Αφηρημένο

Τα καρκινικά κύτταρα-κίνηση είναι ένας υποπληθυσμός στο επιθετικών καρκίνων που εμφανίζουν τα γνωρίσματα από κοινού με βλαστικά κύτταρα, όπως είναι η ικανότητα να αυτο-ανανέωση και διαφοροποίηση, που συνήθως αναφέρονται ως βλαστική ικανότητα. Επιπλέον, τέτοια κύτταρα είναι ανθεκτικά στην χημειοθεραπεία και η ακτινοθεραπεία που παρουσιάζουν θεραπευτική πρόκληση. Να αποκαλύψει λειτουργίες βλαστική ικανότητα που σχετίζεται με κύτταρα γλοιώματος-κίνηση (GICs), προφίλ μεταγραφικό συγκρίθηκαν με νευρικά βλαστικά κύτταρα (NSCs) και ανάλυση γονιδίων οντολογίας εντόπισε ένα εμπλουτισμό του Ca

2+ γονίδια σηματοδότησης σε NSCs και το πιο στέλεχος-όπως (NSC-εγγύς) GICs. Λειτουργική ανάλυση σε ένα σύνολο διαφορετικών γραμμών GIC σχετικά με ευαισθησία σε διαταραχές της ομοιόστασης χρησιμοποιώντας Α23187 και θαψιγαργίνη, αποκάλυψε ότι NSC-εγγύς GICs ήταν πιο ευαίσθητα, επιβεβαιώνοντας τα δεδομένα μεταγραφικό. Επιπλέον, Ca

2+ ευαισθησία των ναρκωτικών μειώθηκε σε GICs μετά την διαφοροποίηση, με πιο ισχυρή επίδραση στην NSC-εγγύς GIC, υποστηρίζοντας μια βλαστική ικανότητα που σχετίζεται με Ca

2+ ευαισθησία. NSCs και η NSC-εγγύς γραμμή GIC εξέφρασε ένα μεγαλύτερο αριθμό των καναλιών ιόντων διαπερατό σε κάλιο, νάτριο και Ca

2+. Αντιστρόφως, ένας μεγαλύτερος αριθμός και τα υψηλότερα επίπεδα έκφρασης του Ca

2+ δεσμευτικός γονίδια που μπορεί ρυθμιστικό διάλυμα CA.

2+, εκφράστηκαν σε NSC-άπω GICs. Ειδικότερα, η έκφραση του GRIA1 υπομονάδα υποδοχέα ΑΜΡΑ γλουταμικού, βρέθηκε να συνδέσουν με Ca

2+ ευαίσθητα NSC-εγγύς GICs, και μειώθηκε καθώς GICs διαφοροποιούνται μαζί με μειωμένη Ca

2+ ευαισθησία φαρμάκου. Η συσχέτιση μεταξύ υψηλή έκφραση του Ca

2 + κανάλια (όπως GRIA1) και ευαισθησία σε Ca

2+ φάρμακα επιβεβαιώθηκε σε εννέα ακόμη νέες γραμμές GIC. Ασβέστιο ευαισθησία φαρμάκου συσχετίστηκε επίσης με την έκφραση του NSC δείκτες νεστίνη (NES) και FABP7 (BLBP, πρωτεΐνη δέσμευσης λιπιδίων του εγκεφάλου) σε αυτή την εκτεταμένη ανάλυση. Εν ολίγοις, NSC-συνδέονται NES

+ /FABP7

+ /GRIA1

+ GICs ήταν επιλεκτικά ευαίσθητα σε διαταραχές Ca

2 + ομοιόσταση, παρέχοντας ένα δυναμικό μηχανισμό στόχο για εξάλειψη ενός ανώριμου πληθυσμού της κακοήθη κύτταρα

Παράθεση:. Wee S, M Niklasson, Marinescu VD, Segerman Α, Schmidt L, Hermansson A, et al. (2014) Επιλεκτική ευαισθησία ασβεστίου σε ανώριμα Γλοίωμα καρκινικά βλαστικά κύτταρα. PLoS ONE 9 (12): e115698. doi: 10.1371 /journal.pone.0115698

Επιμέλεια: Alfredo Quinones-Hinojosa, Johns Hopkins University, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 24 Ιούλ 2014? Αποδεκτές: 26 Νοεμ, 2014? Δημοσιεύθηκε: 22, Δεκεμβρίου του 2014

Copyright: © 2014 Wee et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι μέσα στο χαρτί και Υποστήριξη αρχείων Πληροφορίες

Χρηματοδότηση:. Σουηδικές Childhood Cancer θεμέλιο PR2013-0084 (www.barncancerfonden.se), Καρκίνος σουηδικό ίδρυμα μπορεί να 2011/783 (www.cancerfonden.se), σουηδικό Συμβούλιο Έρευνας 2011-4567 (vr.se), Ινστιτούτο Καρολίνσκα (www.ki.se), το κέντρο της Linnaeus στην αναπτυξιακή βιολογία για αναγεννητικής Ιατρικής (www.dbrm.se). ΝΔ χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από το πρόγραμμα υποτροφιών του Ινστιτούτου Καρολίνσκα PhD. MN χρηματοδοτήθηκε από ένα μεταδιδακτορικό υποτροφία από το Ίδρυμα σουηδική Καρκίνου. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

πολύμορφο γλοιοβλάστωμα (GBM) είναι μια εξαιρετικά κακοήθης μορφή καρκίνου του εγκεφάλου με κακή πρόγνωση για τις πληγείσες άτομα. Παρά το συνδυασμό των χειρουργική επέμβαση, χημειοθεραπεία και ακτινοθεραπεία, περισσότερο από το 90% των ασθενών εμφανίζουν υποτροπή [1], και η μέση επιβίωση παραμένει στο χαμηλότερο 14-16 μήνες [2]. Αν και κακοήθεις όγκους γλοιώματος είναι ιδιαίτερα ετερογενείς, ένας υποπληθυσμός ανώριμων κυττάρων, που ονομάζονται γλοιώματος κύτταρα έναρξης (GICs) [2] – [6] συνυπάρχουν με πιο διαφοροποιημένη κυτταρικών πληθυσμών. GICs έχουν δειχθεί ότι είναι ανθεκτικά σε ακτινοθεραπεία και χημειοθεραπεία και πιστεύεται ότι είναι υπεύθυνη για την υποτροπή του όγκου [7]. Αντικατοπτρίζοντας την ανωριμότητα των GICs και την ικανότητά τους να διαφοροποιούνται [8], αυτά τα κύτταρα έχουν δειχθεί ότι μοιράζονται μια έκφραση -associated γονίδιο βλαστοκυττάρων (βλαστική ικανότητα) με βλαστοκυττάρων πληθυσμούς, όπως κανονική εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων τεράτωμα σχηματισμού [9] – [ ,,,0],11], και προτείνεται ότι GICs ανεφοδιασμό συνεχώς τις μαζικές καρκινικών κυττάρων μέσω της αυτο-ανανέωσης και της διαφοροποίησης [11], [12]. Μεγάλο μέρος της έρευνας ανάπτυξης φαρμάκων για τη θεραπεία GBM έχει επικεντρωθεί στην στοχεύουν χύμα κύτταρα, τα περισσότερα εκ των οποίων δεν διαθέτουν την ικανότητα των όγκων-κίνηση. Μια σημαντική πρόκληση που παραμένει αυξάνει την αποτελεσματικότητα της θεραπείας του καρκίνου στόχευσης GICs καθώς αυτά τα κύτταρα εμφανίζουν αντοχή σε χημειοθεραπεία και η ακτινοθεραπεία με τη χρήση τρέχουσες στρατηγικές.

