Αφηρημένο

Ιστορικό

Μεταξύ γυναικολογικούς καρκίνους, ο καρκίνος των ωοθηκών είναι η δεύτερη πιο κοινή και έχει το υψηλότερο ποσοστό θανάτου. Ο καρκίνος είναι μια γενετική διαταραχή και προκύπτει λόγω της συσσώρευσης των σωματικών μεταλλάξεων σε κρίσιμα γονίδια. Η κατανόηση της γενετικής βάσης του καρκίνου των ωοθηκών έχει επιπτώσεις τόσο για την έγκαιρη διάγνωση και την θεραπευτική παρέμβαση σε αυτόν τον πληθυσμό ασθενών.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Δεκαπέντε κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών, που χρησιμοποιούνται συνήθως για την πειράματα in vitro, ελέγχθηκαν για τις μεταλλάξεις χρησιμοποιώντας αμφίδρομη άμεση αλληλούχιση σε όλες τις περιοχές κωδικοποίησης των

BRAF

,

ΜΕΚ1

και

ΜΕΚ2

.

BRAF

μεταλλάξεις ταυτοποιήθηκαν σε τέσσερις από τις δεκαπέντε κυτταρικών σειρών καρκίνου των ωοθηκών που μελετήθηκαν. Μαζί, αυτές οι τέσσερις κυτταρικές σειρές που περιλαμβάνονται τέσσερις διαφορετικές

BRAF

μεταλλάξεις, δύο εκ των οποίων ήταν νέα. ES-2 είχε το κοινό Β-Raf p.V600E μετάλλαξη στο εξόνιο 15 και Hey περιείχε ένα εξόνιο 11 παρερμηνεύσιμη μετάλλαξη, p.G464E. Οι δύο νέες μεταλλάξεις Β-Raf προσδιορίστηκαν ήταν ένα 5 αμινοξέων ετερόζυγο διαγραφή p.N486-P490del σε OV90, και μία p.Q201H υποκατάσταση εξόνιο 4 εσφαλμένου νοήματος σε OVCAR 10. Μία από τις κυτταρικές σειρές, ES-2, περιείχε μια μετάλλαξη στο ΜΕΚ1, συγκεκριμένα, ένα μυθιστόρημα ετερόζυγο αντικατάσταση των εσφαλμένων διευθύνσεων, p.D67N που προέκυψαν από nt 199 G → A μετάβασης. Καμία από τις κυτταρικές σειρές περιείχαν κωδικοποίησης μεταλλάξεις περιοχή στο

ΜΕΚ2

. Λειτουργικός χαρακτηρισμός του μεταλλαγμένου p.D67N ΜΕΚ1 με παροδική επιμόλυνση με επακόλουθη ανάλυση κηλίδος Western έδειξαν αυξημένη φωσφορυλίωση ERK σε σύγκριση με τους ελέγχους.

Συμπεράσματα /σημαντικότητα

Σε αυτή τη μελέτη, αναφέρουμε τα νέα

BRAF

μεταλλάξεις στο εξόνιο 4 και εξόνιο 12 και επίσης αναφέρει την πρώτη μετάλλαξη στο

MEK1

που σχετίζονται με τον καρκίνο στον άνθρωπο. Λειτουργικά δεδομένα υποδεικνύουν την

MEK1

μετάλλαξη μπορεί να προσδώσει μεταβολή της ενεργοποίησης μέσω του μονοπατιού MAPK. Η σημασία αυτών των ευρημάτων είναι ότι

BRAF

και

MEK1 /2

μεταλλάξεις μπορεί να είναι πιο συχνές από ό, τι αναμενόταν στον καρκίνο των ωοθηκών που θα μπορούσαν να έχουν σημαντικές συνέπειες για τη θεραπεία ασθενών με την ασθένεια αυτή και προτείνει πιθανές νέες θεραπευτική λεωφόρους

Παράθεση:. Estep AL, Palmer C, McCormick F, Rauen KA (2007) Μετάλλαξη Ανάλυση του

BRAF

,

ΜΕΚ1

και

ΜΕΚ2

σε 15 ωοθηκών Γραμμές Cancer Cell: Συνέπειες για θεραπεία. PLoS ONE 2 (12): e1279. doi: 10.1371 /journal.pone.0001279

Ακαδημαϊκό Συντάκτης: Amanda Toland, Πολιτειακό Πανεπιστήμιο του Οχάιο Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 25 Ιουλίου 2007? Αποδεκτές: 13 Νοεμ, 2007? Δημοσιεύθηκε: 5 του Δεκέμβρη του 2007

Copyright: © 2007 Estep et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Επιχορήγηση ΝΙΗ HD048502 (ΚΑΡ) παρέχεται μερική χρηματοδότηση. Καναρίων Ίδρυμα παρέχεται μερική χρηματοδότηση. Το Canary Ίδρυμα δεν είχε κάποιο ρόλο στη συλλογή, ανάλυση και ερμηνεία των δεδομένων

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος των ωοθηκών είναι η δεύτερη πιο κοινή γυναικολογικό καρκίνο στις Ηνωμένες Πολιτείες που επηρεάζει περίπου 22.000 γυναίκες κάθε χρόνο προκαλώντας κατ ‘εκτίμηση 15.200 θάνατοι [1]. Ο καρκίνος είναι μια γενετική διαταραχή που προκύπτει από την συσσώρευση των σωματικών μεταλλάξεων σε γονίδια που εμπλέκονται σε κρίσιμες κυτταρικές οδούς. Αυτές οι μεταλλάξεις οδηγούν τυπικά σε πρωτεΐνες οι οποίες εμφανίζουν ογκογόνο δράση τους μεταβάλλοντας σηματοδότηση μέσω ζωτικών δικτύων μεταγωγής, ή σε απλοανεπάρκεια των κρίσιμων πρωτεϊνών ογκοκατασταλτικών.

