Αφηρημένο

Ιστορικό

Η ενίσχυση πυρίμαχων σύστημα μετάλλαξη τετρα-αστάρι PCR (Τ-ARMS-PCR) αποτελεί ένα γρήγορο και οικονομικό μέσο δοκιμασίας SNP του, απαιτώντας μόνο ενίσχυση PCR και την επακόλουθη ηλεκτροφόρηση για τον προσδιορισμό των γονοτύπων. Για τη βελτίωση της απόδοσης και της αποτελεσματικότητας των Τ-ARMS-PCR, συνδυάσαμε Τ-ARMS-PCR με ένα χιμαιρικό διακόπτη θερμοκρασία εκκινητή με βάση το PCR στρατηγική (TSP), και χρησιμοποιούνται τριχοειδή ηλεκτροφόρηση (CE) για το διαχωρισμό και την ταυτοποίηση αμπλικόνιο. Εμείς αξιολογούνται αυτή τη διαδικασία στην ταυτόχρονη γονοτυπική του καρκίνου και δύο SNPs κινδύνων που σχετίζονται με τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας τέσσερις μαστού.

Μέθοδοι

Ένα σύνολο 24 T-ARMS-PCR εκκινητών, κάθε 5′ ετικέτα με μια καθολική αλληλουχία και ένα ζεύγος γενικών εκκινητών, ομαδοποιήθηκαν μαζί για να ενισχύσει τα 12 αλληλόμορφα στόχου του 6 SNPs σε 186 ελέγχου δείγματα γυναίκες του αίματος. Άμεση ανάλυση αλληλουχίας όλων των δειγμάτων πραγματοποιήθηκε επίσης για την αξιολόγηση της ακρίβειας της μεθόδου αυτής.

Αποτελέσματα

Από τα 186 δείγματα, όσο 11 αμπλικονίων μπορεί να παραχθεί σε ένα μόνο PCR και διαχωρίζεται με CE . τα αποτελέσματα προσδιορισμού του γονότυπου της πολυπλεξίας T-ARMS-PCR ήταν σε πλήρη συμφωνία με άμεση αλληλούχιση όλων των δειγμάτων.

Συμπεράσματα

Αυτή η νέα μέθοδος πολυπλεξίας T-ARMS-PCR είναι η πρώτη μέθοδος που επιτρέπει σε ένα σε γονοτυπική ανάλυση έξι SNPs σε μία μόνο αντίδραση χωρίς θεραπεία μετά την PCR εκτός από την ηλεκτροφόρηση. Αυτή η μέθοδος είναι αξιόπιστη, γρήγορη και εύκολη να γίνει

Παράθεση:. Zhang C, Liu Υ, Ring BZ, Nie Κ, Yang Μ, Wang M, et al. (2013) A Novel Multiplex Tetra-Primer ARMS-PCR για την ταυτόχρονη γονοτυπικός των Έξι ενός νουκλεοτιδίου πολυμορφισμών που σχετίζονται με Γυναίκα καρκίνοι. PLoS ONE 8 (4): e62126. doi: 10.1371 /journal.pone.0062126

Επιμέλεια: Gayle Ε Woloschak, Northwestern University Feinberg School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: πέμπτης Ιουλίου, 2012? Αποδεκτές: 19 Μαρ 2013? Δημοσιεύθηκε: 17 Απριλίου, 2013

