Αφηρημένο

Τα microRNAs (miRNAs) είναι μικρά, μη-κωδικοποίησης RNAs που είναι κρίσιμες ρυθμιστικές αρχές των διαφόρων ασθενειών. MicroRNA-20α (MIR-20α) έχει προηγουμένως μεταβληθεί σημαντικά σε μια σειρά από καρκίνους. Σε αυτή τη μελέτη, ανιχνεύσαμε τη σχέση μεταξύ miR-20a και την ανάπτυξη του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας με qRT-PCR, βρήκαμε ότι το επίπεδο έκφρασης της miR-20a ήταν σημαντικά υψηλότερη σε ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας σε σύγκριση με φυσιολογικούς ελέγχους, η παρεκκλίνουσα έκφραση του miR -20a συσχετίστηκε με μετάσταση λεμφαδένα, ιστολογικά βαθμού και της διαμέτρου του όγκου. Τότε θα εγκατασταθεί με επιτυχία τις σταθερές αντι-miR-20a καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές σειρές από φακοϊό. Σαθεροποιημένο miR-20a απέτρεψε την εξέλιξη του όγκου μέσω διαμόρφωσης κυτταρικού κύκλου, απόπτωση, και μετάσταση in vitro και in vivo. Timp2 και ATG7 αποδείχθηκαν να είναι άμεσοι στόχοι του miR-20a, χρησιμοποιώντας δοκιμασία λουσιφεράσης και κηλίδα western. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι miR-20a καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την εισβολή των καρκινικών κυττάρων του τραχήλου της μήτρας μέσω στόχευσης ATG7 και Timp2. Τα αποτελέσματά μας υποστηρίζουν τη συμμετοχή του miR-20a στην αυχενική ογκογένεση, ειδικά λέμφος μετάσταση στους λεμφαδένες. Προτείνουμε ότι miRNAs θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως θεραπευτικό μέσο για τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας

Παράθεση:. Zhao S, Γιάο D, Τσεν J, Ding Ν, Ren F (2015) MiR-20α Προωθεί τον καρκίνο του τραχήλου της διάδοσης και Μετάσταση In Vitro και in vivo. PLoS ONE 10 (3): e0120905. doi: 10.1371 /journal.pone.0120905

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Xin Yuan-Γκουάν, το Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, την Κίνα

Ελήφθη: 25 του Σεπτέμβρη 2014? Αποδεκτές: 27η Ιανουαρίου, 2015? Δημοσιεύθηκε: 24, Μάρ του 2015

Copyright: © 2015 Zhao et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι μέσα στα αρχεία υποστήριξης Πληροφορίες

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Ίδρυμα Guangxi Φυσικών Επιστημών (No.2011GXNSFA018184 και 2013GXNSFBA019132), Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (No.81460398), και υποστηρίζεται από το Τμήμα Υγείας Guangxi (No.Z2013018). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του τραχήλου της μήτρας είναι ο δεύτερος πιο κοινός τύπος καρκίνου στις γυναίκες σε όλο τον κόσμο, η οποία είναι η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο, με αποτέλεσμα περίπου 300.000 θανάτους κάθε χρόνο [1]. Οι περισσότεροι ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας λαμβάνει τυπική ακτινοθεραπεία και χημειοθεραπεία. Ωστόσο, τα κλινικά αποτελέσματα ποικίλλουν σημαντικά. Σύμφωνα με τον κόσμο, υπήρχαν περίπου 500.000 νέες περιπτώσεις κάθε χρόνο, το 85% των παθολογικών τύπων ήταν πλακώδες καρκίνωμα. Παρά το γεγονός ότι η εξέταση τραχήλου κυτταρολογία ωφελεί πολύ στην έγκαιρη διάγνωση και έγκαιρη θεραπεία κατά τις τελευταίες δεκαετίες, του τραχήλου της μήτρας ποσοστά καρκίνου νοσηρότητα παραμένουν υψηλές, και υπήρχαν όλο και περισσότεροι νέοι περιπτώσεις πρόσφατα. Έτσι, πολλοί ερευνητές οι ίδιοι αφιερώνουν για να βρείτε παθογένεια και πιο αποτελεσματική θεραπεία των όγκων. microRNAs (miRNAs) είναι μικρά μη-κωδικοποίησης RNA των περίπου 21-25 νουκλεοτιδίων (nt) και να ενεργούν ως μετα-μεταγραφικό ρυθμιστές της γονιδιακής έκφρασης [2]. Αυτά τα μικρά μόρια έχουν βρεθεί να ρυθμίζει γονίδια που εμπλέκονται σε διάφορες βιολογικές διεργασίες όπως τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την ανάπτυξη, τη διαφοροποίηση, την απόπτωση και άλλα. Πολυάριθμες μελέτες έχουν δείξει ότι αλλοιώσεις στη σύνθεση miRNAs σε ανθρώπινους καρκίνους είναι συχνά σχετίζονται με την ανάπτυξη του όγκου, εξέλιξη και μετάσταση [3]. νωρίς πειράματά μας με συστοιχίες υβριδισμού σύγκριση του προφίλ έκφρασης microRNA μεταξύ φυσιολογικό τραχηλικό ιστών και του τραχήλου της μήτρας καρκινώματα πλακωδών κυττάρων των ιστών, εξετάστηκαν 89 miRNAs, και miR-20a ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω σημαντικά. MiR-20a ήταν γνωστό ότι ανήκουν στο σύμπλεγμα miR-17-92, η οποία είναι η πιο εκτεταμένα μελετηθεί σύμπλεγμα που έχει ένα ογκογόνο λειτουργία [4]. Σε αυτή τη μελέτη έχουμε επικεντρωθεί σε miR-20a η οποία θα μπορούσε να είναι μια πολλά υποσχόμενη αφετηρία για την ανάπτυξη της μελλοντικής του τραχήλου της μήτρας θεραπεία miRNA με βάση τον καρκίνο.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθικοί

