Αφηρημένο

Ιστορικό

Otto Warburg παρατήρησε ότι τα καρκινικά κύτταρα συχνά χαρακτηρίζονται από έντονες γλυκόλυση με την παρουσία του οξυγόνο και μία ταυτόχρονη μείωση στην μιτοχονδριακή αναπνοή. Η έρευνα έχει επικεντρωθεί κυρίως σε μια πιθανή σύνδεση μεταξύ της αυξημένης γλυκόλυση και την ανάπτυξη όγκων, ενώ μειώθηκε η αναπνοή έχει σε μεγάλο βαθμό αφεθεί αφύλακτο. Ως εκ τούτου, μια σχέση αιτιότητας μεταξύ μειωμένη αναπνοή και την καρκινογένεση δεν έχει αποδειχθεί.

Μεθοδολογία Κύρια Ευρήματα /

Για το σκοπό αυτό, οι αποικίες των

Saccharomyces cerevisiae

, το οποίο είναι κατάλληλο για χειρισμός του μιτοχονδριακή αναπνοή και δείχνει μιτοχόνδρια μεσολάβηση κυτταρικό θάνατο, χρησιμοποιήθηκαν ως μοντέλο. Καταστολή της αναπνοής, καθώς και ROS-σάρωσης μέσω γλουταθειόνης ανέστειλε απόπτωση και παρέχει ένα πλεονέκτημα επιβίωσης κατά τη σπορά και την πρόωρη ανάπτυξη αυτού του ταχέως πολλαπλασιαζόμενων πληθυσμό στερεά κυττάρων. Αντίθετα, βελτίωση της αναπνοής προκάλεσε κυτταρικό θάνατο

Συμπέρασμα /Σημασία

Έτσι, το αποτέλεσμα Warburg μπορεί να συμβάλει άμεσα στην έναρξη του σχηματισμού του καρκίνου -. Όχι μόνο από αυξημένη γλυκόλυση – αλλά και μέσω μειώθηκαν αναπνοή με την παρουσία οξυγόνου, η οποία καταστέλλει την απόπτωση

Παράθεση:. Ruckenstuhl C, Büttner S, Carmona-Gutierrez D, Eisenberg T, Kroemer G, Sigrist SJ, et al. (2009) Το Φαινόμενο Warburg Καταστέλλει Οξειδωτικό στρες που προκαλείται απόπτωση σε ένα μοντέλο Μαγιά για τον καρκίνο. PLoS ONE 4 (2): e4592. doi: 10.1371 /journal.pone.0004592

Επιμέλεια: Julian Rutherford, Πανεπιστήμιο του Newcastle, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 26, Αυγούστου του 2008? Αποδεκτές: 9 Ιανουαρίου 2009? Δημοσιεύθηκε: 25 Φεβρουαρίου του 2009

Copyright: © 2009 Ruckenstuhl et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορήγηση FWF-FSP S93 σε FM και χορηγούν ΕΣΕΕ ΕΕ 511.983 (TransDeath) για να KU. F .. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν αντικρουόμενα συμφέροντα

Εισαγωγή

το 1920 Otto Warburg περιγράφεται η πιο κοινή βιοχημική φαινότυπος των καρκινικών κυττάρων: ακόμη και υπό την παρουσία ενός φυσιολογικού επιπέδου του οξυγόνου, η γλυκόλυση είναι ιδιαίτερα αυξημένη και συνοδεύεται από υψηλή παραγωγή γαλακτικού, καθώς και δραστικά μειωμένη μιτοχονδριακή αναπνοή [1] – [3]. Αν και αυτό το φαινότυπο είναι η βάση για την κατανάλωση διάγνωση όγκων γλυκόζης παρακολούθησης [4], προκλητικά ερωτήματα παραμένουν ασαφείς: Για παράδειγμα, πώς τα καρκινικά κύτταρα να εγκρίνει αυτό το φαινότυπο με διαφορετικούς μηχανισμούς [5], [6], αν τα δύο φαινόμενα (υψηλή γλυκόλυση και μειωμένη αναπνοή) οι αιτιακή σχέση [7], [8], και, τέλος, η συγκεκριμένη συμβολή τους στην ογκογένεση [7], [9] – [11].