Copyright: © 2013 Zhang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από την Κίνα Mega-Έργο Λοιμωδών Νοσημάτων (2011ZX10004-001, 2012ZX10004-215 και 2013ZX10004-202). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο ρόλος των πολυμορφισμών μοναδικού νουκλεοτιδίου (SNP) σε συμβάλλοντας στην μεταβλητότητα μεταξύ των ατόμων σε επιδεκτικότητα σε καρκίνο [1] ρυθμό, ανάπτυξη και μετάσταση όγκου [2] – [4], καθώς και στην αποτελεσματικότητα της θεραπείας και ανεπιθύμητες αντιδράσεις του φαρμάκου, έχει επίσης αναγνωριστεί [5], [6]. Μεταξύ των πολλών μεθόδων που έχουν αναπτυχθεί για να γονότυπο SNPs, ο τετρα-εκκινητή ενίσχυσης πυρίμαχο σύστημα μετάλλαξης PCR (Τ-ARMS-PCR) έχει αποδειχθεί ότι είναι γρήγορη, απλή και οικονομική [7] – [11]. Μέσω συνδυασμού των δύο εξωτερικών εκκινητών και δύο εσωτερικά αρχικά τεμάχια αλληλόμορφο-ειδική, γονοτυποποίηση απαιτεί μόνο μία PCR ακολουθούμενη από ηλεκτροφόρηση διαχωρισμό [8]. Multiplex PCR ενσωματώθηκε σε Τ-ARMS-PCR, χρησιμοποιώντας εκκινητές οκτώ σε μία PCR, και είναι σε θέση να ανιχνεύσει συγχρόνως δυο μεταλλάξεις [9]. Ξεχωριστά, χιμαιρικό εκκινητή που βασίζονται πολλαπλή PCR, το οποίο προσθέτει μια καθολική 5 ‘tag στην αλληλουχία ειδικά αρχικά τεμάχια για πολλαπλούς στόχους, έχει αναφερθεί για τη βελτίωση της απόδοσης και της αποτελεσματικότητας της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης [12]. Με την υψηλή αποδοτικότητα του στην ανίχνευση δεκάδες διαφορετικών προϊόντων PCR σε μία αντίδραση, η χρήση των χιμαιρικών εκκινητή PCR έχει συχνά αναφερθεί για χρήση σε mRNA ποσοτικοποίηση [13] – [15]. Και την ανίχνευση του παθογόνου [16], [17]

ο καρκίνος του μαστού και του καρκίνου του τραχήλου έχουν γίνει τα πιο συχνά διαγιγνώσκονται καρκίνοι και οι κύριες αιτίες θανάτου από καρκίνο μεταξύ των γυναικών [18]. Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι οι σωματικές παραλλαγές σε περιοχές ευαισθησία που συνδέεται με την πιθανότητα εμφάνισης καρκίνου του μαστού και των γυναικολογικών καρκίνων [19] – [23]. SNPs επιλέχθηκαν για αυτή τη μελέτη με βάση την αναφερόμενη ενώσεων με αυτές τις μορφές καρκίνου και έχοντας ένα αρκετά υψηλό επιπολασμό σε ασιατικούς πληθυσμούς. Επελέγησαν τέσσερα παραλλαγές χαμηλής διεισδυτικότητα για την πρόβλεψη του κινδύνου του καρκίνου του μαστού. SNPs rs4784227 [24] και rs3803662 [25] βρίσκονται στο TOX3 παράγοντα μεταγραφής? rs1219648 κείται εντός FGFR2, η οποία συμβάλλει στην ανάπτυξη των κυττάρων, η εισβολή, την κινητικότητα και την αγγειογένεση [26]? rs889312 [27] είναι εντός MAP3K1, η οποία συνδέεται με την κυτταρική απόκριση σε μιτογόνα. Επιλέχθηκαν δύο παραλλαγές που σχετίζονται με τον κίνδυνο του τραχήλου της μήτρας ή των ωοθηκών καρκίνο. SNP rs750749 [21] είναι μια πολυμορφισμούς σε CD83, η οποία εμπλέκεται στην ανοσολογική αναγνώριση και παρουσίαση αντιγόνου? rs749292 σε CYP19A1, η οποία παίζει καθοριστικό ρόλο στην βιοσύνθεση των οιστρογόνων [22], [23].

