Αφηρημένο

Ιστορικό

Ο μεταγραφικός παράγοντας Snail1 προκαλεί επιθηλιακών-to-μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT), μια διαδικασία που είναι υπεύθυνη για την απόκτηση της εισβολής κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης. Αρκετές transcriptomic μελέτες έχουν αναφέρει Snail1 ρυθμιζόμενα γονίδια σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων, πολλοί από αυτούς που εμπλέκονται στην κυτταρική προσκόλληση. Ωστόσο, λίγες μόνο μελέτες έχουν χρησιμοποιήσει πρωτεομική ως εργαλείο για τον χαρακτηρισμό των πρωτεϊνών που μεσολαβούν EMT.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

προσδιορίζονται από πρωτεομική ανάλυση χρησιμοποιώντας 2D-ΨΗΦΟ ηλεκτροφόρηση σε συνδυασμό με MALDI- TOF-TOF και ESI-γραμμικές παγίδα ιόντων φασματομετρία μάζας ένας αριθμός πρωτεϊνών με μεταβλητές λειτουργίες του οποίου η έκφραση διαμορφώνεται από Snail1 σε SW480-ADH ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. Η επαλήθευση εκτελέστηκε με αναλύσεις blot και ανοσοφθορισμό Western. Snail1 καταπιεσμένη αρκετά μέλη της οικογένειας του 14-3-3 /πρωτεϊνών σύνδεσης φωσφοθρεονίνη φωσφοσερίνη και επίσης την έκφραση της πρωτεΐνης που σχετίζεται με Πολλαπλασιασμού 2G4 (PA2G4) το οποίο εντοπίζεται κυρίως στους πυρηνικούς οργανισμούς Cajal. Αντίθετα, η έκφραση των δύο πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην επεξεργασία του RNA, η διάσπαση και η ειδικότητα πολυαδενυλίωσης παράγοντας υπομονάδα 6 (CPSF6) και ο παράγοντας Συγκόλληση προλίνη /γλουταμίνη πλούσια (SFPQ), ήταν υψηλότερη στις Snail1 κυττάρων που εκφράζουν από ότι στους ελέγχους. Η ρύθμιση του 14-3-3ε, 14-3-3τ, 14-3-3ζ και PA2G4 από Snail1 είχε αναπαραχθεί σε ΗΤ29 κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου. Επιπλέον, βρήκαμε μια αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ 14-3-3σ και της έκφρασης Snail1 στην ανθρώπινη παχέος όγκους.

Συμπεράσματα /Σημασία

Έχουμε εντοπίσει ένα σύνολο νέων πρωτεϊνών στόχων Snail1 στον καρκίνο του παχέος εντέρου ότι επεκτείνει τις κυτταρικές διεργασίες που επηρεάζονται από Snail1 και, συνεπώς, τη σημασία της για τη λειτουργία των κυττάρων και φαινότυπο

Παράθεση:. Larriba MJ, Casado-Vela J, Pendás-Franco Ν, Peña R, García de Herreros Α, Berciano ΜΤ, et al. (2010) Μυθιστόρημα Snail1 στοχεύουν πρωτεΐνες στον ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου που προσδιορίζονται από πρωτεομική ανάλυση. PLoS ONE 5 (4): e10221. doi: 10.1371 /journal.pone.0010221

Επιμέλεια: Juan Valcarcel, Centre de Regulació Genòmica, Ισπανία

Ελήφθη: 4 του Μαρτίου του 2010? Αποδεκτές: 26 Μαρ 2010? Δημοσιεύθηκε: 20 Απρ 2010

Copyright: © 2010 Larriba et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Ministerio Επιστημών e Innovación της Ισπανίας (SAF2007-60341, BIO2006-07689, ISCIII-RETIC RD06 /0020/0009 και RD06 /0020/0040), Comunidad de Madrid (S-GEN-0266/2006) και η της Ευρωπαϊκής Ένωσης (MRTN-CT-2005-019496, NucSys). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο μεταγραφικός παράγοντας Snail1 ρυθμίζει τη βιολογία των ινοβλαστών και ρύθμιση προς τα άνω του σε επιθηλιακά κύτταρα προκαλεί μια αλλαγή σε μια μεσεγχυματικά φαινότυπο, μια διαδικασία γνωστή ως επιθηλιακά-to-μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT). Αυτή είναι μια δια-μετατόπιση στο οποίο επιθηλιακά κύτταρα χάνουν συγκολλητικότητα και την πολικότητα και να αποκτήσουν τη μορφολογία άτρακτο και χαρακτηριστικές μεταναστευτικών ικανότητα των ινοβλαστών ως αποτέλεσμα μια δραστική μεταβολή στο προφίλ γονιδιακής έκφρασης [1], [2]. EMT παίζει σημαντικό φυσιολογικό ρόλο κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης και την επούλωση των πληγών, και είναι επίσης ζωτικής σημασίας για την απόκτηση των όγκων εισβολής, το αρχικό βήμα του μεταστατικού καταρράκτη στον καρκίνο [1], [2].

Snail1 φαίνεται να έχουν κύριο ρόλο στην EMT, αν και διάφοροι άλλοι παράγοντες, όπως η Snail2 (Slug), Zeb1 (δEF1), Zeb2 (Sip1), Twist1, Ε47 και Ε2-2 είναι επίσης γνωστό ότι επάγουν ή να συμβάλει στην EMT σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων [2 ], [3]. Αυτοί οι παράγοντες προάγουν μέρει διαφορετικά προφίλ γονιδιακής έκφρασης που έχουν κοινή την καταστολή των γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες προσκόλλησης (Ε-καδερίνης, occludin και αρκετές claudins) και την επαγωγή δεικτών μεσεγχυματικών όπως βιμεντίνης, ινωδονεκτίνη και πρωτεάσες και παράγοντες που προάγουν την κίνηση των κυττάρων [ ,,,0],3], [4]. Snail1 ήταν το πρώτο χαρακτηρισμένο καταστολέα του γονιδίου καταστολέα εισβολής

Cdh1

που κωδικοποιεί για την πρωτεΐνη κρίσιμο προσκόλλησης Ε-καδερίνης [5], [6]. Επιπλέον, Snail1 έχει πρόσφατα δειχθεί ότι ενεργοποιεί Wnt /β-κατενίνης και σηματοδότηση του πυρηνικού παράγοντα

δραστικότητα κάππα

B [7], [8], και καταργεί την αναστολή της Wnt /β-κατενίνης οδού που προκαλούνται από η αντικαρκινική ένωση 1α, 25-διυδροξυβιταμίνη D

3 [9].

