Αφηρημένο

απώλεια PTEN και συστατική ενεργοποίηση της PI3K μονοπάτι σηματοδότησης έχουν συσχετιστεί με την προηγμένη ανδρογόνων-ανεξάρτητο καρκίνο του προστάτη. ΡΤΕΝ ανεπάρκεια καρκινικά κύτταρα του προστάτη C42Luc επιβιώσουν σε μέσα ελεύθερα ορού και δείχνουν σχετική αντίσταση στην απόπτωση ακόμη και παρουσία του αναστολέα της ΡΙ3Κ ZSTK474. Ωστόσο, όταν ZSTK474 συνδυάζεται με το κυκλοεξιμίδιο αναστολέα μετάφρασης, τα κύτταρα υφίστανται απόπτωση C42Luc μέσα σε 6 ώρες. Ταυτοποιήσαμε αποφωσφορυλίωση της BAD (Bcl2 σχετιζόμενη υποκινητή θάνατος) ως ένα κύριο απόπτωση ρυθμιστικό μόριο καθοδικά από ΡΙ3Κ, και απώλεια MCL-1 (μυελοειδή λευχαιμία κυττάρων -1) ως μείζον στόχος του κυκλοεξιμιδίου. Ο συνδυασμός των MCL-1 knockdown και έκφραση του μεταλλαγμένου BAD2SA φωσφορυλίωσης με ανεπάρκεια είναι επαρκής για να προκαλέσει ταχεία απόπτωση σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώνουν τον μηχανισμό για τη συνεργιστική επαγωγή της απόπτωσης με το συνδυασμό ενός αναστολέα της ΡΙ3Κ και ενός αναστολέα σύνθεσης πρωτεΐνης σε ΡΤΕΝ ανεπάρκεια καρκινικά κύτταρα του προστάτη

Παράθεση:. Yancey D, Nelson KC, Baiz D, Hassan S, Φλόρες Α, Pullikuth A, et al. (2013) αποφωσφορυλίωση Bad και μειωμένη έκφραση της MCL-1 επάγουν ταχεία απόπτωση σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 8 (9): e74561. doi: 10.1371 /journal.pone.0074561

Επιμέλεια: Aamir Ahmed, University College London, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 19 Νοεμ 2012? Αποδεκτές: 5 Αυγούστου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 5 Σεπτέμβρη του 2013

Copyright: © 2013 Yancey et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορήγηση R01CA118329 από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου στο Γιώργο Kulik. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Ιστορικό

Αρκετές μελέτες έχουν εντοπίσει την φωσφατιδυλινοσιτόλη 3-κινάση (ΡΙ3Κ) μονοπατιού ως ένας από τους σημαντικότερους παράγοντες στην καρκινογένεση προστάτη και εξέλιξης σε θεραπευτική αντίσταση [1] – [3]. ΡΙ3Κ χρησιμεύει ως μεσολαβητής της ενδοκυτταρικής μεταγωγής σήματος μέσω της παραγωγής φωσφατιδυλινοσιτόλης (3-5) -triphosphate (ΡΙΡ3) μέσω φωσφορυλίωσης του φωσφατιδυλινοσιτόλης (4,5) -biphosphate (ΡΙΡ2). Μόλις δημιουργήθηκε, ΡΙΡ3 στρατολογεί πρωτεΐνες που περιέχουν την ομολογία πλεκστρίνης (ΡΗ) τομέα (συμπεριλαμβανομένης της κινάσης ΑΚΤ) της κυτταρικής μεμβράνης, όπου αυτά υφίστανται μια διαμορφωτική αλλαγή. Σε Akt, Αυτή η διαμορφωτική αλλαγή απολήγει σε φωσφορυλίωση πλήρωσης στη θρεονίνη 308 από φωσφοϊνοσιτιδίου εξαρτώμενη κινάση 1 (ΡϋΚ1) ακολουθούμενη από φωσφορυλίωση ενεργοποίησης στην σερίνη 473 με στόχο της ραπαμυκίνης στα θηλαστικά συγκρότημα 2 (mTORC2) [4]. Η ενεργοποιημένη Akt μετατοπίζεται στον κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα να φωσφορυλιώνει έναν αριθμό προς τα κάτω τους στόχους που εμπλέκονται στην κυτταρική επιβίωση, ανάπτυξη, πολλαπλασιασμό, και την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου [5]. Το λιπίδιο φωσφατάση και ογκοκατασταλτικό ΡΤΕΝ (φωσφατάση και tensin ομόλογο διαγράφονται στο χρωμόσωμα 10) χρησιμεύει ως αρνητικός ρυθμιστής της Akt και του ΡΙ3Κ μονοπάτι από αποφωσφορυλίωση ΡΙΡ3 και μετατροπή πίσω σε ΡΙΡ2. Στον καρκίνο του προστάτη, ο κύριος μηχανισμός για ΡΙ3Κ απορρύθμισης είναι η απώλεια της λειτουργίας του ΡΤΕΝ μέσω ομόζυγη εξαλείψεις, η απώλεια της ετεροζυγωτίας, ή αδρανοποίησης μεταλλάξεων [6], [7], που οδηγεί στην συστατική ενεργοποίηση της Akt.

ανδρογόνων εκτομή επάγει απόπτωση σε επιθηλιακά κύτταρα του προστάτη [8]. Ωστόσο ΡΤΕΝ-αρνητικά καρκινικά κύτταρα του προστάτη δεν υφίστανται απόπτωση με την απουσία των ανδρογόνων [9]. Παρομοίως, τα ποντίκια με προστάτη-περιορισμένη ΡΤΕΝ knockout έχουν μειώσει τα επίπεδα της απόπτωσης και μειωμένη υποστροφή του προστάτη κατόπιν ευνουχισμού [10]. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι συστατική ενεργοποίηση του μονοπατιού ΡΙ3Κ σε προχωρημένους όγκους του προστάτη ΡΤΕΝ-null συμβάλλει στην ανεξαρτησία από ανδρογόνα με αναστολή της απόπτωσης.

