5), ΝΒ4 (οξεία μυελογενής λευχαιμία, M3) , Kasumi-1 (οξεία μυελογενής λευχαιμία, Μ2), Molt-4 (Τ-κυττάρων οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία), Hut-78 (λέμφωμα κυττάρων Τ) και Raji (λέμφωμα Burkitt) αναπτύχθηκαν και διατηρήθηκαν σε RPMI-1640 (Hyclone) μέσο συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου.

In vitro και in vivo θεραπεία με Decitabine

Decitabine (DAC, Xian-Janssen Pharmaceuticals Ltd, Κίνα) διαλύθηκε σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) (ρΗ 7,4) για να ληφθούν 100 μΜ αποθέματα και αποθηκεύτηκαν στους -20 ° C. Για

in vitro μελέτες

, DAC προστέθηκε στο μέσο κυτταρικής καλλιέργειας σε μια τελική συγκέντρωση των 0.25 μΜ για 72 ώρες. Η ίδια συγκέντρωση της κυτιδίνης (Sigma) σε PBS ή PBS μόνο προστέθηκε σε κύτταρα ως θεραπεία ελέγχου. 24 ώρες μετά τα κύτταρα θεραπεία συλλέχθηκαν για περαιτέρω μελέτη. Για

in vivo μελέτες με τη χρήση

DAC, ποντίκια με καθιερωμένους όγκους EL4 εγχύθηκαν με DAC (1,0 mg /kg σωματικού βάρους σε 200 μΐ PBS) ή PBS ί.ρ. μία φορά την ημέρα για 5 διαδοχικές ημέρες. Οι ποντικοί θυσιάστηκαν 7-10 ημέρες μετά την ολοκλήρωση της φαρμακευτικής αγωγής και οι όγκοι αποκόπηκαν υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για ενδοδιηθητικά όγκου λεμφοκύτταρα ανάλυση (ΤΙΕ).

Αντίστροφη Μεταγραφή-PCR (RT-PCR)

Ολικό RNA εκχυλίστηκε από DAC-επεξεργασμένο ή αγωγή με όχημα EL4 κύτταρα και άλλα κύτταρα του ανθρώπου λευχαιμία και λέμφωμα χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. RT διεξήχθη χρησιμοποιώντας Reverse Transcription System (Promega) σε 1 μg συνολικού RNA, και ενισχύσεις PCR διεξήχθησαν στη συνέχεια χρησιμοποιώντας εκκινητές φαίνονται στον Πίνακα 1.Simultaneous ενίσχυση της γλυκεραλδεϋδο-3-φωσφορικής αφυδρογονάσης γονίδιο (GAPDH) χρησιμοποιώντας εκκινητές για το ποντίκι (προς τα εμπρός 5 «-GATGCCCCCATGTTTGT-3 ‘? αντίστροφη 5′-CCGTTCAGCTCTGGGATGA -3′) και ανθρώπους (προς τα εμπρός 5’-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3 ‘? αντίστροφη 5′-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3’) χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος για την ποσότητα και την ακεραιότητα των RNA που αναλύθηκαν. Όλα τα προϊόντα PCR αναλύθηκαν επί πηκτωμάτων αγαρόζης και οπτικοποιούνται με χρώση με βρωμιούχο αιθίδιο.

Η

Real Time PCR

Σε πραγματικό χρόνο PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα ΑΒΙ σύστημα αλληλουχία 7900-ΗΤ (PEApplied Biosystems , Carlsbad, CA, USA) χρησιμοποιώντας προηγουμένως προσδιορισθείσα συνθήκες [31]. κιτ SYBR Προμίγματα Ex Taq PCR (Takara Bio, Inc.) και οι ίδιοι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για την RT-PCR χρησιμοποιήθηκαν για την ενίσχυση P1A ποντίκι, Μελά, Magea4, CD80, CD79b, CD74, CD48, CD300a, CD3eap, CD274, CD247, CD180 και τα γονίδια GAPDH. Κάθε δείγμα αναλύθηκε εις τριπλούν και τα πειράματα επαναλήφθηκαν δύο φορές. Η σχετική ποσότητα του mRNA υπολογίστηκε με γραφική παράσταση της Ct (αριθμός κύκλος), και η μέση σχετική έκφραση για κάθε ομάδα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη συγκριτική μέθοδο (2

– △△ Ct).

Ογκογένεση

ποντίκια C57BL6 έγινε ένεση με διάφορες δόσεις (πιο συχνά με τη χρήση 1 × 10

4 κύτταρα /ποντίκι, sc) της DAC-θεραπεία ή έλεγχο κύτταρα EL4. Οι όγκοι των όγκων μετρήθηκαν ως ab

2/2 (α = μήκος? b = πλάτος) κάθε δύο με τρεις ημέρες. Για την πρόκληση λευχαιμίας ποντικού, τα ποντίκια ενέθηκαν με 2 χ 10