Η κατανόηση της γενετικής βάσης του καρκίνου των ωοθηκών έχει συνέπειες τόσο για την έγκαιρη ανίχνευση, καθώς και όπως και για θεραπευτική παρέμβαση σε αυτόν τον πληθυσμό ασθενών. Γονίδια που έχουν βρεθεί σωματικώς μεταλλαγμένα σε καρκίνο των ωοθηκών περιλαμβάνουν

KRAS

[2] – [5],

NRAS

[2],

PIK3CA

[5] – [9 ],

PTEN

[5], [10], [11],

TP53

[5], [12], [13] και

BRAF

[2] – [4]. Β-Raf, το πρωτεϊνικό προϊόν του

BRAF

, είναι μια πρωτεϊνική κινάση σερίνης /θρεονίνης και η πρώτη στη σειρά ενεργοποιείται από μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ) η οποία είναι μία από τις πολλές οδούς καθοδικός τελεστής της Ras. Εξωκυτταρικά ερεθίσματα οδηγεί στην ενεργοποίηση της Ras, η οποία με τη σειρά της ενεργοποιεί Raf (Α-Raf, Β-Raf, και /ή C-Raf-1). Raf στη συνέχεια φωσφορυλιώνει και ενεργοποιεί ΜΕΚ1 ή /και ΜΕΚ2 (ΜΑΡΚ κινάση). ΜΕΚ1 και ΜΕΚ2 είναι θρεονίνη /κινάσες τυροσίνης με δύο ισομορφές που έχουν την ικανότητα να φωσφορυλιώνουν και ενεργοποιούν ERK1 και ERK2 (ΜΑΡΚ). ERK, μία φορά ενεργοποιείται από ΜΕΚ, έχει πολλές κυτοσολικά και πυρηνικά υποστρώματα [14]. Η ανώμαλη ανάντη σηματοδότηση με αποτέλεσμα υπερενεργοποιημένη ERK παίζει ένα ρόλο κλειδί στην παθογένεση και την πρόοδο του περίπου 30% των ανθρώπινων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου των ωοθηκών [15]. Ως αποτέλεσμα, αυτή η οδός έχει ένας ελκυστικός στόχος για την ανάπτυξη των αναστολέων μικρών μορίων για τη θεραπεία του καρκίνου [16].

γονίδια που περιλαμβάνουν την οδό ΜΑΡΚ,

BRAF

,

ΜΕΚ1

και

ΜΕΚ2

, συστηματικά σαρώνεται για μεταλλάξεις σε 15 κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών χρησιμοποιώντας αμφίδρομη άμεση αλληλούχιση όλων εξώνια. Προηγούμενες αναφορές έχουν δείξει ότι Β-Raf είναι μεταλλαγμένο σε περίπου 28-37% των χαμηλής ποιότητας ορώδες καρκίνωμα [3], [17]. Με αυτές τις πληροφορίες, η αναζήτηση μας επεκτάθηκε για να συμπεριλάβει

ΜΕΚ1

και

ΜΕΚ2

, δύο γονίδια μαζί με

BRAF

, που έχουμε διαπιστώσει πρόσφατα ότι είναι αιτιώδης για καρδιο-Facio -cutaneous (CFC) σύνδρομο (MIM 115150), ένα σύνδρομο πολλαπλές συγγενή ανωμαλία σύμφωνα με την οποία τα άτομα έχουν το χαρακτηριστικό κρανιοπροσωπικές dysmorphia, καρδιακά ελαττώματα και ανωμαλίες εκτοδερμική [18]. Είναι ενδιαφέρον ότι, σε αντίθεση με μεταλλάξεις βλαστικής σειράς που προσδιορίζονται στο σύνδρομο CFC, δεν σωματικές μεταλλάξεις έχουν ποτέ εντοπιστεί σε

ΜΕΚ1 /2

σε κάθε τύπο καρκίνου. Στην ανάλυσή μας, μυθιστόρημα

BRAF

μεταλλάξεις εντοπίστηκαν στο εξόνιο 4 και εξόνιο 12 του δύο ξεχωριστές γραμμές κυττάρων. Επιπλέον, αναφέρουμε την πρώτη λειτουργική μετάλλαξη στο

ΜΕΚ1

που σχετίζονται με τον καρκίνο στον άνθρωπο. Η σημασία αυτών των ευρημάτων είναι ότι

BRAF

και

MEK1 /2

μεταλλάξεις μπορεί να είναι πιο συχνές από ό, τι είχε προηγουμένως αναγνωριστεί στα καρκίνο των ωοθηκών, οι οποίες θα μπορούσαν να έχουν σημαντικές συνέπειες για τη θεραπεία των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών.

