Αφηρημένο

Ιστορικό

Οι αυξητικοί παράγοντες ενεργοποιούν τους υποδοχείς ErbB έχουν περιγραφεί σε όγκους του προστάτη. Η εξαρτημένη προστάτη καρκινική κυτταρική γραμμή ανδρογόνων, LNCaP, εκφράζει τις ErbB-1, ErbB-2 και erbB-3 υποδοχέων κινασών τυροσίνης. Προηγουμένως, αποδείχθηκε ότι ενεργοποιεί NRG ErbB-2 /erbB-3 ετεροδιμερή προκειμένου να προκληθεί θάνατος LNCaP κυττάρων, ενώ, EGF ενεργοποιεί ErbB-1 /ErbB-1 ή ErbB-1 /διμερή ErbB-2 να επάγει την κυτταρική ανάπτυξη και την επιβίωση. Αποδείχθηκε επίσης ότι οι αναστολείς PI3K κατασταλεί αυτή κυτταρικό θάνατο γεγονός που υποδηλώνει ότι το ανδρογόνο στερηθεί κύτταρα LNCaP, NRG ενεργοποιεί μια PI3K-εξαρτώμενο μονοπάτι που σχετίζονται με τον κυτταρικό θάνατο.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Στην παρούσα μελέτη αποδεικνύουμε ότι NRG επάγει autophagy σε κύτταρα LNCaP, χρησιμοποιώντας LC3 ως δείκτη. Ωστόσο, η αυτοφαγία που προκαλείται από την NRG μπορεί να είναι ελλιπής, καθώς τα επίπεδα ρ62 ανυψώσει. Δείξαμε επίσης ότι NRG- προκαλείται από αυτοφαγία είναι ανεξάρτητη της στόχος της ραπαμυκίνης στα θηλαστικά (mTOR) αναστολή από την NRG επάγει την ενεργοποίηση της Akt και S6K. Είναι ενδιαφέρον ότι, η αναστολή της αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) από

N

-acetylcysteine ​​(NAC), ανέστειλε NRG-επαγόμενη αυτοφαγία και κυτταρικό θάνατο. Η μελέτη μας εντόπισε επίσης JNK και Beclin 1 ως σημαντικά στοιχεία στην NRG προκαλείται από αυτοφαγία και κυτταρικό θάνατο. NRG προκαλούμενη αύξηση στην φωσφορυλίωση JNK που ανεστάλη από την NAC. Επιπλέον, αναστολέας της JNK ανέστειλε NRG προκαλείται από αυτοφαγία και κυτταρικό θάνατο. Επίσης, σε κύτταρα που υπερεκφράζουν Bcl-2 ή κύτταρα που εκφράζουν το sh-RNA κατά Beclin 1, τα αποτελέσματα της NRG, δηλαδή την επαγωγή της αυτοφαγία και κυτταρικό θάνατο, ανεστάλησαν.

Συμπεράσματα /Σημασία

Έτσι, , στα κύτταρα LNCaP, NRG-προκαλεί ατελή αυτοφαγία και θάνατο των κυττάρων που εξαρτώνται από τα επίπεδα ROS. Αυτές οι επιδράσεις της NRG διαμεσολαβείται από μονοπάτι που ενεργοποιεί JNK και Beclin 1 σηματοδότησης, αλλά είναι ανεξάρτητη από την αναστολή mTOR

Παράθεση:. Schmukler E, Shai Β, Ehrlich Μ, Pinkas-Kramarski Ε (2012) νεουρεγκιουλίνης Προωθεί Ελλιπής αυτοφαγία των κυττάρων καρκίνου του προστάτη που είναι ανεξάρτητη του mTOR Pathway αναστολή. PLoS ONE 7 (5): e36828. doi: 10.1371 /journal.pone.0036828

Επιμέλεια: Antimo Migliaccio, ΙΙ Università di Napoli, Ιταλία

Ελήφθη: 5 Ιανουαρίου 2012? Αποδεκτές: 6 Απρίλη του 2012? Δημοσιεύθηκε: May 14, 2012 |

Copyright: © 2012 Schmukler et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Ίδρυμα Ισραήλ Science (επιχορήγηση Νο 732/08), από το Υπουργείο Ισραήλ Υγείας (επιχορήγηση Νο 3942), από το Ισραήλ τον Καρκίνο (επιχορήγηση Νο 4914422) και από το Kauffman Καρκίνος του προστάτη Ταμείο Έρευνας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

το προστατικό καρκίνωμα είναι ένας από τους πιο κοινούς καρκίνους αρσενικό. ανάπτυξη κυττάρων του προστάτη ρυθμίζεται από ορμόνες, αυξητικούς παράγοντες και τους αντίστοιχους υποδοχείς τους. Ανάμεσα στα πιο συχνή ομάδα υποδοχέων που εμπλέκονται σε ανθρώπινους καρκίνους είναι η ErbB υποοικογένεια των κινασών τυροσίνης υποδοχέα [1], [2], [3]. Αυτή η οικογένεια περιλαμβάνει τέσσερις υποδοχείς ErbB-1-erbB-4. Ενώ ErbB-1 υποδοχέα (γνωστό ως υποδοχέας του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα, EGFR), ενεργοποιείται με EGF και συνδετήρες τύπου EGF, ErbB-3 και ErbB-4 Οι υποδοχείς που ενεργοποιούνται από NRG ισομορφές /νεουρεγκιουλίνης και υποδοχέα ErbB-2 δεν έχει γνωστή πρόσδεμα [4]. Αυτοί οι υποδοχείς εκφράζονται στο επιθήλιο του προστάτη, ενώ, ErbB-1 συνδέτες εκφράζονται στο στρώμα και NRGs εκφράζονται στο στρώμα και στα βασικά και εκκριτικά επιθήλιο [5].

Η ενεργοποίηση του ErbB-1 σηματοδότηση από EGF και EGF αυξητικούς παράγοντες παίζει σημαντικό ρόλο στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του καρκίνου του προστάτη και προσθήκη του EGF σε καλλιέργειες κυττάρων καρκίνου του προστάτη διεγείρει την ανάπτυξή τους [6]. Επιπλέον, ErbB-2 υπερέκφραση είναι ένα κοινό συμβάν που φαίνεται να παρέχουν ένα επιλεκτικό πλεονέκτημα για διάφορους τύπους καρκινωμάτων συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη [3], [7]. Κανονικά, ErbB-2 εκφράζεται σε επιθηλιακά κύτταρα του προστάτη [7], [8]. Υψηλότερα επίπεδα erbB-2 σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς παρατηρήθηκε σε όγκους του προστάτη [9], [10]. Επιπλέον, η υπερέκφραση του ErbB-2 και erbB-3 έχει ενοχοποιηθεί για την νεοπλαστικό μετασχηματισμό του καρκίνου του προστάτη [11]. Αν και ο ακριβής ρόλος αυτών των ογκογονιδίων και παράγοντες ανάπτυξης σε καρκίνωμα του προστάτη είναι ακόμα ασαφής, η υπερέκφραση του ErbB-1 και ErbB-2 έχει σχέση με φτωχή πρόγνωση και μακρινή μετάσταση [12].