Αν και αρκετές οδούς σηματοδότησης όπως Notch, Hedgehog-Gli, RTK-Akt, ΒΜΡ /ΤΟΡ-β, WNT-β-κατενίνης και STAT3 έχουν δειχθεί ότι υποστηρίζουν αυτο-ανανέωση των βλαστικών κυττάρων και ανώριμων καρκινικών κυττάρων [13], πιθανούς θεραπευτικούς στόχους που μπορούν επιλεκτικά εξάλειψη GICs είναι λίγα [14]. Μία εναλλακτική στρατηγική για να καταστήσει GICs λιγότερο επιθετική καταδείχθηκε με ΒΜΡ επαγόμενη θεραπεία διαφοροποίησης [8]. Επίσης έχουν ανταγωνιστές των υποδοχέων ντοπαμίνης D2 έχουν εντοπιστεί να οδηγεί διαφοροποίηση των λευχαιμικών και του όγκου του μαστού έναρξη κύτταρα σχετικά διαφοροποίησης ανθεκτικά [15].

κανάλια ιόντων έχουν από καιρό έχει ανατεθεί ο ρόλος των διέπουν τις βασικές κυτταρικές διεργασίες εκτός από ηλεκτρικές διεγερσιμότητα και για παράδειγμα κάλιο και Ca

2+ κανάλι σηματοδότησης ελέγχου διάφορες λειτουργίες όπως πολλαπλασιασμό και μετανάστευση σε βλαστικά κύτταρα και κυτταρικές σειρές καρκίνου [16], [17]. Ca

2+ έχει επίσης ενοχοποιηθεί στην επιβίωση των καρκινικών κυττάρων [18]. Πρόσφατα, είχε επίσης δείξει ότι η παρέμβαση με Ca

2 + υπομονάδα καναλιών ήταν σε θέση να οδηγούν τα κύτταρα του ήπατος ογκογενή σε απόπτωση [19].

Σε αυτή τη μελέτη, θέτουμε για τη διερεύνηση των μηχανισμών μοναδικό για οι βλαστική ικανότητα που σχετίζεται με λειτουργίες σε κύτταρα γλοιώματος και καταλήγουν στο συμπέρασμα ότι τα βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν είναι περισσότερο ευαίσθητα σε Ca

2+ διαταραχές σε σύγκριση με πιο ώριμα τύπους κυττάρων.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταροκαλλιέργεια

GliNS1, G179NS και G166NS GIC γραμμές αναπτύχθηκαν σε καλλιέργεια όπως περιγράφηκε προηγουμένως [6], [11]. Εν συντομία, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν πρώτα ως σφαίρες κατά την πρώτη εβδομάδα πριν από τη μεταφορά σε λαμινίνη επικαλυμμένα πιάτα, όπου αναπτύχθηκαν ως προσκολλημένες μονοστιβάδες σε ανθρώπινα Neurocult NS-A βασικά μέσα χωρίς ορό (StemCell Technologies) συμπληρωμένο με Glutamax, Hepes, Ν2 , Β27 (Invitrogen), EGF (10 ng /ml) και bFGF (10 ng /ml) (R &? D Systems). GICs αναπτύχθηκαν μέχρι συρροής, διαχωρίστηκαν χρησιμοποιώντας TrypLExpress (Invitrogen), και στη συνέχεια χωρίστηκε 1:02-1:04. 2/3 του μέσου αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο κάθε 3-4 ημέρες. Για τη διαφοροποίηση, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσα DMEM /F12 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS? Gibco, Life Technologies)) για δύο εβδομάδες

Novel ανθρώπινων κακοήθων γλοιοβλαστώματος κίνηση κυττάρων (GIC) καλλιέργειες (U3NNN-MG σειρά γραμμών GIC) που χρησιμοποιούνται στη μελέτη αυτή είναι μέρος της συλλογής Πανεπιστήμιο της Ουψάλα ανθρώπινου γλοιώματος Cell Culture (HGCC), η οποία περιλαμβάνει καλώς χαρακτηρισμένα GBM προερχόμενο καλλιέργειες καρκίνος κίνηση κυττάρων (Xie et al 2014, χειρόγραφο υπό προετοιμασία). Το έργο αυτό εγκρίθηκε από την ηθική επιτροπή δεοντολογίας της Ουψάλα (2007/353). Όλες οι γραμμές GIC χρησιμοποιήθηκαν μεταξύ των περασμάτων 15 και 30.

προσδιορισμούς κυττάρων

GliNS1, G179NS και G166NS GIC γραμμές, τόσο αδιαφοροποίητα και διαφοροποιημένα, σπάρθηκαν την ημέρα 1 σε 20% πυκνότητα σε laminin- επικάλυψη 96 ή 384 μαύρο καλά, με επίπεδο πυθμένα μικροπλάκες (Corning). Οι ενώσεις προστέθηκαν στις πλάκες την ημέρα 2, που ακολουθείται από επώαση για 48 ώρες. FBS διαφοροποιημένα κύτταρα έλαβαν μέσου χωρίς ορό (50% ανθρώπινο Neurocult NS-Α βασικά μέσα, το 50% Neurobasal (Gibco, Life Technologies), συμπληρωμένο με Glutamax, Hepes, Β27, ¼ Ν2, δεν υπάρχουν παράγοντες ανάπτυξης) κατά τη διάρκεια της ένωσης χημική επεξεργασία. DMSO χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. δοκιμασία βιωσιμότητα πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία CellTiterGlo (Promega, Madison, WI) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Εν συντομία, ρυθμιστικό δοκιμασίας της αντίδρασης προστέθηκε στα φρεάτια με χρήση ενός αυτοματοποιημένου πολυπιπέττα, που ακολουθείται από ανακίνηση του μικροπλάκα για 30 δευτερόλεπτα και 7 λεπτά επώαση στο σκοτάδι. Λουσιφεράσης ανάγνωση ένταση μεταφέρθηκε στη συνέχεια χρησιμοποιώντας Victor2 (Perkin Elmer) με ρύθμιση του 1 s ανάγνωση φωταύγεια ανά καλά. Ζ-παράγοντας υπολογίστηκε για κάθε πείραμα. Για κάθε κυτταρική γραμμή (GliNS1, G179NS, G166NS και hf5205NS), τουλάχιστον 3 επαναλήψεις αναλύθηκαν. Στατιστικοί υπολογισμοί πραγματοποιήθηκαν με GraphPadPrism (GraphPad Software, Inc. San Diego, CA, USA). δεδομένα δόσης-απόκρισης υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τη χρήση log-γραμμική παρεμβολή για την απόκτηση συνδεθείτε IC

50 τιμές.