Αποτελέσματα

BRAF και MEK1 μεταλλάξεις

το γονιδιακό DNA από 15 κυτταρικές γραμμές καρκίνου των ωοθηκών ελέγχθηκε για

BRAF

μεταλλάξεις στην κωδικοποίηση εξώνια 1-18. Τέσσερις μεταλλάξεις ταυτοποιήθηκαν σε τέσσερις ξεχωριστές γραμμές κυττάρων: OVCAR 10, OV90, Hey και ES-2 (Σχήμα 1). Καμία από τις άλλες κυτταρικές σειρές είχαν

BRAF

μεταλλάξεις. Δύο από τα τέσσερα

BRAF

μεταλλάξεις που εντοπίστηκαν ήταν μυθιστόρημα. OVCAR 10 περιείχε nt 603 G → Τ μεταστροφής προκαλώντας p.Q201H ετερόζυγη υποκατάσταση παρερμηνεύσιμη στο εξόνιο 4 (Σχήμα 1Α). OV90 περιείχε μία νέα απαλοιφή οξύ ετερόζυγο 5 αμινο, p.N486-P490del, στο εξόνιο 12 (Εικόνα 1Β). Εκτός από τα δύο νέα

BRAF

μεταλλάξεις εντοπίστηκαν, ταυτοποιήθηκαν δύο επιπλέον μεταλλάξεις οι οποίες έχουν προηγουμένως αναφερθεί στον καρκίνο. Γεια σου περιείχε nt 1391 G → A μετάβασης που οφείλεται σε ένα εξόνιο 11 παρερμηνεύσιμη μετάλλαξη, p.G464E (Σχήμα 1C). Το ηλεκτροφερόγραμμα κατέδειξε απώλεια της ετεροζυγωτίας σε αυτό το τόπο. ES-2 περιείχε ένα εξόνιο 15, Τ → A μεταστροφής στο nt 1799, υποκαθιστώντας γλουταμινικό οξύ για βαλίνη στη θέση 600 (p.V600E) (Σχήμα 1 D). Καμία από αυτές τις μεταλλάξεις εντοπίστηκαν στους ελέγχους.

Τέσσερις

BRAF

μεταλλάξεις εντοπίστηκαν σε τέσσερις ξεχωριστές γραμμές κυττάρων. Α) OVCAR 10 περιείχε nt 603 G → Τ μεταστροφής προκαλώντας p.Q201H ετερόζυγη υποκατάσταση παρερμηνεύσιμη στο εξώνιο 4. Β) OV90 περιείχε μία νέα ετερόζυγη διαγραφή ξεκινώντας στο nt 1457 (βέλος) με αποτέλεσμα μια διαγραφή 5 αμινοξέων, p.N486 -P490del, στο εξώνιο 12. Γ) Hey περιείχε nt 1391 G → A μετάβασης με αποτέλεσμα την απώλεια της ετεροζυγωτίας. Δ) ES-2 περιείχε ένα εξόνιο 15, Τ → Μια μεταστροφής στο nt 1799, υποκαθιστώντας γλουταμινικό οξύ για βαλίνη στη θέση 600 (p.V600E). Ε) Μια nt 199 G → A μετάβαση στο

ΜΕΚ1,

εξόνιο 2 οδήγησε σε ένα ετερόζυγο αντικατάσταση των εσφαλμένων διευθύνσεων, p.D67N.

Η

Όλα τα έντεκα κωδικοποίησης εξώνια του

ΜΕΚ1

και

ΜΕΚ2

επίσης αλληλουχία στις ίδιες κυτταρικές σειρές και τους ελέγχους. Μια μετάλλαξη στο

MEK1

ταυτίστηκε με ES-2 αποτελείται από ένα μυθιστόρημα ετερόζυγο αντικατάσταση των εσφαλμένων διευθύνσεων, p.D67N, που προέκυψαν από nt 199 G → A μετάβασης (Σχήμα 1Ε). δεν εντοπίστηκαν άλλα nonsynonymous αντικαταστάσεις σε ΜΕΚ1. Όλα έντεκα κωδικοποιητικά εξώνια του

ΜΕΚ2

αλληλουχήθηκαν και καμία nonsynonymous υποκαταστάσεις εντοπίστηκαν.

νουκλεοτιδίων Παραλλαγή

Εκτός από αυτές τις μεταλλάξεις, συνολικά τέσσερις διαφορετικές συνώνυμος πολυμορφισμών μονού νουκλεοτιδίου (SNPs) εντοπίστηκαν στο

BRAF

(Πίνακας 1),

MEK1

(Πίνακας 2), και

ΜΕΚ2

(Πίνακας 3). Τρία από αυτά τα τέσσερα SNPs βρέθηκαν σε πέντε ή περισσότερες από τις κυτταρικές σειρές δεκαπέντε και έχουν αναφερθεί προηγουμένως (www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/). Κατά σειρά συχνότητας, οι τρεις συνώνυμο SNPs βάση δεδομένων περιλαμβάνει: i) ΜΕΚ2 p.I220I (rs10250) που υπάρχουν σε 11 από τις κυτταρικές σειρές 15 (73%), ii) BRAF p.G634G (rs9648696) βρέθηκαν σε έξι από τα 15 κυττάρων γραμμές (40%) και, iii) ΜΕΚ2 p.D151D (rs17851657) προσδιορίζονται σε πέντε από τις κυτταρικές σειρές 15 (33%). Υπήρχε ένας εξατομικεύονται ΜΕΚ1 SNP σε OVCAR 10 που προκύπτει από nt 348 ετερόζυγο G → Α μετάβασης στο εξόνιο 3, p.Q113Q (Πίνακας 2). Όλα τα συνώνυμα SNPs χαρακτηρίστηκαν από SIFT (Ταξινόμηση Δυσανεκτικοί Από ανεκτική) και αποφασισμένη να γίνει ανεκτή.