Η αυτοφαγία, μια διαδικασία ρυθμίζεται ο κύκλος εργασιών των κυτταρικών συστατικών, είναι σημαντική για τη φυσιολογική ανάπτυξη του ελέγχου, αλλά μπορεί να είναι ελαττωματική σε ασθένειες [13], [14]. Σύμφωνα με περιορισμένες θρεπτικές ουσίες ή αυξητικούς παράγοντες προϋποθέσεις, η διαδικασία αυτή είναι απαραίτητη για τη διατήρηση της παραγωγής ενέργειας για την επιβίωση των κυττάρων [15]. Autophagy μπορεί επίσης να χρησιμεύσει ως ένας μηχανισμός με τον οποίο τα κύτταρα να απαλλαγούν από ελαττωματικά οργανιδίων και ανακυκλώνουν πρωτεΐνες [16]. Από την άλλη πλευρά, αυτοφαγία μπορεί να οδηγήσει σε μη-αποπτωτικό τύπος θανάτου κυττάρου (θάνατος κυττάρου τύπου II) που παίζουν ένα ρόλο σε αναπτυξιακές κυτταρικό θάνατο και ο θάνατος από τις τοξικές ερεθίσματα [17].

Ο σχηματισμός αυτοφαγοσώματα ελέγχεται από διάφορα atg πρωτεΐνες. πρωτεΐνη Atg8 (το ανθρώπινο ομόλογο είναι ΜΑΡ-LC3) συνδέεται με την μεμβράνη autophagosomal και χρησιμεύει ως δείκτης για το σχηματισμό autophagosome [18]. Σχηματισμός του autophagosome απαιτεί επίσης κατηγορίας III φωσφατιδυλο ινοσιτόλη 3-κινάση (ΡΙ3Κ) [19]. Autophagy διαμεσολαβείται από ΡΙ3Κ εξαρτάται από την αλληλεπίδραση των τελευταίων με πρωτεΐνη atg6, εκ των οποίων 1 είναι Beclin το ανθρώπινο ομόλογο [20]. Beclin 1 δείχθηκε να δρα ως ογκοκατασταλτικό γονίδιο με τον έλεγχο της διαδικασίας autophagy [21]. αλληλεπίδρασή της με την αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη Bcl-2 [22] αναστέλλει autophagy [23]. Κάτω ρύθμιση της Bcl-2 μπορεί να προάγει προφανώς αυτοφαγία [24], υποδηλώνοντας ότι Beclin 1 μεσολάβηση αυτοφαγία μπορούσε να ανασταλεί από την αλληλεπίδρασή του με Bcl-2. Πιο πρόσφατα, αρκετές μελέτες προσδιόρισε το αλληλεπιδρά τομέα Bcl-2 σε Beclin 1 (α περιοχή ΒΗ3) [25], [26], [27].

Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι η NRG (ErbB3 και ErbB4 συνδέτης) αναστέλλει αύξηση των ανδρογόνων που εξαρτώνται LNCaP κύτταρα καρκίνου προστάτη όταν καλλιεργούνται σε πλήρες μέσο [28], ενώ σε απουσία ανδρογόνου, NRG επάγεται θάνατος των κυττάρων LNCaP [29]. Είναι ενδιαφέρον ότι, ο αναστολέας ΡΙ3Κ (3-μεθυλαδενίνη) που αναστέλλει επίσης αυτοφαγία, ανέστειλε NRG-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο, γεγονός που υποδηλώνει ότι μπορεί να επάγει NRG αυτοφαγικά κυτταρικού θανάτου σε αυτά τα κύτταρα [29]. Στην παρούσα μελέτη, απηύθυνε την υπόθεση ότι NRG μεσολαβεί αυτοφαγία στα κύτταρα LNCaP και μελέτησε τα μονοπάτια σηματοδότησης που μεσολαβούν NRG προκαλείται από αυτοφαγία και κυτταρικό θάνατο. Με τη χρήση LC3 ως δείκτη, αποδεικνύουμε ότι αυξάνει τα επίπεδα NRG LC3-ΙΙ. Ωστόσο, τα επίπεδα της ρ62 /πρωτεΐνης SQSTM1, που δεσμεύονται LC3 και αποικοδομείται από αυτοφαγία [30], δεν είχαν μειωθεί κατά τη θεραπεία NRG, υποδεικνύοντας ότι αυτοφαγία που προκαλείται από την NRG είναι ελλιπής.

Έχουμε αποδείξει επίσης ότι η αναστολή της αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) από

N

-acetylcysteine ​​(NAC) αναστέλλει NRG-μεσολάβηση αυτοφαγία και κυτταρικό θάνατο. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι NRG ενεργοποιεί κατηγορίας Ι PI3K, Akt, mTOR και pS6K μονοπάτι, ένας γνωστός αυτοφαγία ανασταλτική οδό, η οποία δεν αναστέλλεται από την NAC. Επιπλέον, δείχνουμε ότι NRG επάγει ενεργοποίηση JNK, η οποία αναστέλλεται από την NAC. Επιπλέον, αναστολέα JNK, Beclin 1 σίγηση και Bcl-2 υπερέκφραση, ανέστειλε NRG-επαγόμενη αυτοφαγία και κυτταρικό θάνατο. Έτσι, προτείνουμε ένα μοντέλο με το οποίο NRG προκαλείται από αυτοφαγία και κυτταρικό θάνατο των κυττάρων LNCaP περιλαμβάνει Beclin 1 και JNK οδών σηματοδότησης και είναι ανεξάρτητη της PI3K /Akt /mTOR σηματοδότησης αναστολή οδού.

