Αφηρημένο

Ιστορικό

adherens κόμβους αποτελούνται από διαμεμβρανικές καντερίνες, οι οποίες αλληλεπιδρούν ενδοκυτταρικά με p120ctn, β-κατενίνης και α-κατενίνης. p120ctn είναι γνωστό ότι ρυθμίζει προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου με την αύξηση της σταθερότητας καντερίνη, αλλά τα αποτελέσματα των άλλων συστατικών προσφύσεως διασταύρωση στην προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου δεν έχουν συγκριθεί με εκείνη των p120ctn.

Μεθοδολογία /Principal Εκτίμηση

Δείχνουμε ότι η εξάντληση των p120ctn από μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) σε DU145 καρκίνου του προστάτη και ΜΟΡ10Α επιθηλιακά κύτταρα του μαστού μειώνει τα επίπεδα έκφρασης του πρωτεϊνών adherens διασταύρωση, Ε-καδερίνης, Ρ-cadherin, SS-κατενίνης και α-κατενίνης, και προκαλεί απώλεια της προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου. p120ctn εξαντλημένα κύτταρα έχουν επίσης αυξημένη ταχύτητα μετανάστευσης και της εισβολής, η οποία συσχετίζεται με αυξημένη Rap1 αλλά όχι Rac1 ή RhoA δραστηριότητα. Προς τα κάτω ρύθμιση της Ρ-cadherin, β-κατενίνης και α-κατενίνης, αλλά όχι Ε-καδερίνης επάγει μία απώλεια της προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου, αυξημένη μετανάστευση και ενισχυμένη εισβολή παρόμοια με p120ctn εξάντληση. Ωστόσο, μόνο p120ctn εξάντληση οδηγεί σε μείωση των επιπέδων των άλλων πρωτεϊνών προσκόλλησης διασταύρωση.

Συμπεράσματα /σημαντικότητα

Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η Ρ-καντερίνη αλλά όχι Ε-καδερίνης είναι σημαντική για τη διατήρηση της adherens διασταυρώσεις σε DU145 και κύτταρα ΜΟΡ10Α, και ότι η εξάντληση οποιουδήποτε από τα καντερίνης-συνδεόμενες πρωτεΐνες, p120ctn, SS-κατενίνης ή α-κατενίνης, είναι αρκετή για να διαταράξει ενώσεις προσφύσεως σε κύτταρα DU145 και να αυξήσει τη μετανάστευση και εισβολή των καρκινικών κυττάρων.

Παράθεση: Kümper S, Ridley AJ (2010) p120ctn και Ρ-καδχερίνη, αλλά όχι E-καδχερίνη Ρυθμίζουν κυτταρική κινητικότητα και εισβολή των DU145 κυττάρων καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 5 (7): e11801. doi: 10.1371 /journal.pone.0011801

Επιμέλεια: Robin Charles Μαΐου, το Πανεπιστήμιο του Birmingham, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 2 Φεβρουαρίου 2010? Αποδεκτές: 29 Ιουνίου 2010? Δημοσιεύθηκε: 27 Ιουλίου του 2010

Copyright: © 2010 Kuemper, Ridley. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από Cancer Research UK, Bettencourt-Schueller Ιδρύματος, καθώς και ένα πλαίσιο 6 σύμβαση της Ευρωπαϊκής Επιτροπής (LSHG-CT-2003 με 502.935? MAIN). SK υποστηρίχθηκε από ένα διδακτορικό υποτροφία από το Kings College London School of Biomedical και Επιστημών Υγείας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

κατά τη διάρκεια μετάσταση, τα καρκινικά κύτταρα αποκτούν συνήθως την ικανότητα να μεταναστεύουν και να εισβάλλουν ιστούς με τη ρύθμιση της αλληλεπίδρασής τους με άλλα κύτταρα και το εξωκυτταρικό περιβάλλον τους. Πολλές μελέτες δείχνουν ότι μεταβολές στην προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου συσχετίζονται με την εξέλιξη του όγκου των επιθηλιακών και τη μετάσταση [1]. Τα καρκινικά κύτταρα μπορούν να εισβάλουν είτε ως απλά κύτταρα είτε συλλογικά ως ομάδες κυττάρων [2], [3], [4]. Και οι δύο τύποι εισβολής συνεπάγονται διάσπαση του επιθηλίου η οποία συνήθως απαιτεί μια αποδυνάμωση των επαφών κυττάρου-κυττάρου και μεταβολή του σχήματος του κυττάρου. Καντερίνες και κατενίνες σχηματίζουν ενώσεων προσφύσεως, τα οποία είναι κεντρική μεσολαβητές της προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου. Η έκφραση των πρωτεϊνών προσφύσεως διασταύρωση συχνά μειώνεται σε όγκους, και την ανασύσταση των λειτουργικών ενώσεις προσφύσεως μπορεί να επανέλθει η επεμβατική φαινότυπο των καρκινικών κυττάρων [5], [6], [7].

Η κλασική καντερίνες (Ε-, συστήματος ανοικτής, Ν και P-cadherin) είναι οι κεντρικές διαμεμβρανικές πρωτεΐνες του συγκροτήματος προσφύσεων διασταύρωση και να μεσολαβήσει Ca

2 + εξαρτώμενη homophilic μεσοκυττάρια αλληλεπιδράσεις. β-κατενίνης και της πλακοσφαιρίνης /γ-κατενίνης συνδέονται στην καντερίνη ενδοκυτταρικές περιοχές με αμοιβαία αποκλειστικό τρόπο και α-κατενίνης με τη σειρά του συνδέεται σε β-κατενίνης [8]. ρ120-κατενίνης (p120ctn) από την άλλη πλευρά συνδέεται σε μία διαφορετική περιοχή του καντερίνες σε β-κατενίνης [9], [10], [11], [12], [13], [14]. Η σύνθεση των πρωτεϊνών του συμπλόκου προσφύσεως διασταύρωση εξαρτάται από τον τύπο των κυττάρων και την έκφραση καντερίνης. α-κατενίνης παρέχει ένα σημαντικό σύνδεσμο μεταξύ των ενώσεων προσφύσεως και την ακτίνη του κυτταροσκελετού. αλληλεπίδρασή της με νημάτια ακτίνης, ωστόσο, φαίνεται να είναι αλληλοαποκλειόμενες στην σύνδεσή του με β-κατενίνη που υποδηλώνει μια έμμεση σύνδεση μεταξύ των κόμβων και του κυτταροσκελετού της ακτίνης [15], [16].

p120ctn έχει βρεθεί να ρυθμίσει adherens σταθερότητας διασταύρωση

in vitro

[17], [18], [19] και

in vivo

[20], [21], [22]. εξάντληση του από RNAi οδηγεί σε μείωση στις πρωτεΐνες προσφύσεως διασταύρωση και καταργεί την προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου [17], εν μέρει από την αύξηση της καντερίνης ενδοκύτωση και αποικοδόμηση [19], [23]. p120ctn επηρεάζει επίσης τη δραστικότητα των μικρών GTPases RhoA, Rac1 και Cdc42 σε ορισμένους τύπους κυττάρων [24], [25], [26], [27], τα οποία διαδραματίζουν κεντρικό ρόλο στη ρύθμιση της δυναμικής του κυτταροσκελετού, το σχηματισμό και τη συντήρηση των προσφύσεων κόμβους και την κυτταρική μετανάστευση [28], [29]. p120ctn μπορεί επομένως συνδέουν ενώσεις προσφύσεως και Rho ΟΤΡάσες.