Οι πρωτεΐνες της οικογένειας Bcl-2 παίζουν κεντρικό ρόλο στην απόπτωση με τη ρύθμιση της μιτοχονδριακής διαπερατότητας της εξωτερικής μεμβράνης (ΜΟΜΡ) και η απελευθέρωση της διέγερσης απόπτωσης πρωτεΐνες όπως το κυτόχρωμα c, SMAC, και παράγοντα επαγωγής απόπτωσης (AIF) απορροφάται εντός των μιτοχονδρίων [11]. Η οικογένεια πρωτεϊνών Bcl-2 διαιρείται σε τρεις ομάδες ανάλογα με τη λειτουργικότητα και την παρουσία συντηρημένων BCL-2 ομολογία (BH1-4) τομείς: πολλών τομέων αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών, πολλών τομέων προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών, και ΒΗ3-μόνο πρωτεΐνες. Οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των ομάδων αυτών των πρωτεϊνών Bcl-2 υπαγορεύουν εάν ένα κύτταρο ζει ή πεθαίνει. αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών Multi-τομέα, όπως BCL-2, BCL-XL, και MCL-1 εμποδίζει ΜΟΜΡ αλληλεπιδρώντας με και απομόνωσης των πολλών τομέων προ-αποπτωτικών Bcl πρωτεΐνες ΒΑΚ και ΒΑΧ [12]. ΒΑΚ και ΒΑΧ έχουν BH1-3 τομείς που επιτρέπουν για ολιγομερισμό στο μιτοχονδριακό εξωτερική μεμβράνη και την επακόλουθη ΜΟΜΡ μέσω σχηματισμού πόρου [13]. Οι ΒΗ3-μόνο πρωτεΐνες, όπως BAD, NOXA, και PUMA [14] – [16], σε ανταγωνιστικές δεσμεύουν και εξουδετερώνουν αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών, επιτρέποντας ΒΑΧ /ΒΑΚ ολιγομερισμό και την προώθηση του κυτταρικού θανάτου, ενώ Bid και Bim μπορούν επίσης να αλληλεπιδράσουν με και ενεργοποιούν ΒΑΧ και ΒΑΚ, εισαγωγή διευκολύνοντας μεμβράνη και ΜΟΜΡ [11].

ΒΗ3-μόνο πρωτεΐνες της λειτουργίας οικογένειας Bcl-2 ως φρουροί που ρυθμίζουν την απόπτωση και επιβίωση σε απόκριση σε εξωκυτταρικά ερεθίσματα μέσω σύνδεσης προς το υδρόφοβο αύλακα αντι-αποπτωτικό εταίρων τους. Κάθε ΒΗ3-μόνο πρωτεΐνη έχει ένα μοναδικό προφίλ εταίρων δέσμευσης. Έτσι, BAD έχει αποδειχθεί ότι δεσμεύονται σε και εξουδετερώνουν BCL-2, BCL-XL, και BCL-W [14], [17], εκτοπίζοντας ΒΑΚ και ΒΑΧ και την προώθηση σχηματισμό πόρων. Ωστόσο, άλλα αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών όπως MCL-1 και Α1 δεν εξουδετερώνονται από BAD, αλλά αντ ‘αυτού δεσμεύονται και εξουδετερώθηκε με NOXA και Puma, αντίστοιχα [15], [17], [18].

Προηγουμένως, δείξαμε ότι η αυξημένη έκφραση Bad προάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του καρκίνου του προστάτη [19]. Ταυτόχρονα, BAD κατάσταση φωσφορυλίωσης παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της απόπτωσης χρησιμεύοντας ως σημείο σύγκλισης πολλών μονοπατιών αντι-αποπτωτική σηματοδότηση, περιλαμβανομένων ουσιαστικά δραστική ΡΙ3Κ [20]. BAD φωσφορυλίωση σε σερίνες 112 και 136 (με βάση την αλληλουχία ποντικού) [21], [22] διευκολύνει την αλληλεπίδραση με 14-3-3 συνοδούς, ενώ η φωσφορυλίωση στο S155 κατά την περιοχή ΒΗ3 διαταράσσει δέσμευση σε BCL-XL ή BCL-2 [23 ]. Ως αποτέλεσμα, η φωσφορυλίωση αδρανοποιεί το προ-αποπτωτική λειτουργία του BAD εμποδίζοντας την αλληλεπίδραση με Bcl-2 και Bcl-XL. Αυτά τα προηγούμενα αποτελέσματα έδειξαν ότι η αναστολή της ΡΙ3Κ και η επακόλουθη BAD αποφωσφορυλίωση θα προκαλούσε απόπτωση σε ΡΤΕΝ-αρνητικά κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Ωστόσο, βρήκαμε ότι παρά την ταχεία αποφωσφορυλίωση Bad, ΡΙ3Κ αναστολή με ZSTK474 διεγείρει απόπτωση σε C42Luc κύτταρα καρκίνου του προστάτη σε σχετικά αργά χρονικά σημεία (μεταξύ 12-24 ώρες).

Ανακαλύψαμε ότι MCL-1 έκφραση προσδίδει αντίσταση σε θεραπείες με αναστολείς PI3K και BAD αποφωσφορυλίωσης. Αντιστρόφως, ο συνδυασμός των MCL-1 απώλεια (που προκαλείται από κυκλοεξιμίδιο ή shRNA knockdown) και αποφωσφορυλίωση Bad πυροδοτεί ταχεία απόπτωση. Αυτά τα αποτελέσματα προσδιορίζουν BAD και MCL-1 όπως τα κύρια φρουροί των προ-αποπτωτικών σηματοδότηση στα ΡΤΕΝ ανεπάρκεια καρκινικά κύτταρα του προστάτη που μελετήθηκαν.