Snail1 υπερεκφράζεται σε διάφορους ανθρώπινους καρκίνους και συχνά συνδέεται με διεισδυτικότητα, μεταστάσεις και φτωχή πρόγνωση [3]. Snail1 RNA δεν ανιχνεύεται στο φυσιολογικό βλεννογόνο του παχέος εντέρου, αλλά απορυθμίζεται σε 60-70% των καρκίνων του παχέος εντέρου [10] – [12]. Μια πρόσφατη μελέτη έχει δείξει ότι Snail1 πρωτεΐνη εκφράζεται στο 79% των όγκων του παχέος εντέρου, συνήθως στην μεσόφαση όγκο στρώματος. Snail1 βρίσκεται τόσο στο επιθηλιακό ιστό του όγκου και του παρακείμενου στρώματος σε 56% των όγκων του παχέος εντέρου, ενώ στο 21% των περιπτώσεων είναι παρούσα μόνο σε στρωματικά κύτταρα με ινοβλαστικά φαινότυπο [13].

Ένας αριθμός μελέτες έχουν επικεντρωθεί στην transcriptomic ανάλυση της ΕΜΤ προωθείται από Snail1 και άλλους παράγοντες μεταγραφής, ή από γονίδια ή παράγοντες όπως ογκογόνο Ras ή Μετασχηματισμός β παράγοντα ανάπτυξης που τους επάγεται [4], [14] – [17]. Ωστόσο, λίγες μόνο μελέτες έχουν χρησιμοποιήσει πρωτεομική ως εργαλείο για τον χαρακτηρισμό των πρωτεϊνών που μεσολαβούν EMT [18]. Η πλειονότητα αυτών των μελετών έχουν χρησιμοποιήσει 2D-PAGE που ακολουθείται από φασματομετρία μάζας MALDI-TOF για την ταυτοποίηση πρωτεϊνών διαφορικά-εκφρασμένο σε ιστούς όγκων και /ή κυτταρικές γραμμές [18] – [20]. Λίγες μελέτες έχουν χρησιμοποιήσει τεχνολογία iTRAQ ακολουθούμενη από 2D-LC διαχωρισμό των πεπτιδίων και φασματομετρίας μάζας [18], [21], [22]. Εδώ, έχουμε χρησιμοποιήσει τεχνολογία 2D-ΨΗΦΟ ακολουθούμενη από MALDI-TOF-TOF και φασματομετρία μάζας ESI-γραμμική παγίδα ιόντων. Ο συνδυασμός αυτών των τεχνικών είναι μια πιο ευαίσθητη και αξιόπιστη προσέγγιση για τον εντοπισμό των μικρές διαφορές στην έκφραση πρωτεΐνης μεταξύ ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου με χαμηλά ή υψηλά επίπεδα Snail1. Οι τεχνικές αυτές μας έδωσαν την ευκαιρία να πάρει μια βαθύτερη κατανόηση των πρωτεομική αλλαγές που σχετίζονται με Snail1 υπερέκφραση. Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε εντοπίσει έναν αριθμό πρωτεϊνών προηγουμένως άγνωστη ως στόχοι Snail1 σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. Μερικά από αυτά εμπλέκονται στον έλεγχο της έκφρασης κυτταρικού γονιδίου και φαινότυπο, και είναι πιθανό μεσολαβητές της ογκογόνο δράση του Snail1.

Αποτελέσματα

Τα περισσότερα γονίδια χαρακτηρίζονται στο παρελθόν, όπως αυτή ρυθμίζεται από Snail1 μεμβράνη κωδικοποιούν πλάσματος πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην κυτταρική προσκόλληση ή κυτταροσκελετικών συστατικών. Να διευρύνουν τις γνώσεις μας των επιδράσεων Snail1 σε ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου, χρησιμοποιήσαμε μια ενοποιητική στρατηγική για τον εντοπισμό πυρηνικές πρωτεΐνες που ρυθμίζονται από Snail1 σε αυτή την νεοπλασία (Σχήμα 1Α). Χρησιμοποιήσαμε 2D-ΨΗΦΟ ηλεκτροφόρηση σε συνδυασμό με MALDI-TOF-TOF και φασματομετρία μάζας ESI-γραμμική παγίδα ιόντων να συγκρίνει το μοτίβο των πρωτεϊνών που υπάρχουν σε πυρηνικά εκχυλίσματα από ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου SW480 κύτταρα-ADH εκφράζουν ένα ρετροϊό μεταγωγή Snail1 cDNA (κύτταρα Snail1) με εκείνη της ψευδο-μολυσμένα κύτταρα (mock κύτταρα). Ένα υποσύνολο των ταυτοποιημένων πρωτεϊνών ελέγχθηκε με στύπωμα Western και ανοσοφθορισμό αναλύσεις των ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του κόλου, και με ανοσοϊστοχημεία της ανθρώπινης βιοψίες καρκίνου του παχέος εντέρου. Έχουμε χαρακτηριζόμενη προηγουμένως την κυτταρική μοντέλο που χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη [7], [10] και διαπίστωσε ότι Snail1 υπερέκφραση προώθησε την απόκτηση ενός πιο αστεροειδής κύτταρο μορφολογία (Σχήμα 1Β), η καταστολή των επιθηλιακών δεικτών Ε-καδερίνης, occludin και κλαουδίνης -7, και η επαγωγή της πρωτεΐνης μεσεγχυματικών Λεφ-1 (Σχήμα 1C).