Οι επιδράσεις της p120ctn στην κυτταρική μετανάστευση και εισβολή ποικίλλουν ανάλογα με τον τύπο του κυττάρου, τις συνθήκες δοκιμασίας και τύποι καντερίνες εκφράζονται [30], [31], [32] . Δεν είναι σαφές σε ποιο βαθμό οι επιπτώσεις της p120ctn μεσολάβηση adherens διασταυρώσεις ή Rho ΘΤΡάσες. Για να αντιμετωπιστεί αυτό, έχουμε γκρέμισε p120ctn σε DU145 κυττάρων καρκίνου του προστάτη και ΜΟΡ10Α μαστικά επιθηλιακά κύτταρα, τα οποία αμφότερα έχουν κανονικά ενώσεις προσφύσεως περιέχει Ε-καδερίνης και Ρ-cadherin. Στους δύο τύπους κυττάρων εξάντληση των p120ctn οδηγεί σε διαταραχή του κυττάρου-κυττάρου επαφές, ρύθμιση προς τα κάτω των πρωτεϊνών διασταύρωση προσφύσεων και αυξημένη κυτταρική κινητικότητα. Είναι ενδιαφέρον ότι η knockdown του p120ctn δεν επηρέασε τα επίπεδα δραστηριότητας των Rho GTPases Rac1 και RhoA αλλά οδήγησε σε αύξηση των δραστικών Rap1. Για πρώτη φορά έχουμε γκρέμισε καντερίνες καθώς κατενίνες και δείχνουν ότι η Ρ-καντερίνη, β-κατενίνης και α-κατενίνης, αλλά όχι εξάντληση Ε-καδερίνης μιμούνται τα αποτελέσματα των p120ctn καταστολή και να οδηγήσει σε απώλεια των επαφών κυττάρου-κυττάρου και ενισχυμένη εισβολή.

Αποτελέσματα

καταστολή της έκφρασης p120ctn οδηγεί σε αρνητική ρύθμιση των πρωτεϊνών προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου και διακοπή των επαφών μεταξύ κυττάρων

για να διερευνήσει τις επιπτώσεις της p120ctn στο κελί των β-κυττάρων προσκόλλησης, συγκρίναμε τις επιδράσεις της εξάντλησης p120ctn σε δύο διαφορετικές κυτταρικές σειρές που έχουν ενώσεις προσφύσεως, ο ανθρώπινος καρκίνος του προστάτη κυτταρική γραμμή DU145 και η ανθρώπινη μαστική επιθηλιακή κυτταρική γραμμή ΜΟΡ10Α. DU145 και ΜΟΡ10Α κύτταρα σχηματίζονται επαφές κυττάρου-κυττάρου και εκφράζεται τόσο Ε- και Ρ-cadherin, η οποία εντοπίζεται στο κύτταρο-κύτταρο επαφές (Εικ. 1Α, Β). DU145 και ΜΟΡ10Α κύτταρα εκφράζουν κατά κύριο λόγο δύο ισομορφές p120ctn που, με βάση το μοριακό τους βάρος, προβλέπονται να είναι ισομορφές 1 και 3 [33] με ισομορφή 3 (κάτω ζώνη) που εκφράζονται σε ελαφρώς υψηλότερα επίπεδα (Σχ. 1).

κύτταρα DU145 (Α) και ΜΟΡ10Α (Β) επιμολύνονται με τα siRNA για p120ctn (p120ctn (1), (2)), τον έλεγχο siRNA ή με αντιδραστήριο επιμόλυνσης μόνο (μακέτα). Μετά από 72 ώρες, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και υπέστησαν χρώση για Ρ-ακτίνη, p120ctn και Ε-καδερίνη ή Ρ-καντερίνη (αριστερά πάνελ), ή λύονται και αναλύονται με ανοσοκηλίδωση για τις υποδεικνυόμενες μόρια προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου και p120ctn knockdown απόδοσης (δεξιά πάνελ) . Ράβδοι κλίμακας = 25 μm. ERK χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης για ανοσοστυπώματα.

Η

εξόντωση p120ctn με δύο διαφορετικά siRNAs στα κύτταρα DU145 και ΜΟΡ10Α επαγόμενη διάσπαση του προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου με αποτέλεσμα ένα «διάσπαρτες» φαινότυπο (Σχ. 1, Σχ. 2). Επιπλέον, τα κύτταρα DU145 σταθερώς εξαντλημένο από p120ctn δεν έχουν σταθερές adherens διασταύρωση (Εικ. S1). Αυτός ο φαινότυπος ήταν ειδικά λόγω εξάντλησης p120ctn, αφού η έκφραση του shRNA ανθεκτικών p120ctn ποντικού (GFP-σύντηξης) διασώθηκε σχηματισμός διασταύρωση, όπως προσδιορίζεται από τον εντοπισμό του p120ctn και Ε-καδερίνης (Εικ. S1).