Αποτελέσματα

Ο συνδυασμός του αναστολέα ΡΙ3Κ ZSTK474 και την πρωτεΐνη αναστολέα σύνθεσης κυκλοεξιμίδιο διεγείρει ταχεία απόπτωση σε C42Luc κύτταρα καρκίνου του προστάτη

Η οδός ΡΙ3Κ σηματοδότησης συστατικώς ενεργοποιημένη σε C42Luc κύτταρα καρκίνου του προστάτη, λόγω της διαγραφής ενός αλληλόμορφου του λιπιδίου φωσφατάσης ΡΤΕΝ και μετάλλαξη μετατόπισης πλαισίου στο άλλο αλληλόμορφο [ ,,,0],24]. Ως αποτέλεσμα, αυτά τα κύτταρα καρκίνου του προστάτη δεν εξαρτώνται από ανδρογόνα ή άλλους εξωτερικούς παράγοντες επιβίωσης. Όταν η οδός PI3K αναστέλλεται από ZSTK474, τα κύτταρα C42Luc υφίστανται απόπτωση, όπως προκύπτει από τα κύτταρα με μικροσκόπιο time-lapse (Εικόνα 1Α, καρό bars) την παρακολούθηση.

Α) κύτταρα C42Luc έλαβαν θεραπεία είτε με 5 μΜ ZSTK474, 100 μg /mL κυκλοεξιμιδίου, ή ο συνδυασμός, καθώς και την απόπτωση καταγράφεται για 24 ώρες χρησιμοποιώντας μικροσκοπία time-lapse. Το αθροιστικό ποσοστό των κυττάρων που εισέρχονται απόπτωση (στρογγυλοποίηση και διόγκωση της μεμβράνης), δείχνεται σε συγκεκριμένα χρονικά σημεία σε 24 ώρες. Τουλάχιστον 100 κύτταρα μετρήθηκαν για κάθε επεξεργασία. Οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν τυπικές αποκλίσεις από το μέσο όρο των τεσσάρων τυχαίως επιλεγέντα πεδία. *,

σ

& lt? 0,05. Β) Κασπάση-3 δοκιμασία ενεργοποίησης σε κύτταρα C42Luc σε επεξεργασία με 5 μΜ ZSTK474, 100 μg /mL κυκλοεξιμιδίου, ή τον συνδυασμό. Μετά από 6 ώρες θεραπείας, τα κύτταρα λύθηκαν και η δραστικότητα της κασπάσης-3 σε κυτταρικά λύματα μετρήθηκε με ένα φθορογόνο υπόστρωμα (DEVD-AFC). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως πολλαπλάσια επαγωγή της έντασης φθορισμού κανονικοποιήθηκε ως προς τον έλεγχο (DMSO). *,

σ

& lt? 0,0001. Γ) χρώση ανοσοφθορισμού των διασπασμένη κασπάση 3 (κόκκινο) και TUNEL (πράσινο) σε κύτταρα C42Luc σε επεξεργασία με DMSO, 5 μΜ ZSTK474, 100 μg /mL κυκλοεξιμιδίου, ή ο συνδυασμός. DAPI χρησιμοποιήθηκε για να απεικονίσει πυρήνες. Κάθε σειρά πινάκων αντιπροσωπεύει το ίδιο οπτικό πεδίο. Δ) στύπωμα Western των κυττάρων C42Luc υποστεί αγωγή είτε με 5 μΜ ZSTK474, 100 μg /mL κυκλοεξιμιδίου, ή τον συνδυασμό. Λύματα ολόκληρων κυττάρων συλλέχθηκαν στους υποδεικνυόμενους χρόνους και ανιχνεύτηκαν για ρΒΑϋ (Ser112) και το συνολικό BAD.

Η

σύγκριση της δυναμικής απόπτωση σε κύτταρα C42Luc αγωγή με τον αναστολέα της ΡΙ3Κ ZSTK474 μόνο και σε συνδυασμό με τη μετάφραση αναστολέα κυκλοεξιμίδη έχει δείξει ότι ο συνδυασμός επάγει απόπτωση ταχύτερα, με σημαντικό αριθμό κυττάρων πεθαίνουν μετά από 6 ώρες. Μετά τη θεραπεία με ZSTK474 ή κυκλοεξιμίδιο μόνο, απόπτωση έγινε εμφανές μόνο σε 12 ώρες, με ένα σημαντικό αριθμό κυττάρων πεθαίνουν 24 ώρες μετά τις θεραπείες (Σχήμα 1Α). Επαγωγή της απόπτωσης με τη θεραπεία συνδυασμού επιβεβαιώθηκε με μέτρηση της δραστικότητας κασπάσης με τη φθορογόνο υπόστρωμα DEVD-AMC, η ανίχνευση της διασπώνται δραστικής μορφής της κασπάσης 3, και προσδιορισμούς TUNEL (Σχήμα 1Β, C).

προηγούμενες δημοσιεύσεις από διάφορα εργαστήρια, συμπεριλαμβανομένων δική μας, έδειξαν ότι η φωσφορυλίωση του ΒΗ3-μόνο πρωτεΐνη BAD παίζει κεντρικό ρόλο στη ρύθμιση της απόπτωσης κατάντη της οδού σηματοδότησης της ΡΙ3Κ σε διάφορες κυτταρικές σειρές, συμπεριλαμβανομένων των κυτταρικών σειρών καρκίνου του προστάτη LNCaP και C42 [20], [25] , [26]. Ωστόσο, BAD αποφωσφορυλίωση δεν διέφερε μεταξύ των κυττάρων σε επεξεργασία με ZSTK474 μόνη ή με τον συνδυασμό των ZSTK474 και κυκλοεξιμίδιο (Εικόνα 1D). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η κακή αποφωσφορυλίωση είναι είτε άσχετο ή ανεπαρκής για την ταχεία επαγωγή της απόπτωσης σε C42Luc κύτταρα καρκίνου του προστάτη.