αναλύσεις των ναρκωτικών στο μυθιστόρημα γραμμές GIC (U3NNN-MG σειρά) σπάρθηκαν σε 384 φρεατίων (BD Falcon Optilux Cat. # 353962) 24 ώρες πριν από τη θεραπεία χρησιμοποιώντας ένα Multidrop 384 υγρό διανομέα (ThermoScientific, Σουηδία). Για να εξασφαλιστεί η φάση αύξησης στο τέλος της δοκιμασίας κυττάρων (-70% συρροή) σπάρθηκαν σε πυκνότητα που κυμαίνεται μεταξύ 2000-4000 κύτταρα /φρεάτιο. Τα φάρμακα μεταφέρονται χρησιμοποιώντας τη ECHO550 μη επαφή διανομέα υγρού (Labcyte, USA) σε ένα πυθμένα πλάκα πολυπροπυλενίου 384 V-. Τα φάρμακα στη συνέχεια αραιώθηκαν σε μέσο και μεταφέρθηκαν με τη χρήση της κεφαλής MDT 384 σε Janus Automated Workstation (PerkinElmer, USA) στις πλάκες του κυττάρου. Τα φάρμακα δοκιμάστηκαν σε 11-σημείο σειρά αραίωσης δόση και αναλύθηκαν για βιωσιμότητα μετά από 72 ώρες κατεργασίας σε αναγνώστη EnVision Multilabel (PerkinElmer, USA) χρησιμοποιώντας ρεζαζουρίνης (R7017, Sigma-Aldrich, Στοκχόλμη, Σουηδία), κατά τη διέγερση /εκπομπή μήκους κύματος 560 /590 nm [20]. Ως θετικός μάρτυρας, ο δοξορουβικίνη φάρμακο υποβλήθηκε σε διαλογή με την ίδια ρύθμιση καμπύλη δόσης-απόκρισης, και φρεάτια που περιέχουν αρνητικοί έλεγχοι DMSO σε 4 διαφορετικές συγκεντρώσεις αναλύθηκαν επίσης. Η επίδραση στη βιωσιμότητα του κάθε δόση φαρμάκου υπολογίστηκε ως δείκτη βιωσιμότητας W = Ytreated /Ycontrol, όπου το Υ αντιπροσωπεύει το μέσο όρο του σήματος φθορισμού.

εκχύλιση RNA, μεταγραφικό και ανάλυση δεδομένων

Δύο επαναλήψεις ήταν αναλύθηκαν για τα αδιαφοροποίητα και διαφοροποιημένη κυτταρικές σειρές GliNS1, G166NS και G179NS, ενώ τρεις επαναλήψεις αναλύθηκαν για DMSO, Α23187 και θαψιγαργίνη αντιμετωπίζονται GliNS1 και G166NS. Ολικό RNA εξήχθη από κύτταρα που αναπτύσσονται προς υποομοροής χρησιμοποιώντας το RNeasy Mini Kit (Qiagen), ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Φθορομετρική ποσοτικό προσδιορισμό της συγκέντρωσης του RNA και η ποιότητα έγινε χρησιμοποιώντας το κιτ δοκιμασίας qubit RNA (Invitrogen). Χρησιμοποιήσαμε 300 ng ολικού RNA στην παρασκευή της βιβλιοθήκης TruSeq, για την οποία χρησιμοποιήθηκε το πρωτόκολλο Παρασκευή δείγματος Kit Illumina Low-Throughput TruSeq RNA με αποτέλεσμα γραμμικό κώδικα cDNA. 50 ng γραμμοκώδικα προϊόντων TruSeq χρησιμοποιήθηκαν για αλληλούχιση Illumina RNA. Τα δείγματα αναλύθηκαν κατά την αλληλουχία σε ένα sequencer Illumina HiSeq 2000 ως ενιαίο τέλος 51-νουκλεοτιδίων διαβάζει σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Raw διαβάζει χαρτογραφήθηκαν στο ανθρώπινο γονιδίωμα αναφοράς και κανονικοποιημένα δεδομένα δημιουργήθηκε για κάθε γονιδιωματική χαρακτηριστικό χρησιμοποιώντας λογισμικό STRT [21]. Εν συντομία, οι πρώτες διαβάζει ευθυγραμμίστηκαν χρησιμοποιώντας Bowtie [22]. Χαρτογραφήθηκαν διαβάζει ομαλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας διαβάζει ανά ΚΒ ανά εκατομμύριο διαβάζει μέθοδο (RPKM) κανονικοποίηση [23], ενώ unmapped διαβάζει αφαιρέθηκαν. Ανάλυση γονιδιακής έκφρασης διαφορική έγινε σε R-στούντιο χρησιμοποιώντας το πακέτο DESeq [24] και ένα σενάριο που εγκρίθηκε από το προηγούμενο έγγραφο [25]. Benjamini ρυθμίστηκε ρ-τιμές χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση δεδομένων. Η ανάλυση των δεδομένων έγινε με τη χρήση Qlucore Γονιδιωματική Explorer 2.0 (Qlucore ΑΒ), PRISM 6 (GraphPad Software), David (https://david.abcc.ncifcrf.gov) και GeneVenn (https://genevenn.sourceforge.net).

Οι κυτταρικές σειρές Ουψάλα U3NNN-MG δεν αναλύθηκαν σε επαναλήψεις. Για κάθε κυτταρική σειρά ολικό RNA εκχυλίστηκε από τα καλλιεργημένα κύτταρα χρησιμοποιώντας το κιτ RNeasy Mini (Qiagen) και σημάνθηκε και υβριδοποιήθηκε σε συστοιχίες Affymetrix GeneChip Human εξόνιο 1,0 ST ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι τιμές έκφρασης RMAnormalized χρησιμοποιώντας το λογισμικό Affymetrix Expression Κονσόλα.