DU145 ( A, C, D) και ΜΟΡ10Α (κύτταρα Β Γ) διαμολύνθηκαν με τα siRNA για p120ctn (p120ctn (1), (2)), siRNA για Ε-καδερίνη (Ε-καδερίνης), τον έλεγχο siRNA (έλεγχος) ή με διαμόλυνση αντιδραστήριο μόνο (μακέτα). Μετά από 56 ώρες, τα κύτταρα παρακολουθήθηκαν με μικροσκοπία time-lapse, αποκτώντας μια εικόνα κάθε 10 λεπτά επί μία περίοδο 16 ωρών. Αντιπροσωπευτικά παραδείγματα εικόνων αντίθεσης φάσης των κυττάρων από τις ταινίες (αριστερά πάνελ) και ίχνη μετανάστευση (δεξιά πάνελ? Σημείο της κάθε κυψέλης να αρχίσει σχεδιάζεται στην τομή των χ και γ άξονες) παρουσιάζονται για τον έλεγχο επιμολυσμένα και p120ctn εξαντλημένο DU145 (Α) και ΜΟΡ10Α κύτταρα (Β). Ράβδοι κλίμακας = 50 μm. Οι (C, D) ταχύτητες Μετανάστευση απεικονίζεται ως κουτί και μουστακιού οικόπεδα δείχνει μέση, διατεταρτημοριακό εύρος (κουτιά) και υψηλότερες και χαμηλότερες τιμές (μουστάκια). (C) ταχύτητες μετανάστευση των κυττάρων DU145 και ΜΟΡ10Α. (D) ταχύτητες μετανάστευση των κυττάρων ελέγχου DU145 σε αποικίες σε σύγκριση με μεμονωμένα κύτταρα. Τα δεδομένα είναι από τρία διαφορετικά πειράματα, κάθε διεξάγονται εις διπλούν, αναλύοντας 15 κύτταρα ανά πεδίο (περίπου 90 κύτταρα συνολικά). *** Ρ & lt? 0.001, σε σύγκριση με τον έλεγχο και προσδιορίζεται από t-test του Student

Η

Τόσο Ε-καδερίνης και Ρ-καντερίνης, καθώς και β- και α-κατενίνης ρυθμίστηκαν προς τα κάτω σε p120ctn-εξαντλημένο. κύτταρα. Προς τα κάτω ρύθμιση των καδερινών συσχετίζεται με την έκταση της εξάντλησης p120ctn: σε 72 ώρες μετά την επιμόλυνση με siRNAs που στοχεύουν p120ctn, επίπεδα p120ctn ήταν χαμηλότερα από ό, τι στις 48 ώρες, και τα επίπεδα Ε-καδερίνης ήταν χαμηλότερες σε 72 ώρες από 48 ώρες (τα στοιχεία δεν φαίνονται)

p120ctn-εξαντλημένο κύτταρα ήταν ωστόσο δεν είναι πιθανό να έχουν υποστεί επιθηλιακά να μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ), καθώς τα επίπεδα των πρωτεϊνών-δεικτών EMT όπως βιμεντίνη δεν είχαν αυξημένη σε σύγκριση με τον έλεγχο-επιμολυσμένα κύτταρα DU145 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

p120ctn ρυθμίζει τη μετανάστευση των κυττάρων DU145 και ΜΟΡ10Α

για να ελέγξετε αν η μετανάστευση των κυττάρων επηρεάστηκε από την εξάντληση p120ctn, τα κύτταρα παρακολουθούνται από μικροσκοπίας time-lapse πάνω από 16 ώρες (Εικ. 2Α, Β) και παρακολουθούνται με καθορίζουν την ταχύτητα της μετανάστευσης τους. p120ctn εξαντλημένο DU145 και ΜΟΡ10Α κύτταρα τόσο μετανάστευσαν ταχύτερα από τα κύτταρα ελέγχου (Εικ. 2, Ταινίες S1, S2, S3 και S4). Αντιθέτως, η εξάντληση του Ε-καδερίνης δεν μετέβαλε ταχύτητα μετανάστευση κυττάρων (Σχ. 2C), ακόμη και αν το επίπεδο έκφρασης του μειώθηκε κατά p120ctn knockdown (Εικ. 1). Η ταχύτητα μετανάστευσης των κυττάρων ελέγχου προσδιορίστηκε από κύτταρα βρίσκονται εντός κυττάρου αποικίες (Σχ. 2C), αλλά μερικά κύτταρα στον πληθυσμό μετανάστευσε ως απλά κύτταρα (Ταινίες S1 και S3). Ωστόσο, δεν υπήρχε διαφορά στην ταχύτητα μετανάστευσης των κυττάρων DU145 σε αποικίες ή μονά κύτταρα (Σχ. 2D), αποκλείοντας την πιθανότητα ότι p120ctn εξαντλημένο κυττάρων που μετανάστευσαν ταχύτερα, επειδή ήταν κυρίως μονά κύτταρα και όχι σε αποικίες.

η μετανάστευση των κυττάρων αναλύθηκε επίσης σε δοκιμασίες μηδέν-τυλίγεται σε μονοστιβάδες συρροής των κυττάρων DU145. Οι περισσότεροι p120ctn εξαντλημένο κύτταρα μετανάστευσε ως μεμονωμένα κύτταρα εντός του τραύματος, ενώ τα κύτταρα ελέγχου μετανάστευσε ως ένα φύλλο, τη διατήρηση των επαφών κυττάρου-κυττάρου (Εικ. 3Α, Ταινίες S5, S6). p120ctn-εξαντλημένο κυττάρων που μετανάστευσαν ταχύτερα από τα κύτταρα ελέγχου (Σχ. 3Β). Ωστόσο, p120ctn-εξαντλημένο κύτταρα έδειξαν μία μείωση στην επιμονή (Σχ. 3Β), γεγονός που δείχνει ότι αλλάζουν κατεύθυνση πιο συχνά. Έτσι, παρά την αυξημένη ταχύτητα μετανάστευσης, τραύματος χρόνος κλεισίματος ήταν παρόμοια για τον έλεγχο-επιμολυσμένα κύτταρα (Σχ. 3C).

κύτταρα DU145 επιμολύνθηκαν με siRNAs για p120ctn (p120ctn) (2) και τον έλεγχο siRNA (έλεγχος) . Μετά από 56 ώρες, ένα συρρέουσα μονοστιβάδα τραυματίστηκε χρησιμοποιώντας ένα ρύγχος πιπέτας και των κυττάρων παρακολουθήθηκε με μικροσκοπία time-lapse, αποκτώντας μια εικόνα κάθε 10 λεπτά επί μία περίοδο 16 ωρών. (Α) είναι εικόνες αντίθεσης φάσης των κυττάρων από το πρώτο καρέ του κάθε ταινία εμφανίζεται χωρίς ή με αντιπροσωπευτικές τροχιές των κυττάρων (7 /εικόνα? Παρακολουθούνται για 16 ώρες) υπέρθεση (πάνω εικόνες). Επιπλέον, οι πληγές μηδέν κυττάρων ελέγχου και κυττάρων p120ctn εξαντλημένο δείχνεται σε 0 ώρες και 16 ώρες μετά τον τραυματισμό (κάτω πάνελ). Ράβδοι κλίμακας = 50 μm. ταχύτητας (Β) Μετανάστευση (αριστερά) και η επιμονή (δεξιά? μετατόπιση /μήκος γραμμής) προσδιορίστηκαν. Οι ταχύτητες μετανάστευσης απεικονίζεται ως κουτί και μουστακιού οικόπεδα δείχνει μέση, διατεταρτημοριακό εύρος (κουτιά) και υψηλότερες και χαμηλότερες τιμές (μουστάκια). (C) περιοχή που καταλαμβάνεται από τα κύτταρα στα τραύματα μηδέν προσδιορίστηκε από τις εικόνες αντίθεσης φάσης που λαμβάνονται σε διαφορετικές χρονικές στιγμές από τις ταινίες. Τα δεδομένα είναι από τρία διαφορετικά πειράματα, κάθε διεξάγονται εις διπλούν, αναλύοντας 15 κύτταρα ανά πεδίο (περίπου 90 κύτταρα συνολικά). * P & lt? 0,05? *** P & lt?. 0.001, σε σύγκριση με τον έλεγχο και καθορίζεται από έλεγχος τ