(Α) Σχέδιο της ροής εργασίας που ακολουθείται στην παρούσα μελέτη. (Β) μικρογραφίες Εκπρόσωπος αντίθεσης φάσης (άνω πάνελ) και συνεστιακή εικόνες ανοσοφθορισμού λέιζερ δείχνει F-ακτίνης χρώση (κάτω πάνελ) των κυττάρων SW480-ADH Mock και Snail1. Ράβδος κλίμακας, 20 μm (άνω πλαίσια) και 10 μm (κάτω πλαίσια). (Γ) ανάλυση κηλίδας Western των ολικών κυττάρων εκχυλίσματα από SW480-ADH Mock και κυττάρων Snail1 δείχνει Snail1 υπερέκφραση και η επίδρασή του στην έκφραση της επιθηλιακής (Ε-καδερίνης, occludin και κλαουδίνης-7) και μεσεγχυματικά (Lef-1) δείκτες. β-τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

Διαφορική ανάλυση έκφρασης πρωτεΐνης των πυρηνικών κλασμάτων από ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου με υψηλή ή χαμηλή έκφραση Snail1

πυρηνικά εκχυλίσματα από SW480-ADH Mock και τα κύτταρα Snail1 αναλύθηκαν με 2D-ΨΗΦΟ όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. αλλαγές μοτίβο πρωτεΐνης ποσοτικά και στατιστικά αναλύθηκαν με τη χρήση του λογισμικού v.6.5 DeCyder υπόψη οι 12 χάρτες spot περιλαμβάνονται στη μελέτη. Το Σχήμα 2 δείχνει ένα αντιπροσωπευτικό 2D χάρτη των πυρηνικών πρωτεϊνών SW480-ADH. Κάθε γέλη αναλύθηκε ξεχωριστά για τον υπολογισμό των αναλογιών όγκου μεταξύ των επιμέρους δειγμάτων και την εσωτερική πισίνα, το οποίο χρησιμοποιήθηκε ως το πρότυπο αναφοράς. Στη συνέχεια, όλες οι εικόνες συνδυάζονται και αναλύονται μαζί με τη χρήση της μονάδας BVA. Μερικές παραλλαγές σε πρωτεΐνες αφθονία παρατηρήθηκαν μεταξύ των κυττάρων Mock και Snail1. Μια ζεύγη

t-test

χρησιμοποιήθηκε για να επιλέξετε 22 σημεία των οποίων η έκφραση διακύμανση μεταξύ των δύο τύπων κυττάρων ήταν στατιστικά σημαντική (Μαθητή

t-test

,

σ

& lt? 0,05) . Αυτά τα σημεία επιλέχθηκαν ως σημεία ενδιαφέροντος και σχολιάζονται στο master γέλης (Σχήμα 2). Αναγνώριση των πρωτεϊνών εκτελέστηκε με δύο μεθόδους: (1) πεπτίδιο μάζα αποτυπωμάτων χρησιμοποιώντας MALDI-TOF-TOF και (2) ESI-γραμμικές παγίδα ιόντων και πεπτίδιο αλληλούχιση MS /MS (εφαρμόζοντας μια περιοριστική ψευδώς θετικό ποσοστό ανακάλυψη (FDR) cut-off, FDR≤1%). Σε αμφότερες τις περιπτώσεις, η ταυτοποίηση με περισσότερα από ένα πεπτίδιο ήταν επαρκώς. Με τη χρήση αυτής της διπλής προσέγγισης, 19 πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν σε 17 από τις 22 θέσεις (Πίνακας 1). Μόνο πέντε πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν με MALDI-TOF-TOF, λόγω των χαμηλών επιπέδων έκφρασης. Δεκαοκτώ πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν με παγίδα ιόντων ESI-γραμμική, με δύο κηλίδες που περιέχουν περισσότερες από μία πρωτεΐνη. Σε αυτές τις περιπτώσεις, οι πρωτεΐνες που αναφέρονται σύμφωνα με τον αριθμό των ταυτοποιημένων πεπτιδίων. Τέσσερις πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν από τις δύο τεχνικές (Πίνακας 1).

πυρηνικά εκχυλίσματα από SW480-ADH Mock και τα κύτταρα υποβλήθηκαν Snail1 διαφορικά σημασμένο με Cy3 και Cy5 βαφές. Ένα εσωτερικό πρότυπο συνδυάζει πρωτεΐνες από τα δύο εκχυλίσματα συμπεριλήφθηκε σε όλες τις γέλες μετά από σήμανση με Cy2 βαφή. 3-10 NL IPG λωρίδες χρησιμοποιήθηκαν για την IEF και πρότυπο SDS-PAGE για την δεύτερη διάσταση. Αντιπροσωπευτικά εικόνα 2D δείχνει το σημείο του χάρτη που αντιστοιχεί στο εσωτερικό πρότυπο, το οποίο είναι κοινό σε όλες πηκτές αναλύθηκαν. Κηλίδες υποδεικνύεται με βέλη ήταν κατατοπιστική για ταυτοποίηση πρωτεϊνών με φασματομετρία μάζας (βλέπε Πίνακα 1 για εκχώρηση κωδικού). Επιλεγμένα σημεία έδειξε μια στατιστική διακύμανση των δεικτών όγκου εντός του επιπέδου 95η εμπιστοσύνης (Μαθητή

t-test

,

σ

& lt? 0,05).

Η

ανάλυση πρωτεϊνών οντολογία των ταυτοποιημένων πρωτεϊνών

Μεταξύ των πρωτεϊνών που μεταβάλλονται από Snail1 υπερέκφραση εντοπίσαμε α-κατενίνης (CTNNA1), η PI3K ρυθμιστική υπομονάδα α (PIK3R1), καλδεσμόνη (CALD1), η διάσπαση και ο συντελεστής εξειδίκευσης πολυαδενυλίωσης υπομονάδα 6 (CPSF6), και βιμεντίνης (VIM) όπως ρυθμίζεται αυξητικά πρωτεΐνες? και ο πολλαπλασιασμός που σχετίζεται με πρωτεΐνη 2G4 (PA2G4, επίσης γνωστή ως πρωτεΐνη ErbB3 δέσμευσης 1 ή EBP1), Ran-ειδικά ΟΤΡάσης-ενεργοποιημένη πρωτεΐνη (RANBP1), και αρκετά μέλη της οικογένειας πρωτεϊνών 14-3-3 (YWHAE, YWHAH και YWHAQ ) μεταξύ των μειωτικά πρωτεΐνες (Πίνακας 1). Παρά εργασίας με πυρηνικά εκχυλίσματα, μόνο 7 από τις 19 πρωτεΐνες είχαν διατεθεί για το πυρηνικό διαμέρισμα (CPSF6, WTAP, ΕΝΟ1, PA2G4, HNRNPH3, RANBP1 και PPIA), ενώ το υπόλοιπο ήταν προτίμηση του κυτταροπλάσματος ή που σχετίζονται με τον κυτταρικό σκελετό. Ωστόσο, δεν μπορούμε να απορρίψει ότι οι τελευταίες πρωτεΐνες ήταν μερικώς ή προσωρινά στο πυρηνικό διαμέρισμα. Όσον αφορά την βιολογική λειτουργία, αρκετές πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην κυτταρική προσκόλληση (CTNNA1) ή τα συστατικά του κυτταροσκελετού (CALD1, VIM και lasp1). Ωστόσο, οι περισσότερες από τις πρωτεΐνες που εμπλέκονται στη μεταγωγή σήματος (PI3KR1, RANBP1 και τα μέλη της οικογένειας 14-3-3) και επεξεργασία RNA (CPSF6, WTAP και HNRNPH3) (Πίνακας 1). Ορισμένες από αυτές τις πρωτεΐνες επελέγησαν για επικύρωση. Με δεδομένη την υψηλή ομολογία υπάρχουν μεταξύ των πρωτεϊνών 14-3-3 και μεταξύ ορισμένων από τα προσδιορισθέντα πεπτίδια (δηλαδή -VISSIEQK- για 14-3-3τ και -VLSSIEQK- για 14-3-3σ, γεγονός που τις καθιστά σχεδόν δυσδιάκριτες), έχουμε αποφάσισε να συμπεριλάβει όλα τα μέλη της οικογένειας στην επικύρωση αναλύσεις.