χρώση ανοσοφθορισμού

Cells καλλιεργηθούν συνδέεται επί γυάλινο κάλυμμα μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη (PFA) επί 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (RT) ακολουθούμενη από επώαση αντίσωμα σε 4 ° C όλη τη νύκτα. Τα ακόλουθα πρωτεύοντα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν: κουνελιού αντι-γλοιακή ινιδική όξινη πρωτεΐνη (GFAP) (ϋΑΚΟ Cytomation) και ποντικού αντι-βήτα III τουμπουλίνης (Tuj 1) (Millipore). Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με φθορισμό σημασμένο δευτερεύοντα αντισώματα αντι-κουνελιού Alexa Fluor 555 και Alexa Fluor 488 (Invitrogen) για 1 ώρα σε RT. Οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με DAPI και να τοποθετηθεί χρησιμοποιώντας Immumount (DAKO). Εικόνες χρωματισμένων κυττάρων αποκτήθηκαν με ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο της Olympus FV1000 και επεξεργασμένα με το λογισμικό Adobe Photoshop CS5.1.

Western ανάλυση κηλίδος

Τα κύτταρα λύθηκαν σε RIPA ρυθμιστικό διάλυμα και συγκέντρωση πρωτεΐνης ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το δικινχονινικού οξύ (BCA) Protein Assay Kit (Sigma-Aldrich? Pierce, Rockford, ΗΠΑ). Ίσες ποσότητες δειγμάτων πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση χρησιμοποιώντας 10% πηκτώματα Mini-PROTEAN TGX (Bio-Rad) ή 4-12% βαθμιαία πηκτή πολυακρυλαμιδίου Bis-Tris (NuPAGE, Invitrogen) υπό αναγωγικές συνθήκες και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF (Bio- Rad) ή μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (Hybond-ECL, GE Healthcare, Σουηδία). Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν σε 5% γάλα για 1 ώρα και επωάστηκε όλη τη νύκτα στους 4 ° C με τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα: αντι-GRIA1 κουνελιού αντίσωμα (Abcam), κουνελιού αντι-S100 άλφα 6 αντισώματος (Abcam), αντι-BLBP αντίσωμα ποντικού (Millipore ) και αντίσωμα ποντικού αντι-βήτα ακτίνης (Abcam). Οι μεμβράνες στη συνέχεια επωάστηκαν με το κατάλληλο κρένου δεύτερο αντίσωμα σημασμένο με υπεροξειδάση (Sigma-Aldrich? GE Healthcare) πριν αποκαλυφθεί με χημειοφωταύγεια (ECL Western Διαύγεια Substrate, Bio-Rad? SuperSignal West Pico χημειοφωταύγειας υπόστρωμα (Pierce, Rockford, ΗΠΑ)).

Αποτελέσματα

μεταγραφικό προφίλ προσδιορίζει βλαστική ικανότητα που σχετίζονται με Ca

2 + γονιδιακή έκφραση οι εντάσεις μπάντα ποσοτικά με τη χρήση ImageJ (ΝΙΗ, USA). σε GICs

Για να προσδιορίσετε η σχέση ανάμεσα στην ανθρώπινη γραμμές GIC και ανθρώπινων εμβρυϊκών νευρικών βλαστικών κυττάρων (NSC), έχουμε εκ νέου αναλύθηκαν τα δεδομένα μικροσυστοιχιών από μια προηγούμενη μελέτη από Pollard

et al

[11]. Ενώ η πρώτη κύρια συνιστώσα διαχωρίζονται φυσιολογικό εγκέφαλο από NSCs και GICs (βλέπε [11]), η δεύτερη κύρια συνιστώσα κατετάγη GICs σε σχέση με την ομοιότητά τους με NSCs, ενδεχομένως αντανακλούν πτυχές της βλαστική ικανότητα (Εικ. 1Α). Η βλαστική ικανότητα που σχετίζεται με γονίδιο SOX2, το BLBP δείκτης NSC (πρωτεΐνη λιπιδίων δέσμευσης του εγκεφάλου, που κωδικοποιείται από το γονίδιο FABP7), καθώς και η νευρωνική TUBB3 δείκτη (τουμπουλίνης βήτα III), η οποία μπορεί να αντανακλά υψηλή ισχύ για την ταυτόχρονη νευρωνική διαφοροποίηση, είχαν εκφράζεται το υψηλότερα σε NSCs, και τα επίπεδα έκφρασης μειώθηκαν με τη σειρά της ομάδας GliNS1 & gt? G179NS & gt? G166NS (Εικ. 1Β). Ενώ η γραμμή GliNS1 ήταν μεταγραφικά σχετίζονται με NSCs (NSC-εγγύς), τη γραμμή G166NS, αποτέλεσε το απώτατο άκρο της κατάταξης σε σχέση με NSCs (NSC-άπω), εκφράζοντας δείκτες από κοινού με μικρογλοία και δραστικά αστροκύτταρα και συνδέονται με φλεγμονή, όπως για παράδειγμα IL-6, CXCL2 (ΜΙΡ-2), και CCL20 (Εικ. 1Β).

(Α) GIC γραμμές Rank διατάσσονται σε σχέση με τις γραμμές NSC (δεύτερο συστατικό σε μία ανάλυση των κύριων συστατικών των μικροσυστοιχιών έκφρασης mRNA με βάση δεδομένα από Pollard et al [11], όπου το πρώτο συστατικό διαχωρίζει NSCs και GICs από φυσιολογικό ιστό εγκεφάλου). GliNS1 προέρχεται από την γραμμή G144ED στη μελέτη Pollard et al. (Β) Re-ανάλυση του προφίλ μεταγραφικό σε Pollard et al σύγκριση GICs να NSCs υποδεικνύει NSC-εγγύς σύμπλεγμα GICs στελέχους που μοιάζει με μεγάλη ομοιότητα με NSCs, μοιράζονται π.χ. SOX2 και έκφραση BLBP. NSC-άπω γραμμές GIC σε αντίθεση εκφράζεται δείκτες μικρογλοία, όπως CXCL2, CXCL5 και CCL20. (Γ) De ηονο ανάλυση της αλληλουχίας RNA και συγκρίσεις κατά ζεύγη των NSCs και τρία επιμέρους γραμμές GIC (GliNS1, G179NS και G166NS) έδειξε ότι NSCs εξέφρασαν ένα μεγαλύτερο αριθμό γονιδίων με 10 φορές υψηλότερη έκφραση του γονιδίου σε σύγκριση με όλες τις γραμμές GIC. (Δ) κατά ζεύγη συγκρίσεις των NSCs στις γραμμές GIC GliNS1, G179NS και G166NS, ξεχωριστά. Γονίδιο εμπλουτισμό και την ανάλυση του γονιδίου οντολογία της αλληλουχίας με βάση τα προφίλ μεταγραφικό, εντόπισε ένα εμπλουτισμό του Ca