Η

Καταστολή της έκφρασης p120ctn οδηγεί σε αυξημένη δραστηριότητα Rap1

Κανονισμός δραστηριοτήτων Rho ΟΤΡάσης από p120ctn έχει προηγουμένως έχουν συσχετιστεί με αυξημένη κινητικότητα κυττάρου [25], [26]. Ωστόσο, δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στα επίπεδα των δραστικών RhoA, Rac1 ή Cdc42 μεταξύ ελέγχου-επιμολυσμένα κύτταρα DU145 p120ctn-εξαντλημένο και (Εικόνα 4Α, Β?. Δεδομένα για Cdc42 δεν φαίνονται). Από p120ctn knockdown προκάλεσε μια απώλεια των επαφών κυττάρου-κυττάρου και την ΟΤΡάσης Rap1 έχει προηγουμένως συνδεθεί με τη σταθεροποίηση του Ε-καδερίνης στην πλασματική μεμβράνη και να ενεργοποιείται εξής Ε-καδερίνης απεμπλοκή [34], τα επίπεδα του δραστικού Rap1 αναλύθηκαν. p120ctn-εξαντλημένο κύτταρα DU145 έδειξαν αυξημένα επίπεδα δραστηριότητας Rap1 (Εικ. 4Α, Β).

κύτταρα DU145 επιμολύνθηκαν με siRNAs για p120ctn (p120ctn (1), (2)), τον έλεγχο siRNA (έλεγχος) ή με το αντιδραστήριο επιμόλυνσης μόνο (μακέτα). Μετά από 72 ώρες τα κύτταρα λύθηκαν και επωάστηκαν με GST-Rhotekin-RBD, GST-ΡΑΚ1-PBD ή GST-RalGDS-RBD επί σφαιριδίων γλουταθειόνης να τραβήξει προς τα κάτω ενεργό RhoA, Rac1 και Rap1 αντίστοιχα. Κυτταρολύματα από ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα επωάζονται με ΟΤΡγδ να προφόρτιση GTPases χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος για προσδιορισμούς αναπτυσσόμενο. (Α) Παράδειγμα ανοσοστυπώματα για δοκιμασίες δραστηριότητας ΟΤΡάσης. ERK επίπεδα σε ανοσοστυπώματα χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος φόρτωσης. Ponceau χρώση των ανοσοστυπωμάτων δείχνει τα επίπεδα των πρωτεϊνών σύντηξης GST. (Β) Οι γραφικές παραστάσεις δείχνουν τα δεδομένα από 3 (RhoA, Rac1) ή 4 (Rap1) είναι ανεξάρτητα πειράματα και τα αποτελέσματα σε σύγκριση με το συνολικό RhoA, Rac1, Cdc42 και ομαλοποιήθηκε ως προς τον έλεγχο. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν SEM. * P & lt? 0,05, σε σύγκριση με τον έλεγχο και καθορίζεται από έλεγχος τ

Η

Μείωση των καδερίνων, β-κατενίνης ή α-κατενίνης δεν επηρεάζει τα επίπεδα έκφρασης άλλων πρωτεϊνών προσκόλλησης διασταύρωση

από εξάντληση p120ctn μείωσε τα επίπεδα των πρωτεϊνών προσφύσεως διασταύρωση Ε-καδερίνης, Ρ-cadherin, SS-κατενίνης και α-κατενίνη (Εικ. 1), ερευνήσαμε την επίδραση του καταστρέφουν κάθε μία από αυτές τις πρωτεΐνες στις ενώσεις προσφύσεως. κύτταρα DU145 επιμολύνθηκαν με 2 ή 3 διαφορετικά ολίγο siRNA για Ε-καδερίνης, Ρ-cadherin, β-κατενίνης, α-κατενίνης και p120ctn (Εικ. 5Α).

κύτταρα DU145 επιμολύνθηκαν με τα υποδεικνυόμενα siRNAs για E-cadherin, Ρ-cadherin, α-κατενίνης και β-κατενίνης, ή με έλεγχο siRNA (έλεγχος), ή αντιδραστήριο επιμόλυνσης μόνο (mock). (Α) Μετά από 72 ώρες τα κύτταρα λύθηκαν και τα επίπεδα πρωτεΐνης υποδεικνύονται πρωτεΐνες αναλύθηκαν με ανοσοστύπωση. Σύνολο ERK ή GAPDH επίπεδα πρωτεΐνης χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) Οι γραφικές παραστάσεις δείχνουν τα επίπεδα πρωτεΐνης του Ρ-cadherin, E-cadherin, α-κατενίνης και p120ctn ακόλουθα knockdown των υποδεικνυόμενων πρωτεϊνών, ποσοτικά με σάρωση Οδύσσεια του ανοσοκηλίδων (αριστερά) ή β-κατενίνης knockdown, ποσοτικά με πυκνομετρία (δεξιά), από 4 ανεξάρτητα πειράματα. Τα αποτελέσματα κανονικοποιούνται για τον έλεγχο. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν SEM. *** Ρ & lt? 0.001, ** ρ & lt? 0,01, * ρ & lt?. 0,05, σε σύγκριση με τον έλεγχο και προσδιορίζεται από t-test του Student

Η

Τα επίπεδα έκφρασης του καθενός από αυτές τις πρωτεΐνες στη συνέχεια προσδιορίστηκε με ποσοτικοποίηση ανοσοκηλίδων. Τα επίπεδα της Ρ-cadherin, β-κατενίνης, α-κατενίνης και πρωτεΐνες p120ctn δεν επηρεάστηκαν από την εξάντληση της Ε-καδερίνης (Εικ. 5Α, Β). Knockdown της Ρ-καντερίνης ελαφρώς μειωμένα επίπεδα Ε-καδερίνης, SS-κατενίνης και α-κατενίνης, αλλά όχι p120ctn, αλλά αυτό παρατηρήθηκε μόνο για siRNA ολιγο (1), που έδωσε το ισχυρότερο (& gt? 80%) εξάντληση της Ρ-καντερίνης . Δύο άλλα ολίγο που μειωμένα επίπεδα Ρ-cadherin από περίπου 50% δεν επηρεάζει τα επίπεδα των άλλων κομβική πρωτεϊνών. β-κατενίνης ή εξάντληση α-κατενίνης δεν μετέβαλε τα επίπεδα των άλλων adherens πρωτεϊνών διασταύρωση σημαντικά (Εικ. 5). Είναι έτσι μόνο εξάντληση p120ctn που οδηγεί σε μια μείωση των επιπέδων όλων των άλλων μορίων προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου (Εικ. 5Β).