4 EL4 κύτταρα /ποντικό iv

In vivo CD8 + και CD4 + Τ κυττάρων εξάντληση

C57BL /6 ποντικοί εγχύθηκαν με 400 μg του αντι-CD4 (κλώνος GK 1.5? BioXcell, ΝΗ, USA) ή αντι-CD8 (κλώνος 53-6.72? BioXcell, ΝΗ, USA) μονοκλωνικά αντισώματα ip κάθε 4 ημέρες αμέσως μετά τη θεραπεία με DAC. Οι ποντικοί ελέγχου υποβλήθηκαν σε αγωγή με καθαρισμένη αρουραίου IgG2b ή IgG2a, αντιστοίχως (BioXcell, ΝΗ, USA). Οι επιδράσεις εξάντλησης εκτιμήθηκαν στο τελικό σημείο του πειράματος με χρώση των κυττάρων σπλήνας και του όγκου για CD4 και CD8 χρησιμοποιώντας αντι-CD4 (RM4.4) και αντι-CD8 (5H10-1) mAbs (eBioscience), που ακολουθείται από ανάλυση κυτταρομετρίας ροής .

αντισώματα και ροής Ανάλυση κυτταρομετρίας

Όλα τα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν αγοράστηκαν από την BD Biosciences (San Diego, CA) ή eBioscience (San Diego, CA). Για χρώση των δεικτών κυτταρικής επιφάνειας, κύτταρα (καρκινικά κύτταρα, τα σπληνοκύτταρα και αιωρήματα απλών κυττάρων όγκων) βάφτηκαν με αντισώματα (FITC-, ΡΕ-, την APC ή Percp- σημασμένο CD80, CD4, CD8a, CD3, ΝΚ1.1, IFN -γ, και αντισώματα ελέγχου ισοτύπου) σε ρυθμιστικό χρώσης (PBS με 1% FCS) σε πάγο για 30 λεπτά. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε 1% παραφορμαλδεϋδη σε PBS. Για την ανίχνευση της ενδοκυτταρικής κυτοκινών, τα κύτταρα διεγείρονται

in vitro

με ΡΜΑ (100 ng /ml) και ιονομυκίνη (1000 ng /ml) για 5 ώρες. Golgi

Διακοπή (BD Pharmingen, ΗΠΑ) προστέθηκε (1/1500) κατά τη διάρκεια των τελευταίων 2 ώρες επώασης. Τα κύτταρα πρώτα κηλιδώθηκαν για τους δείκτες επιφάνειας κυττάρου όπως CD4 ή CD8, ακολουθούμενο από ένα πρότυπο ενδοκυτταρικής διαδικασία χρώσης κυτοκίνης για την ΙΡΝ-γ. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας ένα FACSCalibur® κυτταρόμετρο ροής και τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό FlowJo (Tree Star, Inc., OR).

γονιδιακής έκφρασης μικροσυστοιχιών Ανάλυση

Το συνολικό RNA εξήχθη από DAC- αντιμετωπίζονται και τα κύτταρα EL4 αγωγή με όχημα χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. cDNA επισημασμένο με μια φθορίζουσα χρωστική (Cy5 και Cy3-dCTP) δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας CapitalBio cRNA Ενίσχυση και Kit Επισήμανση (CapitalBio, Πεκίνο, Κίνα). SmartArray (CapitalBio, Πεκίνο, Κίνα) τσιπ που περιέχει περίπου 25.000 γονίδια ποντικού σε υβριδισμό με επισημασμένο cDNA ανιχνευτές σε ένα σύστημα GeneChip. Συστοιχίες σαρώθηκαν με ένα ομοεστιακό σαρωτή LuxScan ™ και οι εικόνες που ελήφθησαν ήταν στη συνέχεια αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας LuxScan ™ 3.0 λογισμικό (δύο από CapitalBio, Πεκίνο, Κίνα). Σημασία Ανάλυση των μικροσυστοιχιών (SAM) διεξήχθη για να προσδιοριστεί διαφορικά εκφρασμένα γονίδια

Bisulfite Sequencing

Η κατάσταση μεθυλίωσης των CpG δινουκλεοτιδίων εντός δύο περιοχών (ολιγο 1:. Νουκλεοτίδιο -792 έως -335, oligo2: νουκλεοτίδιο -151 έως 258), σε σχέση με το 5 ‘άκρο του γονιδίου CD80, αναλύθηκε. Γενωμικό DNA παρασκευάσθηκε από EL4 υποκλώνους EL4 C3 (CD80

-) και EL4 C45 (CD80

+), όχημα ή κύτταρα EL4 DAC επεξεργασμένα χρησιμοποιώντας τον Οδηγό Genomic DNA Purification Kit (Promega Inc, USA). Για υποκλωνοποίηση και ανάλυση αλληλουχίας των επιμέρους αλληλόμορφα, κατεργασμένου με όξινο θειώδες γονιδιωματικό DNA ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ διθειώδους Epitect (Qiagen, Germany) χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα ζεύγη εκκινητών: θραύσμα 1 (προς τα εμπρός 5′-GGGTATTTTTTTAAAAGAAGAGA-3 ‘? Αντίστροφη 5’-AATCCTACAAAAACATCAATCAAC-3 ‘), θραύσμα 2 (προς τα εμπρός 5′-GGTTGGGTGGGAATTATTTTATT-3′? αντίστροφη 5’-ACTTAAACACCTCCTAAACTCACA-3 ‘)

Τα προϊόντα PCR καθαρίστηκαν επί πηκτής και κλωνοποιήθηκε μέσα στον φορέα ρΟΕΜ-Τ (Promega Inc, ΗΠΑ. ). Οι εισαχθεί θραύσματα PCR ξεχωριστών κλώνων αλληλουχήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα αναλυτή αλληλουχίας ΑΒΙ PRISMDNA (Applied Biosystems, USA).