Η διαδικασία συναίνεσης και η αγωγιμότητα της μελέτης αυτής εγκρίθηκαν από την επιτροπή δεοντολογίας του Guangxi Ιατρικό Πανεπιστήμιο. Η μελέτη διεξήχθη σύμφωνα με τις αρχές που ορίζονται στη Διακήρυξη του Ελσίνκι. Τα δεδομένα συλλέχθηκαν ανώνυμα. Λεκτική συγκατάθεση λήφθηκε από όλα τα άτομα, μάρτυρες, και επισήμως καταγραφεί για κάθε έρευνα. Γραπτή συγκατάθεση για τη χρήση των δειγμάτων για ερευνητικούς σκοπούς λήφθηκε από όλους τους ασθενείς πριν από το χειρουργείο. ζωικό πείραμα διεξήχθη σε αυστηρή συμφωνία με τον Οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου των ΗΠΑ Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας, και το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας των πειραμάτων σε ζώα της Guangxi Ιατρικό Πανεπιστήμιο.

ασθενείς και δείγματα

δείγματα τραχηλικού ιστού συλλέχθηκαν από το τμήμα της γυναικολογική ογκολογία, το Ενταγμένο όγκων Νοσοκομείο Guangxi Ιατρικό Πανεπιστήμιο μεταξύ 2010 και 2011. Ογδόντα του τραχήλου της μήτρας δείγματα καρκίνου του διεθνούς Ομοσπονδίας Γυναικολογίας και Μαιευτικής (FIGO ) stageⅠ-ⅱA ελήφθησαν από ασθενείς που υποβλήθηκαν σε χειρουργική θεραπεία. Είκοσι δείγματα stageⅡB-Ⅳ είχαν πήρε από καρκίνο του τραχήλου της βιοψίας. Όλα τα δείγματα ήταν πλακώδες καρκίνωμα. Δεν υπάρχει προηγούμενο τοπική ή συστηματική θεραπεία είχε διεξαχθεί σε αυτούς τους ασθενείς πριν από τη λειτουργία ή βιοψία. LNM επιβεβαιώθηκε σε ασθενείς του σταδίου Ⅰ-ⅡA που χρησιμοποιήσαμε λειτουργίας για την πρώτη θεραπεία. Η διάμεση ηλικία των ασθενών ήταν 49 ετών, με ένα εύρος από 25 έως 69 ετών. Κανονική δείγματα τραχηλικού επιθηλίου συλλέχθηκαν από 120 ασθενείς οι οποίοι είχαν υστερεκτομή για καλοήθη ασθένεια. Η μέση ηλικία για άτομα ελέγχου ήταν 45 ετών, που κυμαίνονται από 33 σε 57 έτη. Οι ιστοί καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο αμέσως μετά την χειρουργική αφαίρεση και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C μέχρι τη χρήση.

ποσοτική πραγματικού χρόνου Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης

RNA εξήχθη από κατεψυγμένο φρέσκο ​​τραχήλου καρκινικούς ιστούς, φυσιολογικούς ιστούς τραχηλικό επιθήλιο και ο καρκίνος του τραχήλου της μήτρας κύτταρα χρησιμοποιώντας το κιτ απομόνωσης miRcut miRNA (Tiangen, Κίνα) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι αντιδράσεις αντίστροφης μεταγραφής πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα κιτ MiraMasTM (Bioo επιστημονικούς, USA), που περιέχει πολυ (Α) πολυμεράση που χρησιμοποιείται για την πολυαδενυλίωση του miRNA. qRT-PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα τυποποιημένο κιτ SYBR Green PCR (Takara, Japan) .Οι εκκινητές συνετέθησαν (Shanghai GenePharma, Κίνα), ως εξής: miR-20a προωθεί εκκινητής: TAC GAT ΑΑΑ ΟΤΟ ΟΤΤ ΑΤΑ GTG CAG GTA G. U6 εμπρός αστάρι: ATT GGA ACG ΑΤΑ CAG AGA AGA ΤΤ. Καθολική αστάρι αντίστροφη: GTC CTT GGT GCC CGA GTG. Το μίγμα 20 μΙ PCR αποτελούνταν από 12,5 μΙ SYBR Green Supermix, 3,5 μΙ RNase-free νερό, 1 μΙ προς τα εμπρός εναρκτήρες, 1 μΐ αντίστροφης εκκινητές, και 2 μΙ αντίστροφη μεταγραφεί προϊόν. Οι συνθήκες της αντίδρασης ήταν 40 κύκλοι ενίσχυσης στους 95 ° C για 3 λεπτά, 95 ° C για 12 s, και 62 ° C για 50 s χρησιμοποιώντας ένα BIO-chromo4 (Bio-Rad, USA) ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR System. U6 χρησιμοποιήθηκε ως αναφορές για miRNAs. Κάθε δείγμα αναλύθηκε εις τριπλούν. Συγκριτική κύκλο κατωφλίου (CT) μέθοδος φορές αλλαγή (2-ΔΔCT) χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση σχετικές μεταβολές.

Cell Culture

Τα CC κυτταρικές σειρές SiHa, HCC94, C33A και Caski ελήφθησαν από κεντρικό εργαστήριο του Συγγενείς όγκων Νοσοκομείο Guangxi Ιατρικό Πανεπιστήμιο. Αυτά τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε ατμόσφαιρα 5% CO2 σε RPMI-1640, με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό.