Καταστολή της p120ctn, Ρ-cadherin, β-κατενίνης και α-κατενίνης αλλά όχι E-cadherin οδηγεί σε διαταραχή των επαφών κυττάρου-κυττάρου και ενισχύει καρκινικών κυττάρων εισβολής

Δεδομένου ότι προς τα κάτω ρύθμιση του p120ctn οδήγησε σε απώλεια του κυττάρου-κυττάρου κόμβων και μία αύξηση στην ταχύτητα μετανάστευσης κυττάρων, τα αποτελέσματα των άλλων καταστρέφουν πρωτεΐνες διασταύρωση adherens στην προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου και κυτταρική κινητικότητα ερευνήθηκαν. Νοκ ντάουν της E-cadherin, Ρ-καδερίνη, β-κατενίνης και α-κατενίνης με RNAi ήταν ιδιαίτερα αποτελεσματική τόσο εντός αποικίες και σε μεμονωμένα κύτταρα, όπως παρατηρήθηκε με ανοσοφθορισμό, αλλά δεν επηρέασε ευδιάκριτα p120ctn επίπεδα (Εικ. 6).

(Α) κύτταρα DU145 επιμολύνθηκαν με τα υποδεικνυόμενα siRNAs για Ε-καδερίνης, Ρ-cadherin, β-κατενίνης, α-κατενίνης, τον έλεγχο siRNA (έλεγχος) ή με το αντιδραστήριο διαμόλυνσης μόνο (mock). Μετά από 72 ώρες, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και υπέστησαν χρώση για Ρ-cadherin, Ε-καδερίνης, β-κατενίνης, α-κατενίνης και p120ctn να συσχετίζονται knockdown φαινοτύπους με έκφραση των πρωτεϊνών νοκ-κάτω. Ράβδοι κλίμακας = 25 μm.

Η

Η knockdown του Ρ-cadherin, β-κατενίνης και α-κατενίνης από καθένα από 2 διαφορετικά siRNAs (ή 3 για Ρ-cadherin) οδήγησε σε διάσπαση του κυττάρου-κυττάρου επαφές, παρόμοια με εξάντληση p120ctn (Εικ. 6, Σχ. S2, Εικ. S3). Αξίζει να σημειωθεί ότι οι τρεις siRNAs 1, 2 και 3 που στοχεύουν P-καντερίνης που προκαλείται από την απώλεια των επαφών κυττάρου-κυττάρου, αν και μειωμένα επίπεδα Ρ-καντερίνης με διαφορετικές ποσότητες (Εικ. 5, Σχ. 6, Σχ. S3). Αντίθετα, knockdown του Ε-καδερίνης σε κύτταρα DU145 δεν προκάλεσε απώλεια των επαφών κυττάρου-κυττάρου (Εικ. 2C, Σχ. 6, Σχ. 7).

κύτταρα DU145 επιμολύνθηκαν με τα υποδεικνυόμενα siRNAs για E-cadherin, Ρ-cadherin, β-κατενίνης, α-κατενίνης και p120ctn, με έλεγχο siRNA (έλεγχος) ή αντιδραστήριο επιμόλυνσης μόνο (mock). 56 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα παρακολουθήθηκαν με μικροσκοπία time-lapse, αποκτώντας μια εικόνα αντίθεσης φάσης κάθε 10 λεπτά επί μία περίοδο 16 ωρών. Αντιπροσωπευτικά παραδείγματα εικόνων αντίθεσης φάσης στις πίστες εκκίνηση και τη μετανάστευση μετά από 16 ώρες παρουσιάζεται. Ράβδοι κλίμακας = 25 μm. ταχύτητας (Β) Μετανάστευση προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ImageJ λογισμικού. Ανάλυση της ταχύτητας μετανάστευσης απεικονίζεται ως κουτί και μουστακιού οικόπεδα δείχνει μέση, διατεταρτημοριακό εύρος (κουτιά) και υψηλότερες και χαμηλότερες τιμές (μουστάκια). Τα δεδομένα είναι από τουλάχιστον 50 κύτταρα από τρία διαφορετικά πειράματα. *** P & lt?. 0.001, σε σύγκριση με τον έλεγχο και καθορίζεται από έλεγχος τ

Η

Τα κύτταρα εξαντληθεί κάθε adherens πρωτεΐνης διασταύρωση εντοπίστηκαν από τις ταινίες timelapse για να καθορίσει την ταχύτητα μετανάστευσή τους (Εικ. 7). Όπως εξάντληση p120ctn, knockdown του Ρ-cadherin, β-κατενίνης και α-κατενίνης οδήγησε σε μια αύξηση στην ταχύτητα μετανάστευσης κυττάρων, παρόμοια με αποτελέσματα που λαμβάνονται με εξάντληση p120ctn, ενώ εξάντληση Ε-καδερίνη δεν μετέβαλε την ταχύτητα μετανάστευσης (Εικ. 7). Παρομοίως Ρ-cadherin αλλά εξάντληση όχι Ε-καδερίνης σε κύτταρα ΜΟΡ10Α οδήγησε σε διάσπαση των επαφών κυττάρου-κυττάρου και αυξημένη ταχύτητα μετανάστευσης (Εικ. 8).