Σε αυτή την εργασία, περιγράφουμε μία νέα multiplex T-ARMS-PCR επιτρέπει την ταυτόχρονη προσδιορισμό του γονότυπου των 6 SNPs (rs4784227 , rs3803662, rs1219648, rs889312, rs750749 και rs749292) που σχετίζονται με καρκίνους του μαστού και γυναικολογικών σε ένα μόνο σωλήνα χρησιμοποιώντας 24 χιμαιρικών εκκινητών και ένα ζεύγος γενικών εκκινητών Η χρήση χιμαιρικών εκκινητών και ένας διακόπτης θερμοκρασίας PCR (TSP) στρατηγική συνδυάστηκαν με Τ- ARMS-PCR για τη βελτιστοποίηση των παραμέτρων ενίσχυση και τη βελτίωση της απόδοσης του SNP γονοτυποποίηση. Ο συνδυασμός αυτών των διαφορετικών τεχνικών προσδιορισμού του γονότυπου αποδεικνύει για πρώτη φορά την ικανότητα του τετρα-εκκινητή ARMS-PCR για αξιόπιστα και αποτελεσματικά ανιχνεύουν έξι SNPs σε μία μόνο αντίδραση. Δεδομένου ότι πρέπει να εντοπιστούν περισσότερα από 10 προϊόντα PCR με διαφορετικά μήκη, τριχοειδή ηλεκτροφόρηση (CE) χρησιμοποιείται αντί της ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης.

Υλικά και Μέθοδοι

Ένα σύνολο από 186 δείγματα αίματος από υγιείς Κινέζοι εθελόντριες που είχαν υπό παρακολούθηση για ενδεχόμενη υπέρταση συλλέχθηκαν σε κοινοτικά κέντρα υγείας σε Wuhan, Κίνα κατά τη διάρκεια του 2011 για τη μελέτη αυτή. Όλες οι πτυχές της μελέτης πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τους εθνικούς κανονισμούς δεοντολογίας και εγκριθεί από τις Institutional Review Boards του Κέντρου Ελέγχου και Πρόληψης 70 της Κίνας Ασθενειών, καθώς και η Επιτροπή Δεοντολογίας της Huazhong Πανεπιστήμιο Επιστήμης και Τεχνολογίας. Οι συμμετέχοντες έλαβαν «γραπτή συγκατάθεση» του σκοπού της μελέτης και του δικαιώματός τους να κρατήσουν εμπιστευτικές πληροφορίες. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους συμμετέχοντες ή τους κηδεμόνες τους.

Το γονιδιακό DNA εκχυλίζεται από 0,2 ml φρέσκα δείγματα περιφερικού αίματος με τη χρήση του Οδηγού

® Το γονιδιακό DNA Καθαρισμός Kit (Promega) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εξάγεται δείγματα DNA είχε μια τελική συγκέντρωση που κυμαίνεται 55 έως 365 ng /μl.

Για να ξεπεραστούν οι περιορισμοί του προτύπου multiplex Τ ARMS-PCR μεθόδους, η προτεινόμενη μέθοδος έχει βελτιστοποιηθεί όσον αφορά το σχεδιασμό αστάρι, τις συνθήκες ποδηλασίας PCR και στη χρησιμοποίηση των χιμαιρικών εκκινητών και στρατηγική TSP, όπως περιγράφεται στις προηγούμενες εκθέσεις μας στην ανίχνευση των ιών της γρίπης και του ανθρώπινου ποδιού χέρι και συνδέονται στόμα παθογόνα [16], [28]. Χρησιμοποιήθηκε ένα σύνολο 24 χιμαιρικών εκκινητές καθένα αποτελείται από ένα γονίδιο-ειδική αλληλουχία με μια καθολική αλληλουχία tag στο 5 ‘άκρο. Το γονίδιο-συγκεκριμένα τμήματα των εκκινητών σχεδιάστηκαν σύμφωνα με τις απαιτήσεις των Τ-ARMS-PCR. Η ειδικότητα του αλληλόμορφου-ειδικούς εκκινητές προσδίδεται από την ταυτότητα του «νουκλεοτίδιο ακροδέκτη 3 είτε με το άγριου τύπου ή του μεταλλαγμένου αλληλόμορφου, η ειδικότητα αυξάνεται με την εισαγωγή μιας σκόπιμης αναντιστοιχία στην θέση -1 από το 3’-άκρο. Ένα ζεύγος γενικών εκκινητών και έξι σύνολα Τ-ARMS-PCR χιμαιρικά εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν για ενίσχυση. Λεπτομερείς αλληλουχίες εκκινητών και συγκεντρώσεις εργασίας κάθε SNP που παρατίθενται στον Πίνακα 1.