2 + σηματοδότησης γονίδια σε NSCs, η οποία αυξήθηκε με απώτερο σειρά κατάταξης στο NSC σε ζεύγη συγκρίσεις. (Ε) ζεύγη συγκρίσεις της NSC-εγγύς (GliNS1) και NSC-άπω (G166NS) GICs. Γονίδιο εμπλουτισμό και ανάλυση γονιδίων οντολογίας πρότεινε ένα διακόπτη στο Ca

2+ διαπερατά κανάλια Ca

2+ γονίδια στο NSC-άπω GIC γραμμή (πάνω κουτάκια) δεσμευτικές. Σε οικόπεδο ηφαίστειο, τα ονόματα των γονιδίων σε πράσινο γονίδια που σχετίζονται δηλώνουν κανάλι ιόντων /αντλία /μεταφορέα, ενώ τα ονόματα γονιδίων σε μωβ δηλώνουν Ca

2 + δεσμευτικές πρωτεΐνες των γονιδίων. Το οικόπεδο ηφαίστειο της σύγκρισης του NSC-εγγύς και NSC-άπω GICs αποκάλυψε ένα μεγαλύτερο αριθμό των καναλιών ιόντων που εκφράζονται στο NSC-εγγύς GIC (GliNS1).

Η

Ένα de novo βαθιά αλληλουχίας RNA των τριών των γραμμών GIC που χρησιμοποιούνται στην Pollard

κ.ά.

μελέτη (GliNS1, G179NS και G166NS) και μια γραμμή NSC (hf5205NS) έδειξε ότι περισσότερα γονίδια εκφράστηκαν σε NSCs από γραμμές GIC (Σχήμα 1C?. S1), ενδεχομένως αντανακλά την πλαστικότητα και την ικανότητα να διαφοροποιούνται τους. Ζεύγη NSC-GIC γονίδιο εμπλουτισμό και λειτουργική σχολιασμού (γονίδιο οντολογία) ανάλυση απροσδόκητα έδειξε ότι το Ca

2+ ιόντων πρόσδεση ήταν η πιο ουσιαστική μεταβολή της κατηγορίας και στις τρεις κυτταρικές σειρές – μια διαφορά που αυξήθηκε σε περισσότερα NSC-άπω γραμμές GIC (Εικ . 1D).

η διαφορική έκφραση του Ca

2 + provokers και ρυθμιστικά σχετίζεται με βλαστική ικανότητα

Κυτοσολικά Ca

2 + σηματοδότησης εξισορροπείται από διάφορους φορείς, όπως Ca

2+ διαπερατά κανάλια ιόντων που αυξάνουν την ενδοκυτταρική Ca

2+ (π.χ. τάση πύλης Ca

2 + κανάλια και υποδοχείς γλουταμινικού, εδώ ονομάζεται Ca

2 + provokers) από τη μία πλευρά, και Ca

2 + συνδετικά που μειώνουν την ελεύθερη ενδοκυττάριο Ca

2 + από την άλλη (εδώ ονομάζεται Ca

2 + buffers) [26]. Άμεση ζεύγη συγκρίσεις μεταξύ των διαφόρων γραμμών GIC έδειξε ότι η NSC-εγγύς GIC γραμμή (GliNS1) εξέφρασε ένα μεγαλύτερο αριθμό γονιδίων καναλιού ιόντων που περιλαμβάνουν Ca

2+ provokers σε σύγκριση με το NSC-άπω γραμμή GIC (G166NS). Αυτές κυμαίνονται από Ca

2+ διαπερατά κανάλια ιόντων (π.χ. υποδοχείς γλουταμινικού: GRIA1, GRIA2, GRIK3 και ρυθμιστικές υπομονάδες GRIN2B και GRIN2D), τασεοελεγχόμενων Ca

2 + κανάλια ιόντων (CACNA1C /-E /H) και Ca

2 + ενεργοποιημένων διαύλων καλίου (π.χ. KCNN3) (Σχ. 1Ε). Σε αντίθεση, η γραμμή NSC-άπω GIC (G166NS) εξέφρασαν υψηλότερα επίπεδα των αισθητήρων του ενδοκυτταρικού Ca

2+ προσκρουστήρες (για τα γονίδια της οικογένειας παράδειγμα S100 και CALB1).

Για να οριοθετηθούν περαιτέρω οι διαφορές στο Ca

2+ γονιδιακή έκφραση μεταξύ δοκιμαστεί γραμμών και NSCs GIC, η έκφραση του Ca

2+ provokers και ρυθμιστικά αναλύθηκε λεπτομερέστερα στις τρεις γραμμές GIC (S1 Εικ.). Όπως προτείνεται στις προηγούμενες ζεύγη συγκρίσεις, η έκφραση των υποδοχέων γλουταμικού μειώθηκε σε NSC-άπω γραμμές GIC (Εικ. 2Α). Η GRIA1 ΑΜΡΑ υποδοχέα (Ca

2 + διαπερατό ιονοτροπικού γλουταμινικό), η οποία έδειξε την υψηλότερη έκφραση μεταξύ των υποδοχέων του γλουταμικού, κατατάσσονται οι γραμμές GIC πανομοιότυπα με τη σειρά GliNS1 & gt? G179NS & gt? G166NS φαίνεται στην ανάλυση PCA (Σχ. 1Α) με βάση την σύγκριση με την έκφραση του γονιδίου NSC. Σε αντίθεση, η έκφραση του Ca

2 + buffers /δραστών αυξήθηκε με αντίστροφη σειρά κατάταξης των GliNS1 & lt? G179NS & lt? G166NS (Σχήμα 2Β.). Αυτό ήταν ιδιαίτερα εντυπωσιακή για το γονίδιο S100A6 που είχε πιο άφθονα εκφράζεται σε G166NS. Παρόμοια με τα δεδομένα mRNA, ανάλυση Western blot του GRIA1 αποκάλυψε μια 70% και περισσότερο από 95% χαμηλότερη έκφραση σε G179NS και G166NS αντίστοιχα σε σύγκριση με το NSC-εγγύς γραμμή GliNS1 (Σχ. 2Β και 2Ε). Η ανάλυση στυπώματος Western των S100A6 έδειξε 45% και 90% χαμηλότερη έκφραση σε G179NS και GliNS1, αντίστοιχα, σε σύγκριση με το NSC-άπω γραμμή G166NS (Σχ. 2C, 2D και 2Ε).