Η

Η

Λειτουργική Χαρακτηρισμός Μεταλλαγμένων

SIFT χρησιμοποιήθηκε για να χαρακτηρίσει το λειτουργική σημασία από τις υποκαταστάσεις nonsynonymous αμινοξέων που προσδιορίζονται στην Β-Raf και ΜΕΚ1. Β-Raf p.G464E, p.N486-P490del, p.V600E και ΜΕΚ1 p.D67N είχαν προβλεφθεί να είναι επιβλαβής υποκαταστάσεις προκαλώντας μεταβολή της λειτουργίας του πρωτεΐνης, ενώ Β-Raf p.Q201H είχε προβλεφθεί να γίνει ανεκτή.

Για να επιβεβαιωθεί η λειτουργική αλλοίωση του νέου μεταλλαγμένου ΜΕΚ1 p.D67N προσδιορίζονται στην ES-2, παροδική επιμόλυνση των κυττάρων ΗΕΚ 293Τ με ανάλυση Western blot μετέπειτα επιδείξει αυξημένο δραστικότητα κινάσης όπως μετράται με την φωσφορυλίωση ERK (Εικόνα 2). Η p.D67N μεταλλαγμένο MEK1 είχε αυξηθεί φωσφορυλίωση ERK σε σύγκριση με τον άγριο τύπο ΜΕΚ1. Το επίπεδο της φωσφορυλίωσης ERK ήταν χαμηλότερο από το μεταλλαγμένο p.Y130C CFC ΜΕΚ1 οποίο είναι γνωστό ότι έχουν ένα υψηλό επίπεδο δραστηριότητας (θετικός έλεγχος).

Ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά κύτταρα 293Τ διαμολύνθηκαν παροδικά με κενό φορέα, άγριου πληκτρολογήστε ΜΕΚ1, ΜΕΚ1 p.Y130C (θετική μετάλλαξη ελέγχου που έχει γνωρίσει το υψηλό επίπεδο δραστηριότητας [18]) και το μεταλλαγμένο ΜΕΚ1 p.D67N. ERK (ERK1 ρ44 και ΕΚΚ2 Ρ42) φωσφορυλίωση προσδιορίστηκε με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας φωσφο-εξειδικευμένα αντισώματα. Η ΜΕΚ1 μεταλλαγμένο p.D67N είχαν αυξημένη φωσφορυλίωση ERK σε σύγκριση με το επίπεδο που επάγεται από κενό φορέα και άγριου τύπου ΜΕΚ1. Το επίπεδο της φωσφορυλίωσης ERK που επάγεται από p.D67N ΜΕΚ1 είναι ελαφρώς μικρότερο από το μεταλλαγμένο p.Y130C CFC ΜΕΚ1 η οποία είναι γνωστό ότι έχουν αυξημένη δραστηριότητα [18]. Μγο-tagged ΜΕΚ1 παρουσιάζεται για αποτελεσματικότητα επιμόλυνσης και ολική ΕΚΚ εμφανίζεται ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

Συζήτηση

Altered σηματοδότηση μέσω της οδού της ΜΑΡΚ στον καρκίνο συχνά προκύπτει από μεταλλάξεις σε ανάντη συστατικών του ΕΚΚ, συμπεριλαμβανομένων K-Ras, N-Ras, H-Ras, C-Raf-1 και Β-Raf [15]. Μοριακές μελέτες των κυτταρικών σειρών καρκίνου των ωοθηκών και δείγματα όγκων εντόπισαν γενετικές μεταλλάξεις σε ορισμένα από αυτά τα γονίδια,

KRAS

,

NRAS

και

BRAF

, η οποία έχει ως αποτέλεσμα την αλλοίωση της σηματοδότηση μέσω αυτής της κρίσιμης διαδρομής [2], [19] – [23].

σωματικές μεταλλάξεις εις

BRAF

έχουν αναφερθεί σε υψηλή συχνότητα σε πολλές καρκίνους συμπεριλαμβανομένου του μελανώματος, του θυρεοειδούς, του παχέος εντέρου και ωοθηκικός. Περίπου 70 νοηματικές μεταλλάξεις που επηρεάζουν 34 κωδικόνια έχουν αναφερθεί (www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic). Στον καρκίνο, η πλειοψηφία των σωματικών

BRAF

μεταλλάξεις οδηγούν σε υποκαταστάσεις παρερμηνεύσιμη βρεθούν, αλλά δεν περιορίζονται σε, εξόνιο 11 (ο πλούσιος σε γλυκίνη βρόχο) και εξόνιο 15 (το τμήμα ενεργοποίησης) στην περιοχή της κινάσης πρωτεΐνης [ ,,,0],24]. Ένα παρερμηνεύσιμη μετάλλαξη στο εξόνιο 15 με αποτέλεσμα μια υποκατάσταση εσφαλμένου νοήματος, Β-Raf p.V600E, αντιπροσωπεύει πάνω από το 90% των

BRAF

μεταλλάξεις εντοπίστηκαν στον ανθρώπινο καρκίνο. Η κρυσταλλική δομή της Β-Καί δείχνει ότι το τμήμα ενεργοποίησης συγκρατείται σε μία ανενεργή διαμόρφωση από την ένωση με τον G-βρόχου. Μεταλλάξεις σε αυτές τις δύο περιοχές, η γλυκίνη πλούσια σε βρόχο και το τμήμα ενεργοποίησης, πιστεύεται ότι διαταράσσουν αυτή την αλληλεπίδραση, τη μετατροπή Β-Καί σε δραστική διαμόρφωση του [25].