Η

γονοτύπησης της δοκιμάστηκαν πολυμορφισμών διεξήχθη με πολλαπλή PCR ενίσχυση και ανάλυση θραύσμα. Έξι σύνολα Τ-ARMS-PCR εναρκτήρες για την ενίσχυση των δώδεκα τεμαχίων διαφορετικών μεγεθών συνενώθηκαν σε ένα ενιαίο 20 μΙ όγκου αντίδρασης, το οποίο περιείχε επίσης 10 μι κύριου μείγματος του κιτ QIAgen Multiplex PCR, 50-100 ng γενωμικού DNA, και βελτιστοποιημένη συγκεντρώσεις του κάθε εκκινητή (βλέπε πίνακα 1). Multiplex PCR εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας Bioer LifePro Thermal Cycler. Ένας διακόπτης βελτιστοποιημένη θερμοκρασία PCR (TSP) πρωτόκολλο, το οποίο χρησιμοποιεί τέσσερις διαφορετικές θερμοκρασία ανόπτησης πραγματοποιήθηκε ως εξής: αρχικό στάδιο μετουσίωσης 95 ° C για 10 λεπτά, 3 κύκλοι των 95 ° C για 30 s, 60 ° C για 30 s, και 72 ° C για 45 s, 10 κύκλοι των 95 ° C για 30 s, 58 ° C για 30 s, και 72 ° C για 45 s, 20 κύκλοι των 95 ° C για 30 s, 68 ° C για 30 s, και 72 ° C για 45 s, 15 κύκλοι των 95 ° C για 30 s, 55 ° C για 30 s, και 72 ° C για 45 s, που ακολουθείται από ένα τελικό κύκλο επέκτασης στους 72 ° C για 10 λεπτά, και στη συνέχεια ψύχθηκε σε 4 ° C.

Τα multiplex PCR προϊόντα διαχωρίζονται με QIAxcel

® κασέτα DNA υψηλής ανάλυσης gel (Qiagen) στο σύστημα QIAxcel (Qiagen). DNA Μέγεθος δείκτης του 25-450 bp (Qiagen) και Ευθυγράμμιση Marker 15 bp /500 bp (Qiagen) χρησιμοποιήθηκαν σε κάθε QIAxcel τρέχει και το μέγεθος των προϊόντων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό ScreenGel (Qiagen). Επειδή κάθε ένα από τα αμπλικόνια ήταν διαφορετικού μήκους, τα αλληλόμορφα ανιχνεύθηκαν βάσει των προτύπων της κορυφής των μεγεθών.

Ένα σύνολο 186 δειγμάτων αναλύθηκαν επίσης για αλληλουχία παράλληλα με την ΑΒΙ 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems , USA) σύμφωνα με την BigDye έκδοση Καταγγελία 3.1 πρωτόκολλο Invitrogen Corporation (Σαγκάη, Κίνα) για να επιβεβαιώσει τα αποτελέσματα multiplex T-ARMS-PCR με τη χρήση των εξωτερικών εκκινητών που παρατίθενται στον πίνακα 1 για κάθε SNP.