Ανάλυση της έκφρασης του Ca

2 + provokers όπως μία από τις υπομονάδες διαπερατό υποδοχέα του γλουταμινικού GRIA1 (Α) ή Ca

2 + ρυθμιστικό S100A6 (Β), κατετάγη τις 3 GIC γραμμές (GliNS1 και G166NS, n = 5 το καθένα. G179NS , n = 2.) σύμφωνα με Ca

2+ ευαισθησία φαρμάκου, με κανάλια γλουταμικού, όπως GRIA1, προβλέποντας υψηλότερη ευαισθησία και ρυθμιστικό έκφραση πρόβλεψη χαμηλότερη ευαισθησία (*** ρ & lt? 0,001? Αζευγάρωτη δύο tailed t-test) . (Γ) ανάλυση κηλίδας Western έδειξε έκφραση πρωτεΐνης GRIA1 και S100A6, με β-ακτίνη ως έλεγχος φόρτωσης. (D) Τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης του GRIA1 εκφράστηκαν ως αλλαγή ποσοστό φορές όταν συγκρίνεται προς GliNS1 (n = 3) και τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης (Ε) S100A6 εκφράστηκαν ως αλλαγή ποσοστό φορές όταν συγκρίνεται με G166NS (n = 3) (** * p & lt? 0.001? ** p & lt? 0,01, * ρ & lt?. 0.05 One-way ANOVA)

Η

GIC Ca

2+ ευαισθησία των ναρκωτικών συσχετίζεται με μεταγραφικό γειτνίαση με NSCs

Επιπλέον Ca

2+ provokers και ρυθμιστικά, μεμβράνη πλάσματος εντοπισμένη Ca

2+ μεταφορείς, όπως εναλλάκτες νατρίου-ασβεστίου (NCX) που ανήκει στην οικογένεια SLC8 και το SERCA (Sarco /ενδοπλασματικό δίκτυο Ca

2+ ΑΤΡ) αντλία εντοπίζεται στη μεμβράνη του ενδοπλασματικού δικτύου (ER), αφαιρέστε ενεργά κυτοσολικά Ca

2+ για τη διατήρηση της ομοιόστασης [27] – [30]. Να διερευνήσει τις δυνατότητες λειτουργικές επιπτώσεις μιας διαφορικής έκφρασης των Ca

2 + κανάλια ιόντων και ασβεστίου

2+ γονίδια δεσμευτική, έχουμε την επόμενη εκτελείται ένα φάρμακο με τη μεσολάβηση πρόκληση του Ca

2 + ομοιόσταση και σηματοδότηση, στην GIC γραμμές. Τα κύτταρα εκτέθηκαν είτε στην ανεξάρτητη κατιόν στόχο (Ca

2+) ιοντοφόρου Α23187 ή ο αναστολέας αντλίας SERCA θαψιγαργίνη (Εικ. 3), τα οποία αυξάνουν κυτοσολίου Ca

2+ επίπεδα από δύο διαφορετικούς μηχανισμούς: Α23187 επιτρέποντας Ca

2+ για να διασχίσουν τη μεμβράνη κανονικά αδιαπέραστο κυττάρων, και θαψιγαργίνη μπλοκάροντας την εισαγωγή του Ca

2+ στο ER. Οι γραμμές GIC έδειξαν διαφορές στην ευαισθησία τόσο για Α23187 και θαψιγαργίνη (Εικ. 3Α και 3Β, αντιστοίχως), εντυπωσιακά με σειρά κατάταξης μεταξύ των γραμμών πανομοιότυπη με εκείνη του NSC-ριζωμένη ώστε μεταγραφικό κατάταξης, με το NSC-εγγύς GliNS1 είναι πιο ευαίσθητα από G179NS, ενώ οι NSC-άπω G166NS ήταν λιγότερο ευαίσθητα σε δύο φαρμάκων. Λειτουργικές αναλύσεις έτσι δείχνουν ότι NSC-εγγύς GICs με υψηλότερη έκφραση του Ca

2+ provokers, είναι πιο ευαίσθητα σε διαταραχές κυτοσολίου Ca

2+ ρύθμιση από GICs με NSC-άπω φαινότυπο που εκφράζουν υψηλότερα επίπεδα του Ca

2 + buffers.

(Α) της δόσης ανάλυση απόκρισης (0,01-40 μΜ) του Ca

2 + ιοντοφόρο Α23187 και (Β) το SERCA Ca

2 + αναστολέα της αντλίας θαψιγαργίνη έδειξε ότι το Ca

2+ βαθμό ευαισθησίας των ναρκωτικών διέταξε με ομοιότητα μεταγραφικό να NSCs, με την υψηλότερη ευαισθησία στις NSC-εγγύς GICs. NSC εγγύς GIC ήταν πιο ευαίσθητα σε (C) 40 μΜ Α23187 και (Δ) 0,156 μΜ θαψιγαργίνη θεραπείες σε σύγκριση με τα άπω γραμμές NSC (* ρ & lt? 0,05? Αζευγάρωτη δύο tailed t-test). NSC-εγγύς GICs n = 3 και NSC-άπω GICs n = 4.

Η

Μειωμένη Ca

2+ ευαισθησία φαρμάκου κατά την GIC διαφοροποίηση

Ως ευαισθησία στο Ca

2+ φαρμάκων συνδέθηκε με μια NSC-σαν έκφραση προφίλ το ερώτημα κατά πόσον η διαφοροποίηση των GICs θα επηρεάσει Ca

2+ ευαισθησία διερευνήθηκε. Για το σκοπό αυτό, τρεις γραμμές GIC υποβλήθηκαν σε ένα πρωτόκολλο διαφοροποίηση χρησιμοποιώντας ορό εμβρύου μόσχου (FBS). Επικύρωση της διαφοροποίησης έγινε με ανάλυση μεταγραφικό των γραμμών GIC και διαφοροποιημένους απογόνους χρησιμοποιώντας αλληλούχιση RNA τους (S1 πίνακα). Ανάλυση σε κύριες συνιστώσες του παγκόσμιου συνόλου δεδομένων έδειξε ότι οι αλλαγές στο μεταγραφικό ήταν διαφορετικές και διαχωρίζονται σημαντικά μεταξύ αδιαφοροποίητα GICs και διαφοροποιημένη GICs (diffGICs) (Εικ. 4Α). Είναι ενδιαφέρον ότι, η έκφραση GRIA1 που συσχετίζονται με Ca

2+ ευαισθησία των ναρκωτικών, μειώθηκαν σε όλες τις γραμμές GIC κατά τη διαφοροποίηση (Εικ. 4Β), η οποία πρότεινε ότι το καθεστώς της διαφοροποίησης θα μπορούσε να επηρεάσει Ca

2+ ευαισθησία. Λειτουργική Ca

2+ επομένως ευαισθησία προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας Α23187 (10 μΜ, 48 ώρες) σε διαφοροποιημένα GICs και σε σύγκριση με μη διαφοροποιημένα GICs αποκαλύπτοντας ένα σαφώς μειωμένο αποτέλεσμα επί της βιωσιμότητας των κυττάρων σε όλες τις γραμμές GIC κατά τη διαφοροποίηση και με το ισχυρότερο αποτέλεσμα στο φάρμακο ευαίσθητη NSC-εγγύς GIC γραμμή (GliNS1) (Σχ. 4C). Τα ευρήματα αυτά υποστηρίζουν περαιτέρω τα δεδομένα που Ca

2+ ευαισθησία συνδέεται με ανώριμα NSC-όπως GICs.