Εκτός από σωματικές μεταλλάξεις, μεταλλάξεις γραμμής σπέρματος σε

BRAF

έχουν πρόσφατα διαπιστωθεί ότι προκαλούν το σύνδρομο CFC, μια πολλαπλή συγγενή διαταραχή ανωμαλία σύμφωνα με την οποία τα άτομα έχουν το χαρακτηριστικό κρανιοπροσωπικές dysmorphisms, καρδιακές ανωμαλίες, ανωμαλίες εξωδερματική και αναπτυξιακή καθυστέρηση [18], [26]. Οι περισσότερες από τις μεταλλάξεις στο σύνδρομο CFC δεν εμπίπτουν στο πεδίο κινάσης εξόνιο 11 και εξόνιο 15 πρωτεΐνη. Η πιο κοινή αιτιολογικός CFC μετάλλαξη, p.Q257R, κατοικεί στο εξόνιο 6 της πλούσια σε κυστεΐνη περιοχή. Όπως και οι περισσότεροι που προκαλούν καρκίνο μεταλλάξεων στο

BRAF

, βιοχημικές μελέτες έχουν διαπιστώσει ότι οι περισσότερες μεταλλαγμένες πρωτεΐνες νέα CFC Β-Raf έχουν αυξημένη δραστικότητα κινάσης σε σχέση με τη δραστικότητα της κινάσης του φυσικού τύπου Β-Raf [18], [26 ]. Οι μελέτες αυτές χαρακτηρίζουν το γεγονός ότι

BRAF

μεταλλάξεις συμβαίνουν όχι μόνο σωματικά αλλά και στα βλαστικά κύτταρα, και ότι οι μεταλλάξεις που επιφέρουν αυξημένη δραστικότητα κινάσης δεν περιορίζονται σε αυτούς που συνήθως συνδέονται με τον καρκίνο.

Αμφίδρομη αλληλούχιση όλων των κωδικοποίησης εξώνια του

BRAF

σε 15 καλά χαρακτηρισμένα και άκρως χρησιμοποιούνται κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών εντοπίζονται τέσσερις κυτταρικές σειρές με

BRAF

μεταλλάξεις. Μόνο μία κυτταρική σειρά είχε το κοινό εξώνιο 15

BRAF

μετάλλαξη. ES-2, η οποία προέρχεται από καρκίνωμα ωοθηκών σαφής κυττάρου [27] είχαν την κοινή ετερόζυγη μετάλλαξη p.V600E παρερμηνεύσιμη. Προηγούμενες αναφορές έχουν δείξει ότι Β-Raf μεταλλάσσεται συνηθέστερα σε χαμηλής ποιότητας ωοθηκών ορώδες καρκίνωμα με συχνότητα περίπου 28-37% και ότι όλες οι μεταλλάξεις είναι η κοινή παραλλαγή p.V600E Β-Raf [3], [17]. Είναι ενδιαφέρον, οι δύο ορώδες που προέρχονται από κυτταρικές σειρές που εξετάστηκαν σε αυτή τη μελέτη (Hey και OV90) δεν έχουν το κοινό Β-Raf μετάλλαξη p.V600E? Ωστόσο, και οι δύο έκαναν περιέχει

BRAF

μεταλλάξεις. Hey, που προέρχεται από ένα θηλώδες ορώδες καρκίνωμα [28], περιείχε ένα εξόνιο 11 παρερμηνεύσιμη μετάλλαξη, p.G464E. Αυτό παρερμηνεύσιμη μετάλλαξη έχει περιγραφεί προηγουμένως (www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic) και είναι επίσης ένα κωδικόνιο το οποίο μεταλλάσσεται σε σύνδρομο CFC ([29]? Rauen, αδημοσίευτα δεδομένα). OV90 η οποία προέρχεται από ένα ορώδες αδενοκαρκίνωμα [30] περιείχε μία νέα μετάλλαξη στο εξόνιο 12 με αποτέλεσμα ένα ετερόζυγο διαγραφή οξύ πέντε αμινο, p.N486-P490del. Αν και εξαιρετικά σπάνια, σωματικών εξόνιο 15 Β-Raf εντός πλαισίου απαλοιφή-ενθέσεις έχουν αναφερθεί στον καρκίνο [31], [32]. Επιπλέον, έχουμε εντοπίσει δύο CFC άτομα με μικρές σε πλαίσιο απαλοιφές στο εξώνιο 11 (Rauen, αδημοσίευτα δεδομένα). Τέλος, OVCAR 10, το οποίο προέρχεται από ένα ανθρώπινο επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών, είχε ένα μοναδικό p.Q201H ετερόζυγη υποκατάσταση παρερμηνεύσιμη στο εξόνιο 4. Η παρούσα nonsynonymous SNP δεν έχει ταυτοποιηθεί σε καρκίνο ή σύνδρομο CFC και προσδιορίσθηκε να είναι ανεκτή από SIFT, έτσι ίσως Β-Raf p.Q210H αντιπροσωπεύει ένα σπάνιο πολυμορφισμό.