Αποτελέσματα

NRG Προκαλεί Autophagy, η οποία αναστέλλεται από 3-μεθυλαδενίνη (3-ΜΑ) σε LNCaP κύτταρα

LNCaP είναι ένα ανδρογόνο που αποκρίνονται κυτταρική γραμμή καρκινώματος του προστάτη που εκφράζει τους υποδοχείς ErbB [29]. Προηγουμένως, δείξαμε ότι NRG επάγει κυτταρικό θάνατο που ανεστάλη με 3-ΜΑ, ένας αναστολέας ΡΙ3Κ [29], και είναι ανεξάρτητη της κασπάσης (Δεν εμφανίζεται και [29]). Αποδείχθηκε επίσης ότι NRG προκαλεί μορφολογικές αλλαγές στα κύτταρα LNCaP που είχαν ανασταλεί από 3-ΜΑ (Video S1 και [29]). Στην παρούσα μελέτη, αναλύσαμε την επίδραση της NRG επί αυτοφαγία και κυτταρικό θάνατο των κυττάρων LNCaP που αναπτύχθηκαν χωρίς ανδρογόνων μιμητικό. Για να προσδιοριστεί η επαγωγή αυτοφαγία, χρησιμοποιήσαμε πρωτεΐνη LC3 ως δείκτη. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, τα κύτταρα LNCaP σε επεξεργασία με NRG για 14 ώρες και 24 ώρες, επέδειξε ενισχυμένη μετατροπή της LC3-Ι σε LC3-ΙΙ, η οποία αναστέλλεται από 3-ΜΑ, που δείχνει ότι πράγματι NRG επάγει αυτοφαγία σε κύτταρα LNCaP. Για να καταδειχθεί περαιτέρω επαγωγή αυτοφαγία, χρησιμοποιήσαμε κύτταρα LNCaP που εκφράζουν σταθερά φορέα έκφρασης GFP-LC3. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Β, NRG επαγόμενη ενισχυμένη σχηματισμός autophagosome όπως αντικατοπτρίζεται από αυξημένη Διακοπτόμενης χρώση της GFP-LC3. Ως θετικός μάρτυρας, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ραπαμυκίνη, η οποία επάγεται επίσης αυτοφαγία σε κύτταρα LNCaP (Σχήμα 1Β). Έτσι, τα κύτταρα LNCaP ανταποκριθεί στις NRG από αυξημένη επαγωγή αυτοφαγία. Να μελετήσει περαιτέρω αυτοφαγία που προκαλείται από την NRG, εξετάσαμε το επίπεδο έκφρασης της ρ62 /SQSTM1. Η Ρ62 /SQSTM1 πρωτεΐνη δεσμεύεται LC3-ΙΙ και αποικοδομείται από αυτοφαγία [30]. Παραδόξως, η θεραπεία NRG δεν ενισχυθεί η υποβάθμιση ρ62 υποδεικνύει ότι η αυτοφαγία που προκαλείται από την NRG μπορεί να είναι ατελής. Ως έλεγχος, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ισορροπημένο διάλυμα άλατος του Earle (EBSS) και τα επίπεδα των LC3-ΙΙ και Ρ62 προσδιορίστηκαν με ανοσοστύπωμα (Σχήμα S1). Όπως φαίνεται, EBSS που προκαλείται ανύψωση LC3-II και η υποβάθμιση του ρ62 όπως αναμενόταν. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η θεραπεία μείωσε τα επίπεδα 3-ΜΑ LC3-ΙΙ του NRG κατεργασμένα κύτταρα καθώς και τα επίπεδα ρ62 απουσία NRG. Η εξήγηση για αυτά τα αποτελέσματα είναι ακόμη άγνωστες.

(Α) LNCaP κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 ng /ml νεουρεγκιουλίνης (NRG) παρουσία ή εν απουσία 10 mM 3-μεθυλαδενίνη (3-ΜΑ) για η υποδεικνυόμενη χρονική περίοδο. Λύματα ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκαν και υποβλήθηκαν σε ανάλυση ανοσοαποτυπώματος με αντισώματα αντι-LC3 και αντι-Ρ62.

Άνω πάνελ,

αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα.

Κάτω πάνελ,

πυκνομετρική ανάλυση παρουσιάζεται ως πολλαπλότητα επαγωγής συγκριτικά με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου (η = 3? Σημαίνει ± Τ.Α? * Ρ & lt? 0,05). κύτταρα (Β) LNCaP εκφράζουν σταθερά LC3-GFP υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 50 ηΜ ραπαμυκίνη για τη διάρκεια της νύχτας ή με 100 ng /ml NRG για 5 ώρες. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη και οι πυρήνες βάφτηκαν με bisdenzimide (Hoecsht 33.258). Μετά από μονιμοποίηση και χρώση, τα κύτταρα φωτογραφήθηκαν χρησιμοποιώντας Nikon οπτικό μικροσκόπιο φθορισμού Model TE-2000S (60 × μεγέθυνση).

Άνω πάνελ

, εκπρόσωπος εικόνες.

Κάτω πίνακα

, αυτοφαγία ήταν ποσοτικά μετρώντας τις τελείες αριθμό LC3 ανά κύτταρο χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ. Το αποτέλεσμα που παρουσιάζεται είναι αντιπροσωπευτικό δύο ανεξάρτητων πειραμάτων. 70-80 κύτταρα αναλύθηκαν ανά θεραπεία? δεδομένα που παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD (*

σ

& lt? 0,05)

Η

NRG προκαλείται από αυτοφαγία είναι ατελής

θεραπεία NRG προκαλεί αυτοφαγία, αλλά επίσης οδηγεί σε ένα. αυξάνουν σε Ρ62 επίπεδα, υποδεικνύοντας ότι η autophagy επάγεται από NRG είναι ελλιπής (Σχήμα 1). Για την περαιτέρω επιβεβαίωση αυτών των αποτελεσμάτων, τα κύτταρα LNCaP που εκφράζουν σταθερά πρωτεΐνη σύντηξης LC3-GFP υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με είτε NRG για 24 ώρες ή επωάστηκαν με μέσο EBSS για αρκετές ώρες. Τα κυτταρολύματα ανοσοστυπώθηκαν με αντι-ΟΡΡ αντίσωμα για την ανίχνευση των επιπέδων του GFP-tagged LC3-Ι και LC3-II. Όπως φαίνεται στο σχήμα 2Α, και οι δύο EBSS και NRG επάγουν αυτοφαγία, όπως κρίνεται από την αύξηση των επιπέδων της LC3-ΙΙ-GFP σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα. Ωστόσο, σε κύτταρα που επωάστηκαν με EBSS, επίπεδα LC3-ΙΙ-GFP μειώνεται με την πάροδο του χρόνου, ενώ σε κύτταρα κατεργασμένα με NRG τα επίπεδα της LC3-ΙΙ-GFP είναι σχετικά υψηλή, ακόμη και μετά από 24 ώρες επώασης. Επιπλέον, υπό την παρουσία βαφιλομυκίνης-Α

1 (αναστολέας της autophagosome-λυσοσώματος σύντηξης) η συσσώρευση της LC3-ΙΙ-GFP είναι σημαντικά υψηλότερη στην EBSS κατεργασμένα κύτταρα σε σύγκριση με NRG επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 2Β). Στο σύνολό τους, αυτά εύρημα υποδεικνύει ότι η NRG-που προκαλείται από αυτοφαγία είναι ελλιπής.