Απώλεια MCL-1 ευαισθητοποιεί καρκινικά κύτταρα του προστάτη στην απόπτωση που επάγεται από τον αναστολέα ΡΙ3Κ ZSTK474

για να διαλευκανθεί ο μηχανισμός της ταχείας απόπτωση που προκαλείται από κυκλοεξιμίδιο σε συνδυασμό με ZSTK474, έχουμε στρέψει την προσοχή μας σε άλλες οικογένειας Bcl-2 πρωτεϊνών. Από αποφωσφορυλιωμένο BAD μπορεί να δεσμεύσει BCL-XL, BCL-2, και Bcl-W, αλλά δεν μπορούν να αλληλεπιδράσουν με MCL-1, υποθέσαμε ότι MCL-1 θα μπορούσε να είναι υπεύθυνη για την καθυστέρηση της απόπτωσης σε κύτταρα με αποφωσφορυλιωμένο BAD. Μια άλλη γραμμή του στοιχεία για να υποστηρίξει ένα ρόλο της MCL-1 στη ρύθμιση της απόπτωσης είναι σχετικά βραχεία ημιζωή της, η οποία επιτρέπει τη δυναμική ρύθμιση των επιπέδων MCL-1 από εξωκυτταρικά ερεθίσματα [27] και καθιστά MCL-1 ειδικά ευαίσθητα στην αναστολή της μετάφρασης από κυκλοεξιμίδιο

Ο καρκίνος του προστάτη κύτταρα εκφράζουν συνήθως τρία αντι-αποπτωτικών Bcl πρωτεΐνες:. BCL-XL, BCL-2, και MCL-1 [28], [29]. Ανάλυση της αντι-αποπτωτική επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης Bcl2 οικογένεια σε κύτταρα C42Luc αγωγή με προ-αποπτωτικών παραγόντων έδειξε ότι MCL-1 έκφραση μειώνεται σημαντικά σε κύτταρα κατεργασμένα με κυκλοεξιμίδιο για 6 ώρες, και σε κύτταρα που έλαβαν το συνδυασμό του ZSTK474 και κυκλοεξιμίδιο (Εικόνα 2Α). Σε αντίθεση, δεν υπάρχουν σημαντικές μειώσεις στην έκφραση Bcl-2 και Bcl-XL ανιχνεύθηκαν σε κύτταρα κατεργασμένα με ένα συνδυασμό αναστολέων. Παρόλα αυτά, αυτή η συνακόλουθη αποδείξεις αφήνει ανοιχτό το ενδεχόμενο ότι και άλλες βραχύβιες πρωτεΐνες μπορεί να συμβάλει στην αύξηση της απόπτωσης σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με ZSTK474 και κυκλοεξιμίδιο.

Α) ανάλυση Western blot των κυττάρων C42Luc αγωγή είτε με 5 μΜ ZSTK474, 100 μg /mL κυκλοεξιμιδίου, ή ο συνδυασμός για 6 ώρες. Λύματα ολόκληρων κυττάρων ανιχνεύθηκαν για MCL-1, BCL-2, και BCL-XL να συγκριθούν τα αποτελέσματα του αναστολέα πρωτεϊνικής σύνθεσης και ανιχνεύτηκαν για ρΒΑϋ (S112) και ρΑΚΤ (S473 και T308) να επαληθεύσουν τα αποτελέσματα του αναστολέα ΡΙ3Κ. Β) Ανάλυση της απόπτωσης με μικροσκοπία time-lapse. κύτταρα C42Luc διαμολύνθηκαν παροδικά με τον φορέα λεντοϊού που κωδικοποιεί GFP και MCL-1-ειδικά shRNA ή ομελέτα ελέγχου shRNA, και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 5 μΜ ZSTK474 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων σε υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία μετά τις θεραπείες προσδιορίστηκε όπως στο Σχήμα 1Α. Τουλάχιστον 100 κύτταρα μετρήθηκαν για κάθε επεξεργασία. Οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν τυπικές αποκλίσεις από το μέσο όρο των τεσσάρων τυχαίως επιλεγέντα πεδία. *,

σ

& lt? 0.005? #,

σ

& lt? 0.001 ένθετο δείχνει κηλίδα Western του ενδογενούς MCL-1 και τα επίπεδα της β-ακτίνης (έλεγχος φόρτωσης) σε κύτταρα C42Luc 48 ώρες μετά τη μόλυνση με φορέα λεντοϊού που εκφράζουν MCL-1 ειδικό ή ομελέτα shRNA. Γ) δοκιμασία Η ενεργοποίηση της κασπάσης-3 των κυττάρων C42Luc επιμολυσμένα με shRNA στόχευση MCL-1 ή ομελέτα έλεγχο shRNA. Η ενεργοποίηση της κασπάσης μετρήθηκε 6 ώρες μετά τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με είτε DMSO ή 5 μΜ ZSTK474. Θεραπείες προστέθηκαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. *,

σ

& lt? 0,01? **

σ

& lt? 0,05. Δ) Ανάλυση της απόπτωσης με μικροσκοπία time-lapse σε κύτταρα C42Luc επιμολυσμένα με MCL-1-ειδικό shRNA (ριγέ μπαρ) ή ομελέτα shRNA (καρό μπάρες) και δοξυκυκλίνη επαγόμενο Flag-MCL-1. Το αθροιστικό ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων σε υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία προσδιορίστηκε όπως στο Σχήμα 1Α 24 ώρες μετά τη θεραπεία με δοξυκυκλίνη. Τουλάχιστον 100 κύτταρα μετρήθηκαν για κάθε επεξεργασία. Οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν τυπικές αποκλίσεις από το μέσο όρο των τεσσάρων τυχαίως επιλεγέντα πεδία. *,

σ

& lt? 0,01 #,

σ

& lt? 0,05. Ένθετο δείχνει στύπωμα Western Flag-tagged MCL-1 ανοσοκαταβυθίστηκε με ρητίνη αντι-FLAG και ανιχνεύτηκαν για MCL-1 έκφρασης.