αποτελέσματα

ένα σύνολο από 186 δείγματα πληκτρολογούνται με ένα multiplex δοκιμασία Τ-ARMS-PCR και επίσης πληκτρολογήσει παράλληλα με την άμεση αλληλούχιση για την αξιολόγηση της ακρίβειας και της αποτελεσματικότητας της δοκιμασίας. Όλα τα προϊόντα PCR καλά επιλυθεί και μέγεθος με CE και ScreenGel, επιτρέποντας την εύκολη αναγνώριση των διαφόρων γονότυπων. Δύο από τα 186 δείγματα είχαν έντεκα μοναδικά αμπλικονίων, που σημαίνει αυτοί οι ασθενείς έχουν μόνο μία ομοιογενή SNP μεταξύ των έξι δοκιμάστηκαν τόπους. Ηλεκτροφόρημα και την εικόνα γέλης από τα δύο δείγματα (Εικ. 1) δείχνουν ότι η σήμανση για QIAXEL μπορούν να διαχωριστούν με σαφήνεια όσο το 11 κομμάτια σε ένα δείγμα. Η ακρίβεια των πολλαπλών PCR ανάλυση ενός δείγματος επιβεβαιώθηκε με άμεση αλληλούχιση (Εικ. 2). Οι Θραύσμα μεγέθη προσδιορίζονται με βάση QIAXEL CE που απαριθμούνται στον Πίνακα 2. Ανάγνωση μήκη ήταν 2 έως 10 bp μεγαλύτερα από τα αναμενόμενα αυτά, αλλά αυτό δεν παρεμβαίνει με τον προσδιορισμό αλληλόμορφο. Ετεροζυγώτες και ομοζυγώτες ήταν σαφώς ανατεθεί από τα προφίλ CE. Δεν παρατηρήθηκε διασταυρούμενη αντίδραση. Οι γενότυποι σκόραρε από το multiplex δοκιμασία ήταν στο 100%, σύμφωνα με την άμεση αλληλούχιση

Α:. Εικόνα τζελ από τα 4 δείγματα. Β Gel εικόνα και ηλεκτροφόρημα του δείγματος σε διαδρομή 1. 11 ταινίες που κυμαίνονται 202-356 bp παρατηρήθηκαν, υποδεικνύοντας 5 ετερογενή και ομογενή 1 SNPs εντοπίστηκαν C: Gel εικόνα και ηλεκτροφόρημα του δείγματος στην Λωρίδα 2. Παρατηρήθηκαν Ένας άλλος συνδυασμός των 5 ετερογενείς και 1 ομοιογενή SNPs.

Η

Η

Οι συχνότητες διανομή και αλληλόμορφο γονότυπος κάθε SNP παρατίθενται στον πίνακα 3. Το αλληλόμορφο αναφερθεί να σχετίζεται με τον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου τονίζεται. Η παρατηρούμενη συχνότητα των γονότυπων σε αυτή τη μελέτη ήταν γενικά παρόμοια με αυτή που μετράται με HapMap για μια κινεζική πληθυσμό Han (HCB). Εάν οι HapMap συχνότητες χρησιμοποιούνται για την πρόβλεψη αναμένεται μετράει γονότυπου σε αυτή τη μελέτη, τότε η σύγκριση αυτού του πληθυσμού προς τον πληθυσμό HapMap HCB έδειξαν σημαντική απόκλιση για rs4784227 σε Tox3 και rs749292 σε CYP19A1, στην οποία ο κίνδυνος και αλληλόμορφα μη κινδύνου, αντίστοιχα, βρίσκονται σε σημαντικά υψηλότερο ποσοστό από ό, τι στο παρελθόν αναφερθεί για μια κινεζική πληθυσμό. Είναι πιθανό ότι υπάρχει ποικιλομορφία στον πληθυσμό των Χαν, που δεν έχει ακόμη συλληφθεί από τις HapMap μελέτες. Ένα συμπληρωματικό πίνακα (Πίνακας S1) παρέχεται για να δείξει τα ακριβή σύνολα αλληλόμορφα για όλες τις 6 SNPs βρίσκονται σε κάθε επιμέρους δείγμα για περαιτέρω αναφορά.

Η

Συζήτηση

Οι μέθοδοι που επιτρέπουν χαμηλού κόστους , γρήγορο και αξιόπιστο προσδιορισμό SNP προσελκύουν αυξανόμενο ενδιαφέρον στην εποχή της εξατομικευμένης ιατρικής. Είναι ευρέως αποδεκτό ότι η χρήση των πληροφοριών από πολλαπλές γονότυπους SNP παρέχει μια πιο ακριβή αξιολόγηση του κινδύνου από εκείνη που προβλέπεται από ένα αλληλόμορφο ενιαίο κίνδυνο [29], ως εκ τούτου, οι μέθοδοι ικανές για την ταυτοποίηση πολλαπλών γονοτύπων, όπως MALDI-TOF φασματομετρία μάζας [30], [31 ] και υβριδισμό με βάση [32] – [34] ή με βάση ένζυμο [35] μέθοδοι έχουν χρησιμοποιηθεί. Ωστόσο, αυτές οι μέθοδοι, είτε απαιτούν δαπανηρό ειδικό εξοπλισμό, όπως φασματόμετρο μάζας, ή χρονοβόρα λειτουργία μετα-PCR.