αντίδραση ανάμικτων λεμφοκυττάρων και CD80 αποκλεισμός

T κύτταρα που συλλέγονται από σπλήνα και λεμφαδένες του EL4- ανοσοποιημένους ποντικούς BALB /c χρησιμοποιήθηκαν ως κύτταρα αποκριτές. DAC ή όχημα-επεξεργασμένα κύτταρα EL4 ακτινοβολείται με ακτίνες Χ (14 Gy) χρησιμοποιήθηκαν ως διεγερτικά κύτταρα. κύτταρα ανταπόκρισης και διεγερτικά κύτταρα επωάστηκαν σε τρυβλία 96 φρεατίων σε αναλογία 8:01, 4:01, 2:01 και 1:01, και καλλιεργήθηκε στους 37 ° C σε 5% CO

2 για 6 ημέρες. πολλαπλασιασμός των Τ-κυττάρων εκτιμήθηκε με Καταμέτρηση κυττάρων Kit-8 (Dojindo, Kumomoto, Japan) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, μετά από επώαση για 6 ημέρες στους 37 ° C, 10 μL υδατοδιαλυτό άλας τετραζολίου (WST) -8 προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο, και τα κύτταρα επωάστηκαν για άλλες 4 έως 6 ώρες στους 37 ° C. Η απορρόφηση του δείγματος στα 450 nm μετρήθηκε. Για αποκλεισμός CD80, αντι-CD80 (16-10Α1, eBioscience, San Diego, CA) ή ένα ισότυπο ελέγχου ταιριάζει IgG, (eBioscience, San Diego, CA) προστέθηκαν σε φρεάτια συγκαλλιέργειας σε μια τελική συγκέντρωση 5 μg /ml .

IL-2 και IFN-γ ELISA

τα υπερκείμενα των μικτών καλλιεργειών συλλέχθηκαν 72 ώρες μετά την συν-καλλιέργεια και αναλύθηκαν για IL-2 και ΙΡΝ-γ με χρήση κιτ ELISA (eBiosciences, San Diego, CA).

Στατιστικά

οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση λογισμικού GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., USA). t δοκιμή Student χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνει τις διαφορές όγκου του όγκου μεταξύ των δύο ομάδων. Για σύγκριση της επιβίωσης ποντικού, χρησιμοποιήθηκαν η ανάλυση επιβίωσης και log-rank test Kaplan-Meier. Ένα

P

αξία μικρότερη από 0,05 θεωρήθηκε σημαντική.

Αποτελέσματα

DAC Θεραπεία Αναστέλλει EL4 κυττάρων Ογκογένεση και οδηγεί σε παλινδρόμηση των εγκατεστημένων όγκων σε ποντίκια C57BL /6

για να δοκιμαστεί εάν η θεραπεία DAC επηρεάζει ογκογονικότητα των καρκινικών κυττάρων σε ποντίκια, τα κύτταρα EL4 υποβλήθηκαν σε αγωγή είτε με DAC (0,25 μΜ) ή κυτιδίνη (0,25 μΜ) ή όχημα (PBS) για 72 ώρες. Συμπεριλάβαμε κυτιδίνης σαν παράγοντας ελέγχου αφού DAC είναι το ανάλογο της κυτιδίνης. Επιπλέον, μια προηγούμενη μελέτη αποκάλυψε ότι νουκλεοτιδίων (Θυμιδίνη) θεραπεία είναι τοξικό για τα κύτταρα EL4 [32]. Βιώσιμα κύτταρα EL4 από τις προαναφερθείσες θεραπείες στη συνέχεια εγχέεται σε ποντικούς C57BL /6 υποδορίως (s.c.) σε έναν αριθμό από 1 × 10

4 κύτταρα /ποντικό. Σε αυτό τον αριθμό, κυτιδίνη και υπό αγωγή με όχημα EL4 κύτταρα σχημάτισαν όγκους σε όλες εγχυθεί ποντίκια και αναπτύχθηκαν προοδευτικώς? Σε αντίθεση, δεν παρατηρήθηκαν όγκοι σχηματίστηκαν σε ποντικούς που λαμβάνουν DAC-επεξεργασμένα κύτταρα EL4 (Σχήμα 1Α). EL4 όγκοι εγκατεστημένες σε C57BL /6 ποντίκια μόνο όταν χρησιμοποιήθηκαν πολύ μεγάλου αριθμού DAC-κατεργασμένων κυττάρων EL4 (8-16 φορές υψηλότερες δόσεις) (Σχήμα 1Β). Ενδοφλέβια ένεση του οχήματος-κατεργασμένων κυττάρων EL4 (1 × 10