Η

Για να εξεταστεί άμεσα το ρόλο του MCL-1 ως το κύριο μεσολαβητής του cycloheximide- επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα C42Luc, έχουμε μειωμένη έκφραση πρωτεΐνης MCL-1 χρησιμοποιώντας shRNA knockdown. Ανάλυση της απόπτωσης με δοκιμασία κασπάσης και μικροσκοπία time-lapse σε κύτταρα μολυσμένα με ένα φορέα λεντοϊού που εκφράζει είτε MCL1-ειδικό shRNA ή ομελέτα ελέγχου shRNA έδειξε ότι ZSTK474 επαγόμενη απόπτωση πιο αποτελεσματικά σε κύτταρα με knockdown του MCL-1 (Σχήμα 2Β, C) . Αντιστρόφως, έκτοπη έκφραση ενός δοξυκυκλίνης-επαγώγιμο Flag-MCL-1 κατασκεύασμα μειωμένη απόπτωση σε κύτταρα επιμολυσμένα με MCL-1 shRNA σε συγκρίσιμα επίπεδα με εκείνα που σε κύτταρα επιμολυσμένα με περιπλεγμένο shRNA (Σχήμα 2D). Αυξημένη απόπτωση παρατηρήθηκε επίσης σε κύτταρα που υπέστησαν κατεργασία ZSTK474 στα οποία MCL-1 έκφραση χτυπήθηκε κάτω χρησιμοποιώντας ένα δεύτερο MCL-1-ειδικά κατασκεύασμα shRNA που στοχεύουν 3′-UTR (Σχήμα S1). Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματα αυτών των πειραμάτων δείχνουν ότι MCL-1 απώλεια συνεισφέρει στην κυκλοεξιμίδη επαγόμενη ευαισθητοποίηση στην απόπτωση που επάγεται από ZSTK474.

BIM εμπλέκεται στη ρύθμιση απόπτωσης σε κύτταρα C42Luc

BIM και NOXA , ΒΗ3-μόνο πρωτεΐνες της οικογένειας Bcl2, έχουν ταυτοποιηθεί ως συνεταίροι δέσμευσης του MCL-1. NOXA δεσμεύεται κυρίως στην MCL1, ενώ BIM μπορούν επίσης να δεσμεύουν άλλα αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών της οικογένειας Bcl2, καθώς δεσμεύονται σε και ενεργοποιούν ΒΑΧ [15], [30]. NOXA, αλλά όχι ΒΙΜ, φέρεται εμπλέκεται στο σύμπλοκο πρωτεΐνης που στοχεύει MCL-1 για την αποικοδόμηση [31]. Πράγματι, σε κύτταρα C42Luc σε επεξεργασία με κυκλοεξιμίδιο, NOXA αποικοδομήθηκε ενώ BIM έκφραση παρέμεινε σταθερή (Σχ. 3Α). Έτσι, επικεντρώθηκε στην ανάλυση των BIM. Συνεπής με προηγούμενες εκθέσεις, BIM ανιχνεύθηκε σε ανοσοϊζήματα με χάντρες σημαία από κύτταρα C42Luc που εκφράζουν FLAG-MCL-1 (Σχ. 3Β). Για να ελεγχθεί αν BIM εμπλέκεται στην επαγωγή απόπτωσης με το συνδυασμό του κυκλοεξιμίδιο και ZSTK474, χρησιμοποιήσαμε δύο ΒΙΜ-ειδικό Τα siRNAs να χτυπήσει κάτω την έκφραση του ενδογενούς πρωτεΐνης BIM. Σημαντική μείωση της δραστηριότητας κασπάσης, καθώς και μειωμένη απόπτωση στα δύο κύτταρα C42Luc-shBIM1 και C42Luc-shBIM2 σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου C42Luc, ανιχνεύθηκε μετά από θεραπείες με κυκλοεξιμίδιο και ZSTK474 (Σχ. 3C, D), επιβεβαιώνοντας το ρόλο του BIM στην απόπτωση κυττάρων C42Luc. Επιπλέον, η μειωμένη απόπτωση παρατηρήθηκε σε αμφότερα C42Luc-shBIM1 και τα κύτταρα C42Luc-shBIM2 σύγκριση με κύτταρα C42Luc επιμολυσμένα με ένα κατασκεύασμα που εξέφραζε MCL-1-ειδικά shRNA, υποδεικνύοντας ότι BIM εμπλέκεται στην έναρξη απόπτωσης «κατάντη» του MCL-1 απώλεια.

Α) έκφραση NOXA μειώνεται σε κύτταρα C42Luc αγωγή με το συνδυασμό των ZSTK474 και κυκλοεξιμίδιο. Η ανάλυση στυπώματος Western των MCL-1, NOXA, ΒΙΜ και β-ακτίνης (έλεγχος φορτίσεως) σε κύτταρα σε αγωγή για 4 και 6 ώρες με κυκλοεξιμίδιο. Β) Συν-ανοσοκαταβύθιση MCL-1 και ΒΙΜ από κύτταρα που εξέφραζαν δοξυκυκλίνη επαγόμενο FLAG-MCL-1. Γ) Η απόπτωση σε κύτταρα που εκφράζουν C42Luc δύο ΒΙΜ-ειδικό shRNA και σε γονικά κύτταρα εκτιμήθηκε με μικροσκοπία χρόνο παρέλευσης. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με όχημα ((-) DMSO) ή συνδυασμό κυκλοεξιμιδίου και ZSTK474 (+). Ποσό της απόπτωσης (%) προσδιορίστηκε όπως στο Σχήμα 1Α. Τουλάχιστον 100 κύτταρα μετρήθηκαν για κάθε επεξεργασία. Οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν τυπικές αποκλίσεις από το μέσο όρο των τεσσάρων τυχαίως επιλεγέντα πεδία. Τα δεδομένα για 6 ώρες μετά τη θεραπεία παρουσιάζονται. Οι διαφορές στο% απόπτωση των κυττάρων ελέγχου (που εκφράζουν ομελέτα shRNA) και τα κύτταρα C42Luc BIM1 ή C42Luc BIM2 ήταν στατιστικά σημαντική (p & lt? 0,05 και p & lt? 0,0001, αντίστοιχα). Τοποθετήστε δείχνει μειωμένη έκφραση BIM σε κύτταρα που σταθερώς εξέφρασαν ΒΙΜ-ειδικό shRNA. Δ) Η απόπτωση σε κύτταρα που εκφράζουν C42Luc ένα από τα δύο ΒΙΜ-ειδικό shRNA ή φορέα ελέγχου εκτιμήθηκε με μέτρηση της δραστικότητας κασπάσης. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή για 6 ώρες με όχημα ((-) DMSO) ή τον συνδυασμό του κυκλοεξιμιδίου και ZSTK474 (+). Οι διαφορές στην δραστηριότητα της κασπάσης μεταξύ των κυττάρων ελέγχου και κυττάρων C42Luc BIM1 ή C42Luc BIM2 ήταν στατιστικά σημαντική (ρ = 0,002 και ρ = 0,05, αντίστοιχα). κύτταρα Ε) C42Luc ή κύτταρα C42LucBIM2 που εκφράζουν σταθερά ΒΙΜ-στόχευση shRNA είχαν επιμολυνθεί με φορέα λεντοϊού που εκφράζουν GFP και είτε ομελέτα (SCR) ή MCL-1-ειδικό shRNA2. Ποσοστό απόπτωσης σε GFP-θετικά κύτταρα προσδιορίστηκε με μικροσκοπία time-lapse. Τουλάχιστον 100 κύτταρα μετρήθηκαν για κάθε επεξεργασία. Οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν το μέσο όρο και το τυπικό σφάλμα των τεσσάρων οπτικών πεδίων. Ποιοτικά παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε κύτταρα C42LucBIM1. Βήτα ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης στο (Α) και (C).