διαμορφωθεί ένα σταθερό αντι-miR-20a τραχήλου καρκινικές κυτταρικές σειρές από φακοϊό

Οι φορείς λεντοϊών με miRNAs που βασίζεται στο πλαίσιο miR-20a κατασκευάστηκε από την GeneChem Εταιρείας (Σαγκάη, Κίνα). Εν συντομία, το δίκλωνο ολιγονουκλεοτίδιο που κωδικοποιεί αντι-miRNA και αρνητικός έλεγχος ανοπτήθηκαν και εισάγεται στο γραμμικοποιημένο φορέα ευκαρυωτικής pfu-GW-009 (GeneChem). Όλες αυτές οι φορείς επιβεβαιώθηκαν με ανάλυση αλληλουχίας. Οι ανασυνδυαστικής φορείς και οι φορείς συσκευασίας (pHelper 1.0 και pHelper 2.0) (GeneChem) συν-επιμολύνθηκε σε 293Τ κύτταρα (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) με Lipofectamine2000 (Invitrogen). Τα υπερκείμενα καλλιέργειας συλλέχθηκαν στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, συμπυκνώθηκε. Όλες οι φορείς λεντοϊών που εκφράστηκαν ενισχυμένη πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP), η οποία επέτρεψε για να χαμογελάνε και τη μέτρηση της αποτελεσματικότητας μόλυνση τους σε μολυσμένα κύτταρα. Τα κύτταρα διαιρούνται σε τρεις ομάδες ανάλογα με τους στόχους μας: Α: χωρίς μόλυνση του ιού (NC)? β: λοίμωξη του ιού ελέγχου (NC-LV)? c:.. λοίμωξης αντι miR-20a-ιού (αντι-miR-20a-LV)

λειτουργία Βιολογίας Κυττάρου in vitro

δοκιμασία Κυτταρική βιωσιμότητα

Η ικανότητα κυτταρικός πολλαπλασιασμός μετρήθηκε με την 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) δοκιμασία -2,5-διφαινυλτετραζολίου (ΜΤΤ). Εικοσιτέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση, 1 × 10

4 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκα μικροτιτλοδότησης 96 φρεατίων για 24, 48, 72, και 96 ώρες, αντίστοιχα. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επωάστηκαν με 20 μΙ ΜΤΤ (5 mg /ml, ρΗ = 7.4) για 4 ώρες στους 37 ° C και 150 μΙ διμεθυλοσουλφιδίου προστέθηκαν για τη διαλυτοποίηση των κρυστάλλων για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Η οπτική πυκνότητα (OD) μετρήθηκε σε μήκος κύματος 490 nm. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν τρεις φορές και υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας μέσο όρο των αποτελεσμάτων, τα οποία θα χρησιμοποιηθούν για να σχεδιάσετε τις καμπύλες ανάπτυξης. ποσοστό αναστολής της ανάπτυξης υπολογίστηκε ως εξής: (AC-AT) /AC × 100% (AC = τιμή απορρόφησης του NC και AT = τιμή απορρόφησης της πειραματικής ομάδας)

δοκιμασία κυτταρικού κύκλου.. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε 70% αιθανόλη για 2 ώρες στους 4 ° C. Μετά την πλύση με PBS, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με RΝάση Α (50 μg /ml) και χρωματίστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (25 μg /ml) για 30 λεπτά στους 37 ° C. Τα δείγματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα κυτταρόμετρο ροής και τη διανομή των φάσεων του κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ΜΟϋΡΙΤ Software (BD Biosciences). Η πολλαπλασιαστική δείκτης υπολογίστηκε ως το ποσοστό των κυττάρων σε S /G2 /M φάση.

δοκιμασία κυτταρικής απόπτωσης.

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και χρωματίστηκαν με ανεξίνη V-ΡΕ και 7ΑΑΌ χρησιμοποιώντας αννεξίνης Kit V-ΡΕ (Beckman) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή και υποβλήθηκαν σε ανάλυση κυτταρομετρίας ροής.

επεμβατικές και μετανάστευση δοκιμασία.

50.000 κύτταρα σπάρθηκαν σε transwell ενθέτου (Corning) συμπληρωμένο με 1640 με 10% ορό. Η κάτω πλευρά του transwells πληρώθηκε με 1640 με 20% ορό. Για τη δοκιμασία μετανάστευση, Matrige l (BD Biosciences) εμβολιάζεται σε transwell ενθέτου και αφέθηκαν να αναπτυχθούν έως συρροής για 1 ημέρα. 50,000 κύτταρα σπάρθηκαν σε ένθετα transwell συμπληρωμένο με 1640 με 10% ορό. Η κάτω πλευρά του transwells πληρώθηκε με 1640 με 20% ορό. Μετά από 24 ώρες, οι μεμβράνες κηλιδώθηκαν χρησιμοποιώντας χρώση αιματοξυλίνης-ηωσίνης, κύτταρα μετρήθηκαν κάτω από το μικροσκόπιο φθορισμού. Αυτό το πείραμα εκτελέστηκε τρεις φορές ανεξάρτητα εις διπλούν.

δοκιμασίας σχηματισμού αποικίας.

Περίπου 500 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε φρέσκο ​​6 φρεατίων για άλλες 12 ώρες και διατηρήθηκαν σε RMPI 1640 που περιέχει 10% FBS για 2 εβδομάδες. Οι αποικίες σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη και βάφτηκαν με 0.1% κρυσταλλικό ιώδες σε 20% μεθανόλη για 15 λεπτά. Τα κύτταρα μετρήθηκαν υπό το μικροσκόπιο φθορισμού. Αυτό το πείραμα εκτελέστηκε τρεις φορές ανεξάρτητα εις διπλούν.