ταχέως πολλαπλασιαζόμενα ζύμες παρουσιάζουν παρόμοιες τιμές ζύμωση, όπως τα καρκινικά κύτταρα [12], επιτρέποντας έτσι να μελετήσει τη σχέση μεταξύ του ενεργειακού μεταβολισμού και μέγιστο πολλαπλασιασμό. Αξιοσημείωτα, προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος, το οποίο προστατεύει από ογκογένεση, συνδέεται στενά με την μιτοχονδριακή διεργασίες σε κύτταρα θηλαστικών. Τα κύτταρα ζυμομυκήτων μπορούν επίσης να υποστούν προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο [13], [14] σε ένα μιτοχόνδρια τρόπο εξαρτώμενο [15], [16], συμπεριλαμβανομένων κυτοχρώματος c και την απελευθέρωση ΟΕΕ, το άνοιγμα του καναλιού στην ανθρώπινη έκφραση Bax [17] – [19], αποπόλωση της μιτοχονδριακής μεμβράνης δυναμικό [20], και το μιτοχονδριακό κατακερματισμό [21].

Η ιδιαίτερη ικανότητα της Crabtree-θετικών ζύμες όπως

Saccharomyces cerevisiae

για την ενεργοποίηση και απενεργοποίηση της αναπνοής σε απάντηση στις αλλαγές των η πηγή άνθρακα και η δυνατότητα παραγωγής βιώσιμων στελεχών που στερούνται μιτοχονδριακού DNA (rho

0), επιτρέπει την αυστηρότερη γενετική αξιολόγηση του ρόλου των μιτοχονδρίων κατά τη διάρκεια του κυτταρικού θανάτου [15], [22]. Εδώ, θα εκτιμηθεί η πιθανή σχέση μεταξύ κατέστειλε κυτταρικού θανάτου και ανέστειλαν την οξειδωτική φωσφορυλίωση, σε αποικίες αναπτύχθηκαν από ένα απλό κύτταρο, που μοιάζει με την ανάπτυξη του όγκου.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Σε μία μεγίστη πολλαπλασιαζόμενα πληθυσμό στερεό κύτταρο , η αναπνοή αυξάνει την παραγωγή ROS και την απόπτωση

S. cervevisiae

κύτταρα κληρονομούν ένα μοναδικό σύστημα καταστολής γλυκόζης που κατά την ανάπτυξη σε γλυκόζη καταστέλλει δραστικά την αναπνοή ανεξάρτητα της διαθεσιμότητας οξυγόνου [23]. Μοντελοποίηση της ανάπτυξης του όγκου, ελέγξαμε αν επιρροές καταστέλλεται αναπνοή κυτταρικής επιβίωσης κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης των κυτταρικών πληθυσμών που ξεκινώντας από ένα μόνο κύτταρο σε μέσα γλυκόζης. Τρία διαφορετικά στελέχη ανίκανοι αναπνοή μαζί με ισογονιδιακές άγριου τύπου

S. cerevisiae

χρησιμοποιήθηκαν σε μία δοκιμασία αποικίας όπου απομονωμένες αποικίες αναπτύχθηκαν από μεμονωμένα κύτταρα. Κύτταρα απομακρύνθηκαν από τις αποικίες κατά την πρώιμη ανάπτυξη ενός rho

0 στέλεχος αποικία εμφανίζουν σημαντικά αυξημένη επιβίωση σε σύγκριση με το στέλεχος άγριου τύπου (σχ. 1Α). Σταθερά, η παραγωγή αντιδραστικών μορφών οξυγόνου (ROS), μια διαδικασία σφικτά συνδεδεμένο με και συχνά αιτιολογικοί για προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο, ελαττώνεται (Εικ. 1Β).

(Α) Μεμονωμένες αποικίες αναπτύχθηκαν από μονά κύτταρα, χειραγωγείται επάνω σε πλάκες άγαρ. Κλωνογονική δοκιμασία των κυττάρων απομακρύνθηκε από τις αποικίες του στελέχους άγριου τύπου, rho