Εκκαθάριση των πρωτεϊνών στόχων υποψήφιος

για μια ποσοτική εκτίμηση της έκφρασης των πρωτεϊνών υποψήφιων στόχων σε SW480-ADH Mock και Snail1 κύτταρα, που αναλύθηκαν με Western blot τρία πυρηνικά εκχυλίσματα που παρασκευάζονται ανεξάρτητα (Ν1, Ν2, Ν3). Επιπλέον, οι εκχυλίσματα κυτταρολύματος από ένα από τα πειράματα (C1) συμπεριλήφθηκαν στην ανάλυση (Σχήμα 3Α). Μεταβλητή ρύθμιση προς τα κάτω (20% έως 70%) του 14-3-3 β, ε, σ, τ πρωτεΐνες και ζ βρέθηκαν στον πυρήνα των κυττάρων Snail1. Για όλους αυτούς εκτός 14-3-3σ την κατιούσα ρύθμιση ήταν ασθενέστερη στο κυτταρόπλασμα σε σύγκριση με τον πυρήνα (Σχήμα 3Α). Έχουμε ήταν σε θέση να ανιχνεύσουν 14-3-3η έκφραση ούτε στον πυρήνα ούτε στο κυτταρόπλασμα, ενώ εκείνη του 14-3-3γ δεν επηρεάστηκε από Snail1 υπερέκφραση (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). έκφραση PA2G4 ήταν επίσης χαμηλότερη στα δύο πυρήνα και κυτοσόλης του SW480-ADH Snail1 ό, τι στην Mock κύτταρα (Σχήμα 3Α).

(Α) ανάλυση κηλίδας Western της έκφρασης επιλεγμένων πρωτεϊνών σε κυτοσολική (C) και πυρηνική ( Ν) εκχυλίσματα των κυττάρων SW480-ADH Mock και Snail1. Οι HNRNPH3 ισομορφές (1-4) που υποδεικνύεται. Οι αριθμοί κάτω από τα πηκτώματα δείχνουν την ποσοτικοποίηση της αλλαγής στην έκφραση μεταξύ Snail1 και Mock κύτταρα μετά από κανονικοποίηση σε β-τουμπουλίνης ή Lamin Β (κυτοσολική και πυρηνικά ελέγχου, αντίστοιχα). Η στατιστική σημασία των αλλαγών πυρηνική έκφραση προωθείται από Snail1 εκτιμήθηκε με δύο ουρών unpaired Student του

t-τεστ

. Ήταν

σ

& lt? 0,001 για 14-3-3ε, 14-3-3σ, 14-3-3ζ, CPSF6 και οι ισομορφές 3 και 4 του HNRNPH3?

σ

& lt? 0,01 για 14-3-3τ? και

σ

& lt? 0,05 για 14-3-3β και PA2G4. Η ρύθμιση των SFPQ (

σ

= 0,057) παρατηρήθηκε και ότι από τις ισομορφές 1 + 2 HNRNPH3 (

σ

= 0,058) δεν έφτασε τη στατιστική σημαντικότητα, αλλά μια σαφής τάση. (Β) ανάλυση κηλίδας Western της έκφρασης επιλεγμένων πρωτεϊνών σε κυτοσολική (C) και πυρηνική (Ν) κλάσματα των κυττάρων ΗΤ29 Mock και Snail1. Οι αριθμοί κάτω από τα πηκτώματα δείχνουν την ποσοτικοποίηση της αλλαγής στην έκφραση μεταξύ Snail1 και Mock κύτταρα μετά από κανονικοποίηση σε β-τουμπουλίνης ή Lamin Β (κυτοσολική και πυρηνικά ελέγχου, αντίστοιχα). μελέτης (C) Ποσοτική RT-PCR της έκφρασης PA2G4 σε SW480-ADH και κύτταρα ΗΤ29 Mock και Snail1. έκφρασης 18S rRNA χρησιμοποιήθηκαν για την κανονικοποίηση. Η στατιστική σημαντικότητα αξιολογήθηκε από δύο ουρών unpaired Student του

t-test

, μόνο αστερίσκος υποδεικνύει

σ

& lt?. 0.05

Η

Αντίθετα, το επίπεδο της CPSF6 ήταν υψηλότερη σε κύτταρα Snail1 ό, τι σε Mock κύτταρα (Σχήμα 3Α). Αναλύσαμε επίσης την έκφραση του παράγοντα Συγκόλλησης προλίνη /γλουταμίνη πλούσια (SFPQ), μια πρωτεΐνη που βρίσκεται 1.59-φορές απορυθμίζεται στην πρωτεομική ανάλυση, αλλά απουσιάζει από τον Πίνακα 1, επειδή αναγνωρίστηκε μόνο με ένα πεπτίδιο σε σημείο 609. Το κάναμε γιατί και οι δύο SFPQ και CPSF6 εμπλέκονται στην επεξεργασία προ-mRNA και εντοπίζεται στην πυρηνική paraspeckles [23], γεγονός που υποδηλώνει μια πιθανή συντονισμένη δράση των Snail1. Πράγματι, βρήκαμε ότι Snail1 αυξημένη έκφραση των πυρηνικών SFPQ, αλλά και το χαμηλό επίπεδο των SFPQ ανιχνεύονται στο κυτταρόπλασμα (Σχήμα 3Α).