In vivo δοκιμασίες για πολλαπλασιασμό καρκινικών

Είκοσι τέσσερα 6-εβδομάδων που ζυγίζουν 19-21 g ανοσοανεπάρκεια μπεζ /nude /xid ηυ /ηυ θηλυκού ποντίκια αγοράστηκαν από Guangxi Ιατρικό Πανεπιστήμιο, και διατηρείται υπό συνθήκες ελεύθερες παθογόνων με ακτινοβολημένα chow. Στο πείραμά μας, 2 × 10

6 κύτταρα διαφορετικών ομάδων σε 0,2 mL PBS εγχύθηκε υποδόρια στο πορτ-μπαγκάζ του 24 ποντίκια, οδηγώντας στο σχηματισμό ενός όγκου ανά ζώο. ένυδρη χλωράλη 0.2ml ήταν ενδοπεριτοναϊκή εγχύθηκε να λάβει φθορίζουσες εικόνες μετά την αναισθησία, όταν η διάμετρος του όγκου ήταν 2 εκατοστά. Σχεδιάστε την καμπύλη ανάπτυξης. Η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε με τον όγκο του όγκου, η οποία υπολογίστηκε όπως περιγράφεται:. Όγκος (mm

3) = πλάτος

2 (mm

2) × μήκος (mm) /2

κηλίδος Western

οι κυτταρικές πρωτεΐνες παρασκευάσθηκαν χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό κυτταρικής λύσης (50 mM Tris-HCl, ρΗ 8,0, 1% ΝΡ-40, 2 mM EDTA, 10 mM NaCl, 2 mg /ml απροτινίνη, 5 mg /ml λευπεπτίνη, 2 mg /ml πεπστατίνη, 1 mM DTT, 0,1% SDS και 1 mM φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο). Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης (50 μg) διαχωρίστηκαν με 10% SDS PAGE και εν συνεχεία μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (NY, USA) με ηλεκτροκηλίδωση. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% BSA σε TBST (10 mM Tris-HCl, ρΗ 8.0, 150 mM NaCl, και 0,05% Tween 20) για 1 ώρα, και στη συνέχεια επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα (Santa Cruz) όλη τη νύκτα στους 4 ° C πριν επακόλουθη επώαση με δεύτερο αντίσωμα (BD) για 1 ώρα στους 37 ° C. Η πρωτεΐνη οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (Santa Cruz).

Λουσιφεράσης δοκιμασία

Οι θέσεις από 3 ‘UTR ATG7 /Timp2 ή μεταλλαγμένη 3’ UTR δεσμευτικός miR-20a κλωνοποιήθηκαν στον ανταποκριτή pGL3 λουσιφεράσης φορέα (GeneChem). Για τη δοκιμασία ρεπόρτερ, 100 ηΜ miR-20a μιμούνται ή να ελέγχουν miRNA ήταν συν-επιμολύνθηκαν με 0.1 μα άγριου τύπου pGL3-3’UTR ή μεταλλαγμένο πλασμίδιο DNAs σε κύτταρα SiHa σε πλάκες 96-φρεατίων χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000. Η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε 48 ώρες μετά την διαμόλυνση, όπως περιγράφεται προηγουμένως.

Στατιστική ανάλυση

Όλα τα δεδομένα υπέστησαν επεξεργασία χρησιμοποιώντας PASW Στατιστικά 16. τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± SEM. χρησιμοποιώντας t δοκιμές για συγκρίσεις 2-ομάδα. Ενώ τα αποτελέσματα δεν εμφανίζουν κανονική κατανομή, επιλέξαμε να αναλύσουμε τα δεδομένα με μη-παραμετρικές μεθόδους. (Mann-Whitney U test ανάμεσα σε δυο ομάδες και τεστ Kruskal-Wallis H για τρεις ή περισσότερες ομάδες). Ένα

P

τιμή μικρότερη από 0,05 θεωρείται στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

MiR-20α-up ρυθμίζεται σε καρκίνο του τραχήλου

Χρησιμοποιώντας ένα qRT- μέθοδο PCR, τα επίπεδα miR-20a ανιχνεύθηκαν σε 100 τραχήλου καρκινικούς ιστούς και 120 φυσιολογικό τραχηλικό ιστούς, καθώς και του τραχήλου της μήτρας κυτταρικές γραμμές. Μεταξύ των 100 ασθενών με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, τα δεδομένα που αναφέρθηκαν στο Σχ. 1Α παρουσιάζει miR-20a είναι σίγουρα πάνω ρυθμισμένα στην εξασθενημένη ιστού με ένα μέσο όρο 6,92, γεγονός που υποδηλώνει ότι η αύξηση του miR-20a ήταν ένα συχνό γεγονός στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Οι ασθενείς με τα επάνω ρυθμισμένη έκφραση του miR-20a έτειναν να έχουν LNM (

P

= 0,001) όπως στο Σχ. 1Β, αυξημένα μεγέθη όγκου (

P

= 0,013, Mann-Whitney U test), σε προχωρημένο στάδιο (

P

= 0,004, Kruskal-Wallis test Η), και προηγμένες ιστολογική Βαθμός (

P

= 0,027, Mann-Whitney test U) του καρκίνου του τραχήλου. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ο miR-20a μπορεί να παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην αυχενική μετάσταση και την πρόοδο του καρκίνου

Α:. MiR-20α μετρήθηκε με qRT-PCR. Datas παρουσιάστηκαν ως log10 της πολλαπλής μεταβολής. Η δοκιμή Mann-Whitney πραγματοποιήθηκε για να εξεταστεί η διαφορά μεταξύ της κανονικής τους ελέγχους και τους ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, δοκιμή Kruskal-Wallis Η χρησιμοποιήθηκε για τον καθορισμό της διαφοράς μεταξύ των σταδίων Ι-ΐν των ασθενών με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Β: Συγκρίναμε την έκφραση μεταξύ των ασθενών που είχαν lymp μετάσταση στους λεμφαδένες ή όχι στο ίδιο στάδιο. C: Τα επίπεδα έκφρασης του miR-20a ανιχνεύθηκε με qRT-PCR σε καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές γραμμές (SiHa, HCC94, C33A και Caski).