4 κύτταρα /ποντικό) οδήγησε στην ανάπτυξη της επαγόμενης από EL4 λευχαιμία σε ποντικούς CBF1 και προκάλεσε τον θάνατο των ποντικών πλέον? Σε αντίθεση, δεν υπάρχουν ποντίκια που λαμβάνουν αυτόν τον αριθμό των DAC-κατεργασμένων κυττάρων EL4 πέθανε από λευχαιμία (Εικόνα 1 C). Για να ελεγχθεί αν

σε

vivo

ένεση του DAC θα μπορούσε να αναστείλει την ανάπτυξη των εγκατεστημένων όγκων, τα κύτταρα EL4 ενέθηκαν σε ποντικούς C57BL /6 s.c. Όταν οι όγκοι μεγάλωσαν σε μέγεθος περίπου 5 × 6 mm, που αυτοί οι ποντικοί υποβλήθηκαν σε αγωγή με DAC ή PBS i.p. ημερησίως για 5 διαδοχικές ημέρες. Σε αντίθεση με την προοδευτική ανάπτυξη του όγκου σε ποντίκια που έλαβαν φορέα, θεραπεία DAC προκαλείται συνεχής υποχώρηση του όγκου ακόμη και μετά τη θεραπεία DAC διεκόπη (Εικόνα 1D). Έτσι, DAC-επεξεργασμένα κύτταρα EL4 δείχνουν μειωμένη ικανότητα στην ογκογένεση, και παροδική θεραπεία της ΕΑΒ των ποντικιών με τα καθιερωμένα όγκους οδηγεί σε συνεχή υποχώρηση του όγκου.

(Α) κύτταρα EL4 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με DAC (0,25 μΜ σε μέσο καλλιέργειας) ή κυτιδίνης ή PBS για 72 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια εγχέεται σε κάθε ποντικό s.c. σε μία δόση 1 χ 10

4 κύτταρα /ποντικό. Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε σε δύο κατευθύνσεις κάθε δύο ή τρεις ημέρες. Ο όγκος του όγκου υπολογίζεται χρησιμοποιώντας τον τύπο: Όγκος = (L x Π

2) /2, όπου L = μήκος? W = πλάτος. *

P

& lt? 0.05 όταν DAC-θεραπεία σε σύγκριση με το PBS ή θεραπεία κυτιδίνης. Πέντε έως έξι ποντικοί χρησιμοποιήθηκαν σε κάθε ομάδα και τα δεδομένα ομαδοποιήθηκαν από δύο πειράματα. (Β) κύτταρα EL4 σε επεξεργασία με DAC ενέθηκαν σε ποντικούς C57BL /6 s.c. σε μία δόση 1 χ 10

4 κύτταρα /ποντικό (G1), 8 × 10

4 κύτταρα /ποντικό (G2) ή 16 × 10

4 κύτταρα /ποντικό (G3). PBS-κατεργασμένα κύτταρα EL4 (1 × 10

4 κύτταρα /ποντικό) χρησίμευσαν ως μάρτυρες. Ποντίκι δεδομένα επιβίωσης εμφανίζεται. Πέντε ποντικοί συμπεριελήφθησαν σε κάθε ομάδα και τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (C) DAC επεξεργασμένα ή PBS-επεξεργασμένα κύτταρα EL4 ενέθηκαν σε κάθε ποντικό ε.φ. σε μία δόση 1 χ 10

4 κύτταρα /ποντικό. επιβίωση Mouse παρακολουθήθηκε έως 100 ημέρες μετά την ένεση των κυττάρων του όγκου. Δέκα ποντίκια ανά ομάδα χρησιμοποιήθηκαν και τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (D) Τα ποντίκια με καθιερωμένους όγκους EL4 υποβλήθηκαν σε αγωγή με DAC ή PBS i.p. για 5 διαδοχικές ημέρες ξεκινώντας την ημέρα 10. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών πειραμάτων. Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν στατιστική σημαντικότητα του

P

& lt?. 0.05

Η

Αντιδράσεις CTL ΕΑΒ Θεραπεία Προκαλεί αντι-όγκου

Το γεγονός ότι η παροδική θεραπεία ΕΑΒ οδήγησαν σε επίμονες όγκου παλινδρόμησης υποδεικνύει ότι η αγωγή DAC θα μπορούσε να επάγεται κατά του όγκου ανοσοαποκρίσεων. Για να ελεγχθεί αυτή η πιθανότητα, C57BL /6 ποντίκια με καθιερωμένους όγκους EL4 υπέστησαν αγωγή με DAC όπως περιγράφεται ανωτέρω (Σχήμα 1 D). Επτά έως δέκα ημέρες αργότερα, τα ποντίκια θυσιάστηκαν, και τα μονοπύρηνα κύτταρα από όγκους υπέστησαν βαφή για CD4, CD8 και ΝΚ1.1 /CD3, ακολουθούμενη από ανάλυση μέσω κυτταρομετρίας ροής. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, όγκοι από ποντικούς DAC-αγωγή είχαν σημαντικά αυξημένους αριθμούς CD8