(Α) κύτταρα ΜΟΡ10Α επιμολύνθηκαν με τα υποδεικνυόμενα siRNAs για το Ε -cadherin, Ρ-cadherin ή με έλεγχο siRNA (έλεγχος). Μετά από 72 ώρες, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και υπέστησαν χρώση για Ρ-ακτίνη και p120ctn. Ράβδοι κλίμακας = 25 μm. (Β) 56 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα παρακολουθήθηκαν με μικροσκοπία time-lapse, αποκτώντας μια εικόνα αντίθεσης φάσης κάθε 10 λεπτά επί μία περίοδο 16 ωρών. ταχύτητα μετανάστευσης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ImageJ λογισμικού. Ανάλυση της ταχύτητας μετανάστευσης απεικονίζεται ως κουτί και μουστακιού οικόπεδα δείχνει μέση, διατεταρτημοριακό εύρος (κουτιά) και υψηλότερες και χαμηλότερες τιμές (μουστάκια). Τα δεδομένα είναι από τουλάχιστον 50 κύτταρα από τρία διαφορετικά πειράματα. *** Ρ & lt?. 0.001, σε σύγκριση με τον έλεγχο και προσδιορίζεται από t-test του Student

Η

Με βάση τις αλλαγές στην προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου και την ταχύτητα μετανάστευσης παρατηρήθηκε, τα αποτελέσματα της p120ctn, E-cadherin, Ρ-cadherin, β- και α-κατενίνης επί εισβολή μέσω Matrigel διερευνήθηκε. Εξόντωση p120ctn με δύο διαφορετικά siRNAs αυξημένη εισβολή μέσω Matrigel ενώ εξάντληση Ε-καδερίνης δεν επηρέασε εισβολή (Εικ. 9Α, Β). Η knockdown του P-καντερίνης αφετέρου οδήγησε σε αύξηση των εισβολή παρόμοια με εξάντληση p120ctn (Εικ. 9). Η εξάντληση των β-κατενίνης, καθώς και α-κατενίνης προκάλεσε μια αύξηση στην εισβολή παρόμοια με p120ctn και Ρ-cadherin. Για να αποκλειστεί η πιθανότητα ότι οι διαφορές στον αριθμό των κυττάρων στο κάτω μέρος του Matrigel επικαλυμμένα Transwells οφείλονταν σε πολλαπλασιασμό των κυττάρων αλλαγμένη, κύτταρα μετρήθηκαν 48 ώρες αφού είχαν επιμολυνθεί με τα siRNA. Δεν υπάρχουν αλλαγές σε αριθμούς κυττάρων σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου siRNA επιμολυσμένα παρατηρήθηκαν (Σχ. 9C). Εν κατακλείδι, knockdown του Ρ-cadherin, β-κατενίνης και α-κατενίνης, αλλά όχι Ε-καδερίνης προκάλεσε μια διάρρηξη των επαφών κυττάρου-κυττάρου και μία αύξηση στη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και εισβολή παρόμοια με την knockdown του p120ctn.

κύτταρα DU145 επιμολύνθηκαν με τα υποδεικνυόμενα siRNAs για p120ctn, Ρ-cadherin, E-cadherin, α-κατενίνης και β-κατενίνης, με έλεγχο siRNA (έλεγχος) ή αντιδραστήριο επιμόλυνσης μόνο (mock). Μετά από 55 ώρες τα κύτταρα σπάρθηκαν πάνω σε ένθετα μεμβράνη Transwell που περιέχει ένα στρώμα Matrigel. FCS χρησιμοποιήθηκε ως χημειοελκτικό στον κάτω θάλαμο. Δοκιμασίες σταμάτησαν μετά από 17 ώρες με τον καθορισμό κύτταρα στον πυθμένα των ενθέτων μεμβράνης χρησιμοποιώντας κρυσταλλικό ιώδες. Εικόνες οκτώ διαφορετικών πεδίων ορατότητας αποκτήθηκαν και τα κύτταρα σε όλες τις εικόνες μετρήθηκαν και αναλύθηκαν. (Α) Οι γραφικές παραστάσεις δείχνουν τα δεδομένα από τρία ανεξάρτητα πειράματα, κάθε ένα πραγματοποιούνται εις τριπλούν. Τα αποτελέσματα κανονικοποιούνται για τον έλεγχο. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν SEM. ** Ρ & lt? 0,01, * ρ & lt? 0,05, σε σύγκριση με τον έλεγχο, προσδιορίστηκε με t-test του Student. (Β) Αντιπροσωπευτικές εικόνες των κυττάρων στον πυθμένα των μεμβρανών Transwell. Ράβδοι κλίμακας = 50 μm. (C) 48 ώρες μετά την επιμόλυνση τα κύτταρα μετρήθηκαν και συγκρίθηκαν με sicontrol. Γραφήματα δείχνουν τα στοιχεία από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. Τα αποτελέσματα κανονικοποιούνται για τον έλεγχο. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν SEM.

Η

Συζήτηση

p120ctn έκφραση συχνά χάνονται ή προς τα κάτω σε μια μεγάλη ποικιλία καρκίνων του ανθρώπου [35], καθώς και μειωμένα επίπεδα p120ctn συσχετίζονται με το βαθμό του όγκου [36], [37], [38], [39]. Έχουμε δείξει εδώ ότι η εξάντληση των p120ctn σε Ε-καδερίνης και-καντερίνη εκφράζουν Ρ κύτταρα DU145 και ΜΟΡ10Α διαταράσσει επαφές κυττάρου-κυττάρου, και αυξάνει τη μετανάστευση και την εισβολή των κυττάρων DU145, υποστηρίζοντας ένα μοντέλο όπου p120ctn δρα ως εισβολή ή μετάσταση καταστολέα [48]. Αυτές οι επιδράσεις συσχετίζονται με μειωμένη έκφραση των πρωτεϊνών προσφύσεως διασταύρωση Ε-καδερίνης, Ρ-cadherin, SS-κατενίνης και α-κατενίνης. Ωστόσο, μόνο προς τα κάτω ρύθμιση της Ρ-καδερίνης και όχι Ε-καδερίνης ήταν σε θέση να προκαλέσει παρόμοιο φαινότυπο με p120ctn εξάντληση, υποδεικνύοντας ότι το Ε-καντερίνης δεν απαιτείται για να διατηρηθεί προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου σε κύτταρα DU145 ή ΜΟΡ10Α.