P

-τιμή & lt?. 0.05 θεωρήθηκε σημαντική

Η

Επιπλέον, τα επίπεδα έκφρασης του miR-20a είχαν εντοπιστεί από qRT-PCR σε καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές σειρές (SiHa, HCC94, C33A και Caski) (Εικ. 1Γ), τα οποία ήταν υψηλότερα στην κυτταρική γραμμή SiHa.

miR-20α διευκολύνει τραχήλου της μήτρας ανάπτυξη του καρκίνου και μετάσταση in vitro

Σημειώνοντας τη συσχέτιση μεταξύ up-ρύθμιση των επιπέδων του miR-20a και του τραχήλου της μήτρας εξέλιξης του καρκίνου, διερευνήσαμε την επίδραση της miR-20a επί των ανάπτυξη, τη μετανάστευση και εισβολή ικανότητες του τραχήλου της μήτρας καρκινικών κυτταρικών γραμμών. SiHa κυτταρική σειρά μολύνθηκε είτε με αντι-miR-20a ή τον έλεγχο φακοϊού και να δημιουργήσουν τη σταθερή SiHa κυτταρική σειρά αντι-miR-20a (Εικ. 2Α). Σε σύγκριση με την έκφραση της ομάδας ελέγχου, miR-20a σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται στην κυτταρική γραμμή SiHa μετά από μόλυνση με αντι-miR-20a-LV (Σχ. 2Β). Τα κύτταρα διαιρούνται σε τρεις ομάδες ανάλογα με τους στόχους μας: Α: χωρίς μόλυνση του ιού (NC)? β: λοίμωξη του ιού ελέγχου (NC-LV)? c:. λοίμωξης αντι miR-20a-ιού (αντι-miR-20a-LV)

Α: GFP ροή επισήμανση κυτταρομετρίας ανάλυση έδειξε ότι το ποσοστό των GFP θετικών κυττάρων ήταν περίπου 97% σε σταθερές φακοϊό μολυσμένα κυτταρική σειρά SiHa. Β:. MiR-20α ήταν χαμηλότερη εκφράζονται σε σταθερές αντι-miR-20a SiHa κυτταρική γραμμή, ενώ το επίπεδο έκφρασης του miR-20a ήταν ακόμα πολύ υψηλή σε κύτταρα μολυσμένα με αρνητικό μάρτυρα

Η

Στη συνέχεια, η κυτταρική ανάπτυξη χαρακτηριστικά, κυτταρικού κύκλου, σχηματισμός κλώνος, κυτταρική μετανάστευση, προσκόλληση, διεξήχθησαν πειράματα κυτταρικής εισβολής. Καμπύλες ανάπτυξης έδειξε ότι η μόλυνση του αντι-miR-20a ανάπτυξη καρκίνου του τραχήλου κυτταρική γραμμή επιβραδύνθηκε (Σχ. 3Α). Η κυτταρομετρία ροής έδειξε την μέση του περίοδο G1 των κυττάρων στην ομάδα που αντι-miR-20a-LV είναι 69,6%, ενώ η αντίστοιχη ομάδα ελέγχου ήταν 55%, είναι για τη μείωση του κύκλου πολλαπλασιασμού των κυττάρων (Σχ. 3Β). Αποπτωτικό ποσοστό αυξήθηκε και έφτασε τις διαφορές στατιστική σημαντικότητα σε κάθε ομάδα (

P

& lt? 0.001) (Εικ. 3C). Μετανάστευση, την ικανότητα προσκόλλησης της εισβολής του τραχήλου της μήτρας καρκινικών κυττάρων ανιχνεύθηκε επίσης, miR-20a θα μπορούσε να διευκολύνει τη μετάσταση (

P

& lt? 0,01) (Εικ. 3D και 3Ε). Ο ρυθμός σχηματισμού αποικιών των δύο ομάδων, δεν ήταν στατιστικά σημαντική διαφορά (

P

& gt? 0,05) (Εικ. 3F). Όπως ήταν αναμενόμενο, τα κάτω την έκφραση του miR-20a κατέστειλε σημαντικά τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και εισβολή ικανότητες

Α:. Down-ρυθμιζόμενη miR-20a ανέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε κύτταρα SiHa με δοκιμασία ΜΤΤ. Β: κυτταρικού κύκλου καθορίζεται από τη ροή χρώση ΡΙ κυτταρομετρία. C: κυτταρικής απόπτωσης ανιχνεύεται με Annexin V-ΡΕ συνδυασμένη ροή επισήμανση κυτταρομετρία, αποπτωτικά ρυθμός αυξήθηκε και έφθασε στατιστική σημαντικότητα των διαφορών σε κάθε ομάδα. D, E εκπροσωπούνται τα αποτελέσματα της κυτταρικής εισβολής και μετανάστευση διαμέσου της μεμβράνης με ή χωρίς Matrigel, η οποία έδειξε ότι η αντι-miR-20a μείωσε την ικανότητα κυτταρική μετανάστευση και εισβολή. F: Τα ποσοστά σχηματισμού αποικιών των τριών αυτών ομάδων δεν είχε καμία σημαντική διαφορά