+ και CD4

+ Τ κυττάρων σε σύγκριση με όγκους από ποντικούς υπό αγωγή με όχημα? ΝΚ1.1

+ CD3

– ΝΚ κυττάρων ήταν μόλις ανιχνεύσιμη σε όγκους από DAC-αγωγή και αγωγή με PBS ποντικούς (Σχήμα 2Α, Β). Οι όγκοι από ποντικούς DAC-αγωγή περιείχε υψηλότερους αριθμούς ΙΡΝ-γ παραγωγή CD8 + Τ κυττάρων σε σύγκριση με όγκους από ποντικούς υπό αγωγή με όχημα (Εικόνα 2C, D). Για να προσδιοριστεί εάν η αυξημένη αποκρίσεις Τ κυττάρων ήταν υπεύθυνοι για DAC επαγόμενη υποχώρηση του όγκου, C57BL /6 ποντίκια με καθιερωμένους όγκους EL4 αγωγή με DAC επίσης θεραπεία με αντι-CD8 ή αντισώματα αντι-CD4 ή συγγενή αντισώματα ελέγχου τους ε.π. Anti-CD8 ή θεραπεία αντι-CD4 οδήγησε σε πλήρη εξάντληση των CD8

+ ή CD4

+ κύτταρα από σπλήνες και όγκους (Σχήμα 3Α, C). Η εξάντληση των CD8

+ Τ κύτταρα (Σχήμα 3Β), αλλά όχι CD4

+ Τ κύτταρα (Σχήμα 3D), είχε ως αποτέλεσμα πιο επιθετική ανάπτυξη του όγκου σε διαφορετικά προστατεύονται ποντίκια. Έτσι, η κατεργασία DAC ποντικών με εγκατεστημένων όγκων που επάγεται CD8

+ Τ κυτταρική ανοσία κατά του όγκου.

(Α-Β) C57BL /6 ποντίκια με καθιερωμένους όγκους EL4 υποβλήθηκαν σε αγωγή με DAC (1 mg /kg σωματικού βάρους) ή PBS μία φορά την ημέρα για 5 διαδοχικές ημέρες. 7-10 ημέρες μετά την αγωγή, οι ποντικοί θανατώθηκαν, οι όγκοι συλλέχθηκαν, και διαχωριστεί κύτταρα όγκου υπέστησαν χρώση για την έκφραση των διαφόρων δεικτών κυτταρικής επιφάνειας, που ακολουθείται από κυτταρομετρία ροής για την ποσοτικοποίηση CD8

+, CD4

+ και ΝΚ1. 1

+ CD3

– κύτταρα. (Γ) Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής και ποσοτικοποίηση των ενδοκυτταρική παραγωγή ΙΡΝ-γ από διηθούν όγκο CD8

+ Τ κύτταρα. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν μέση τιμή + SD? n = 3-7 ποντικούς ανά ομάδα. (Δ) Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της ενδοκυττάριας παραγωγής ΙΡΝ-γ από διηθούν όγκο CD4

+ Τ κύτταρα. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν μέση τιμή + SD? n = 3-7 ποντικούς ανά ομάδα. t δοκιμή Student χρησιμοποιήθηκε για τη στατιστική ανάλυση. Αριθμοί στα σχήματα κυτταρομετρίας ροής δείχνουν% θετικά κύτταρα που αντιστοιχούν σε κάθε πύλη.

Η

Τέσσερις δόσεις του αντι-CD8 ή αντι-CD4 αντίσωμα (400 μg /ανά ποντικό, ip) ενέθηκαν σε διαστήματα 4 ημερών ξεκινώντας από την ημέρα 1 μετά τη θεραπεία της ΕΑΒ. Τρία ποντίκια ανά ομάδα χρησιμοποιήθηκαν για το πείραμα που παρουσιάζεται. (Α) CD8

+ Τ κύτταρα σε σπλήνες και οι όγκοι αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής μετά αντι-CD8 αντίσωμα ή ένα αντίσωμα ελέγχου θεραπεία ισότυπο. (Β) Η ανάπτυξη του όγκου σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με αντι-CD8 ή ισότυπο mAb ελέγχου μετά τη χορήγηση DAC. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά δύο ανεξάρτητων πειραμάτων με παρόμοια αποτελέσματα. Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν στατιστική σημαντικότητα του

P

& lt? 0,05. (Γ) CD4

+ Τ κύτταρα σε σπλήνες και οι όγκοι αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής μετά αντι-CD4 αντίσωμα ή ένα αντίσωμα ελέγχου θεραπεία ισότυπο. (Δ) Η ανάπτυξη του όγκου των ποντικών που υπέστησαν αγωγή με αντι-CD4 ή ένα ισότυπο mAb ελέγχου μετά τη χορήγηση DAC. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά δύο ανεξάρτητων πειραμάτων με παρόμοια αποτελέσματα. Αριθμούς σε αριθμούς κυτταρομετρίας ροής δείχνουν% θετικά κύτταρα που αντιστοιχούν σε κάθε πύλη.