Η

αποφωσφορυλίωση Bad είναι υπεύθυνη για την ταχεία απόπτωση που διεγείρεται από τον αναστολέα ΡΙ3Κ ZSTK474 συν κυκλοεξιμίδιο

Νωρίτερα, αποδείξαμε ότι η θεραπεία με έναν αναστολέα της ΡΙ3Κ πυροδοτεί την αποφωσφορυλίωση Bad σε S112 και S136? χρησιμοποιήσαμε επίσης shRNA knockdown να αποδείξουν ότι BAD είναι απαραίτητη για την επαγωγή απόπτωσης από τους αναστολείς ΡΙ3Κ σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη [20]. Παρόλα αυτά, αρκετές στόχους της PI3K σηματοδότησης εκτός από BAD είχαν εμπλακεί στην αναστολή της απόπτωσης [32]. Για να καθοριστεί εάν αποφωσφορυλίωση Bad είναι επαρκής για να επάγει την ταχεία απόπτωση σε παρουσία κυκλοεξιμίδιο, κύτταρα C42Luc επιμολύνθηκαν με ένα μεταλλαγμένο BAD φωσφορυλίωσης με ανεπάρκεια δοξυκυκλίνη επαγόμενο, όπου Ser112 και Ser136 υποκαταστάθηκαν για αλανίνες (BAD2SA). Κατά κυκλοεξιμίδιο θεραπεία, κύτταρα μετεμβολιασμένα με BAD2SA έδειξαν σημαντικά αυξημένη απόπτωση συγκριτικά με κύτταρα επιμολυσμένα με άγριου τύπου BAD (WT-BAD) (Σχήμα 4Α και Β). Συνεπής με κεντρικό ρόλο του BAD στη ρύθμιση απόπτωσης, η θεραπεία των κυττάρων του προστάτη με ένα κακό-μιμητικό ΑΒΤ-737 (με βάση την περιοχή ΒΗ3 των BAD) επάγεται αυξημένη απόπτωση όταν συνδυάζεται με κυκλοεξιμίδιο, παρόμοιο με το συνδυασμό του κυκλοεξιμιδίου με τον αναστολέα ΡΙ3Κ ZSTK474 (Σχήμα 4C).

Α) Η ενεργοποίηση της κασπάσης 3 σε κύτταρα C42Luc και C42LucBAD2SA που εξέφρασαν φωσφορυλίωση ανεπάρκεια BAD μεταλλαγμένο. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 μg /mL κυκλοεξιμιδίου επί 6 ώρες πριν από τη δοκιμασία. *,

σ

& lt? 0,01. Β) Ανάλυση της απόπτωσης με μικροσκοπία time-lapse. κύτταρα C42Luc επιμολύνθηκαν παροδικά με δοξυκυκλίνη επαγώγιμο HA-BAD2SA ή άγριου τύπου ΗΑ-BAD, και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με δοξυκυκλίνη (Dox) 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Μετά από 18 ώρες θεραπείας Dox, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 μg /mL κυκλοεξιμιδίου, και το αθροιστικό ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων προσδιορίστηκε με μικροσκοπία χρόνο παρέλευσης. Τουλάχιστον 100 κύτταρα μετρήθηκαν για κάθε επεξεργασία. Οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν τυπικές αποκλίσεις από το μέσο όρο των τεσσάρων τυχαίως επιλεγέντα πεδία. *,

σ

& lt? 0,01 #,

σ

& lt? 0,03. Ένθετο δείχνει ανάλυση Western blot φωσφορυλιωμένων BAD (pBAD112) και η συνολική BAD έκφραση σε κύτταρα C42Luc συλλέγονται 18 ώρες μετά τη θεραπεία Dox. Χαμηλότερες ζώνες αντιστοιχούν σε ενδογενή πρωτεΐνη, ενώ οι άνω λωρίδες αντιστοιχούν σε εκφράζεται επαγόμενα HA-BAD κατασκευάσματα. C) κύτταρα C42Luc υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 μg /ml κυκλοεξιμιδίου, σε συνδυασμό με 10 μΜ ΑΒΤ-737, ένα μιμητικό ΒΗ3 βασίζεται στην επικράτεια ΒΗ των κακών ή ZSTK474. Η απόπτωση αναλύθηκε με μικροσκοπία time-lapse. Σωρευτική κυτταρικό θάνατο σε υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία εμφανίζεται. Τουλάχιστον 100 κύτταρα μετρήθηκαν για κάθε επεξεργασία. Οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν τυπικές αποκλίσεις από το μέσο όρο των τεσσάρων τυχαίως επιλεγέντα πεδία. *,

σ

& lt? 0,01 **,

σ

& lt? 0,05 #,

σ

& lt? 0.001 ##,

σ

& lt? 0.002 .