(Α) LNCaP κύτταρα που εκφράζουν σταθερά LC3-GFP υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 100 ng /ml NRG για 24 ώρες ή επωάζονται με μέσο EBSS για τον προκαθορισμένο χρόνο έμμηνα. Λύματα ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκαν και υποβλήθηκαν σε ανάλυση ανοσοαποτυπώματος με αντι-ΟΡΡ αντίσωμα. κύτταρα (Β) LNCaP εκφράζουν σταθερά LC3-GFP υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 ng /ml NRG για 24 ώρες ή επωάστηκαν με μέσο EBSS για 2 και 4 ώρες. Οι αγωγές εκτελέστηκαν παρουσία ή απουσία 10 ηΜ βαφιλομυκίνης-Α1 (Bafilo-Α1). Λύματα ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκαν και υποβλήθηκαν σε ανάλυση ανοσοαποτυπώματος με αντι-ΟΡΡ αντίσωμα.

Άνω πάνελ

, εκπρόσωπος κηλίδα.

Κάτω πάνελ

, πυκνομετρική ανάλυση παρουσιάζεται ως πολλαπλότητα επαγωγής συγκριτικά με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου (αριστερό γράφημα? *, Ρ & lt? 0,05 και **, ρ & lt? 0,02 σε σύγκριση με τον έλεγχο) ή ως διαφορά μεταξύ των μετρούμενων τιμών με ή χωρίς 10 nM Bafilo-Α1 σε κάθε ομάδα (δεξιά γραφική παράσταση? *, p & lt? 0,05 και **, p & lt? 0,02 σε σύγκριση με το NRG tretment) (n = 3? μέσοι όροι ± SD)

Η

. NRG-που προκαλείται από αυτοφαγία και θάνατο των κυττάρων των LNCaP κυττάρων αναστέλλεται από τη μείωση των δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS) Επίπεδα

έχει προηγουμένως αποδειχθεί ότι η επαγωγή αυτοφαγία εξαρτάται από το σχηματισμό και τη συσσώρευση των ROS [23], [31] , [32], [33]. Ως εκ τούτου, για να χαρακτηρίσει την επίδραση της ROS επί NRG μεσολάβηση αυτοφαγία και κυτταρικό θάνατο, τα κύτταρα LNCaP διεγέρθηκαν με NRG με την παρουσία ή απουσία της γενικής αντι-οξειδωτικό

N

-acetylcysteine ​​(NAC) [34 ], και LC3 και ρ62 επίπεδα προσδιορίστηκαν με ανοσοστύπωμα (Σχ. 3Α). Η προ-επώαση με NAC παρεμπόδισε πλήρως NRG-επαγόμενη ανύψωση LC3-ΙΙ, υποδεικνύοντας ότι NRG-επαγόμενη αυτοφαγία είναι ROS-εξαρτώμενη. Στη συνέχεια, εξετάσαμε αν NAC μπορεί να προστατεύσει από την NRG-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο. LNCaP κύτταρα προ-αγωγή με NAC με και χωρίς θεραπεία NRG, και η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την δοκιμασία κυανή χρώση μεθυλενίου. Όπως καταδεικνύεται στο Σχήμα 3Β, η παρουσία NAC παρεμπόδισε τη μείωση στην βιωσιμότητα των κυττάρων που προκαλείται από NRG. Δύο επιπλέον μέθοδοι για την ανίχνευση του κυτταρικού θανάτου (δοκιμασία αποκλεισμού χρώσης Hoecsht και κυτταρομετρία ροής) που υποστηρίζονται περαιτέρω αυτά τα αποτελέσματα. NRG επάγεται ενισχυμένη κυτταρικό θάνατο, όπως φαίνεται από την αύξηση του πληθυσμού υπο-G1 (Εικόνα 3C) ή από το υψηλό ποσοστό των Hoecsht-θετικών κυττάρων (Σχήμα 3D). Αυτό κυτταρικό θάνατο ανεστάλη έντονα από την NAC. Επιπλέον, η θεραπεία με NAC ανέστειλε NRG προκαλείται από μορφολογική μεταβολή (S5). Ως εκ τούτου, τα ευρήματά μας αποδεικνύουν σαφώς ότι η NAC αναστέλλει την συσσώρευση LC3-ΙΙ, κυτταρικό θάνατο και μορφολογικές αλλαγές που προκαλούνται από την NRG σε κύτταρα LNCaP.

(Α) LNCaP κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 ng /ml NRG με ή χωρίς 10 mm

Ν

-acetylcysteine ​​(NAC) για 24 ώρες. Λύματα ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκαν και υποβλήθηκαν σε ανάλυση ανοσοαποτυπώματος με αντισώματα αντι-LC3 και αντι-Ρ62.

Αριστερό πάνελ,

αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα.

Δεξί πάνελ,

πυκνομετρική ανάλυση παρουσιάζεται ως πολλαπλότητα επαγωγής συγκριτικά με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου (n = 6? Σημαίνει ± Τ.Α? * Ρ & lt? 0,05). (Β) LNCaP κύτταρα ελέγχθηκαν για βιωσιμότητα των κυττάρων με τη χρήση της δοκιμασίας του κυανού του μεθυλενίου χρώση. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 ng /ml NRG με την παρουσία ή απουσία 10 mM NAC. Μεθυλενίου μπλε δοκιμασία διεξήχθη 60 ώρες αργότερα. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως% του ελέγχου, και είναι ο μέσος όρος ± Τ.Α 4-6 προσδιορισμών (** ρ & lt? 0,0001). Αυτό το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα. (Γ) LNCaP κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 ng /ml NRG με ή χωρίς 10 mM NAC. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 60 ώρες αργότερα και αναλύθηκε για περιεχόμενο DNA τους με κυτταρομετρία ροής. Το ποσοστό των κυττάρων σε διάφορα στάδια του κυτταρικού κύκλου ενδείκνυται. (D) κύτταρα LNCaP υπέστησαν κατεργασία με 100 ng /ml NRG με την παρουσία ή απουσία 10 mM NAC για 60 ώρες. Τα κύτταρα βάφτηκαν με την φθορίζουσα χρωστική δισβενζιμίδιο DNA (Hoecsht 33258, 1 μg /ml) για την αξιολόγηση του αριθμού των κυττάρων που πεθαίνουν. Μετά τη χρώση, τα κύτταρα φωτογραφήθηκαν χρησιμοποιώντας Ολύμπου οπτικό μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης ανεστραμμένης Μοντέλο IX70 (20 × μεγέθυνση? Κλίμακα μπαρ, 50 μικρόμετρα).