Η

MiR-20α Αυξάνει την ανάπτυξη του όγκου σε Vivo

Με βάση τις παρατηρούμενες μειώσεις σε μεταναστευτικά, επεμβατικές και πολλαπλασιαστικές συμπεριφορές. σε κύτταρα SiHa μολυσμένα με αντι-miR-20a-LV, έχουμε την επόμενη διερευνήθηκε ο ρόλος του miR-20a in vivo. Εμείς υποδορίως εμβολιάσθηκαν γυμνά ποντίκια με ίσους αριθμούς (1 × 10

6 κύτταρα ανά ποντικό) των κυττάρων SiHa με την αναγκαστική έκφραση του miR-20a ή NC, Tumor επίπτωση αξιολογήθηκε κάθε πέντε ημέρες, και οι όγκοι εμφανίστηκαν σε όλα τα ποντίκια. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι διαμεσολαβείται φακοϊό αντι-miR-20a μπορεί να καταστείλει σημαντικά την ανάπτυξη του τραχήλου της μήτρας ξενομοσχευμάτων καρκίνου σε γυμνούς ποντικούς (Εικ. 4)

Α:. Ανθρώπινου τραχηλικού μοντέλο καρκίνου μεταμοσχεύονται υποδορίως σε γυμνούς ποντικούς καθιερώθηκε. Στο τέλος του πειράματος, οι όγκοι του όγκου μετρήθηκαν την χάραξη της καμπύλης ανάπτυξης των διαφόρων ομάδων. Στο μοντέλο υποδόριου όγκου η διάσταση του όγκου σε πειραματική ομάδα είναι μικρότερη από ότι στην ομάδα ελέγχου. Υπήρχε μία σημαντική διαφορά μεταξύ κάθε ομάδα (

P

& lt? 0,01). Β:. Εικόνες από όγκους σε κάθε ομάδα

Η

MiR-20α Άμεσα στόχους και Αναστέλλει ATG7 και Timp2

Για να καταλάβουμε πώς miR-20a διευκολύνει τραχήλου της μήτρας ανάπτυξη του καρκίνου και μετάσταση, χρησιμοποιήσαμε τρεις αλγορίθμους (Targetscan, Pictar και Μιράντα) για να βοηθήσει στον εντοπισμό των στόχων miR-20a σε ανθρώπινους καρκίνους του τραχήλου. Από αυτά τα γονίδια στόχους που είχαν προβλεφθεί από τις τρεις αλγορίθμους (Εικ. 5Α), που σχετίζονται με autophagy πρωτεΐνη 7 (ATG7) και αναστολείς μεταλλοπρωτεϊνάσης ιστού 2 (Timp2) προσέλκυσε την προσοχή μας αμέσως όπως έχουν ενοχοποιηθεί στην ογκογένεση και τη μετάσταση. Εμείς κλωνοποίησαν το ATG7 και Timp2 3′-UTR σε έναν φορέα αναφοράς λουσιφεράσης. δοκιμασία λουσιφεράσης αποκάλυψε ότι miR-20a συνδέεται άμεσα με ATG7 και Timp2 3′-UTR, και με την οποία μειώνεται αξιοσημείωτα δραστηριότητες λουσιφεράσης (Σχ. 5Β). Ωστόσο, η μετάλλαξη των υποθετικές θέσεις miR-20a στην 3′-UTR του ATG7 και Timp2 κατήργησε λουσιφεράσης αποκρισιμότητα σε miR-20a. Για να αξιολογηθεί άμεσα την επίδραση του miR-20a επί της έκφρασης ATG7 και Timp2, πραγματοποιήσαμε ανάλυση στυπώματος western. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5C, νοκ ντάουν του miR-20a, μέσω της μόλυνσης των αντι-miR-20a-LV, σε κύτταρα SiHa αυξημένη ATG7 και Timp2 επίπεδα της πρωτεΐνης. Στο σύνολό τους, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ATG7 και Timp2 είναι άμεσες μεταγενέστεροι στόχοι για miR-20a σε κύτταρα SiHa. Τα παραπάνω αποτελέσματα μας ώθησε να εξετάσει κατά πόσον miR-20a καταστέλλει την ανάπτυξη του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας και των μεταστάσεων μέσω της καταστολής ATG7 και της έκφρασης Timp2

Α:. Προβλεπόμενη επακόλουθη σύζευξη της περιοχής στόχου και miRNA από Targetscan, Pictar και Μιράντα. Β: Η δραστηριότητα της λουσιφεράσης εμφανίζεται μια σημαντική μείωση μετά από miR-20a επιβάλλεται έκφρασης σε σύγκριση με αρνητικό ομάδα ελέγχου. C:. Κηλίδα Western αναλύσεις έδειξαν νοκ ντάουν του miR-20a, μέσω της μόλυνσης των αντι-miR-20a-LV, σε κύτταρα SiHa αυξημένη ATG7 και Timp2 επίπεδα της πρωτεΐνης