0 (καμία μιτοχονδριακό DNA) και δύο στελέχη μεμονωμένο γονίδιο-διαγραφή (

mgm1

και

oxa1

), που καλλιεργούνται για SCGlu. Μετά από 3 ημέρες 500 κύτταρα ολόκληρων αποικιών, μετά από 5 ημέρες 500 κύτταρα του κεντρικού αποικίας περιοχή αναλύθηκαν (μέση ± SEM,

n

= 2). Η στατιστική σημαντικότητα ρ & lt? 0.006 συγκρίνει μονάδες σχηματισμού αποικιών (cfu) μεταλλαγμένων στελεχών για το στέλεχος άγριου τύπου στα αντίστοιχα χρονικά σημεία. (Β) Κύτταρα από το σύνολο αποικία (3 ημέρες), καθώς και από την κεντρική περιοχή (5 ημέρες) βάφτηκαν για αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) με dihydroethidium και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής FACSAria (μέση ± SEM,

n

= 2? ** p & lt? 0,01, *** p & lt? 0.001 σε σύγκριση με τα στελέχη διαγραφή στα αντίστοιχα χρονικά σημεία). (Γ) Περίπου 50 (2 ημέρες) και 10 (3 ημέρες) αποικίες που αναπτύσσονται σε πλάκες SCGlu πλύθηκαν μακριά και κλωνογονική δοκιμασίες διεξήχθησαν με τα συλλεχθέντα κύτταρα (μέση ± SEM,

n

= 5? ** Ρ & lt ? 0,01, *** p & lt? 0.001). (D) Περίπου το 50 αποικίες που αναπτύχθηκαν σε πλάκες SCGlu για 2 ημέρες χρωματίστηκαν για φωσφατιδυλοσερίνη έκθεση (AnnV) και θραύση του DNA (TUNEL) και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής FACSAria (μέση ± SEM,

n

= 3? ** p & lt? 0,01, *** p & lt? 0.001). (Ε) Μικροσκοπία φθορισμού από την κεντρική και την εξωτερική περιοχή 5 ημερών κύτταρα αποικία άγριου τύπου, που φιλοξενεί το πλασμίδιο DsRed-MLS.

Η

Για να εξαιρέσετε rho

0 στέλεχος συγκεκριμένα αποτελέσματα δεν αντιπροσωπεύουν τις ελλείψεις της αναπνοής , δύο άλλα στελέχη της αναπνοής μειωμένη ερευνήθηκαν. στελέχη ενιαίο διαγραφή του γονιδίου και των δύο,

MGM1

(ομόλογο με την ανθρώπινη

OPA1

) – ένα ΘΤΡάσης που βρίσκεται στο χώρο των μιτοχονδρίων [24] – και

OXA1

(ένα insertase της εσωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης – εξαιρετικά διατηρημένη από προκαρυωτικά σε θηλαστικά [25], [26]) συμπεριφέρθηκε σαν τον (τύπου άγρια) rho

0 στέλεχος. Μετά από 3 και 5 ημέρες,

mgm1

καθώς και

oxa1

διαγράφεται κύτταρα ανακτώνται από το σύνολο αποικία (3 ημέρες) ή την κεντρική περιοχή (5 ημέρες), και ως εκ τούτου κυρίως μεγάλα κύτταρα, έδειξε αύξησε σημαντικά την επιβίωση (Σχ. 1Α), καθώς και η αναστολή της παραγωγής ROS σε σύγκριση με τα δείγματα του στελέχους άγριου τύπου (σχ. 1Β). Αξίζει να σημειωθεί ότι, σε αντίθεση με άλλες αναπνοή ανεπάρκεια μεταλλαγμένα στελέχη (συμπεριλαμβανομένων rho

0 και Δ

mgm1

) της Δ

oxa1

στέλεχος έδειξε ίδιους ρυθμούς ανάπτυξης όπως το στέλεχος άγριου τύπου σε υγρές καλλιέργειες και κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης των αποικιών, αντίστοιχα (Εικ. 2Α και Β). καμπύλες ανάπτυξης

(Α) ενός

oxa1

στέλεχος διαγραφής και το αντίστοιχο στέλεχος άγριου τύπου. Πείραμα διεξήχθη εις τριπλούν. Ο άξονας y κλιμακώνεται λογαριθμικά. (Β) Μέγεθος του απομονωμένες αποικίες των υποδεικνυόμενων στελέχη που αναπτύχθηκαν για 3 και 5 ημέρες σε τρυβλία SCGlu, αντίστοιχα. Διάμετροι αξιολογήθηκαν από την επεξεργασία των φωτογραφιών με Metamorph Imaging (μέση τιμή ± SEM,

n

= 2).