Αριστερό πάνελ

, εκπρόσωπος εικόνες.

Δεξιό πλαίσιο

, ποσοστό θανάτου κυττάρων εκτιμήθηκε με απαρίθμηση του αριθμού των Hoecsht-θετικών κυττάρων σε σύγκριση με τα ολικά κύτταρα αριθμός σε κάθε πεδίο (10-15 πεδία για κάθε αγωγή, 100-200 κύτταρα ανά πεδίο). Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD (** p & lt? 0.0001)

Η

NRG-επαγόμενη LC3-II Ανάδειξη και θάνατο των κυττάρων σε LNCaP κύτταρα είναι ανεξάρτητη της Akt /mTOR μονοπάτι σηματοδότησης

Με σκοπό να προσδιοριστεί το μονοπάτι σηματοδότησης που οδηγεί σε NRG-επαγόμενη αυτοφαγία και κυτταρικό θάνατο, εξετάσαμε πρώτα την οδό σηματοδότησης Akt /mTOR. LNCaP κύτταρα εκφράζουν μετάλλαξη ΡΤΕΝ που οδηγεί σε ενεργοποίηση Akt [35], [36]. Akt ενεργοποιεί mTOR, η οποία είναι μια γνωστή αρνητικός ρυθμιστής της autophagy [37], [38]. Έτσι, ήταν λογικό να εξετάσει την φωσφορυλίωση και ενεργοποίηση των πρωτεϊνών αυτών. LNCaP κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με NRG για 24 ώρες και η ενεργοποίηση της Akt και mTOR εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας αντι-φωσφο Akt και αντισώματα S6K αντι-φωσφο. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α, το βασικό επίπεδο του φωσφορυλιωμένου Akt και S6K παρατηρήθηκε στα μη κατεργασμένα κύτταρα ελέγχου, όμως, η θεραπεία NRG αύξησε το επίπεδο της φωσφορυλιωμένης Akt και S6K. NAC, η οποία αναστέλλει την επαγόμενη NRG αυτοφαγία, δεν είχε καμία επίδραση στα επίπεδα φωσφορυλίωσης του Akt ούτε ούτε S6K. Τα αποτελέσματα αυτά μπορεί να υποδηλώνουν ότι η NRG-που προκαλείται από αυτοφαγία είναι ανεξάρτητη από την αναστολή mTOR. Για να διερευνηθεί περαιτέρω η οδό σηματοδότησης που εμπλέκονται στην NRG-επαγόμενη αυτοφαγία σε κύτταρα LNCaP, εξετάσαμε έπειτα την ενεργοποίηση της ERK και JNK, δύο γνωστοί ενεργοποιημένη από μιτογόνο πρωτεϊνικών κινασών (MAPKs) οι οποίες είναι προς τα κάτω συστατικά σηματοδότηση των υποδοχέων ErbB [39]. Χρησιμοποιήθηκαν Ειδικά αντι-φωσφο πρωτεΐνη αντισώματα προς Erk1 /2 και JNK. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4, NRG προκάλεσε αύξηση στην φωσφορυλίωση των ERK1 /2 και JNK. NAC, η οποία αναστέλλει την επαγόμενη NRG αυτοφαγία, δεν είχε επίδραση επί /2 φωσφορυλίωση Erk1, υποδεικνύοντας ότι η ενεργοποίηση Erk δεν εμπλέκεται σε NRG-επαγόμενη autophagy ή ότι NAC δρα κατάντη στην ενεργοποίηση Erk. Από την άλλη πλευρά, η φωσφορυλίωση JNK ήταν έντονα μειωμένη παρουσία NAC, υποδεικνύοντας ότι JNK μπορεί να είναι ένας δυνητικός μεσολαβητής της NRG-επαγόμενης αυτοφαγία.

(Α) LNCaP κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 ng /ml NRG με ή χωρίς 10 mM NAC για 24 ώρες. Λύματα ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκαν και υποβλήθηκαν σε ανάλυση ανοσοαποτυπώματος με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. (Β) Η πυκνομετρική ανάλυση αρκετών επαναλήψεις παρουσιάζεται ως πλάσια επαγωγή των μη επεξεργασμένων κυττάρων ελέγχου. Τα μέσα της έντασης μπάντες είχαν τυποποιηθεί σε σχέση με το σύνολο των μη φωσφορυλιωμένη σήματα πρωτεΐνη (Τα δεδομένα είναι η μέση φορές επαγωγής ± SD? * Ρ & lt? 0,05).

Η

Από NRG επαγόμενη φωσφορυλίωση S6K αλλά και προκαλείται από αυτοφαγία, εμείς δίπλα σε σύγκριση αυτοφαγία που προκαλείται από την αναστολή mTOR στην αυτοφαγία που προκαλείται από την NRG. Ο αναστολέας mTOR, ραπαμυκίνη, προηγουμένως δειχθεί ότι επάγει autophagy με προς τα κάτω ρύθμιση δραστικότητας του mTOR [37], [40]. Βρήκαμε ότι η ραπαμυκίνη θεραπεία καθώς και θεραπεία NRG επαγόμενη αυτοφαγία, όπως κρίνεται από την αυξημένη LC3-II /αναλογία LC3-Ι (Σχήμα 5Α και Β) και με ενισχυμένο σχηματισμό LC3 puncta (Σχήμα 1Β). Ωστόσο, όπως ήταν αναμενόμενο, η φωσφορυλίωση S6K αυξήθηκε μετά από αγωγή NRG αλλά μειώνονται μετά ραπαμυκίνη θεραπεία. Επιπλέον, η θεραπεία NAC παρεμπόδισε autophagy επάγεται από ραπαμυκίνη και NRG, ωστόσο δεν είχε καμία επίδραση επί NRG-επαγόμενη φωσφορυλίωση S6K. Είναι ενδιαφέρον ότι, η ραπαμυκίνη θεραπεία αν και ανέστειλε την κυτταρική ανάπτυξη [29], δεν είχε καμία επίδραση επί των κυττάρων μορφολογία, ενώ NRG προκάλεσε μια δραματική μορφολογική αλλαγή, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [28], [29] και όπως καταδεικνύεται στο Σχήμα 5C και Σχήμα S1 (στρογγυλά και αποκολλημένα κύτταρα ). Αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι NRG-επαγόμενη autophagy διαφέρει από autophagy πυροδοτείται από ραπαμυκίνη. Στη συνέχεια, εξετάσαμε την επίδραση της NRG και ραπαμυκίνη συν-θεραπεία για αυτοφαγία-inducion στα κύτταρα LNCaP (Σχήμα 5D). Όπως φαίνεται, η συνδυασμένη θεραπεία που προκαλείται από τα υψηλότερα επίπεδα σε σύγκριση με LC3II κάθε μόνη θεραπεία, γεγονός που υποδηλώνει ότι η ραπαμυκίνη και NRG θα μπορούσε να δράσει μέσω διαφορετικών οδών σηματοδότησης για να προκαλέσει αυτοφαγία.