Η Tetra-εκκινητή ARMS-PCR μέθοδος έχει γίνει μια από τις πιο συχνά χρησιμοποιούμενες μέθοδοι για SNP του γονότυπου. Απαιτεί μόνο κανονικό εξοπλισμό μοριακής βιολογίας και εξαλείφει την ανάγκη του υβριδισμού ή ενζυματικές αντιδράσεις επιπλέον. Παρά το γεγονός ότι οι μέθοδοι triplex και τετραπλών PCR έχουν αναφερθεί, υπάρχει περιορισμένη χρήση των multiplex T-ARMS-PCR σε γονοτυπική λόγω των δύο βασικών περιορισμών. Πρώτον, η πιθανότητα εύρεσης εκκινητές με συμφωνημένα θερμοκρασίες τήξης μειώνεται δραστικά όταν προσπαθεί να συνδυάσει την ανίχνευση διαφόρων SNPs σε μία μόνο αντίδραση. Δεύτερον, η προκύπτουσα ομάδα των αμπλικονίων απαιτεί επαρκή διαστήματα μήκους μεταξύ γειτονικών ζωνών σε ηλεκτροφόρηση για τη διευκόλυνση του διαχωρισμού. Με το συνδυασμό T-ARMS-PCR με ένα χιμαιρικό θερμοκρασία στρατηγική PCR διακόπτη αστάρι με βάση το έχουμε παρακάμψει σε μεγάλο βαθμό αυτούς τους περιορισμούς. Η μέθοδός μας δείχνει για πρώτη φορά την ικανότητα του τετρα-εκκινητή ARMS-PCR για την ανίχνευση εύκολα έξι SNPs σε μία μόνο αντίδραση.

Η αξιοπιστία της μεθόδου φάνηκε πληκτρολογώντας 186 κλινικά δείγματα αίματος παράλληλα με άμεση αλληλούχιση και λήφθηκε ένα 100% συνοχή μεταξύ των δύο μεθόδων. Συνεπώς, η παρούσα μελέτη απόδειξη της έννοιας καθιερώνει μια ταχεία, επαναλήψιμη, και οικονομικώς αποδοτική μέθοδος για την ανίχνευση του multiplex SNPs, αφού CE με QIAXCEL είναι κατάλληλη για την επίλυση αμπλικονίων με τόσο λίγο όσο 5 διαφορά μεγέθους bp, τη μικρότερη διαφορά μεγέθους σε αυτό το τεστ ήταν 10 bp. Καθώς τα μήκη ανάγνωσης σε αυτή τη δοκιμασία έχει μια τυπική απόκλιση από 0.8 έως 1.3 (πίνακας 2), τον προσδιορισμό της αλληλόμορφο επομένως δεν παρενέβαινε.

Η χρήση των χιμαιρικών εκκινητών και διακόπτης διφασική θερμοκρασία της διαδικασίας ανόπτησης μειώνει τη διαφορά σε αποτελεσματικότητα ενίσχυσης μεταξύ αμπλικόνια. Κατά τη διάρκεια των πρώτων λίγων κύκλων PCR, η ενίσχυση διεξάγεται με αλληλόμορφο-ειδικές χιμαιρικές εκκινητές. Σε μεταγενέστερα στάδια της PCR, η ενίσχυση είναι κατά κύριο λόγο πραγματοποιείται με καθολική εκκινητές, έτσι ώστε όλοι οι στόχοι σε αυτό το πολλαπλό σύστημα PCR ενισχυμένο με αμερόληπτο τρόπο από ένα μόνο ζεύγος γενικών εκκινητών. Αυτό μειώνει την εμφάνιση των προκατειλημμένη και μερικής ενίσχυσης, ελαχιστοποιεί μη ειδικές αντιδράσεις, και μειώνει την ανάγκη για βελτιστοποίηση της κάθε δοκιμασίας PCR.