(Α) χαρτογράφηση μεταγραφικό αλληλουχίας RNA που ακολουθείται από ανάλυση σε κύριες συνιστώσες επαληθεύεται διαχωρισμού μεταξύ αδιαφοροποίητα και διαφοροποιημένα GICs (GliNS1 , G179NS και G166NS). Δεξιός πίνακας δείχνει ανοσοφθορισμού χρώσεις της διαφοροποίησης Σημάδια GFAP (κόκκινη) και Tuj 1 (πράσινο) κατά την αγωγή FBS. (Β) Σύγκριση των επιπέδων έκφρασης GRIA1 σε αδιαφοροποίητα και διαφοροποιημένα GICs (n = 6) αποκάλυψε μια μείωση φορές αλλαγή στην έκφραση GRIA1 κατά τη διαφοροποίηση στον ορό που προκαλείται σε όλες τις γραμμές GIC. (*** Ρ & lt? 0,001? Αζευγάρωτη δύο tailed t-test). (Γ) ανάλυση βιωσιμότητας κυττάρων του σχετική ευαισθησία προς το Ca

2+ ιονοφόρο Α23187 μετά τη διαφοροποίηση έδειξε αυξημένη βιωσιμότητα κατά τη διαφοροποίηση της NSC-εγγύς γραμμή GIC GliNS1 (* ρ & lt? 0,05? Αζευγάρωτη δύο tailed t-test).

Η γονιδιακή έκφραση συσχετίζεται με Ca

2+ ευαισθησία των ναρκωτικών

Για να διερευνήσει τις δυνατότητες επιπλέον γονίδια συσχετίζεται με Ca

2+ ευαισθησία, στοιχεία μεταγραφικό από εννέα νέες γραμμές GIC (που προέρχεται σε ένα ανεξάρτητο εργαστήριο) συγκρίθηκε με Ca

2+ δεδομένα ευαισθησίας από την έκθεση σε θαψιγαργίνη (έκθεση 72 ώρες) (Σχ. 5Α και S2 πίνακα). 7 από τα 9 γραμμές έχουν δειχθεί να ανακεφαλαιώσουμε το μητρικό όγκου (S3 πίνακα). Ανάλυση συσχέτισης (Pearson) μεταξύ NSC-δεικτών και ευαισθησία σε θαψιγαργίνη (1 μΜ) αποκάλυψε μία σημαντική συσχέτιση για νεστίνη (NES) (Εικ. 5Β, ακραία σημειώνονται με κόκκινο χρώμα εξαιρέθηκε από την ανάλυση) και λιπίδια bindig πρωτεΐνη εγκεφάλου (BLBP έκφραση mRNA /FABP7) (Σχ. 5C), ενώ δεν βρέθηκε κανένας συσχετισμός για SOX2 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η ανάλυση στυπώματος Western επαλήθευσε ότι περαιτέρω ευαίσθητες σειρές φάρμακο ασβέστιο (U3017-MG και U3084-MG) που εκφράζεται περισσότερο BLBP πρωτεΐνη από λιγότερο ευαίσθητες σειρές (U3013-MG και U3035-MG) (Σχ. 5D). Η ανάλυση συσχέτισης επιβεβαίωσε επίσης μια συσχέτιση μεταξύ της ευαισθησίας στην θαψιγαργίνη και έκφραση GRIA1 (Σχ. 5Ε), η οποία επιβεβαιώθηκε από την ανάλυση των επιπέδων πρωτεΐνης με κηλίδα western, όπως έκφραση πρωτεΐνης GRIA1 ανιχνεύθηκε μόνο στους ευαίσθητους GICs (Εικ. 5F). Περαιτέρω γονίδιο εμπλουτισμό και γονίδιο οντολογία αναλύσεις σιωπηρή γονιδίων που εμπλέκονται στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, το οξυγόνο, το μεταβολισμό του RNA και μακρομόριο, και όχι απροσδόκητα Ca

2 + μεσολάβηση σηματοδότησης ως συσχετίζεται με Ca

2+ ευαισθησία του φαρμάκου (Εικ. 6Α) .

(Α) Εννέα νέα GIC γραμμές υποβλήθηκαν σε ανάλυση δόσης απόκρισης θαψιγαργίνη (0.1-100 μΜ), που δείχνουν διαφορετικές απόκριση σε μέτριες δόσεις φαρμάκου. (Β, Γ) Οικόπεδο συσχέτιση μεταξύ βιωσιμότητα των κυττάρων μετά από Ca

2+ έκθεση στο φάρμακο (θαψιγαργίνη, 1 μΜ) και (Β) NES και (Γ) FABP7 έκφραση /BLBP mRNA. U3047-MG θεωρήθηκε ακραία στο γράφημα NES (σημειώνονται με κόκκινο χρώμα) και αποκλείεται από την ανάλυση. (D) ανάλυση κηλίδας Western που δείχνει BLBP (FABP7) έκφραση πρωτεΐνης σε επιλεγμένα θαψιγαργίνη ευαίσθητα (U3017-MG και U3084-MG) και λιγότερο ευαίσθητη (U3013-MG και U3035-MG) κυτταρικές γραμμές, με β-ακτίνη ως έλεγχος φόρτωσης. (Ε) Οικόπεδο συσχέτιση μεταξύ βιωσιμότητα των κυττάρων μετά από Ca

2+ έκθεση στο φάρμακο (θαψιγαργίνη, 1 μΜ) και GRIA1 mRNA έκφρασης. (F) Δυτική έκφραση blot ανάλυση δείχνει πρωτεΐνη GRIA1 σε επιλεγμένες θαψιγαργίνη ευαίσθητα (U3017-MG και U3084-MG) και λιγότερο ευαίσθητα (U3013-MG και U3035-MG) κυτταρικές σειρές. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