Μόνο δύο από τις καρκινικές κυτταρικές σειρές των ωοθηκών είχαν μεταλλάξεις στο πληγέν τυπικά εξόνιο 11/15 περιοχές στον τομέα κινάσης πρωτεΐνης Β-Raf. Αυτό το εύρημα εγείρει την πιθανότητα ότι ο καρκίνος σχετίζεται με

BRAF

μεταλλάξεις έξω από το εξόνιο 11/15 μπορεί να είναι πιο συχνές από ό, τι αναμενόταν. Δεδομένου ότι η συντριπτική πλειοψηφία των

BRAF

μελέτες έρευνας μετάλλαξη που δημοσιεύθηκε περιορίζονται στα εξώνια 11 και 15, άλλες πιθανές μεταλλάξεις εκτός των περιοχών αυτών μπορεί να αγνοηθεί.

Για να εξερευνήσετε την λειτουργική σημασία αυτών των νέων B- Raf μεταλλάξεις, όλοι εκείνοι που προσδιορίζονται στην παρούσα μελέτη αναλύθηκαν με SIFT (https://blocks.fhcrc.org/sift/SIFT.html), ένα πρόγραμμα ανάλυσης ηλεκτρονική μετάλλαξη που προβλέπει τη λειτουργική συνέπεια υποκαταστάσεις nonsynonymous αμινοξέων [33], [34]. Όλες τις φωτογραφίες

BRAF

μεταλλάξεις που εντοπίστηκαν προβλέπεται να έχουν αλλάξει τη λειτουργία της πρωτεΐνης εκτός από p.Q201H. Η λειτουργική σημασία του

BRAF

κωδικοποίησης μεταλλάξεις στα εξόνια, εκτός από 11 και 15 υποστηρίζεται από βιοχημικές μελέτες των νέων μεταλλάξεων βλαστικής σειράς που προσδιορίζονται στο CFC. Όπως και σωματικές μεταλλάξεις, οι περισσότερες μεταλλάξεις CFC βλαστική παρέχουν αυξημένη δραστηριότητα κινάσης, ενώ μερικά είναι κινάσης απομειωθεί. Ωστόσο, όλες οι μεταλλάξεις CFC που έχουν χαρακτηριστεί βιοχημικά alter λειτουργία της πρωτεΐνης σε κάποιο βαθμό ([18], [26]? Rauen, αδημοσίευτα δεδομένα).

Β-Raf έχει μόνο δύο γνωστοί καθοδικούς τελεστές, ΜΕΚ1 και ΜΕΚ2 . Σε μια προσπάθεια για να χαρακτηρίσει το φάσμα μετάλλαξη της οδού ΜΑΡΚ στον καρκίνο των ωοθηκών, έχουμε την αλληλουχία επίσης

ΜΕΚ1 /2

και ταυτοποιείται μία νέα ΜΕΚ1 υποκατάσταση ετερόζυγο εσφαλμένου νοήματος, p.D67N σε ES-2, η οποία προέκυψε από nt 199 G → A μετάβασης. Αυτή είναι η πρώτη εντοπιζόμενες λειτουργικές ΜΕΚ μετάλλαξη που σχετίζεται με τον καρκίνο και δεν αποτελεί σπάνιο πολυμορφισμό σε ότι αυτή η μετάλλαξη δεν ταυτοποιήθηκε σε 40 φυσιολογικούς μάρτυρες (80 αλληλόμορφα) ή σε 52 CFC άτομα (104 αλληλόμορφα) έχουμε αλληλουχία μέχρι σήμερα ([18 ]? Rauen, αδημοσίευτα δεδομένα). Είναι ενδιαφέρον ότι, αν και δεν είχε προσδιορίσει αυτό ΜΕΚ1 p.D67N μεταλλαγμένο σε CFC ομάδα μας, αυτή η ίδια μετάλλαξη ΜΕΚ1 έχει πρόσφατα αναφερθεί ως μια μετάλλαξη βλαστικής σειράς σε σύνδρομο CFC [29]. Εκτός από ένα

MEK1

μετάλλαξη, ES-2 είχε επίσης μια B-Raf υποκατάστασης p.V600E απουσίας. Αυτές οι δύο μεταλλάξεις μπορεί να έχουν συνεργάζονται ογκογόνο γεγονότα. Αυτό που κάνει αυτό το εύρημα ιδιαίτερα ενδιαφέρον είναι το γεγονός ότι προηγούμενες μελέτες προσδιορισμού αλληλουχίας της περιοχής κινάσης πρωτεΐνης MEK1 /2 απέτυχε να εντοπίσει τυχόν μεταλλάξεις σε γλοιώματα, όγκους των όρχεων γεννητικών κυττάρων, καρκίνο του μαστού και τον καρκίνο του πνεύμονα [35] – [38]. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η p.D67N στην ES-2 δεν εμπίπτει στο πεδίο της πρωτεϊνικής κινάσης η οποία εκτείνεται από το ΑΑ 68-271 (www.ensembl.org/Homo_sapiens). Πολλές μεταλλάξεις βλαστικής σειράς CFC που βρίσκεται 5 ‘της περιοχής κινάσης πρωτεΐνης ([18], [29], [39]? Rauen, αδημοσίευτα δεδομένα). Λειτουργικές μελέτες αυτών των νέων μεταλλάξεων CFC έχουν καταδείξει αυξημένη δραστηριότητα