Η

Συζήτηση

μας ομάδα έχει εστιάσει το ενδιαφέρον για το μοριακό μηχανισμό της ανάπτυξης του τραχήλου της μήτρας πλακώδες καρκίνωμα κατά τα τελευταία χρόνια, ειδικά αφιερώνει στην έρευνα της ανάπτυξης και της μετάστασης. λεμφαδένα μετάσταση (LNM) είναι η πιο σημαντική προγνωστικός παράγοντας από τους ασθενείς με σταδίου ΙΒ ή ΙΙΑ, το ποσοστό πενταετούς επιβίωσης των ασθενών μειώνεται δραματικά από περίπου 80-95% σε ασθενείς χωρίς μεταστάσεις στους λεμφαδένες σε περίπου 50-65% σε ασθενείς με θετικούς λεμφαδένες. Ως εκ τούτου, αναμένεται ότι η απορρύθμιση των microRNAs μπορεί να διευκολύνει την προηγμένη εξέλιξη του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας πλακωδών κυττάρων. Zhang J, et al ρίξει φως σχετικά με την αρνητική ρύθμιση ανάδρασης του NF-κΒ /miR-130 /TNF-α /NF-κΒ στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας και μπορεί να παρέχει γνώσεις σχετικά με την καρκινογένεση του καρκίνου του τραχήλου [5]. Wen SY, et al βρήκαν ότι miR-506 έκφραση ρυθμίζεται προς τα κάτω σε περίπου το 80% του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας δείγματα εξετάστηκαν και αντιστρόφως ανάλογη με την έκφραση του Ki-67 [6]. Μεταξύ ογκογόνο miRNAs, ένα από τα καλύτερα χαρακτηρισμένο είναι miR-17-92, ένα πολυσιστρονικό σύμπλεγμα miRNA, που ορίζεται ως OncomiR-1 [7]. Ο πρόδρομος μεταγραφή περιέχει έξι διαδοχικές δομές φουρκέτας στελέχους-βρόχου που αποφέρουν τελικά έξι ώριμη miRNAs: miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-20a, miR-19b-1 και miR-92-1 [8]. Ειδικότερα, miR-17-92 βρίσκεται στο 13q31.3, μια περιοχή ενισχύθηκε σε αρκετές αιματοποιητικές κακοήθειες και συμπαγείς όγκους, συμπεριλαμβανομένων των λεμφωμάτων διάχυτο Β-κυττάρου, θυλακιώδη λεμφώματα, λεμφώματα Burkitt, και καρκίνωμα πνεύμονα [9].

Πρόσφατα ευρήματα δείχνουν ότι αυτά τα miRNAs ολοκληρωμένα συστατικά των μοριακών οδών που ρυθμίζουν την ανάπτυξη του όγκου και τη συντήρηση των όγκων, οι επιπτώσεις του miR-20a υπερέκφραση εξετάστηκαν σε πολλαπλά ζωικά μοντέλα, καρκίνους του ανθρώπου, και συστήματα καλλιέργειας κυττάρων για την ικανότητά της να ρυθμίζει ένας αριθμός κυτταρικών διεργασιών που ευνοούν κακοήθη μετασχηματισμό [10-11]. Οι μελέτες αυτές ως σύνολο αποκάλυψε ότι λειτουργίες miR-20a pleiotropically τόσο κατά τη φυσιολογική ανάπτυξη και κακοήθη μετασχηματισμό για την προώθηση του πολλαπλασιασμού, αναστέλλουν τη διαφοροποίηση, αυξάνουν την αγγειογένεση, και να διατηρήσουν την κυτταρική επιβίωση. Ωστόσο, το δυναμικό λειτουργία αυτού του microRNA σε εξέλιξη ανθρώπινου τραχηλικού πλακώδες καρκίνωμα έχει λίγες αναφορές. Στην παρούσα μελέτη, μας ενδιαφέρει το δυνητικό ρόλο του miR-20a στην κακοήθη εξέλιξη των κυττάρων SiHa.

Σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι το miR-20a ήταν συχνά up-ρυθμίζονται σε δείγματα ιστών. Έτσι, υποτίθεται ότι το miR-20a μπορεί να είναι ένα μυθιστόρημα ογκογονίδιο όγκου miRNA και η απορρύθμιση της μπορεί να περιλαμβάνει την προηγμένη εξέλιξη του καρκίνου στον άνθρωπο. Στη συνέχεια, μελετήθηκε η λειτουργία του miR-20a σε κύτταρα SiHa. Καθιέρωση των σταθερών αντι-miR-20a τραχήλου καρκινικές κυτταρικές σειρές από φακοϊό, και προηγείται με τα χαρακτηριστικά της κυτταρικής ανάπτυξης, του κυτταρικού κύκλου, σχηματισμός κλώνος, κυτταρική μετανάστευση, προσκόλληση, και πειράματα εισβολή. Το μοντέλο της κάτω εξέφρασε miR-20a του τραχήλου της μήτρας ξενομοσχευμάτων καρκίνου σε γυμνούς ποντικούς ιδρύθηκε επίσης που διερευνούν τις δυνατότητες της αντι-miR-20a in vivo. Στη συνέχεια βρήκαμε ότι ανέστειλε miR-20a απέτρεψε την εξέλιξη του όγκου μέσω διαμόρφωσης κυτταρικού κύκλου, του πολλαπλασιασμού, της απόπτωσης, και εισβολή. καμπύλες ανάπτυξης έδειξαν ότι η μόλυνση των αντι-miR-20a του τραχήλου της μήτρας ανάπτυξη γραμμή καρκινικών κυττάρων επιβραδύνεται. Το μοντέλο του κάτω-εκφράζεται miR-20a του τραχήλου της μήτρας ξενομοσχεύματα καρκίνου σε γυμνούς ποντικούς ιδρύθηκε, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι διαμεσολαβείται φακοϊό αντι-miR-20a μπορεί να καταστείλει σημαντικά την ανάπτυξη του τραχήλου της μήτρας ξενομοσχευμάτων καρκίνου σε γυμνούς ποντικούς.