Η

Σε μια συμπληρωματική προσέγγιση, σπέρνεται αποικίες (10 και 50 ανά πλάκα) του άγριου τύπου και Δ

oxa1

στελέχη, αντίστοιχα, πλύθηκαν από πλάκες SCGlu μετά από 2 και 3 ημέρες και κλωνογονική επιβίωση αξιολογήθηκε. Και πάλι, το στέλεχος ανίκανο αναπνοής έδειξε καλύτερη επιβίωση από την αναπνέοντα στέλεχος άγριου τύπου (σχ. 1C). Επιπλέον, το πλεονέκτημα επιβίωσης του Δ

oxa1

στέλεχος συνέβη ήδη μετά από 2 ημέρες, η οποία είναι σε καλή συμφωνία με τα προηγούμενα δεδομένα ότι οι αποικίες άγριου τύπου καλλιεργείται σε συνήθη μέσα γλυκόζη όπου φαίνεται να εγκαταλείψουν την λογαριθμική φάση ανάπτυξης μετά από περίπου 36 ώρες [27].

για να αξιολογηθεί η επαγόμενη τύπος κυτταρικού θανάτου που διαλέγονται για αποπτωτική δείκτες χρησιμοποιώντας προσδιορισμούς Αηηβχίην και TUNEL. Η απόπτωση ήταν σημαντικά μειωμένη σε αναπνοή με ανεπάρκεια

oxa1

μετάλλαξη παραλείψεως σε σχέση με τον έλεγχο άγριου τύπου (σχ. 1D). Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η πέψη του κυτταρικού τοιχώματος των κυττάρων άγριου τύπου ήταν λιγότερο αποτελεσματική. Ως εκ τούτου, χαμηλότερες ποσότητες θετικώς χρωματισμένων κυττάρων ελήφθησαν σε σχέση με την παρατηρούμενη επιβίωση των κυττάρων σε κλωνογενείς δοκιμασίες μετά από 2 ημέρες. Αυτό σημαίνει ότι η παρατηρούμενη καταστολή των αποπτωτικών δεικτών στο

oxa1

διαγραφεί στέλεχος είναι πιθανώς ακόμη υψηλότερο από ό, τι φαίνεται στο 1D. Σε αυτή τη γραμμή, όταν υποβάλλεται σε επεξεργασία με 30% περισσότερο ένζυμο μίγμα για να ενισχύσει την πέψη του κυτταρικού τοιχώματος, περίπου 37% των κυττάρων άγριου τύπου επέδειξαν μία θετική χρώση TUNEL (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Μιτοχονδριακή κατακερματισμός αποτελεί προϋπόθεση για την απόπτωση σε ζυμομύκητες. Ως εκ τούτου, μιτοχονδριακή μορφολογία των κυττάρων από αποικίες άγριου τύπου (και όχι για rho

0 κύτταρα, επειδή στερούνται αναπνοή) παρακολουθήθηκε χρησιμοποιώντας DsRed φέρει μία μιτοχονδριακή αλληλουχία εντοπισμού. Μετά από 5 ημέρες, τα κύτταρα από την κεντρική περιοχή (έτσι μεγαλύτερα κύτταρα) έδειξε ένα δραστικά αυξημένη κατακερματισμό των μιτοχονδρίων και περισσότερο διάτρητο δομές ενώ προσφάτως τρέφονται νεότερα κύτταρα από το εξωτερικό χείλος εμφανίζεται μια κανονική σωληνωτή κατασκευή των μιτοχονδρίων (Εικ 1Ε).

Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η κατάργηση της αναπνοής καταστέλλει την απόπτωση και την παραγωγή ROS σε ένα έντονα πολλαπλασιαζόμενα κυτταρικό πληθυσμό σε στερεά υλικά.

Αναγκαστική ενίσχυση της αναπνοής προκαλεί κυτταρικό θάνατο κατά τη διάρκεια της σποράς ενός κυτταρικού πληθυσμού