in vitro

επί άγριου τύπου ΜΕΚ στη διέγερση φωσφορυλίωσης ERK, αλλά αυτές οι μεταλλάξεις CFC δεν είναι τόσο δραστικές ως τεχνητά δημιουργούνται ουσιαστικά δραστική ΜΕΚ μεταλλαγμένο ([18]? Rauen, αδημοσίευτα δεδομένα). Άλλες μελέτες έχουν δείξει ότι μεταβολή του Ν-άκρου της ΜΕΚ αυξάνει τη βασική δράση κινάσης που εμπλέκουν ένα σημαντικό ρυθμιστικό ρόλο μαζί με την αναγνώριση του υποστρώματος [40] – [42].

Για να εκτιμηθεί η λειτουργική συνέπεια του ΜΕΚ1 σ. D67N, αυτή η υποκατάσταση αμινοξέος αναλύθηκε με SIFT και βρέθηκε να επηρεάζεται λειτουργικά. Για την επιβεβαίωση αυτής της πληροφορίας, ΜΕΚ1 p.D67N διαμολύνθηκε παροδικά σε κύτταρα ΗΕΚ 293Τ, και φωσφορυλίωση ERK μετρήθηκε με ανάλυση στυπώματος Western. Η p.D67N μεταλλαγμένο MEK1 δραστηριοποιείται όπως καταδεικνύεται από την αυξημένη φωσφορυλίωση ERK σε σύγκριση με άδειο φορέα και άγριου τύπου ΜΕΚ1, δύο ελέγχους που δεν ενεργοποιούν ΕΚΚ. Ωστόσο, το επίπεδο της φωσφορυλίωσης της ERK για p.D67N είναι μικρότερη από τη θετική CFC έλεγχο MEK1 p.Y130C μεταλλαγμένα [18].

Εκτός από

BRAF

και

ΜΕΚ1

μεταλλάξεις, πολλά συνώνυμα SNP βάση δεδομένων εντοπίστηκαν επίσης. Β-Raf p.G634G (rs9648696) ταυτοποιήθηκε σε 40% από τις κυτταρικές γραμμές 15, ΜΕΚ2 p.I220I (rs10250) ήταν παρούσα στο 73% και ΜΕΚ2 p.D151D (rs17851657) ταυτοποιήθηκε σε 33% από τις κυτταρικές σειρές. Αυτές οι συνώνυμες SNPs βάση δεδομένων ήταν παρούσες σε μία συχνότητα η οποία είναι συγκρίσιμη με εκείνη που έχουν αναφερθεί προηγουμένως (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp? [43]). Υπήρχε ένα εξατομικεύονται

MEK1

SNP σε OVCAR 10 που προκύπτει από nt 348 ετερόζυγο G → A μετάβαση στο εξόνιο 3, p.Q113Q. Όλες οι συνώνυμες SNPs χαρακτηρίστηκαν με SIFT και αποφασισμένο να γίνει ανεκτή.

Τα ευρήματά μας τονίζουν ότι οι μεταλλάξεις που μεταβάλλουν τη λειτουργία της οδού ΜΑΡΚ διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στον καρκίνο των ωοθηκών [15]. Επιπλέον, ο προσδιορισμός των μεταλλάξεων σε βασικές συνιστώσες μονοπάτι ΜΑΡΚ θα είναι σημαντική για τον καθορισμό της ανταπόκρισης του καρκίνου για θεραπευτική, την επιθετική και μεταστατική συμπεριφορά του όγκου και την πρόγνωση του ασθενούς. Τέσσερις από 15 (26%) κυτταρικές σειρές σε αυτή τη μελέτη είχαν

BRAF

μεταλλάξεις και 1 των 15 (7%) είχαν μια μετάλλαξη ΜΕΚ. Είναι γνωστό ότι

BRAF

μεταλλάξεις έχουν ταυτοποιηθεί σε ορισμένους τύπους καρκίνου των ωοθηκών? Ωστόσο, μεταλλάξεις στα κατάντη δράστες της Β-Raf συμπεριλαμβανομένων των

ΜΕΚ1

και

ΜΕΚ2

μπορεί επίσης να συμβάλλουν σημαντικά της ογκογένεσης καρκίνου των ωοθηκών. Ο καθορισμός των pathogenetics του καρκίνου των ωοθηκών μπορεί να επιτρέψει τη χρήση στοχευμένων θεραπευτικά, όπως μικρού μορίου αναστολείς ΜΑΡΚ μονοπάτι, τα οποία έχουν αρχίσει πρόσφατα να αποτελεί μια μεγάλη υπόσχεση [16]. Επιπλέον, μια αναφορά υποδεικνύει ότι τα κύτταρα με ενεργοποιημένα Β-Raf έχουν ενισχυμένη, επιλεκτική ευαισθησία σε αναστολείς ΜΕΚ [44]. Τα αποτελέσματά μας υπογραμμίζουν τη σημασία που περαιτέρω χαρακτηρισμό της ευαισθησίας των διαφόρων BRAF και μεταλλάξεις ΜΕΚ σε μικρές αναστολή μόριο είναι ένας σημαντικός δρόμος για την επίτευξη προς την ανάπτυξη αποτελεσματικών θεραπειών για τον καρκίνο των ωοθηκών.