(Α) Μια ανάλυση συσχέτισης της έκφρασης γονιδιώματος μεγάλη mRNA (ανάλυση μικροσυστοιχιών) και την ευαισθησία στην θαψιγαργίνη (1 μΜ) σε 9 επιπλέον γραμμές GIC, ανακτώνται 785 γονίδια συσχετίζεται με Ca

2+ ευαισθησία των ναρκωτικών. Γονίδιο εμπλουτισμό και την οντολογία αναλύσεις έχουν εντοπιστεί εμπλοκή των γονιδίων που επηρεάζουν τον πολλαπλασιασμό, το οξυγόνο και το μεταβολισμό του RNA, τον καταβολισμό και Ca

2 + μεσολάβηση σηματοδότησης. (Β) 385 γονίδια θετικώς συσχετίζεται με υψηλή ευαισθησία διηθούνται πρώτα για τα γονίδια που εκφράζονται επίσης υψηλότερη στην NSC-εγγύς γραμμή GIC GliNS1 και εν συνεχεία επίσης ρυθμίζεται προς τα κάτω σε αυτή τη γραμμή κατά τη διαφοροποίηση, η οποία βρέθηκε να μειώσει Ca

2+ ευαισθησία φαρμάκου , την ανάκτηση ένα σύνολο εννέα γονίδια, συμπεριλαμβανομένου του υποδοχέα κωδικοποίησης GRIA1 ΑΜΡΑ.

η

για την ταυτοποίηση των γονιδίων σε αυτό το σύνολο δεδομένων που σχετίζονται επίσης με NSC-εγγύς βλαστική ικανότητα υπογραφή στο GICs, το σύνολο διηθείται περαιτέρω για γονίδια, τα οποία επίσης (1) είχε υψηλότερη έκφραση σε σύγκριση με GliNS1 G166NS και (2) έχουν μειωτικά κατά τη διαφοροποίηση (Σχ. 6Β). Αυτό ανακτηθεί ένα σύντομο κατάλογο των εννέα γονίδια, δύο εκ των οποίων κώδικα για τα κανάλια ιόντων που μπορεί να αυξήσει του κυτταροπλάσματος Ca

2 + (Ca

2+ provokers), δηλαδή GRIA1 και την προς τα μέσα ανορθωτή Κ

+ κανάλι KCNJ4 , η οποία μπορεί να συμμετέχει στη διατήρηση ενός αποπολωμένα δυναμικό της μεμβράνης που απαιτείται για την ενεργοποίηση τασεοελεγχόμενων Ca

2 + κανάλια και Ca

2 + διαπερατό υποδοχείς γλουταμινικού. Εν ολίγοις, η συσχέτιση μεταξύ των λειτουργικών Ca

2+ ευαισθησία των ναρκωτικών και της γονιδιακής έκφρασης υποδηλώνει συμμετοχής προς ευαισθησία στο φάρμακο προκάλεσε Ca

υπερφόρτωση 2+, από ένα δίκτυο γονιδίων που εμπλέκονται στη διατήρηση Ca

2 + ομοιόσταση και δυναμικό της μεμβράνης.

ανάλυση reactome Φαρμάκων εντοπίζει Ca

2 + επαγόμενη έκφραση του γονιδίου στην παγκόσμια μεταγραφικό

για την αναγνώριση ενδοκυτταρική απαντήσεις σε Ca

2+ στηρίζεται η διαφορά επιπέδου του Ca

2+ ευαισθησία σε GICs, οι NSC-εγγύς GliNS1 και NSC-άπω G166NS εκτέθηκαν σε Α23187 επί 7 ώρες, ακολουθούμενη από ανάλυση με αλληλούχιση μεταγραφικό RNA ( «χαρτογράφηση reactome φάρμακο») (S4 πίνακα). Στην πιο Ca

2 + ευαίσθητη ναρκωτικών γραμμή GIC GliNS1, γονίδια με σημαντικά αλλοιωμένη έκφραση (Benjamini προσαρμοσμένη τιμή p & lt? 0,05) αναλύθηκαν με γονιδιακή εμπλουτισμό και τη γονιδιακή οντολογία, η οποία έδειξε ότι τα γονίδια που σχετίζονται με τον κυτταρικό κύκλο άλλαξαν (Εικ . 7Β και S2 Εικ.), γεγονός που υποδηλώνει διακοπή του κυτταρικού κύκλου πριν σε κυτταρικό θάνατο. Όχι απροσδόκητα, τα γονίδια που εμπλέκονται στην απόκριση ER στρες επίσης εμπλουτισμένο, όπως και τα γονίδια σε μεταβολικές διαδικασίες RNA. Είναι ενδιαφέρον, μεταβολική διαδικασία του RNA που εμπλέκονται γονίδια επίσης συσχέτιση με την ευαισθησία θαψιγαργίνη στο προηγούμενο πείραμα (Σχ. 6Α).

απόκριση Μεταγραφική σε αυξημένη κυτοσολίου Ca

2+ (Α23187), ερευνήθηκε με ανάλυση αλληλουχίας RNA μετά 7 ώρες έκθεσης στο φάρμακο στο NSC-εγγύς GIC γραμμή GliiNS1 και η NSC-άπω γραμμή G166NS. Ηφαίστειο οικόπεδα σημαντικά (p & lt? 0,05) αλλοιωμένη έκφραση του γονιδίου σε GliNS1 (Α) και G166NS (C) με κοινόχρηστο προκαλείται από γονίδια που σημειώνονται με κόκκινο και πράσινο (Ca

2 + ενεργοποιημένο παράγοντα μεταγραφής NFATC2). Σημειώστε τις διαφορές στην χ-άξονας δείχνει υψηλότερη όλες τις παγκόσμιες επαγωγή της γονιδιακής έκφρασης σε GliNS1. (Β) Gene εμπλουτισμό και την ανάλυση του γονιδίου οντολογία γονιδίων με σημαντική αλλαγή στην έκφραση (p & lt? 0,05) σε GliNS1, εντοπίστηκαν γονίδια που εμπλέκονται στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, καθώς και ER /λειτουργίες που σχετίζονται Golgi και κυτταρική αντίδραση στο στρες. (Δ) Ανάλυση εμπλουτισμό Gene γονιδίων ρυθμίζεται προς τα κάτω τουλάχιστον 3 φορές σε GliNS1 και ρυθμίζεται αυξητικά τουλάχιστον 1,5 φορές σε G166NS.

Η

γονιδίων με αλλαγμένη έκφραση μετά την έκθεση στο φάρμακο σχεδιάστηκαν έναντι μέσης τιμής έκφρασης (πριν