καρκίνο Μυθιστόρημα οι θεραπείες που βασίζονται στην υπόθεση ότι ανασύσταση ή αναγκαστική αύξηση της αναπνοής εντός συμπαγών όγκων μπορεί να οδηγήσει στην αναστολή της ανάπτυξης και κυτταρικού θανάτου [10], [28], [29]. Για να ελέγξετε αν η γενετική επιβολή των επιρροών αναπνοής κυτταρικού θανάτου κατά τη διάρκεια της σποράς ενός κυτταρικού πληθυσμού (η οποία είναι η χρονολογική βήμα πριν καθιερώνει μια αποικία), πειράματα media-shift χρήση γλυκόζης (SCGlu), γαλακτόζη (SCGal), και γλυκερόλη (SCGly) μέσα μαζικής ενημέρωσης ως εναλλασσόμενες πηγές άνθρακα διεξήχθησαν. Με αυτόν τον τρόπο, η αναπνοή γίνεται είτε κατασταλεί (SCGlu), συνεργατικά ενεργά με ζύμωση (SCGal), ή αποτελεί την αποκλειστική πηγή ενέργειας (SCGly). Κατά τη στάση (μη πολλαπλασιαζόμενα) υγρό πληθυσμούς κυττάρων άγριου τύπου ζυμομύκητα αναπτύχθηκαν σε SCGlu μετατοπίστηκαν στους στερεό SCGal ή SCGly, μόνο το 65% ή 44%, αντίστοιχα, των σπαρμένων κυττάρων ήταν σε θέση να σχηματίσουν μια αποικία (Εικ. 3Α). Χρησιμοποιώντας υψηλά πολλαπλασιαστικές καλλιέργειες άγριου τύπου BY4741 στελέχους (από την εκθετική φάση ανάπτυξης) αυτή η επίδραση ήταν ακόμα πιο έντονη με σχεδόν καθόλου επιβίωση τόσο του αναπνευστικού μέσα (Εικ. 3Α). Συγκρίσιμα αποτελέσματα λήφθηκαν με εξαιρετικά πολλαπλασιαστική καλλιέργειες άλλων στελεχών άγριου τύπου όπως ΑΗ22, TB50, και DBY746 (τα δεδομένα δεν φαίνονται) κάτω από συνθήκες μας. Ακόμη και μια μεταφορά στο ίδιο υψηλό αναπνευστικό μέσα μαζικής ενημέρωσης (από το υγρό SCGly σε στερεά SCGly) οδήγησε σε μειωμένη σχηματισμό αποικιών ~ 70% (σε σύγκριση με μια μετατόπιση από υγρό SCGly σε στερεά SCGlu), υπογραμμίζοντας ότι ειδικά η έναρξη της ανάπτυξης των αποικιών είναι αρνητικά επηρεάζεται από ενισχυμένη αναπνοή (Σχ. 3Β).

(Α) κλωνογονική δοκιμασία καλλιεργειών προ-αναπτύχθηκαν σε υγρό SCGlu. 500 κύτταρα απλώθηκαν σε SCGlu, SCGal, και SCGly άγαρ πλάκες, αντίστοιχα (μέση ± SEM,

n

= 3? *** Ρ & lt? 0.001). (Β) κλωνογονική δοκιμασία καλλιεργειών προ-αναπτύχθηκαν σε υγρό SCGly. 500 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε τρυβλία των μέσων ενημέρωσης SCGly και SCGlu, αντίστοιχα (μέση ± SEM,

n

= 2? ** Ρ & lt? 0,01). (C) Τα κύτταρα από το σύνολο αποικία (3 ημέρες), καθώς και από την κεντρική περιοχή (5 ημέρες) βάφτηκαν για αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) με dihydroethidium (DHE). Τιμές σχετικές μονάδες φθορισμού (RFU) κανονικοποιήθηκαν με τιμές άγριου τύπου στέλεχος (μέση ± SEM,

n

= 2? ** Ρ & lt? 0,01, *** ρ & lt? 0.001). (Δ) Μέγεθος απομονωμένες αποικίες άγριου τύπου αναπτύσσονται σε πλάκες μέσων SCGlu και SCGal παρακολουθούνταν από τη λήψη φωτογραφιών σε υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία. Διάμετροι αξιολογήθηκαν από την επεξεργασία των φωτογραφιών με Metamorph Imaging (λευκή γραμμή αντιπροσωπεύει το 1 cm) (μέση τιμή ± SEM,

n

= 3? * Ρ & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01).

Η

Αναγκαστική ενίσχυση της αναπνοής καταστέλλει την ανάπτυξη και αυξάνει την παραγωγή ROS αποικιών

Οι παρατηρούμενες επιδράσεις της καταστέλλονται σπορά αποικία όταν η αναπνοή είναι υψηλή επίσης αντικατοπτρίζεται στην περαιτέρω αύξηση του πληθυσμού των κυττάρων: Μετά από δύο ημέρες ανάπτυξης στερεά SCGal, οι αποικίες εμφανίζονται μόνο το μισό του μεγέθους αυτών που καλλιεργούνται σε στερεά SCGlu, αν και περαιτέρω αύξηση του μεγέθους (μετά την αρχική καθυστέρηση) είναι συγκρίσιμη (Εικ. 3D). Η αρχική καθυστέρηση θα μπορούσε να συνδέεται με μια άμεση ROS έκρηξη, όπως υπογραμμίζεται περαιτέρω από δραστικά αυξημένα επίπεδα ROS σε αποικίες που αναπτύχθηκαν σε SCGal ή SCGly (Σχ. 3C, επίσης να δείτε παρακάτω και Σχ. 4Γ).