Η

DAC Θεραπεία Προκαλεί CD80 έκφραση σε καρκινικά κύτταρα

Από ΕΑΒ που προκαλείται από τη θεραπεία CTL αποκρίσεις σε όγκους EL4, υποθέσαμε ότι επεξεργασία DAC μπορεί να ρυθμίζουν το ανοσοποιητικό μόρια τόνωση που υπάρχει στα κύτταρα EL4, τα οποία μπορούν να διεγείρουν CTL αποκρίσεων σε ανοσοεπαρκή ποντίκια. Προγενέστερες μελέτες έχουν αναφέρει τα πάνω ρύθμιση μορίων MHC κατηγορίας και καρκινικά αντιγόνα με απομεθυλίωση παράγοντες [11], [17]. Ωστόσο, απέτυχε να ανιχνεύσει τα πάνω ρύθμιση του MHC τάξης Ι και τα μόρια κατηγορίας II σε DAC-κατεργασμένα κύτταρα EL4 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Για να διερευνήσουν περαιτέρω τους μηχανισμούς της ΕΑΒ που προκαλείται από την ασυλία του όγκου, συγκρίναμε την διαφορική έκφραση των γονιδίων σε DAC-επεξεργασμένα κύτταρα EL4 και τους ελέγχους χρησιμοποιώντας αναλύσεις cDNA μικροσυστοιχιών (GEO προσχώρηση # GSE38473) και διαπίστωσε ότι η θεραπεία της ΕΑΒ αλλάξει σημαντικά την έκφραση του γονιδίου προφίλ σε EL4 κυττάρων σε σύγκριση με τη θεραπεία με όχημα (Εικόνα S1 Α). Ένα σύνολο 847 ρυθμίζεται αυξητικά γονίδια ταυτοποιήθηκαν σε κύτταρα EL4 DAC επεξεργασμένα με τη χρήση της ανάλυσης SAM (σχ S1B). Μεταξύ των ρυθμισμένη προς τα πάνω γονίδια σε DAC-επεξεργασμένα κύτταρα EL4, 3 καρκινικά αντιγόνα όρχεις και 9 συστάδας διαφοροποιήσεως (CD) μόρια που περιλαμβάνουν CD80 (Β7-1), ένα ουσιαστικό Τ κυττάρων συν-διεγερτικό μόριο, ταυτοποιήθηκαν (Σχήμα 4Α). RT-PCR και qRT-PCR επαληθεύεται επίσης ρύθμιση προς τα πάνω τους (Σχήμα 4Β και 4C).

Το ποντίκι SmartArray chips υβριδοποιήθηκαν με RNA που προέρχεται από DAC ή PBS επεξεργασμένα κύτταρα EL4. (Α) Heatmap ορισμένων απορυθμίζεται γονιδίων με τη θεραπεία της ΕΑΒ. Στήλες αντιπροσωπεύουν δεδομένα μικροσυστοιχιών που λαμβάνονται από 3 ανεξάρτητες βιολογικές επαναλήψεις. (Β) RT-PCR χρησιμοποιήθηκε για την επικύρωση των up-ρυθμιζόμενα γονίδια. (C) qRT-PCR χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση πάνω ρυθμισμένα γονίδια στο DAC και PBS κατεργασμένα κύτταρα EL4.

Η

Για να προσδιοριστεί η εμμονή και σταθερότητα του DAC- επαγόμενη έκφραση CD80, τα κύτταρα EL4 καλλιεργήθηκαν σε μέσο που περιέχουν DAC (0,25 μΜ) ή PBS για 72 ώρες. DAC-επαγόμενη έκφραση CD80 σε κύτταρα EL4 επαληθεύτηκε τόσο mRNA (Σχήμα 5Α) και στο επίπεδο πρωτεΐνης (Σχήμα 5Β). Κινητική ανάλυση αποκάλυψε ότι η έκφραση CD80 κορυφώθηκε σε 3-5 ημέρες μετά τη θεραπεία της ΕΑΒ, και διατηρήθηκε σε υψηλά επίπεδα για περίπου 3 εβδομάδες και στη συνέχεια μειώθηκε στο επίπεδο βάσης (Σχήμα 5C). Για να ελέγξετε αν η θεραπεία DAC μπορεί να επάγει την έκφραση CD80