περαιτέρω που χαρακτηρίζεται ATG7 και Timp2 ως λειτουργική στόχους του miR-20a με λουσιφεράσης προσδιορισμούς γονιδίου αναφοράς και ανάλυση στυπώματος Western, αντιστοίχως. Autophagy παραδίδει κυτταροπλασματικά συστατικά στα λυσοσώματα για αποικοδόμηση και την ανακύκλωση των προϊόντων αποικοδόμησης, όπως τα αμινοξέα, υδατάνθρακες και λιπίδια τα οποία χρησιμοποιούνται για να συνθέσουν νέες πρωτεΐνες και οργανιδίων ή μεταβολίζονται για την παροχή ενέργειας [12]. Autophagy σχετίζεται στενά με ευκαρυωτικά κυτταρικό θάνατο και απόπτωση. Πράγματι, σε ορισμένες περιπτώσεις, οι ίδιες πρωτεΐνες ελέγχουν τόσο αυτοφαγία και την απόπτωση. Αποπτωτική σηματοδότηση μπορεί να ρυθμίσει την αυτοφαγία και αντιστρόφως αυτοφαγία μπορεί να ρυθμίσει την απόπτωση. Έχει προταθεί ότι «αυτοφαγικά κυτταρικό θάνατο» είναι ένας άλλος τύπος «ενεργών» προγραμματισμένος θάνατος [13]. ATG7 είναι ένα από τα κύρια ρυθμιστές της διαδικασίας αυτοφαγία, υπεύθυνη για δύο σημαντικές αντιδράσεις που εμπλέκονται στο σχηματισμό autophagosome και στην κύστη εξέλιξη [14]. Επιπλέον, είχε ήδη διαπιστωθεί ότι ATG7 – /- knockout ποντίκια πεθαίνουν μέσα σε μία ημέρα από τη γέννησή τους και δείχνουν μειωμένο μέγεθος νεογνού, οφείλεται σε μια διαταραχή της οδού αυτοφαγία [8]. Γιοσισίρο Inami, et al βρήκαν ότι η απώλεια της ATG7 στο ήπαρ ποντικού προκαλεί ηπατοκυτταρικό αδένωμα [15]. Μέσω της χρήσης του κέρδους ή απώλειας μορίων, αποδείξαμε ότι miR-20a ήταν σε θέση να διαμορφώνει autophagy ποικίλα επίπεδα ενδογενούς έκφρασης ATG7, και αυτή η επίδραση διαμεσολαβείται μέσω ενός συναινετική αλληλουχία miR-20a που περιέχονται στο 3′-UTR του γονιδίου .

κατά τη διαδικασία της εισβολής όγκου, ουσιαστικά βήματα περιλαμβάνουν την υποβάθμιση των βασικών μεμβρανών και την αναδιαμόρφωση της εξωκυττάριας μήτρας (ECM) με πρωτεολυτικά ένζυμα όπως μεταλλοπρωτεϊνάσες μήτρας (MMPs) υπό ρύθμιση από αναστολείς μεταλλοπρωτεϊνασών ιστού (ΤΙΜΡ ). MMPs, ιδιαιτέρως ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9, είναι ένζυμα κλειδιά που είναι γνωστό ότι υποβαθμίζουν τα εξαρτήματα του γύρω ECM κατά τη διάρκεια της εισβολής του καρκίνου και μετάσταση [16]. Η υπολογιστική πρόβλεψη των χώρων miRNAtarget πρότεινε Timp2 ίσως τον στόχο του miR-20a, η οποία επαληθεύεται από στυπώματος Western και λουσιφεράσης δοκιμασία επίσης.

Συμπεράσματα

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η έκφραση του miR-20a μπορεί να είναι συναφείς με κακοήθη διαδικασία του καρκίνου του τραχήλου, ιδιαίτερα εισβολή και τη μετάσταση με στόχευση ATG7 και Timp2. Μεγάλης κλίμακας και μακροχρόνιες μελέτες παρακολούθησης που απαιτούνται για την επιβεβαίωση της σημασίας του miR-20a στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. MiRNAs μπορεί να είναι ένας ελκυστικός στόχος για θεραπευτική παρέμβαση.

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 Εικ. . Vector χάρτη

Ένα: φορέας λεντοϊού χάρτη? Β pGL3 χάρτη διάνυσμα υποστηρικτής

doi:. 10.1371 /journal.pone.0120905.s001

(DOC)

S2 Εικ. Lentivirus Vector αποτελέσματα αλληλουχίας

doi:. 10.1371 /journal.pone.0120905.s002

(DOC)

S1 συνόλου δεδομένων. . Γονιδίου-στόχου ακολουθίες με χημική σύνθεση

δύο πλευρές των ακολουθιών κωδικοποίησης ήταν XbaI Περιορισμός Enzyme κοπή περιοχές, επισημαίνονται ζώνες ήταν πολυφαγία ιστοσελίδες

doi:. 10.1371 /journal.pone.0120905.s003

(DOC)

S1 πίνακα. Σύνδεσης μεταξύ της έκφρασης του miR-20a με κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά σε ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας

doi:. 10.1371 /journal.pone.0120905.s004

(DOC)

S2 πίνακα. τιμή OD μετά τη μόλυνση (ΜΤΤ)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0120905.s005

(DOC)

S3 πίνακα. Η αναστολή της ανάπτυξης των SiHa ξενομοσχεύματα σε γυμνούς ποντικούς από αντι-miR-20a-LV

doi:. 10.1371 /journal.pone.0120905.s006

(DOC)