Μέθοδοι

κυτταρικές σειρές και απομόνωση Γενωμικό DNA

Δεκαπέντε κυτταρικές γραμμές καρκίνου των ωοθηκών, που χρησιμοποιούνται συνήθως για το

in vitro πειράματα

, υποβλήθηκαν σε διαλογή για μεταλλάξεις: OVCAR 3, SKOV 3, TOV-112d, Α2780, OV90 , ES-2, TOV-21g, Caov-3, A1847, IGROV 1, OVCAR 5, 2008, OVCAR 10, PEO1 και Hey. Σφαιρίδια κυττάρου από κάθε μία από αυτές τις κυτταρικές γραμμές προσεφέρθησαν ευγενώς από τους Drs. Charles Drescher και Beatrice Knudsen. Γονιδιωματικό DNA απομονώθηκε από σφαιρίδια κυττάρου χρησιμοποιώντας το κιτ Tissue QIAamp DNA (Qiagen, Valencia, CA), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Σαράντα υγιείς ανθρώπους μάρτυρες συμπεριλήφθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Γονιδιωματικό DNA απομονώθηκε από λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος χρησιμοποιώντας το κιτ QIAamp Blood DNA Midi (Qiagen, Valencia, CA), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα δείγματα ελέγχου ελήφθησαν στο πλαίσιο εγκεκριμένου συμβούλιο επιθεώρησης ιδρύματος από το Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνια στο Σαν Φρανσίσκο.

PCR και Αμφίδρομη αλληλουχίας

εκκινητές PCR σχεδιάστηκαν για να ενισχύσουν όλες κωδικοποίησης εξώνια και περιοχές εσωνίων συνοδευτικά του

BRAF

(NM_004333.2),

MEK1

(NM_002755.2) και

ΜΕΚ2

(NM_030662.2) (Πίνακας 4 και Πίνακας 5). Για αλληλούχιση, οι εκκινητές PCR τροποποιημένο στο 5 ‘άκρο για να συμπεριλάβει Μ13 προς τα εμπρός (GTAAAACGACGGCCAGT) και αντίστροφη (CAGGAAACAGCTATGACC) αλληλουχίες. PCR και αλληλούχιση πραγματοποιήθηκαν με Agencourt Bioscience Corporation (Beverly, ΜΑ). Αμφίδρομη αλληλουχίας διεξήχθη με ΑΒΙ BigDye Kit Cycle Sequencing v3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και να τρέξει σε ένα όργανο τριχοειδή αλληλουχίας ABI3730xl (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Η

ανάλυση

δεδομένα αλληλουχίας αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας δύο προγράμματα ανάλυσης αλληλουχίας, PolyPhred λογισμικού v5.02 (University of Washington, Seattle, WA) και SeqScape® λογισμικού (Applied Biosystems, Foster City, CA) . Επιπλέον, το εγχειρίδιο επανεξέταση διεξήχθη με μετάλλαξη Surveyor 3.00 (SoftGenetics LLC, State College, PA). Περαιτέρω αξιολόγηση των ανιχνεύθηκαν μεταλλάξεις νουκλεοτιδίων αποτελούνταν από Διαλογής Δυσανεκτικοί Από ανεκτική (SIFT? Blocks.fhcrc.org/sift/SIFT.html) και διαλογή έναντι γνωστών βάσεων δεδομένων: NCBI, Cosmic, UniProtKB /Swiss-Prot και JSNP (www.ncbi.nlm .nih.gov /SNP, www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/, ca.expasy.org/sprot/, snp.ims.u-tokyo.ac.jp/).

Τα πλασμίδια

Ανθρώπινο

ΜΕΚ1

cDNA (ΟηΟεηε, Rockville, MD) κλωνοποιήθηκε σε φορέα pcDNA3 με Myc-tag στο Ν-άκρο. Η

MEK1

nt 199 G → A μετάβαση εισήχθη χρησιμοποιώντας το Quick-Αλλαγή τοποθεσίας-Directed Mutagenesis (Stratagene, La Jolla, CA) και επαληθεύεται από την άμεση αλληλούχιση.

Ανάλυση παροδικές επιμολύνσεις και Western Blot

Ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά (ΗΕΚ) κύτταρα 293Τ σπάρθηκαν την ημέρα πριν σε δίσκους των έξι φρεατίων και επιμολύνθηκαν εις διπλούν, με 2 μg ολικού DNA πλασμιδίου και 5 μΐ Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα κύτταρα στερήθηκαν ορό (0.5% ορός εμβρύου μόσχου) και 24 ώρες αργότερα υποβάλλονται σε λύση σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει πρωτεάση και Φωσφατάση Αναστολέας κοκτέιλ (Sigma, St. Louis, ΜΟ). Τα επίπεδα έκφρασης του myc-ΜΕΚ, ολική ΕΚΚ και φωσφορυλιωμένο ERK αναλύθηκαν με κηλίδα Western. Myc (Α-14) και ρ-ΕΚΚ (Ε-4) αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), και ρ44 /42 ΜΑΡ κινάσης αντίσωμα αγοράστηκε από την Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ).

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς ευχαριστήσω το Ίδρυμα Κανάρια (www.canaryfoundation.org) για την οικονομική και επιστημονική υποστήριξη και Δρ. Ingrid Revet και William Tidyman για στοχαστική σχόλια και τεχνική βοήθεια.