Η ρύθμιση από Snail1 ήταν περίπλοκη στην περίπτωση του ετερογενούς πυρηνικής ριβονουκλεοπρωτεΐνης Η3 (HNRNPH3) , η οποία παρουσιάζει αρκετές ισομορφές που προκύπτουν από εναλλακτικό μάτισμα [24]. Τα πεπτίδια που χρησιμοποιούνται στην πρωτεομική μελέτη για τον εντοπισμό HNRNPH3 δείχνουν ότι η κατιούσα ρύθμιση κηλίδα μπορεί να αντιστοιχεί μόνο σε ισομορφές 1, 2 ή 3. Η ανάλυση με στύπωμα Western έδειξε ότι η έκφραση των ισομορφών 1 και 2 (προβλεπόμενο ΜΒ 36,9 και 35,2 kDa, αντίστοιχα) ρυθμίζεται αυξητικά από Snail1, ενώ εκείνη των ισομορφών 3 και 4 (προβλεπόμενο ΜΒ 31,5 και 22,3 kDa, αντίστοιχα) ήταν έντονα προς τα κάτω σε τόσο πυρήνα και κυτοσόλιο των κυττάρων Snail1 (Σχήμα 3Α). Ως εκ τούτου, η πρωτεΐνη που εντοπίζονται στην πρωτεομική ανάλυση πρέπει να είναι ισομορφή 3 HNRNPH3.

Η καταστολή της 14-3-3ε, 14-3-3τ, 14-3-3ζ και PA2G4 από Snail1 σε πυρηνικά εκχυλίσματα ήταν αναπαράγεται σε δύο ανεξάρτητα πειράματα σε άλλο ανθρώπινη κυτταρική σειρά καρκίνου του παχέος εντέρου, ΗΤ29 (Σχήμα 3Β). Επιπλέον, η ποσοτική ανάλυση RT-PCR αποκάλυψε ένα μειωμένο επίπεδο PA2G4 RNA σε τόσο SW480-ADH και τα κύτταρα ΗΤ29 εκφράζουν Snail1 σε σύγκριση με τις αντίστοιχες Mock τους κύτταρα (Σχήμα 3C).

υποκυτταρική κατανομή των πρωτεϊνών στόχων Snail1

Η έκφραση ορισμένων από τις πρωτεΐνες-στόχους Snail1 επικυρώνονται με κηλίδα Western μελετήθηκε περαιτέρω με ανοσοφθορισμό και αναλύσεις συνεστιακή μικροσκόπηση. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4, το επίπεδο της 14-3-3 β, ε και σ ήταν πολύ χαμηλότερο σε αμφότερα πυρήνα και κυτοσόλιο των κυττάρων SW480-ADH Snail1 ό, τι σε Mock κύτταρα. Σε όλες τις τρεις περιπτώσεις η έκφραση ήταν υψηλότερη στο κυτταρόπλασμα σε σύγκριση με τον πυρήνα με μια μεταβλητή αναλογία: β & lt? Σ & lt? Ε. Ανάλυση ανοσοφθορισμού έδειξε επίσης μια μείωση τόσο πυρηνικά και κυτοσολικά έκφραση PA2G4 σε κύτταρα Snail1 σύγκριση με Mock κύτταρα (Σχήμα 5Α). Η έκφραση του PA2G4 είχε ένα λεπτό σχέδιο διάστικτο τόσο πυρήνα και κυτοσόλης, και ήταν ιδιαίτερα ισχυρή σε μερικά γύρο και ευκρινείς πυρηνική εστίες περίπου 0.5 μm σε διάμετρο (Σχήμα 5). Διπλή χρώση χρησιμοποιώντας αντισώματα έναντι Coilin (δείκτης των φορέων Cajal), η TMG κεφαλαιοποίησης των snRNAs συρραφής (δείκτης των φορέων Cajal και πυρηνικών στίγματα των παραγόντων ματίσματος), Fibrillarin (δείκτης πυρηνίσκος) και PML (δείκτης των φορέων PML) έδειξε ότι η PA2G4-θετικό πυρηνικό εστίες αντιστοιχούν σε φορείς Cajal (Εικόνα 5Β). Το αποτέλεσμα αυτό επιβεβαιώθηκε σε νευρώνες (τα δεδομένα δεν φαίνονται), ο τύπος κυττάρου όπου τα σώματα Cajal είναι πιο σημαντικά [25]. Η καλύτερα κατανοητή η λειτουργία των σωμάτων Cajal είναι η βιογένεση των μικρών πυρηνικών και πυρηνισκικός RNPs (snRNPs, snoRNPs) που συμμετέχουν στην προ-mRNA ματίσματος και προ-rRNA επεξεργασίας, αντίστοιχα [25], [26]. Τα πειράματα διπλής χρώσης έδειξε επίσης μια αμυδρή χρώση PA2G4 στον πυρηνίσκο (βλέπε Εικόνα 5Β, PA2G4 και Fibrillarin συν-χρώση), όπως έχει περιγραφεί προηγουμένως [27].

Αντιπροσωπευτικές εικόνες συνεστιακή μικροσκοπία δείχνει την έκφραση και τον εντοπισμό των 14-3-3 β, ε και σ (κόκκινο) σε κύτταρα SW480-ADH Mock και Snail1. έκφραση GFP (πράσινη) ήταν αναλλοίωτη με Snail1 και χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. μπαρ κλίμακα, 10 μm.

Η

(Α) Εκπρόσωπος εικόνες ομοεστιακό μικροσκόπιο που δείχνει την έκφραση και ο εντοπισμός των PA2G4 (κόκκινο) σε κύτταρα SW480-ADH Mock και Snail1. έκφραση GFP (πράσινη) ήταν αναλλοίωτη με Snail1 και χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. μπαρ κλίμακα, 5 μm. (Β) Εκπρόσωπος εικόνες ομοεστιακό μικροσκόπιο δείχνει διπλή ανοσοσήμανση για PA2G4 (κόκκινο) και μοριακών δεικτών (μπλε) των φορέων Cajal (Coilin), φορείς Cajal και την πυρηνική στίγματα των παραγόντων ματίσματος (TMG-cap), πυρηνίσκος (Fibrillarin), και PML φορείς (PML) σε Mock κύτταρα SW480-ADH. Το ροζ χρώμα στις εικόνες συγχώνευσης υποδεικνύει την ύπαρξη colocalization. μπαρ κλίμακα, 5 μm.