Η

Ταυτόχρονη αποφωσφορυλίωση Bad και MCL-1 ήττα είναι αρκετή για να προκαλέσει ταχεία απόπτωση σε κύτταρα C42

για να επιβεβαιωθεί ότι η κακή αποφωσφορυλίωσης και MCL-1 ήττα είναι αρκετή για να προκαλέσει ταχεία απόπτωση, κύτταρα C42Luc συν-επιμολυσμένα με BAD2SA και MCL-1shRNA, και την απόπτωση αξιολογήθηκε με μικροσκοπία time-lapse. Κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με BAD2SA και MCL-1 shRNA έδειξαν σημαντικά περισσότερο απόπτωσης σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με το συνδυασμό του WT-BAD και MCL-1 shRNA ή BAD2SA και κωδικοποιημένο shRNA (Σχήμα 5). Τα αποτελέσματα αυτά προσδιορίζουν BAD και MCL-1 ως βασικοί παράγοντες στη ρύθμιση της απόπτωσης σε C42Luc καρκινικά κύτταρα του προστάτη.

κύτταρα C42Luc ήταν συν-επιμολυσμένα με είτε MCL-1-ειδικό shRNA ή ομελέτα shRNA σε συνδυασμό είτε με τη BAD2SA ή WT-BAD κατασκεύασμα. 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, η απόπτωση αναλύθηκε με μικροσκοπία time-lapse. Τουλάχιστον 100 κύτταρα μετρήθηκαν για κάθε επεξεργασία. Οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν τυπικές αποκλίσεις από το μέσο όρο των τεσσάρων τυχαίως επιλεγέντα πεδία. *,

σ

& lt? 0,05 **,

σ

& lt? 0,005 ***,

σ

& lt?. 0.001

Η

Για να αντιμετωπιστεί η γενικότητα της επαγωγής απόπτωσης με το συνδυασμό του κυκλοεξιμιδίου και ZSTK474 σε καρκινικά κύτταρα προστάτη, αξιολογήσαμε την απόπτωση σε WFU3, PC3 και DU145 κύτταρα με time-lapse μικροσκοπία και κασπάσης-3 φθορομετρικές δοκιμασίες. PTEN

– /- WFU3 προστάτη του ποντικιού επιθηλιακά κύτταρα έδειξε επαγωγή της απόπτωσης συγκρίσιμη με κύτταρα C42Luc (Εικόνα S2). Σε αντίθεση, η διέγερση απόπτωσης σε PC3 και DU145 κύτταρα με συνδυασμό κυκλοεξιμίδιο και ZSTK474 ήταν σημαντικά μικρότερη σε σύγκριση με τα κύτταρα C42Luc (σύγκρινε Σχήματα 1Α και 6C), παρά την αποφωσφορυλίωση των BAD και απώλεια MCL-1 έκφραση σε επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 6Α, Β, C). Ωστόσο, όταν αυτές οι κυτταρικές σειρές συν-επιμολύνθηκαν με φορείς έκφρασης που κωδικοποιούν MCL-1 shRNA και BAD2SA με μεταλλαγμένες θέσεις φωσφορυλίωσης, σημαντική διέγερση απόπτωσης παρατηρήθηκε σε όλες τις κυτταρικές σειρές (Σχήμα 6D, Εικόνα 5). Αυτό το αποτέλεσμα μας οδήγησε να υποθέσουμε ότι διαφορετική ευαισθησία στην απόπτωση σε κυτταρικές γραμμές μπορεί να εξαρτάται από προφίλ έκφρασης της οικογένειας Bcl2 σε αυτά τα κύτταρα.

Α) Η θεραπεία με συνδυασμό κυκλοεξιμίδιο και ZSTK474 ενεργοποιεί MCL-1 απώλεια σε PC3, C42Luc , και τα κύτταρα DU145, καθώς και την αποφωσφορυλίωση Bad στην ΡΤΕΝ ανεπάρκεια PC3 και τα κύτταρα C42Luc. Κυτταρολύματα παρασκευάστηκε 6 ώρες μετά τις θεραπείες ανιχνεύθηκαν για pS112BAD, σύνολο BAD, και MCL-1, χρησιμοποιώντας β-ακτίνης ως ένας έλεγχος φόρτωσης. Απόπτωση σε C42Luc, PC3 και DU145 κύτταρα αξιολογήθηκε με (β) μέτρηση της κασπάσης 3 δραστηριότητα με φθορογόνο υπόστρωμα ή (C) από το χρόνο μικροσκοπία μεσολάβηση. Τουλάχιστον 100 κύτταρα μετρήθηκαν για κάθε επεξεργασία. Οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν τυπικές αποκλίσεις από το μέσο όρο των τεσσάρων τυχαίως επιλεγέντα πεδία. Δ) εξόντωση MCL-1 και η έκτοπη έκφραση της φωσφορυλίωσης με ανεπάρκεια BAD ήταν επαρκή για να επάγει απόπτωση σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. PC3 ή DU145 κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με MCL-1-ειδικά shRNA ή κωδικοποιημένα ελέγχου shRNA σε συνδυασμό είτε με ένα κατασκεύασμα έκφρασης BAD2SA ή WT-BAD. 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, η απόπτωση αναλύθηκε με μικροσκοπία time-lapse. Τουλάχιστον 100 κύτταρα μετρήθηκαν για κάθε επεξεργασία. Οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν τυπικές αποκλίσεις από το μέσο όρο των τεσσάρων τυχαίως επιλεγέντα πεδία.