(Α) Περίπου 100 αποικίες αναπτύχθηκαν επί 36 ώρες σε πλάκες SCGlu με ή χωρίς 5 mM GSH, ξεπλένεται και κλωνογονική δοκιμασίες διεξήχθησαν με τα συλλεχθέντα κύτταρα (μέση ± SEM,

n

= 3? ** ρ & lt? 0,01) . Επιπλέον ίσες ποσότητες κυττάρων χρωματίστηκαν για αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) με dihydroethidium (DHE) και ποσοτικοποιούνται χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη μικροπλακών φθορισμού (Genios-Pro). Οι τιμές του σχετικές μονάδες φθορισμού (RFU) εμφανίζεται (μέση ± SEM,

n

= 3? ** ρ & lt? 0,01) (Β). (Γ) κλωνογονική δοκιμασία καλλιεργειών προ-αναπτύχθηκαν σε υγρό SCGlu. 500 κύτταρα απλώθηκαν σε SCGlu, SCGal, ή SCGly πλάκες άγαρ, αντίστοιχα, με ή χωρίς 1 mM GSH (μέση ± SEM,

n

= 2? *** Ρ & lt? 0.001).

Έτσι, για τη θέσπιση έντονα πολλαπλασιαστικά πληθυσμό στερεά κυττάρων απαιτεί αναπνοή πρέπει να κατασταλεί.

μεσολάβηση αναπνοή κυτταρικό θάνατο σε αποικίες και πρόσφατα σπέρνονται κυττάρων καταστέλλεται αποτελεσματικά μέσω ROS σαρώσεως

για την περαιτέρω αποδείξει ότι αναπνοή και τα συνοδευτικά παραγωγή ROS είναι μια σημαντική αιτία της απόπτωσης κατά την ανάπτυξη αποικιών που χρησιμοποιήσαμε ανηγμένη γλουταθειόνη (GSH) ως ένα αντιδραστήριο καθαρισμού: οι αποικίες του άγριου τύπου και

oxa1

στελέχη διαγραφή αναπτύχθηκαν σε άγαρ SCGlu πλάκες με ή χωρίς GSH και η κυτταρική επιβίωση προσδιορίσθηκε μετά από 36 ώρες σε κλωνογονική δοκιμασία. Ενώ η

oxa1

στέλεχος διαγραφή δεν έδειξε αλλαγμένη επιβίωση κατά την προσθήκη της GSH, η επιβίωση των κυττάρων άγριου τύπου δραστικά βελτιωμένη (Σχήμα 4Α). Αυτό συνοδεύτηκε από σημαντικά μειωμένα επίπεδα ROS (Σχήμα 4Β). Είναι ενδιαφέρον ότι, η παράταση της ζυμωτική φάση ανάπτυξης, διπλασιάζοντας συγκέντρωση γλυκόζης στις πλάκες μέσα ενημέρωσης οδήγησε σε ελαφρώς αυξημένη επιβίωση των κυττάρων (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Επιπλέον, η επίδραση της γλουταθειόνης ως ROS καθαριστής ελέγχθηκε σε μια δοκιμασία μετατόπισης, όπου ιδιαίτερα πολλαπλασιαστικών κυττάρων άγριου τύπου αναπτυχθέντα προκαταρκτικά σε υγρά μέσα SCGlu σπάρθηκαν πάνω σε πλάκες SCGal και SCGly με ή χωρίς GSH. Εντυπωσιακά, η επιβίωση ενισχύθηκε με 50% και 55%, αντίστοιχα, σε σύγκριση με & lt? 1% επιβίωση σε πλάκες χωρίς GSH (σχήμα 4Γ).. Μια παρόμοια μετατόπιση των στατικών κυττάρων απέδωσε αυξημένη επιβίωση από 50% και 60% έως 75% και 77%, αντίστοιχα, σε GSH που περιέχουν πλάκες (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι σαρώσεως ROS μέσω γλουταθειόνης ενισχύει την επιβίωση των κυττάρων κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης των αποικιών, καθώς και κατά τη διάρκεια της σποράς σε ιδιαίτερα αναπνευστικό media. Περιέργως, έχει αναφερθεί πρόσφατα ότι σε καρκινικά κύτταρα και σε νευρώνες (που επίσης εμφανίζουν το αποτέλεσμα Warburg), κυτόχρωμα

γ

μειώνεται και διατηρείται ανενεργή από GSH [30].