(Α) LNCaP κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία είτε με 100 ng /ml NRG ή 50 ηΜ ραπαμυκίνη (Rapa) για 24 ώρες, με την παρουσία ή απουσία 10 mM NAC. Λύματα ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκαν και υποβλήθηκαν σε ανάλυση ανοσοαποτυπώματος με αντι-LC3, αντι-φωσφο-S6K και αντι-S6K αντισώματα. (Β) Ανάλυση πυκνομετρική των αποτελεσμάτων που περιγράφονται στο Α αντιπροσωπεύεται ως πλάσια επαγωγή των μη κατεργασμένων κυττάρων ελέγχου (n = 3, το μέσο ± Τ.Α). (C) Εκπρόσωπος εικόνες της κυτταρικής μορφολογίας ακόλουθες επεξεργασίες με NRG και η ραπαμυκίνη εμφανίζονται (Όλυμπος, 20 × μεγέθυνση). (D) κύτταρα LNCaP υπέστησαν αγωγή είτε με 100 ng /ml NRG, 50 ηΜ ραπαμυκίνη ή και τα δύο για 24 ώρες. Λύματα ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκαν και υποβλήθηκαν σε ανάλυση ανοσοαποτυπώματος με αντισώματα αντι-LC3. Αυτό το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα.

Η

NRG-επαγόμενη αυτοφαγικά κυτταρικό θάνατο σε LNCaP κύτταρα Εξαρτάται από την JNK ενεργοποίηση

Επειδή οδός mTOR δεν εμπλέκεται στην NRG προκαλείται από αυτοφαγία και κυτταρικού θανάτου, ψάξαμε για άλλες πιθανές μεσολαβητές. Επιλέξαμε να εξετάσουμε τη συμμετοχή των JNK, αφού NRG επαγόμενη φωσφορυλίωση JNK, η οποία αναστέλλεται από NAC. Επομένως, εξετάσαμε πρώτα την επίδραση του αναστολέα JNK SP600125 επί NRG-επαγόμενη autophagy (Σχήμα 6Α). Όπως φαίνεται, με την παρουσία του SP600125, NRG-επαγόμενη αυτοφαγία ανεστάλη, όπως κρίνεται από την μειωμένη αναλογία LC3-II /LC3-I. Ωστόσο, η θεραπεία SP600125 δεν είχε καμία επίδραση στα επίπεδα ρ62. Στη συνέχεια, εξετάσαμε την επίδραση του αναστολέα JNK στη βιωσιμότητα των κυττάρων με τη χρήση Hoecsht αποκλεισμού χρωστικής κυανού του μεθυλενίου και δοκιμασίες χρώσης (Εικ. 6Β και C, αντίστοιχα). Όπως φαίνεται, υπό την παρουσία του αναστολέα JNK, NRG-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο αναστάλθηκε? υποδεικνύοντας ότι η ενεργοποίηση ΙΝΚ από την NRG μπορεί να είναι σημαντική για την επαγωγή αυτοφαγία και κυτταρικό θάνατο των κυττάρων LNCaP.

(Α) LNCaP κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 ng /ml NRG για 24 ώρες με ή χωρίς 20 μΜ SP600125. Λύματα ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκαν και υποβλήθηκαν σε ανάλυση ανοσοαποτυπώματος με αντι-LC3, αντι-Ρ62, αντι-ρ-JNK και αντι-ΙΝΚ αντισώματα.

Αριστερό πάνελ,

αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα.

Δεξί πάνελ,

πυκνομετρική ανάλυση παρουσιάζεται ως πολλαπλότητα επαγωγής συγκριτικά με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου (n = 5? Σημαίνει ± Τ.Α? * Ρ & lt? 0,05). (Β) LNCaP κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 ng /ml NRG με την παρουσία ή απουσία 20 μΜ SP600125 για 60 ώρες. Τα κύτταρα βάφτηκαν με την φθορίζουσα χρωστική δισβενζιμίδιο DNA (Hoecsht 33258, 1 μg /ml) για την αξιολόγηση του αριθμού των κυττάρων που πεθαίνουν. Μετά τη χρώση, τα κύτταρα φωτογραφήθηκαν χρησιμοποιώντας Ολύμπου οπτικό μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης ανεστραμμένης Μοντέλο IX70 (20 × μεγέθυνση? Κλίμακα bar, 50 μικρόμετρα).

Αριστερό πάνελ

, εκπρόσωπος εικόνες φαίνονται.

Δεξιό πλαίσιο

, ποσοστό θανάτου κυττάρων εκτιμήθηκε με απαρίθμηση του αριθμού των Hoecsht-θετικών κυττάρων σε σύγκριση με τα ολικά κύτταρα αριθμός σε κάθε πεδίο (10-15 πεδία για κάθε αγωγή, 100-200 κύτταρα ανά πεδίο). Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± Τ.Α (** ρ & lt? 0,0001). (C) κύτταρα LNCaP ελέγχθηκαν για βιωσιμότητα των κυττάρων με τη χρήση της δοκιμασίας του κυανού του μεθυλενίου χρώση. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 ng /ml NRG με την παρουσία ή απουσία 20 μΜ SP600125. Μεθυλενίου μπλε δοκιμασία διεξήχθη 60 ώρες αργότερα. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως% του ελέγχου, και είναι ο μέσος όρος ± Τ.Α 4-6 προσδιορισμών (** ρ & lt? 0,0001). Αυτό το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα.