σε αντίθεση με τα αποτελέσματα μας, p120ctn έχει αναφερθεί ότι απαιτείται για την εισβολή του Ε-καδερίνης με ανεπάρκεια κυττάρων εν μέρει από τη σταθεροποίηση των καντερίνες μεσεγχυματικά Ν-καντερίνη ή καντερίνη-11, τα οποία είναι γνωστό ότι προάγει εισβολή [32]. Από την άλλη πλευρά η συλλογική εισβολή των Ε- και Ρ-καντερίνη κύτταρα που εκφράζουν Α431 αναστάλθηκε όταν οι επαφές κυττάρου-κυττάρου διασπάστηκαν είτε με p120ctn knockdown ή την ταυτόχρονη knockdown του Ε-καδερίνης και Ρ-cadherin [35]. Σε αυτές τις μελέτες HGF ή EGF, αντίστοιχα, χρησιμοποιήθηκαν ως χημειοελκτικά σε προσδιορισμούς εισβολής και της μετανάστευσης, ενώ χρησιμοποιήσαμε ορό. Μια πιθανότητα είναι ότι θα μπορούσε να συμβάλει p120ctn ειδικά σε HGF /EGF-επαγόμενη μετανάστευση ή την εισβολή όπως έχει προηγουμένως συνδεθεί με HGF- ή σκέδαση κυττάρων προκαλούμενη από EGF [40].

p120ctn έχει αποδειχθεί ότι διεγείρει Rac και ή /και δραστηριότητα Cdc42 ή /και αναστέλλουν την δραστικότητα RhoA σε κύτταρα που στερούνται Ε-καδερίνης, συμπεριλαμβανομένων των ινοβλαστών και καρκινικές κυτταρικές γραμμές [32], [41]. Αντίθετα, διαπιστώσαμε ότι σε κύτταρα DU145 που εκφράζουν Ρ- και Ε-καδερίνη, αλλά όχι Ν-cadherin, η εξάντληση των p120ctn δεν επηρέασε δραστηριότητα του RhoA και Rac1. Ομοίως, το E-cadherin /Ρ-καντερίνη-κύτταρα που εκφράζουν Α431, εξάντληση p120ctn δεν μεταβάλλει RhoA δραστηριότητα /Rac1 [31].

Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι οι επιπτώσεις των p120ctn σχετικά με τις δραστηριότητες Rho ΟΤΡάσης είναι τον κυτταρικό τύπο. Αυτό θα μπορούσε να οφείλεται σε διαφορές στη σύνθεση των συμπλοκών p120ctn, για παράδειγμα σύμπλοκα που περιέχουν GEFs που θα μπορούσαν να ενεργοποιήσουν Rac1 /Cdc42 ή κενά που ρυθμίζουν προς τα κάτω RhoA [26], [41]. Είναι ενδιαφέρον ότι, σε MDA-MB-231 κύτταρα καρκίνου του μαστού, η ενεργοποίηση της RAC από p120ctn απαιτεί καντερίνης δεσμευτικός [32], υποδηλώνοντας ότι τα μεσεγχυματικά καντερίνες θα μπορούσε να συμβάλει ειδικά στην δραστηριότητα Rac. Αν και δραστηριότητα ΘΤΡάσης Rho δεν επηρεάστηκε από p120ctn, βρήκαμε ότι η δραστηριότητα Rap1 είναι αυξημένη στα κύτταρα DU145 p120ctn εξαντλημένο. Rap1 είναι ένας σημαντικός ρυθμιστής του κυττάρου-κυττάρου κόμβους, και ενεργοποιείται με την εμπλοκή E-cadherin [42], [43]. Η διακοπή της ενώσεις προσφύσεως από εξωκυτταρικό ασβέστιο εξάντληση επάγει επίσης μία αύξηση στη δραστικότητα Rap1 [44]. Τα αποτελέσματά μας με εξάντληση p120ctn είναι συνεπή με την υπόθεση ότι η ενδοκυττάρωση του Ε-καδερίνης αυξάνει τη δραστηριότητα Rap1 [44].

Απροσδόκητα, η knockdown του Ρ-cadherin, β- και α-κατενίνης, αλλά όχι E-cadherin οδήγησε στη διάσπαση των επαφών κυττάρου-κυττάρου. Πιθανώς τα υποκατάστατα Ρ-καντερίνης για Ε-καδερίνης για τη διατήρηση των επαφών κυττάρου-κυττάρου, αλλά όχι Ε-καδερίνης για Ρ-cadherin. Αυτή η υπόθεση υποστηρίζεται από μελέτες σε κύτταρα MDCK, όπου έχει αποδειχθεί ότι το E-cadherin είναι σημαντική μόνο για την εγκατάσταση, αλλά όχι διατήρηση των επαφών κυττάρου-κυττάρου, ενώ α-κατενίνης για να διατηρηθεί κυττάρου-κυττάρου επαφές [45]. Επιπλέον, η εξάντληση P-καντερίνης μόνος αναφέρθηκε ότι επάγει απώλεια των επαφών κυττάρου-κυττάρου και προς τα κάτω ρύθμιση των επιπέδων Ε-καδερίνης σε κύτταρα ΜΟΡ10Α [46] και η υπερέκφραση της Ρ-καντερίνης MDA-MB-231 κύτταρα καρκίνου του μαστού μειώνεται κυτταρική μετανάστευση και εισβολή [47]. Στον καρκίνο περισσότερες μελέτες έχουν επικεντρωθεί στη σύνδεση μεταξύ της Ε-καδερίνης κατιούσα ρύθμιση και αυξημένη επιθετικότητα του καρκίνου και εισβολή, αν και υπάρχουν επίσης ενδείξεις ότι η Ρ-καντερίνης επηρεάζει την εξέλιξη του όγκου. Για παράδειγμα, τα επίπεδα Ρ-cadherin μειωτικά κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του μελανώματος [48] και Ρ-cadherin χάνεται συχνά σε καρκίνους του προστάτη [49]. Σε κύτταρα DU145, βρήκαμε ότι η εξάντληση P-καντερίνης προκαλεί απώλεια του κυττάρου-κυττάρου διασταυρώσεις χωρίς να επηρεάζει σημαντικά τα επίπεδα των άλλων πρωτεϊνών adherens διασταύρωση, υποδεικνύοντας ότι είναι η κύρια cadherin που απαιτείται για προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου σε αυτά τα κύτταρα.

Η knockdown του β- και α-κατενίνης επίσης επαγόμενη διάσπαση των επαφών κυττάρου-κυττάρου και μία αύξηση στην εισβολή, αλλά δεν άλλαξε τα επίπεδα Ρ-καντερίνη ή πρωτεΐνη p120ctn. Είναι πιθανό ότι επηρεάζουν την εντόπιση του P-καδερίνης και /ή p120ctn παρά επίπεδα. Οι β- και α-κατενίνες έχουν αναφερθεί ότι επηρεάζουν καντερίνη-προσκόλληση [15], [16], και η εξάντληση των β-κατενίνης σε ένα Ε-καδερίνης με ανεπάρκεια κυτταρικής γραμμής οδήγησε σε μείωση εισβολή [50], αλλά μέχρι τώρα λίγα είναι γνωστά για τους ρόλους τους στην μετανάστευση και εισβολή. β-κατενίνης έχει επίσης έναν σημαντικό ρόλο στην Wnt-σηματοδότηση και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του καρκίνου η οποία πιστεύεται ότι είναι ανεξάρτητη από τη λειτουργία του καντερίνης [51].