Μέχρι στιγμής , η έρευνα σχετικά με την επίδραση Warburg έχει επικεντρωθεί κυρίως στην υψηλή γλυκολυτικής ροής, ενώ η συνοδευτική καταστολή της μιτοχονδριακής αναπνοής συχνά αφήνονται αφύλακτα [8], [9]. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η αναπνοή προκαλεί απόπτωση κατά τη σπορά και την ανάπτυξη ενός κυτταρικού πληθυσμού, παρέχοντας άμεση πειραματική απόδειξη για την υποστήριξη της υπόθεσης Warburg κατά την έναρξη της ογκογένεσης. Η έντονα μειωμένη αναπνευστική ικανότητα μπορεί να είναι ζωτικής σημασίας για κακοήθεια του όγκου [12] και για την αντίσταση ενάντια αναπόφευκτες διακυμάνσεις οξυγόνωση σε όγκους [31], [32]. Είναι ενδιαφέρον, έχει αποδειχθεί ότι rho ζύμη

0 στελέχη εμφανίζουν αυξημένη αντίσταση έναντι ορισμένων εξωτερικών ερεθισμάτων αποπτωτικά όπως οξικό οξύ, το οποίο προκαλεί το θάνατο μέσω της μιτοχονδριακής οδού [15], [17]. Μια παρόμοια αντίσταση κατά του κυτταρικού θανάτου μπορεί επίσης να παίζει ένα ρόλο για τα κύτταρα του όγκου σε ένα όξινο περιβάλλον. Είμαστε εικάζουν ότι επαναπρογραμματισμό των κυττάρων του καρκίνου ακολουθεί μια αρχαία μηχανισμό που υπάρχει στο

S. cerevisiae

αποικίες άγριου τύπου: υψηλή γλυκόλυση με την παρουσία οξυγόνου

Υλικά και Μέθοδοι

Στελέχη και των μέσων ενημέρωσης

Τα πειράματα διεξήχθησαν σε BY4741 (ΜΑΤα

his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0

) και τις αντίστοιχες μεταλλάξεις null του

mgm1

και

oxa1

, αντίστοιχα, που λαμβάνονται από Euroscarf. Στέλεχος BY4741 rho

0 δομήθηκε με αρκετούς γύρους θεραπείας βρωμιούχο αιθίδιο όπως περιγράφηκε προηγουμένως [33]. Για να εκτελέσετε μικροσκοπία φθορισμού των μιτοχονδριακών δομών το πλασμίδιο DsRed-MLS (DsRed μεταφέρουν μια μιτοχονδριακή ακολουθία εντοπισμού) [34] μεταμορφώθηκε σε στέλεχος BY4741. Για επιμεταλλώσεις επιβίωση YEPD (1% εκχύλισμα ζύμης, 2% πεπτόνη, και 2% γλυκόζη) μέσο συμπληρωμένο με 2% άγαρ. Για όλους τους προσδιορισμούς, τα στελέχη αναπτύχθηκαν σε μέσο SC περιέχουν βάση 0.17% άζωτο ζυμομύκητα (Difco), 0,5% (ΝΗ

4)

2SO

4, και 30 mg /l όλων των αμινοξέων (εκτός 80 mg /l ιστιδίνης, 200 mg /l λευκίνη (χωρίς λευκίνη κατά την εργασία με το πλασμίδιο DsRed-MLS)), 30 mg /l αδενίνη, και 320 mg /l ουρακίλης με% γλυκόζη 2 (SCGlu), 2% γαλακτόζη (SCGal), και 3% γλυκερόλη (SCGly), αντιστοίχως, συμπληρωμένο με 2% άγαρ, όπου χρειάζεται. Ανηγμένη γλουταθειόνη (GSH? Sigma-Aldrich) προστέθηκε σε συγκεντρώσεις 1 ή 5 mM, όπου χρειάζεται