Η

Beclin 1 είναι αναγκαία και Bcl-2 προσδίδει αντοχή στην NRG προκαλείται από αυτοφαγία και

κυτταρικού θανάτου

Beclin 1, ένα συστατικό του η τάξη-III PI3K συγκρότημα, είναι ένα σημαντικό γνωστό ρυθμιστή της αυτοφαγία [41], [42]. Για να προσδιοριστεί η συμμετοχή αυτής της οδού σε NRG προκαλείται από αυτοφαγία, LNCaP κύτταρα επιμολυσμένα με sh-Beclin 1 ή τον έλεγχο ομελέτα φορείς έκφρασης sh-RNA. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 7Α, η θεραπεία NRG ενισχυμένη αυτοφαγία στα κύτταρα ελέγχου. Ωστόσο, σε sh-Beclin 1 επιμολυσμένων κυττάρων, NRG-μεσολάβηση αυτοφαγία μειώθηκε σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι Beclin πρωτεΐνη 1 εμπλέκεται στην NRG μεσολάβηση αυτοφαγία σε κύτταρα LNCaP.

(Α) LNCaP κύτταρα επιμολύνθηκαν με Beclin 1 sh-RNA (3 μg) ή ελέγχου κωδικοποιημένο sh-RNA (3 μg) και επωάστηκαν σε κανονικό μέσο για 72 ώρες. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με 100 ng /ml NRG για επιπλέον 24 ώρες. Λύματα ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκαν και υποβλήθηκαν σε ανάλυση ανοσοαποτυπώματος με αντι-LC3 και αντισώματα αντι-Beclin 1.

Αριστερό πάνελ

, αντιπροσωπευτικό πείραμα παρουσιάζεται.

δεξί πάνελ

, η ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων παρουσιάζεται. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως φορές επαγωγής σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου (η = 3? σημαίνει ± Τ.Α? * ρ & lt? 0,05). (Β) δεν έχουν λάβει προηγουμένως ή Bcl-2-GFP που εκφράζουν σταθερά LNCaP κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 ng /ml NRG για τα υποδεικνυόμενα χρονικά διαστήματα. Λύματα ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκαν και υποβλήθηκαν σε ανάλυση ανοσοαποτυπώματος με αντι-LC3 και-Bcl-2 αντι αντισώματα.

Αριστερό πάνελ

, εκπρόσωπος κηλίδα εμφανίζεται.

Δεξιό πλαίσιο

, ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων παρουσιάζεται ως πλάσια επαγωγή σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου (η = 3? Σημαίνει ± Τ.Α? * Ρ & lt? 0,05). (C) δεν έχουν λάβει προηγουμένως και Bcl-2-GFP που εκφράζουν σταθερά κύτταρα LNCaP ελέγχθηκαν για βιωσιμότητα των κυττάρων με χρήση της ανάλυσης κυανή χρώση μεθυλενίου. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 ng /ml NRG και το μπλε του μεθυλενίου δοκιμασία εκτελέστηκε 60 ώρες αργότερα. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως% του ελέγχου, και είναι ο μέσος όρος ± Τ.Α 4-6 προσδιορισμών (** ρ & lt? 0,0001). Αυτό το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα.

Η

Τα μέλη της Bcl-2 αντι-αποπτωτική οικογένεια είχαν προηγουμένως αποδειχθεί ότι αναστέλλει την δραστικότητα autophagy προαγωγής της Beclin 1 [23]. Αποδείχθηκε επίσης ότι κατά τη διάρκεια autophagy αναστέλλεται η αλληλεπίδραση μεταξύ Bcl-2 αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών και Beclin 1. Υποθέτοντας ότι Beclin 1 εμπλέκεται στην NRG-επαγόμενη αυτοφαγία και κυτταρικό θάνατο, υποθέσαμε ότι η υπερέκφραση του Bcl-2 θα προστατεύουν τα κύτταρα LNCaP από NRG-επαγόμενη αυτοφαγία και κυτταρικό θάνατο. Έτσι, το επόμενο εξετάσαμε την επίδραση της Bcl-2-GFP υπερέκφραση επί NRG μεσολάβηση αυτοφαγία των κυττάρων LNCaP (Σχήμα 7Β). Όπως φαίνεται, αυτοφαγία σε αφελή κύτταρα LNCaP αυξήθηκε μετά από 16 ώρες και 24 ώρες της θεραπείας NRG, ενώ στα κύτταρα LNCaP που υπερεκφράζουν σταθερά Bcl-2-GFP, θεραπεία NRG δεν είχε καμία επίδραση στα επίπεδα της επαγωγής αυτοφαγία. Επιπλέον, Bcl-2-GFP που υπερεκφράζουν LNCaP κύτταρα ήταν ανθεκτικά στην NRG-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο σε σύγκριση με αφελείς LNCaP κύτταρα (Σχ. 7C). Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν έντονα ότι εκτός από την ενεργοποίηση της JNK, Beclin 1 είναι επίσης απαραίτητη για την αυτοφαγικά διαδικασία που προωθείται από την NRG.

Συζήτηση

καρκίνους του προστάτη συνήθως ξεκινούν ως ανδρογόνα-ευαίσθητο βλάβες, αλλά συχνά εξελίσσονται σε ανδρογόνο αναίσθητος αλλοιώσεις με την εξέλιξη σε προχωρημένα στάδια. Η εξαρτώμενη από ανδρογόνο κυτταρική γραμμή LNCaP εκφράζει υψηλά επίπεδα του ErbB-2 και erbB-3 σε σύγκριση με άλλα ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη. [28] Επιπλέον, αυτά τα κύτταρα δεν εκφράζουν NRG αλλά το κάνουν εκφράζουν ΤΟΡ-α και EGF, οι οποίες μπορούν να λειτουργήσουν ως αυτοκρινή ενεργοποιητές του EGFR [28]. Προηγουμένως, δείχθηκε ότι σε LNCaP κύτταρα που αναπτύσσονται χωρίς ανδρογόνων μιμητικό, NRG αλλά όχι EGF επάγει τον κυτταρικό θάνατο. Αυτή η επίδραση της NRG επί του κυτταρικού θανάτου προκαλείται από ErbB-2 /erbB-3 ετεροδιμερή [29]. Αποδείχθηκε επίσης ότι ο θάνατος κυττάρου που διεγείρεται από NRG αναστέλλεται από τους αναστολείς ΡΙ3Κ, υποδεικνύοντας ότι μπορεί να επάγει NRG αυτοφαγικά κυτταρικό θάνατο [29]. Στην παρούσα μελέτη, δείχνουμε για πρώτη φορά ότι NRG επάγει πράγματι αυτοφαγία σε κύτταρα LNCaP, χρησιμοποιώντας δύο προσδιορισμούς: ανάλυση ανοσοστυπώματος με αντισώματα αντι-LC3 και μικροσκοπική ανάλυση χρώσης LC3-GFP σε κύτταρα LNCaP. Αυτή η επίδραση της NRG ανεστάλη επίσης με 3-ΜΑ. Ωστόσο, η αυτοφαγία που προκαλείται από την NRG είναι ελλιπής, δεδομένου ότι δεν υποβάθμιση της πρωτεΐνης ρ62 μετά από θεραπεία NRG ανιχνεύθηκε. Έτσι, NRG ενεργοποίηση ErbB2 ετεροδιμερή /ErbB3 προκαλεί ατελή αυτοφαγία και θάνατο των κυττάρων σε κύτταρα LNCaP.

Αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) έχουν εμπλακεί στα μονοπάτια σηματοδότησης ξεκίνησε από κινάσες τυροσίνης, συμπεριλαμβανομένων των υποδοχέων ErbB [43], [ ,,,0],44]. Αρκετές γραμμή αποδείξεων αποδεικνύει ότι αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS), παίζουν ένα ρόλο στην αυτοφαγία. Κατ ‘αρχάς, ROS απαιτούνται για την πείνα που προκαλείται από αυτοφαγία, προφανώς λόγω της ρύθμισης της δραστηριότητας Atg4 [32]. Δεύτερον, οι ίδιες ROS μπορεί να επάγει αυτοφαγία σε ορισμένες κυτταρικές γραμμές [31], [45]. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η NRG-επαγόμενη αυτοφαγία είναι ευαίσθητο σε επίπεδα ROS, αφού με την παρουσία του γενικού αντιοξειδωτικό NAC, NRG-επαγόμενη αυτοφαγία και κυτταρικό θάνατο ανεστάλησαν.

Έχει προηγουμένως δειχθεί ότι mTOR χρησιμεύει ως αρνητικός ρυθμιστής του autophagy καταστέλλοντας τη δραστηριότητα της Atg13 /Atg1 συγκρότημα [46]. Έτσι, οι αυξητικοί παράγοντες και ορισμένες ορμόνες ασκούν αντι-αυτοφαγικά αποτέλεσμά τους με την ενεργοποίηση της τάξης Ι ΡΙ3Κ /Akt /mTOR μονοπάτι [47]. Από την άλλη πλευρά, προ-αυτοφαγικά ερεθίσματα, όπως θρεπτικά ασιτία και θεραπεία ραπαμυκίνη, να οδηγήσει σε απενεργοποίηση του mTOR που ακολουθείται από επαγωγή αυτοφαγία. Πράγματι, η αναστολή της mTOR από ραπαμυκίνης που προκαλείται από αυτοφαγία στα κύτταρα LNCaP. Την ίδια κύτταρα, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι NRG επάγει την ενεργοποίηση του mTOR, όπως φαίνεται από την φωσφορυλίωση του S6K, και ανάντη ρυθμιστή της Akt. Επιπλέον, ήταν προηγουμένως αποδειχθεί ότι επάγει NRG ErbB2 /ErbB3 σχηματισμό ετεροδιμερούς και ενεργοποίηση τάξης Ι ΡΙ3Κ σε κύτταρα LNCaP [28]. Στο σύνολό τους, φαίνεται ότι NRG ενεργοποιεί ένα αντι-αυτοφαγικά σηματοδοτικό μονοπάτι, δηλαδή το ErbB /τάξης Ι ΡΙ3Κ /Akt /mTOR μονοπάτι και ακόμη προωθεί την επαγωγή αυτοφαγία στα κύτταρα LNCaP. NAC, το οποίο μπλοκάρει πλήρως η NRG-που προκαλείται από αυτοφαγία, δεν επηρέασε τη φωσφορυλίωση της Akt ούτε ούτε S6K. Ως εκ τούτου, προτείνουμε ότι η NRG-που προκαλείται από αυτοφαγία είναι ανεξάρτητη από την αναστολή mTOR.

NRG προκαλεί την ενεργοποίηση διαφόρων οδών σηματοδότησης. Είχε προηγουμένως δειχθεί ότι σε κύτταρα LNCaP, NRG ενεργοποιεί μεταξύ των άλλων μονοπάτια σηματοδότησης και οι ΜΑΡ κινάσες: Erk, ρ38, JNK και οι ΡΙ3Κ μονοπατιών σηματοδότησης [28]. Έχουμε προσπαθήσει να ακολουθήσει το μονοπάτι σηματοδότησης που οδηγεί σε NRG προκαλείται από αυτοφαγία και κυτταρικό θάνατο. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η JNK εμπλέκεται σε NRG-επαγόμενη αυτοφαγία και κυτταρικό θάνατο. Πράγματι, συνεχώς αυξανόμενες ενδείξεις υπάρχει όσον αφορά το ρόλο των JNK ως μεσολαβητής της επαγωγής autophagy ακόλουθα διάφορα ερεθίσματα [48], [49], [50]. Σε συμφωνία με τα ευρήματα αυτά, δείξαμε ότι JNK φωσφορυλίωση αυξήσεις μετά τη θεραπεία NRG στα κύτταρα LNCaP. Βρήκαμε επίσης ότι η NAC, έναν αναστολέα της NRG-που προκαλείται από αυτοφαγία και κυτταρικό θάνατο, μπλοκ JNK φωσφορυλίωση. Στο σύνολό τους, προτείνουμε ότι η ΙΝΚ μεσολαβεί το pro-αυτοφαγικά επίδραση της NRG. Πράγματι, με την παρουσία της JNK αναστολέα SP600125, NRG-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο και αυτοφαγία ανεστάλησαν.

Η δημιουργία πυρήνων και συναρμολόγηση του autophagosome απαιτεί ενεργοποίηση της κατηγορίας-III PI3K συγκρότημα, το οποίο αποτελείται από την PI3K (vps34 ), vps15, atg14 και atg6 (Beclin 1 σε κύτταρα θηλαστικών) [19], [20]. Beclin 1 μεσολάβηση αυτοφαγία ρυθμίζεται αρνητικά από την αλληλεπίδρασή του με Bcl-2 αντι αποπτωτικών πρωτεϊνών.