Η

Ανάλυση των ανθρώπινων όγκων του παχέος εντέρου

Η καταστολή των πολλών μελών της οικογένειας 14-3-3 κατά έναν παράγοντα μεταγραφής που σχετίζονται με όγκους, όπως Snail1 μας ώθησε να μελετήσουμε η έκφραση αυτών των πρωτεϊνών στον ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου. Όπως 14-3-3σ ήταν το μέλος το οποίο έκφραση ήταν πιο έντονα καταπιεσμένη από Snail1 τόσο στον πυρήνα και στο κυτταρόπλασμα, εμείς θα επιλεγεί για τη μελέτη σχετικά με τα ανθρώπινα δείγματα. Πρώτα, αναλύσαμε 14-3-3σ έκφραση με ανοσοϊστοχημεία σε συστοιχία ιστού που περιέχει ζεύγη φυσιολογικών και καρκινικών δειγμάτων από 46 ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου, και βρήκαν ότι 14-3-3σ ήταν ιδιαίτερα εκφράζεται από τα δύο φυσιολογικά και καρκινικά κύτταρα επιθηλιακά αλλά όχι από στρωματικά κύτταρα (Σχήμα 6Α). Δεδομένου ότι αυτό το πρότυπο έκφρασης της 14-3-3σ ήταν συνεπής με την καταστολή της από έναν επαγωγέα του EMT, όπως μας Snail1, αποφασίσαμε να εκτελέσετε μια πιο λεπτομερή μελέτη των 14-3-3σ και της έκφρασης Snail1 σε διαδοχικές φέτες πέντε βιοψίες των όγκων του παχέος εντέρου. Σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες [13], βρήκαμε κυρίως Snail1 ανοσοαντιδραστικότητα στον πυρήνα των κυττάρων με φαινότυπο μεσεγχυματικά εντός του όγκου (Σχήμα 6Β). Αυτά τα κύτταρα θα μπορούσαν να αντιστοιχούν σε επιθηλιακά κύτταρα όγκου τα οποία έχουν υποστεί ΕΜΤ και /ή ινοβλάστες που έχουν ενεργοποιηθεί από το μικροπεριβάλλον του όγκου [13]. Κατά συνέπεια με τα δεδομένα που ελήφθησαν από τη συστοιχία ιστό, 14-3-3σ εκφράστηκε τόσο πυρήνα και κυτοσόλης των επιθηλιακών κυττάρων του όγκου, αλλά ήταν απούσα σε στρωματικά κύτταρα (Σχήμα 6Β). Ως εκ τούτου, 14-3-3σ και Snail1 έχουν αντίθετες πρότυπα έκφρασης (επιθηλιακών και στρωματικών, αντίστοιχα) σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Επιπλέον, 14-3-3σ έκφραση μοιάζει πολύ με αυτή του γονιδίου στόχου Snail1

Cdh1

/Ε-καδερίνης και, όπως προτείνεται για αυτό το γονίδιο, είναι πιθανό ότι Snail1 καταστέλλει 14-3-3σ έκφραση σε μεσεγχυματικά κύτταρα.

(Α) εικόνες Ανοσοϊστοχημεία δείχνει 14-3-3σ έκφραση σε αντιπροσωπευτικά δείγματα φυσιολογικών και καρκινικών του παχέος εντέρου του 46 αναλύονται στον πίνακα ιστό. Μπάρες δείχνουν μεγέθυνση. Οι τομές βάφτηκαν αντίθετα με αιματοξυλίνη. εικόνων (Β) Ανοσοϊστοχημεία δείχνει 14-3-3σ και Snail1 έκφραση σε δύο διαδοχικές φέτες από έναν εκπρόσωπο των όγκων καρκίνου του παχέος εντέρου από τα πέντε που αναλύθηκαν. Μπάρες δείχνουν μεγέθυνση. Οι τομές βάφτηκαν αντίθετα με αιματοξυλίνη. Δικαίωμα πάνελ είναι μια 3Χ-μεγέθυνση της περιοχής που αναφέρεται στο αριστερό πάνελ.

Η

Συζήτηση

Ο προσδιορισμός πρωτεϊνών που ρυθμίζονται από Snail1 διευρύνει το παρόν γνώσεων σχετικά με τη βιολογία αυτού του παράγοντα μεταγραφής και ρίχνει νέο φως στους μηχανισμούς της EMT και εξέλιξης του καρκίνου. Επιλέξαμε καρκίνο του παχέος εντέρου ως ένα σύστημα εργασίας επειδή Snail1 απορυθμίζεται τόσο σε επίπεδο RNA και πρωτεΐνης σε αυτήν την νεοπλασία και συμβάλλει στην malignization του [10] – [13]. Προηγουμένως, τα προφίλ γονιδιακής έκφρασης που προκαλείται από Snail1 σε διαφορετικά συστήματα είχαν μελετηθεί από transcriptomic αναλύσεις, και τα περισσότερα από τα γονίδια στόχους Snail1 επισημανθέντα κωδικοποιούνται για τις πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην κυτταρική προσκόλληση, εξωκυτταρικής μήτρας και του κυτταροσκελετού [4], [15], [28] . Σε αυτή τη μελέτη, πραγματοποιήσαμε μια πρωτεομική ανάλυση των πυρηνικών εκχυλισμάτων με στόχο τον εντοπισμό νέων πρωτεϊνών που ρυθμίζονται από Snail1 που θα μπορούσε να μεσολαβήσει μεγάλη επιπτώσεις της στην κυτταρική φυσιολογία και φαινότυπο.

Η μελέτη μας δείχνει μια αξιοσημείωτη διατήρηση της παγκόσμιας μοτίβο των πυρηνικών έκφραση πρωτεΐνης σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου που εκφράζουν υψηλά ή χαμηλά επίπεδα Snail1. Ακόμα, έχουν εντοπιστεί μια σειρά από προηγουμένως μη Snail1 ρυθμιζόμενες πρωτεΐνες που εμπλέκονται στις λειτουργίες διαφορετικές κυττάρων. Είκοσι-δύο σημεία βρέθηκαν ως απελευθερωμένη σημαντικά μεταξύ των δύο τύπων κυττάρων με ένα

σ

& lt? 0,05 (Μαθητή

t

-τεστ). Δεκαεννέα διαφορετικές πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν, τα περισσότερα από αυτά με τη χρήση του ESI-γραμμικό μέσο παγίδα ιόντων σε συνδυασμό με ένα νανο-HPLC. Μόνο πέντε πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν με MALDI-TOF-TOF, πιθανώς λόγω της χαμηλής έκφρασης των πρωτεϊνών που υπάρχουν στα σημεία. Δύο κηλίδες (1419 και 1926) που περιέχονται περισσότερες από μία πρωτεΐνη. Ωστόσο, σε σημείο 1419, βιμεντίνης ήταν σημαντικά σε μεγαλύτερη αφθονία (με βάση τον αριθμό των αναγνωρισμένων πεπτιδίων) από τις άλλες πρωτεΐνες και έχουν ανατεθεί τις διαφορές στην έκφραση. Στο σημείο 1926, ο αριθμός των ταυτοποιημένων πεπτιδίων ήταν αρκετά παρόμοια μεταξύ lasp1 και HNRNPH3, καθιστώντας πιο δύσκολη την εκχώρηση της διαφορικής έκφρασης.