Απομονωμένα monocolony δοκιμασία

Έξι τρυβλία Petri εκατοστών, που παρέχεται μαζί με 13 ml στερεών SC μέσων (. με ή χωρίς λευκίνη) χρησιμοποιήθηκαν. Ενιαία κύτταρα 16-20 ώρες τη νύχτα καλλιέργειες τοποθετήθηκαν πάνω σε πλάκες στερεά υλικά SC χρησιμοποιώντας ένα μικροχειριστή (Series 200, Singer Instruments). Για να ελαχιστοποιηθεί η αφυδάτωση των στερεών πλακών, επώαση εκτελέσθηκε στους 28 ° C σε ένα κλειστό, υγροποιημένο θάλαμο αναπαραγωγής (KBF115, Binder). Για τον προσδιορισμό διάμετρο, φωτογραφίες τραβήχτηκαν στα ενδεικνυόμενα χρονικά σημεία (Μικροβιολογία-Colony-Counter, Lemnatec) και επεξεργασία με χρήση απεικόνισης Metamorph.

Καμπύλες

Επιβίωση επιμετάλλωση, πειράματα media-shift, και την ανάπτυξη

Για να προσδιοριστεί η επιβίωση των κυττάρων μέσα στην αποικία, είτε ολόκληρο απομονωμένες αποικίες (στην περίπτωση των 3 ημερών) και τα δείγματα από τις κεντρικές περιοχές των απομονωμένων αποικιών (στην περίπτωση των 5 ημερών) απομακρύνθηκαν σε υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία, ή SCGlu πλάκες με περίπου 100 αποικίες (μετά 36 ώρες), 50 αποικίες (μετά από 2 ημέρες) ή 10 αποικίες (μετά από 3 ημέρες) πλύθηκαν off. Οι αριθμοί κυττάρων προσδιορίστηκαν με μια συσκευή μέτρησης κυττάρων CASY (Scharfe Systems) και 500 κύτταρα απλώθηκαν σε πλάκες άγαρ YEPD. μονάδες σχηματισμού αποικιών (CFU) προσδιορίστηκαν μετά από 2 ή 3 ημέρες (σε περίπτωση ανεπαρκούς αναπνοής στελεχών rho

0 και Δ

mgm1

) με Μικροβιολογία-αποικίας-Counter (Lemnatec) και επεξεργασία χρησιμοποιώντας SAWmicrobio έκδοση 3.1.

για πειράματα media-shift, καλλιέργειες αναπτύχθηκαν σε SCGlu και SCGly υγρά μέσα σε λογαριθμική (6 ώρες) και σταθερές (24 ώρες) φάση, αντίστοιχα, και 500 κύτταρα απλώνονται επί αντίστοιχων στερεών πλακών μέσων καθώς και σε πλάκες SCGlu σε κάθε περίπτωση.

για την αξιολόγηση των ρυθμών ανάπτυξης σε υγρά μέσα, ολονύκτιες καλλιέργειες αναπτύχθηκαν σε SCGlu. Οι καλλιέργειες εμβολιάστηκαν σε 5 × 10

5 κύτταρα σε SCGlu και κυτταρική ανάπτυξη παρακολουθήθηκε επί 12 ώρες χρησιμοποιώντας μια συσκευή μετρητή κυττάρων CASY.

Χρώση για αποπτωτική δείκτες και μικροσκοπία φθορισμού

Χρώση αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) με dihydroethidium (DHE), Annexin V-χρώση, και TUNEL χρώση διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [34]. Σε κάθε δείγμα 30.000 κύτταρα αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής (FACS-Άρια, BD) και υποβάλλονται σε επεξεργασία με τη χρήση του λογισμικού FACSDiva. Εναλλακτικά ίσες ποσότητες διυδροεργοταμίνης χρωματισμένα κύτταρα μετρήθηκαν σε αναγνώστη φθορισμού μικροπλακών (Genios-Pro, Tecan).

μιτοχονδριακή μορφολογία επιθεωρήθηκε με μικροσκοπία φθορισμού χρησιμοποιώντας ένα φίλτρο DsRed σε ένα μικροσκόπιο Zeiss Axioskop. Κύτταρα του κεντρικού, καθώς και η εξωτερική περιοχή των απομονωμένων monocolonies των κυττάρων άγριου τύπου που φιλοξενούν πλασμίδιο DsRed-MLS παρακολουθήθηκαν μετά από 5 ημέρες.

Στατιστική ανάλυση

Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση σπουδαστές t-test (one-tailed, unpaired), με * p & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01 και *** ρ & lt?. 0.001, αντίστοιχα

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Ulrike Potocnik για τεχνικής βοήθειας.