in vivo,

κύτταρα EL4 (CD45.2

+) ενέθηκαν υποδορίως σε ποντικούς C57BL /6 ή ί.ν. σε CD45.1 συγγενή ποντίκια. Δύο εβδομάδες αργότερα, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με DAC (1 mg /kg σωματικού βάρους, ί.ρ.) για 5 διαδοχικές ημέρες. Επτά έως 10 ημέρες αργότερα κύτταρα όγκου από DAC- και ποντικούς υπό αγωγή με όχημα εξετάστηκαν για έκφραση CD80. θεραπεία DAC σημαντικά επάνω ρυθμισμένη έκφραση CD80 σε κύτταρα EL4 από s.c. όγκοι (Σχήμα 5D, αριστερό πλαίσιο), καθώς και σε κύτταρα EL4 από κολοκύθια οστών (Σχήμα 5D, δεξιό πλαίσιο). Για να καθοριστεί εάν DAC επαγόμενη προς τα πάνω ρύθμιση του CD80 είναι ένα γενικό φαινόμενο, 6 ανθρώπινες κυτταρικές σειρές λευχαιμίας και 2 ανθρώπινες κυτταρικές σειρές λεμφώματος υπέστησαν αγωγή με DAC (1 μΜ για 72 ώρες) που ακολουθείται από ανάλυση RT-PCR. Τέσσερα από τα 5 CD80-αρνητικές κυτταρικές γραμμές (U937, ΤΗΡ-1, ΝΒ4 και Molt-4) έδειξε DAC-επαγόμενη έκφραση CD80, ενώ σε τρεις κυτταρικές γραμμές με την έκφραση προ-υπάρχοντος γονιδίου CD80 (Κ562, Hut-78 και Raji) , η επίδραση επαγωγής δεν ήταν προφανής (Σχήμα 5Ε).

(Α) κύτταρα EL4 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DAC (0,25 μΜ) ή PBS για 72 ώρες. RT-PCR χρησιμοποιήθηκε για να ανιχνεύσει έκφραση γονιδίου CD80 σε DAC και PBS κατεργασμένα κύτταρα EL4. Το γονίδιο GAPDH ήταν ταυτοχρόνως ενισχύθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της έκφρασης CD80 σε DAC-θεραπεία και PBS-επεξεργασμένα κύτταρα EL4. κύτταρα (C) EL4 υποβλήθηκαν σε αγωγή με PBS και DAC για 3 διαδοχικές ημέρες και διατηρήθηκαν σε καλλιέργεια. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν κάθε δύο ημέρες και βάφτηκαν με αντι-CD80 που ακολουθείται από ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. κύτταρα (D) EL4 (CD45.2) ενέθηκαν s.c. σε ποντικούς C57BL /6 ή ί.ν. σε CD45.1 συγγενείς C57BL /6 ποντίκια. ΕΑΒ χορηγήθηκε ε.π. 2 εβδομάδες αργότερα για 5 διαδοχικές ημέρες. κύτταρα EL4 από διαχωριστεί όγκοι (αριστερό πάνελ) και κολοκύθια οστών (ΒΜ) (δεξιός πίνακας) αναλύθηκαν για την έκφραση CD80 με κυτταρομετρία ροής. (Ε) Η επαγωγή της έκφρασης CD80 σε ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές. Τα καρκινικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DAC (0,25 μΜ) ή PBS για 72 ώρες. RT-PCR χρησιμοποιήθηκε για να καθοριστεί η έκφραση του γονιδίου CD80. Αριθμούς σε αριθμούς κυτταρομετρίας ροής δείχνουν% θετικά κύτταρα που αντιστοιχούν σε κάθε πύλη.

Η

ΕΑΒ Προκαλεί απομεθυλίωση της Περιφέρειας Διοργανωτή σε CD80 Gene

Για τον προσδιορισμό της υποκείμενης μηχανισμός με τον οποίο ΕΑΒ επάγει την έκφραση CD80 σε κύτταρα EL4, αναλύσαμε την αλληλουχία της περιοχής προαγωγού του CD80 ποντικού. Δεν υπήρχαν τυπικά CpG νησίδες στην περιοχή προαγωγού του CD80. Ωστόσο, 14 CpG δινουκλεοτίδια βρέθηκαν σε Exon1 και ανάντη 800 bp περιοχή (Σχήμα 6Α) του. Δύο ζευγάρια εκκινητών σχεδιάστηκαν για όξινο θειώδες ανάλυση αλληλουχίας των δύο θραυσμάτων που καλύπτουν το νουκλεοτίδιο -792 -335 να (F1), και το νουκλεοτίδιο -151 να 258 (F2). Εμείς πρώτα σύγκριση της κατάστασης μεθυλίωσης των CpG δινουκλεοτιδίων σε δύο θραυσμάτων από δύο EL4 υποκλώνους με ή χωρίς φυσική έκφραση του CD80 (Σχήμα 6Β). Στην F1, το 96% των CpG δινουκλεοτιδίων υπέστησαν μεθυλίωση σε CD80

– κύτταρα έναντι 67% το CD80

+ κύτταρα. Στην F2, το 92% των CpG δινουκλεοτιδίων υπέστησαν μεθυλίωση σε CD80

– κυττάρων σε σύγκριση με 6% το CD80

+ κύτταρα (Σχήμα 6C). επεξεργασία ΕΑΒ των κυττάρων EL4 προκάλεσε σημαντική αύξηση σε χώρους απομεθυλίωση τόσο F1 και F2 περιοχές (Σχήμα 6D). Μεταξύ DAC-επεξεργασμένα κύτταρα EL4,

+ κύτταρα CD80 εμφάνισαν περισσότερες περιοχές απομεθυλίωση σε σύγκριση με το DAC-αγωγή CD80

– κυττάρων (Σχήμα 6Ε). Έτσι, η έκφραση του γονιδίου CD80 στα κύτταρα EL4 συνδέεται στενά με το καθεστώς απομεθυλίωση της περιοχής του υποκινητή της και τη θεραπεία της ΕΑΒ αυξάνει σημαντικά απομεθυλίωση του CD80 υποκινητή.