Τα αποτελέσματά μας συμφωνούν με τον μεταγραφικό καταστολέα ρόλο της Snail1, όπως και σε 12 από τα 17 σημεία με ταυτοποιημένες πρωτεΐνες, η έκφραση ήταν χαμηλότερη σε Snail1-κύτταρα που εκφράζουν ό, τι σε Mock κύτταρα, ενώ μόνο σε πέντε από αυτά η έκφραση ήταν υψηλότερη σε κύτταρα Snail1. Η καταστολή των μειωτικά πρωτεϊνών θα μπορούσε να είναι ένα άμεσο αποτέλεσμα του Snail1, ειδικά στην περίπτωση των οποίων το επίπεδο PA2G4 RNA μειώθηκε επίσης κατά Snail1. Αντίθετα, η επαγωγή της έκφρασης πρωτεΐνης με Snail1 πρέπει να είναι έμμεση, διαμεσολαβείται από άλλους παράγοντες μεταγραφής, όπως έχει αναφερθεί για Matrix μεταλλοπρωτεασών 2 και 9 [29], [30]. Επιπλέον, βρήκαμε ότι Snail1 μεταβάλλει το μοτίβο μάτισμα HNRNPH3 σε κύτταρα SW480-ADH. Αυτό είναι σύμφωνο με τις μελέτες που περιγράφουν ότι Snail1 αλλάζει το μοτίβο του ματίσματος του p120-κατενίνης και

zonula Οοοίιιάεηδ

-1 με μη χαρακτηρισμένα μηχανισμούς [31], [32].

Σε συμφωνία με τις προηγούμενες transcriptomic μελέτες, δείχνουμε εδώ ότι Snail1 αλλάζει την έκφραση των πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην κυτταρική προσκόλληση και κυτταροσκελετού (CTNNA1, CALD1, VIM και lasp1). Επιπρόσθετα και στη γνώση μας για πρώτη φορά, αναφέρουμε ότι Snail1 ρυθμίζει πρωτεΐνες που εμπλέκονται σε άλλες κυτταρικές λειτουργίες, όπως ωρίμανση RNA (CPSF6, HNRNPH3 και SFPQ) και ενδοκυτταρική σηματοδότηση (PI3KR1, RANBP1 και 14-3-3 οικογένεια πρωτεϊνών). Η σχεδόν γενική κατασταλτική επίδραση του Snail1 στην έκφραση 14-3-3 μελών της οικογένειας είναι εκπληκτικό και συμφωνεί με την προτεινόμενη πρόσφατα καρκίνος-προστατευτική ρόλος ορισμένων από αυτές τις πρωτεΐνες [33], [34]. Οι πρωτεΐνες 14-3-3 έχουν για πολύ καιρό γνωστή ως πρωτεΐνες δέσμευσης φωσφοσερίνης /φωσφοθρεονίνη σε θέση να δεσμεύσει και να διαμορφώνουν την αλληλεπίδραση μεταξύ πρωτεϊνών και εμπλέκονται σε κυτταρικές διαδικασίες όπως σηματοδότηση, έλεγχο του κυτταρικού κύκλου, απόπτωση, ενδοκυτταρική διακίνηση, κυτταροσκελετική δομή και τη μεταγραφή [34 ], [35]. Μόνο τα τελευταία χρόνια αρκετές 14-3-3 μέλη της οικογένειας έχουν συνδεθεί με μία ποικιλία διεργασιών καρκίνου. Ενώ 14-3-3σ έχει προταθεί ως ένα ογκοκατασταλτικό γονίδιο που σιγήσει ή αδρανοποιείται κατά την διάρκεια της εξέλιξης του μελανώματος και του μαστού, γαστρικό, ηπατοκυτταρικό, καρκινώματα των ωοθηκών και των πλακωδών κυττάρων [33], [36] – [40]? έχει βρεθεί υπερεκφράζεται σε καρκίνο του παγκρέατος [41]. Επιπλέον, μια πρωτεομική ανάλυση έδειξε ότι 14-3-3σ έκφραση ρυθμίζεται προς τα κάτω σε διηθητικά καρκινώματα μεταβατικού επιθηλίου της ουροδόχου κύστης που υποβάλλονται σε ΕΜΤ [19]. Αυτό είναι σε συμφωνία με τα δεδομένα μας από ανθρώπινο βιοψίες καρκίνου του παχέος εντέρου που δείχνουν μία αντίθετη πρότυπο έκφρασης του 14-3-3σ και Snail1. Αξίζει να σημειωθεί ότι, 14-3-3 ε, ζ και η μπορεί να σχηματίσει ένα τριμερές σύμπλοκο με Chibby και β-κατενίνης διευκόλυνση της πυρηνικής εξαγωγής της β-κατενίνης, με αυτόν τον τρόπο τον ανταγωνισμό μεταγραφική δραστηριότητα της, που αποτελεί σημαντικό παράγοντα στον καρκίνο του παχέος εντέρου [42]. Αντίθετα, 14-3-3ζ συνεργάζεται με ErbB2 για την προώθηση της EMT και την εξέλιξη του πόρου καρκινώματα μαστού σε διηθητικό καρκίνο [43], και η υπερέκφραση των συνεργατών της με υποτροπή του καρκίνου του μαστού [44]. Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε εντοπίσει 14-3-3 β, ε, σ, τ και ζ ως μειωτικά μετά την έκφραση Snail1 σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. Η δράση των πρωτεϊνών 14-3-3 μπορεί να διαμορφώνεται από την αλληλεπίδραση με διάφορους εταίρους σε μια χωρικά και χρονικά μόδας και επίσης υπόκειται σε ρύθμιση από φωσφορυλίωση. Ως εκ τούτου, η ίδια 14-3-3 μέλος της οικογένειας μπορεί να έχει πολλαπλές και ακόμα αντίθετους ρόλους καθιστώντας την ανάλυση της επίδρασης των επιμέρους 14-3-3 πρωτεϊνών είναι πολύ περίπλοκη και εξαρτάται από την ενσωμάτωση των πρόσθετων σημάτων [45]. Ως εκ τούτου, είναι δύσκολο να προβλεφθεί ο ρόλος αυτών των πρωτεϊνών στη δράση Snail1 στον καρκίνο του παχέος εντέρου, η οποία μπορεί να σχετίζεται με τις μεταλλάξεις που τυπικά υπάρχει σε αυτή την νεοπλασία.