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι p120ctn ρυθμίζει τα επίπεδα έκφρασης της β- και α κατενίνης καθώς και καντερίνες στα κύτταρα DU145. Δεδομένου ότι έχουμε δείξει ότι η Ρ-cadherin επίπεδα είναι πιο σημαντική από Ε-καδερίνης στην διατήρηση προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου σε κύτταρα DU145 και ΜΟΡ10Α, εμείς υποθέτουν ότι η αυξημένη μετανάστευση και εισβολή που παρατηρούμε εξής p120ctn, SS-κατενίνης ή α-κατενίνης knockdown είναι οφείλεται είτε σε μειωμένη σταθερότητα Ρ-καντερίνη ή αλλαγές στον εντοπισμό του.

Υλικά και Μέθοδοι

siRNAs

Όλα τα siRNA που χρησιμοποιούνται ελήφθησαν από Dharmacon (Fisher Scientific Ηνωμένο Βασίλειο, Loughborough, ΗΝΩΜΈΝΟ ΒΑΣΊΛΕΙΟ). Το ακόλουθο ON-TARGET

συν

μόνο ολίγο χρησιμοποιήθηκαν p120ctn στόχευση (CTNND1 (1) 5′-UAGCUGACCUCCUGACUAA-3 ‘? (2) 5′-GGACCUUACUGAAGUUA-3′), Ε-καντερίνη (Cdh1 (1 ) 5’-GGCCUGAAGUGACUCGUAAU-3 ‘? (2) 5’GAGAACGCAUUGCCACAUA-3’), Ρ-καντερίνη (CDH3 (1) 5’GUGACAACGUCUUCUACUA-3 ‘? (2) 5′-GAGGGUGUCUUCGCUGUAG-3’? (3) 5 «-GAAAUCGGCAACUUUAUAA-3 ‘), β-κατενίνης (CTNNB1 (1) 5′-GCGUUUGGCUGAACCAUCA-3′) και α-κατενίνη (CTNNA1 (1) 5’-GAUGGUAUCUUGAAGUUGA-3 ‘? (2) 5′-GUGGAUAAGCUGAACAUUA-3 »). Μη στόχευση siRNA χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας σε όλα τα πειράματα (ON-TARGET ελέγχου # 1? 5’-UGGUUUACAUGUCGACUAA-3 ‘).

κυτταρικής καλλιέργειας και επιμολύνσεις

DU145 καρκίνου του προστάτη κύτταρα αναπτύχθηκαν σε RPMI συμπληρωμένο με 10% FCS, 100 IU /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη. ΜΟΡ10Α μαστικά επιθηλιακά κύτταρα αναπτύχθηκαν σε DMEM /F12 συμπληρωμένο με 5% ορό αλόγου, 100 IU /ml πενικιλίνη, 100 μg /ml στρεπτομυκίνη, 20 ng /ml EGF, 0,5 μg /ml υδροκορτιζόνη, 100 ng /ml τοξίνης χολέρας και 5 μg /ml ινσουλίνη. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 1.8 × 10

5 ανά φρεάτιο σε πλάκες 24-φρεατίων και αντίστροφοι επιμολυσμένα με siRNAs (τελική συγκέντρωση 20 ηΜ) σε αντιβιοτικό μέσο άνευ χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen, Paisley, UK), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή . Μετά από 6-8 ώρες, τα κύτταρα επανασπάρθηκαν σε 2 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο (DU145) ή 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο (ΜΟΡ10Α) για ανοσοφθορισμό και time-lapse μικροσκοπία και σε 1 × 10

5 ανά φρεάτιο (πλάκα 24 φρεατίων) για δοκιμασίες ανοσοκηλίδωση και γρατσουνιές πληγή. Για δημιουργία σταθερών p120ctn εξαντλημένο κύτταρα DU145, χρησιμοποιήθηκε το σύστημα φορέα pSuperior (Oligoengine, Seattle, WA). Η αλληλουχία του ολίγο shRNA στόχευσης ανθρώπινη p120ctn σχεδιάστηκε όπως περιγράφεται [52]. Μια σταθερή πισίνα κύτταρο που περιέχει το shRNA επιλέχθηκε σε μέσον που περιείχε 5 μg /ml πουρομυκίνη. Για πειράματα διάσωσης ποντικού p120ctn-GFP [26], η οποία δεν είναι ευαίσθητη στην shRNA στόχευσης ανθρώπινη p120ctn, διαμολύνθηκε παροδικά σε κύτταρα DU145 χρησιμοποιώντας Amaxa nucleofection (Lonza, Κολωνία, Γερμανία) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (www.lonzabio.com) .

ανοσοαποτύπωσης

κύτταρα που αναπτύσσονται σε περίπου 80% συρροή πλύθηκαν μία φορά με ψυχρό PBS και λύθηκαν σε είτε κρύο 2 χ ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος SDS (Invitrogen) απευθείας και ομογενοποιείται με βελόνα 21G ή σε λύση ρυθμιστικού (50 mM Tris ρΗ 7,5, 1% Triton-Χ-100, 0.5% δεοξυχολικό νάτριο, 0.1% SDS, 500 mM NaCl, 10 mM MgCl

2, 2 mM EDTA, 10% γλυκερόλη, 1 mM Na

3νο

4, 25 mM NaF, πλήρης μίνι άνευ ΕϋΤΑ αναστολέα πρωτεάσης (Roche, Welwyn Garden City, Ηνωμένο Βασίλειο), αναστολέα PhosSTOP φωσφατάσης (Roche)) και στη συνέχεια καθαρίζεται με φυγοκέντρηση. Τα προϊόντα λύσης διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και υποβάλλονται σε ανάλυση ανοσοστυπώματος. Για επανανίχνευσης τα μεμβράνες PVDF επωάστηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα (50 mM Tris HCl (ρΗ 7,5), 100 mM β-μερκαπτοαιθανόλη, 2% SDS) απογύμνωσης για 20 λεπτά στους 65 ° C. Πρωτογενή αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν σε αραίωση 1:1000: p120ctn (# 610134), Ε-καδερίνης (# 610182) αγοράστηκαν από την BD Biosciences (Oxford, UK), Ρ-καντερίνη (# 05-916), Rac1 (# 05 -389) από την Upstate (Millipore, Watford, Ηνωμένο Βασίλειο), β-κατενίνης (# C2206), α-κατενίνης (# C2081) από την εταιρεία Sigma-Aldrich (Dorset, UK), ERK (# sc-94), RhoA (# sc -418) από την Santa Cruz Biotechnology (Insight Βιοτεχνολογία, Wembley, Ηνωμένο Βασίλειο) και Rap1A /Rap1B (# 4938) από την Cell Signaling (New England Biolabs, Hitchin, Ηνωμένο Βασίλειο).