(Α) Η κατανομή των CpG δινουκλεοτιδίων σε μια περιοχή 1 kb ανάντη της Το εξόνιο 1 του γονιδίου CD80. Οι αριθμοί αναφέρονται στη θέση σε σχέση με το 5 ‘άκρο του CD80. Επελέγησαν δύο CpG εμπλουτισμένο περιοχές (F1 και F2) για ανάλυση Bisulfite αλληλούχιση. (Β) Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της έκφρασης CD80 σε δύο παραλλαγές ΕΙ_4 (EL4C3 και EL4C45). Αριθμούς σε αριθμούς κυτταρομετρίας ροής δείχνουν θετικά κύτταρα% που αντιστοιχεί σε κάθε πύλη. (Γ) Bisulfite αλληλουχίας της περιοχής CD80 υποκινητή σε EL4C45 (άνω πάνελ) και EL4C3 (κάτω πίνακας). Ανοίξτε και μαύροι κύκλοι αντιπροσωπεύουν απομεθυλιωθεί και μεθυλιωμένα CpG θέσεις, αντίστοιχα. Η συχνότητα μεθυλίωσης σε CpG περιοχές κάθε κυτταρική σειρά που υποδεικνύεται. (Δ) Ανάλυση Bisulfite αλληλούχιση της περιοχής CD80 προαγωγού σε DAC- και PBS κατεργασμένα κύτταρα EL4. κύτταρα (Ε) EL4 πρώτα σε επεξεργασία με DAC ή PBS, CD80

+ και CD80

– EL4 κύτταρα στη συνέχεια ταξινομούνται κατά κυτταρομετρία ροής με βάση ταξινόμησης. ανάλυση όξινο θειώδες αλληλουχίας διεξήχθη σε DAC-θεραπεία, CD80

+ και CD80

-. κύτταρα EL4

Η

DAC που προκαλείται από CD80 έκφραση σε EL4 κύτταρα Πυροδοτεί αντι-όγκου CTL απόκρισης

για να καθοριστεί εάν DAC-επαγόμενη έκφραση CD80 σε κύτταρα EL4 ενεργοποιεί αποκρίσεις CTL κατά των όγκων, τα κύτταρα EL4 συν-καλλιεργήθηκαν με DAC για 72 ώρες. CD80

+ και CD80

– EL4 κύτταρα στη συνέχεια διαχωρίστηκαν με χρήση ροής υψηλής ταχύτητας κυτταρομετρία με βάση τη διαλογή για να ληφθεί υψηλής καθαρότητας CD80

+ και CD80

– κύτταρα EL4 (Σχήμα 7Α). Αυτά τα κύτταρα στη συνέχεια εγχέεται C57BL /6 ποντίκια (2 × 10

4 κύτταρα /ποντικό s.c.). Όλα τα ποντίκια που έλαβαν CD80

– κύτταρα EL4 μεγάλωσε όγκους, ενώ η πλειοψηφία (60-80%) των ποντικών που έλαβαν DAC-αγωγή CD80

+ κύτταρα EL4 απέτυχαν να αναπτυχθούν όγκου. Σε ορισμένες περιπτώσεις, CD80

+ EL4 όγκοι αναπτύχθηκαν παροδικά ή αυξήθηκε αργότερα (Σχήμα 7Β). CD80

+ EL4 όγκοι περιείχαν πολύ μεγαλύτεροι αριθμοί CD8

+ και CD4

+ Τ κυττάρων (Σχήμα 7C-E) σε σύγκριση με CD80

– EL4 όγκους. NK1.1

+ CD3

– ΝΚ κύτταρα ανιχνεύθηκαν μόνο σε ορισμένες περιπτώσεις CD80

+ όγκους EL4 αλλά όχι σε CD80

– EL4 όγκους (Σχήμα 7C, F). Έτσι, DAC-επαγόμενη έκφραση CD80 ενεργοποιεί ανοσία κατά του όγκου

in vivo

.

(Α) κύτταρα EL4 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DAC. CD80

+ και CD80

– κύτταρα EL4 διαχωρίστηκαν με κυτταρομετρία ροής με βάση ταξινόμησης. Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της έκφρασης CD80 σε κύτταρα EL4 πριν και μετά τη διαλογή δείχνεται. (Β) Η ανάπτυξη των όγκων κινητική της ΕΑΒ που έλαβαν CD80

+ και CD80

– κύτταρα EL4. 2 × 10

4 CD80

+ ή CD80

– DAC-επεξεργασμένα κύτταρα EL4 ενέθηκαν υποδορίως σε κάθε ποντικό. Η ανάπτυξη του όγκου σε μεμονωμένες ποντικού δείχνεται. (Γ) Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής των κυττάρων Τ και ΝΚ κυτταρική διήθηση σε CD80

+ και CD80

– όγκους. Ενιαία κυτταρικά εναιωρήματα των όγκων χρωματίστηκαν για CD4, CD8, CD3, ΝΚ1.1 που ακολουθείται από ανάλυση κυτταρομετρίας ροής.