Για την εκτίμηση των σφαλμάτων που προκύπτουν από την αξιοποίηση των electrophoregrams multi-band να διακρίνει αμπλικόνια , το μήκος ανάγνωσης της κάθε ζώνης συγκρίθηκε με τα θεωρητικά μήκη υπολογίζεται από τον εκκινητή ευθυγράμμισης (Πίνακας 2). Δεν αλληλοεπικάλυψη στο εύρος μήκους ανάγνωσης μεταξύ οποιωνδήποτε δύο από τα αμπλικόνια παρατηρήθηκε, επιπλέον, δεν υπάρχει επικάλυψη των διαστημάτων εμπιστοσύνης 99% της παρατηρούμενης μέση διάρκεια ανάγνωσης. Είναι αξιοσημείωτο ότι οι εντάσεις μπορεί να υπόκεινται σε διάφορους παράγοντες, συμπεριλαμβανομένων της ποιότητας γονιδιακού DNA και PCR ποιότητας αντιδραστήρια? βρήκαμε ότι 50-100 ng /μL DNA είναι η βέλτιστη για την παροχή επαρκώς σαφής και φωτεινό ζώνες με ελάχιστη φόντο (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον, σε αντίθεση με τις περισσότερες άλλες μεθόδους που αναφέρθηκαν T-ARMS-PCR, ένα διασκέφθηκε αναντιστοιχία στην θέση -1 από το 3 ‘άκρο ενσωματώθηκε δύο εσωτερικά αρχικά τεμάχια και ήταν επαρκώς ειδικό για τη διαφορική ανίχνευση δύο αλληλίων για κάθε SNP. Λόγω του περιορισμού των διακρίσεων μεγέθους μεταξύ των προϊόντων της PCR, ο σχεδιασμός εκκινητών PCR μπορεί να περιορίζεται σε κάποιο βαθμό, κάνοντας πολλούς T-ARMS-PCR δύσκολο να πληκτρολογήσετε αυτά τα SNPs που βρίσκονται πιο κοντά από 20 bp ο ένας στον άλλο.

Δύο διακριτά πλεονεκτήματα της μεθόδου πολλαπλών ARMS-PCR είναι ο σύντομος χρόνος δοκιμασίας και του χαμηλού κόστους, ακόμη και για τον ποσοτικό προσδιορισμό μεγάλων αριθμών δειγμάτων. Η προτεινόμενη μέθοδος, που περιλαμβάνει μόνο τα συμβατικά PCR με CE, μπορεί να πραγματοποιηθεί μέσα σε 3,5 ώρες με ελάχιστη χέρια-για την προσπάθεια. Μετά την εκχύλιση του γενωμικού DNA, τα επόμενα στάδια μπορεί να ολοκληρωθεί σε ένα μόνο σωλήνα αντίδρασης, επιτρέποντας την έτοιμη ανάλυση πολλαπλών δειγμάτων σε ένα μονό τρέξιμο για διαλογή υψηλής απόδοσης. Η δοκιμασία αυτή καταναλώνει μόνο πρότυπα αντιδραστήρια PCR και φυσίγγια ηλεκτροφόρηση? το κόστος σε αυτή τη μελέτη ήταν μόνο 2 $ ΗΠΑ για την ταυτόχρονη ανίχνευση των έξι SNPs ανά δείγμα.

Για τις γνώσεις μας, η προτεινόμενη μέθοδος είναι η πρώτη για τον εντοπισμό έξι SNPs σε μια ενιαία αντίδραση χρησιμοποιώντας τετρα-αστάρι ARMS- PCR. Η νέα μέθοδος πολυπλεξίας τετρα-εκκινητή ARMS-PCR αναπτύχθηκε σε αυτή τη μελέτη έχει σημαντικές δυνατότητες να εφαρμόζεται ευρέως και στις δύο εμπορικές και κλινικές ρυθμίσεις για την προβολή των πολλαπλών SNPs.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακα S1.

αλληλόμορφα των 6 SNPs του κάθε δείγματος σε αυτή τη μελέτη

doi:. 10.1371 /journal.pone.0062126.s001

(DOCX)