Βρήκαμε ότι Snail1 καταστέλλει επίσης PA2G4 έκφραση σε ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα. Αυτή η πρωτεΐνη αλληλεπιδρά με την κυτταροπλασματική περιοχή του υποδοχέα ErbB3 προς τα κάτω ρύθμιση ErbB μεταγωγή σήματος και εξασθένησης ερεγουλίνη-τροφοδοτούμενη ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του μαστού [46], [47]. PA2G4 βρίσκεται όχι μόνο στο κυτταρόπλασμα, αλλά και στον πυρήνα, όπου συμπεριφέρεται ως πλειοτροπική πρωτεΐνη που αλληλεπιδρά με έναν αριθμό πρωτεϊνών και RNA που εμπλέκονται σε μεταγραφική ρύθμιση και τον έλεγχο της μετάφρασης [48], [49]. Έτσι, PA2G4 αναστέλλει E2F1- και ανδρογόνων μεταγραφή με μεσολάβηση υποδοχέα μέσω της αλληλεπίδρασής της με την πρωτεΐνη ρετινοβλαστώματος, υποδοχέα ανδρογόνου, αρκετές ιστόνες αποακετυλάσες και Sin3A [50] – [53]. Ο εντοπισμός των PA2G4 στο σώμα Cajal που έχουμε τώρα αναφερθεί υποδηλώνει ότι αυτή η πολυλειτουργική πρωτεΐνη εμπλέκεται επίσης στην ωρίμανση των snRNA και snoRNA. Επιπλέον, PA2G4 υπερέκφραση προκαλεί διαφοροποίηση των ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του μαστού [54], αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων ινοβλαστών, και καταστέλλει την ανάπτυξη και την μετάσταση των σιελογόνων αδενοειδών κυττάρων κυστική καρκινώματος [55]. Από όλες αυτές τις μελέτες είναι κατανοητό ότι PA2G4 καταστολή μπορεί να συνεισφέρει στην ογκογόνο δράση του Snail1.

Είναι ενδιαφέρον, Snail1 ρυθμίζει προς τα πάνω την έκφραση των πρωτεϊνών CPSF6 και SFPQ εμπλέκονται σε RNA πολυαδενυλίωσης και ματίσματος, αντίστοιχα [56], [57 ]. Και οι δύο πρωτεΐνες έχουν βρεθεί πρόσφατα να είναι παρούσα σε paraspeckles, ένα subnuclear διαμέρισμα προτείνεται να είναι θέση για την επεξεργασία προ-πιΚΝΑ και κατακράτηση [23]. Αξίζει να σημειωθεί ότι, τόσο CPSF6 και SFPQ είναι εταίροι σύντηξης για κινάσες τυροσίνης σε αιματολογικές κακοήθειες [58]. Snail1 μεταβάλλει επίσης το πρότυπο μάτισμα HNRNPH3, άλλης πρωτεΐνης που εμπλέκονται στη διαδικασία ματίσματος [24]. Περιέργως, οι ισομορφές HNRNPH3 που προκαλούνται από Snail1 περιέχουν δύο αντίγραφα ενός RNA-πεδίο σύνδεσης (μοτίβο αναγνώρισης RNA) που βρίσκονται συνήθως σε πρωτεΐνες που δεσμεύονται μονόκλωνο RNA, ενώ οι ισομορφές καταστέλλεται από Snail1 περιέχουν μόνο ένα [24]. Ωστόσο, η λειτουργική συνέπεια αυτής της διαφοράς είναι άγνωστη. Ως εκ τούτου, η μελέτη μας δείχνει ότι μπορεί να ρυθμίζουν Snail1 αρκετά βήματα στην ωρίμανση RNA, όπως πολυαδενυλίωσης και ματίσματος, και έτσι mRNA σταθερότητα και τη μετάφραση. Συνολικά, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι εκτός από την δραστικότητα της καταστολής αναγνωρίζεται μεταγραφή, Snail1 μπορεί να ρυθμίζει τη γονιδιακή έκφραση μετα-μεταγραφικά με διαμόρφωση του επιπέδου των πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην προ-επεξεργασία mRNA και την τοποθεσία.

Εν κατακλείδι, τα ευρήματά μας εμπλέκουν Snail1 ως ρυθμιστής του προηγουμένως απρόβλεπτες κυτταρικών λειτουργιών επιπλέον της ενδοκυτταρικής προσκόλλησης και της μορφολογίας των κυττάρων. Η σε βάθος μελέτη των μηχανισμών δράσης των πρόσφατα εντοπίστηκαν πρωτεΐνες-στόχους Snail1 θα συμβάλλουν στον καθορισμό της ακριβούς πολύπλοκη βιολογική δραστηριότητα της Snail1 και έτσι τις γνώσεις της διαδικασίας της EMT κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης και της ογκογένεσης.

Υλικά και μέθοδοι

δήλωση Ηθικής

Αυτή η μελέτη διεξήχθη σύμφωνα με τις αρχές που διατυπώνονται στη Διακήρυξη του Ελσίνκι. Η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Instituto de Salud Carlos III (Μαδρίτη, Ισπανία) και την Επιτροπή Ηθικής για την κλινική έρευνα του Institut Municipal d’Assistencia Sanitaria (Βαρκελώνη, Ισπανία). Όλοι οι ασθενείς με την προϋπόθεση γραπτή συγκατάθεση για τη συλλογή των δειγμάτων και η επακόλουθη ανάλυση.

καλλιέργειας κυττάρων

SW480-ADH και ΗΤ29 καρκινικά κύτταρα ανθρώπινου παχέος εντέρου που εκφράζει σταθερά Snail1 (κύτταρα Snail1) ή ένα άδειο φορέα ( mock κύτταρα) δημιουργήθηκαν με ρετροϊική μεταγωγή χρησιμοποιώντας φορείς PRV-Snail1-IRES-GFP (κύτταρα Snail1) ή PRV-IRES-GFP (mock κύτταρα), όπως έχουμε ήδη αναφερθεί [10].