Η

Πράγματι, έχει αναφερθεί στο παρελθόν ότι τα κύτταρα PC3 εκφράζουν υψηλότερα επίπεδα BCL-XL, ενώ τα κύτταρα DU145 εμφανίζουν μειωμένη έκφραση του ΒΑΧ ( Σχ. 7Α) [33], [34]. Εφόσον έχει αποδειχθεί ότι η εξουδετέρωση του BCL-XL ευαισθητοποιεί κύτταρα σε απόπτωση [35], εστιάσαμε στην δοκιμή του ρόλου της έκφρασης ΒΑΧ σε αποπτωτική απόκριση των κυττάρων DU145. κύτταρα DU145 διαμολύνθηκαν με φορείς GFP-ΒΑΧ ή την έκφραση GFP, και απόπτωση σε GFP-θετικά κύτταρα ακολουθήθηκε από μικροσκοπία time-lapse. κύτταρα DU145 επιμολυσμένα με GFP-ΒΑΧ έδειξαν αυξημένη απόπτωση όταν έλαβαν θεραπεία με τον συνδυασμό ZSTK474 και κυκλοεξιμίδιο. Έτσι, η έκφραση ΒΑΧ αποκαθιστά την ευαισθησία του καρκίνου του προστάτη DU145 κύτταρα σε απόπτωση που επάγεται από θεραπείες συνδυασμού (Σχήμα 7).

Α) Ανάλυση Western blot της έκφρασης ΒΑΧ σε PC3, C42Luc, και τα κύτταρα DU145. Κυτταρολύματα παρασκευάστηκε 6 ώρες μετά κατεργασίες ανιχνεύθηκαν με αντισώματα έναντι ΒΑΧ και β-ακτίνης. Β) Ανάλυση στυπώματος Western των κυττάρων επιμολυσμένων με πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP) ή GFP-ΒΑΧ χίμαιρα. Γ) έκφραση του GFP-ΒΑΧ επιταχύνει απόπτωση σε κύτταρα DU145. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με GFP ή GFP-ΒΑΧ και απόπτωση αναλύθηκε με μικροσκοπία time-lapse. Τουλάχιστον 100 κύτταρα μετρήθηκαν για κάθε επεξεργασία. Οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν τυπικές αποκλίσεις από το μέσο όρο των τεσσάρων τυχαία επιλεγμένους τομείς.

Η

Συζήτηση

μηχανιστική κατανόηση της επαγωγής της απόπτωσης είναι αναγκαία για τη βελτίωση της αποτελεσματικότητας της PI3K αναστολείς

Δυσλειτουργία της οδού ΡΙ3Κ έχει καλώς τεκμηριωθεί σε μια ποικιλία τύπων καρκίνου, με περίπου 40% μεταβάλλεται ΡΙ3Κ σηματοδότησης σε θέσεις πρωτογενούς όγκου του προστάτη [36], [37] και 100% αλλοιωμένη σηματοδότηση σε μεταστατικές θέσεις [38]. Στον καρκίνο του προστάτη, οι πρωτογενείς μηχανισμούς ΡΙ3Κ απορύθμιση είναι η απώλεια της λειτουργίας του ΡΤΕΝ μέσω ομόζυγη εξαλείψεις, η απώλεια της ετεροζυγωτίας, ή αδρανοποίησης μεταλλάξεων, οδηγεί στην συστατική ενεργοποίηση της ΡΙ3Κ /Akt σηματοδότηση. Η λειτουργική απώλεια του PTEN συνδέεται με την προηγμένη εξέλιξη του καρκίνου, υψηλής ποιότητας Gleason, και τη συνολική κακή πρόγνωση, υπογραμμίζοντας την ανάγκη για χημειοθεραπευτικούς επιλογές για όγκους με ενεργό PI3K /Akt σηματοδότηση [39] – [41].

Αρκετές αναστολείς μικρού μορίου της οδού ΡΙ3Κ, συμπεριλαμβανομένων των αναστολέων της παν-ΡΙ3Κ ZSTK474 (Zenyaku Kogyo Co) και BKM120 (Novartis), και το BEZ235 αναστολέας διττής ΡΙ3Κ /mTOR (Novartis) έχουν ήδη εισέλθει κλινικές δοκιμές πρώιμης φάσης για τη θεραπεία των στερεών κακοηθειών , συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη [42] – [44]. Ωστόσο, νωρίτερα μελέτες δεν αναφέρουν σημαντικές βελτιώσεις στην κλινική έκβαση [45], [46].

Μια καλύτερη κατανόηση των μηχανισμών αντίστασης των καρκινικών κυττάρων στην αναστολή PI3K είναι απαραίτητη για να επιλέξετε τη βέλτιστη θεραπευτικές αγωγές για όγκους με ενεργή PI3K σηματοδότησης. Συγκεκριμένα, πληροφορίες για πρωτεΐνες που ελέγχουν απόπτωση σε ΡΤΕΝ ανεπάρκεια καρκίνου του προστάτη κύτταρα θα καθοδηγήσουν την επιλογή των παραγόντων για να αυξήσει την ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων του προστάτη σε απόπτωση.

BAD και MCL-1 είναι κρίσιμα απόπτωση ρυθμιστικών μορίων σε προστάτη καρκινικά κύτταρα

προηγούμενη εργασία μας περιγράφεται ένα δίκτυο σηματοδότησης συγκλινουσών μονοπατιών σηματοδότησης που ελέγχουν BAD φωσφορυλίωση και, συνεπώς, η απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη [20]. Δείξαμε επίσης ότι η κακή νοκ ντάουν κάνει PTEN ανεπάρκεια καρκίνου του προστάτη LNCaP κύτταρα ευαίσθητα στην απόπτωση που προκαλείται από τους αναστολείς PI3K. Αυτά τα προηγούμενα δεδομένα, σε συνδυασμό με τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται εδώ δείχνουν αυξημένη απόπτωση σε κύτταρα που εκφράζουν φωσφορυλίωση ανεπάρκεια μεταλλαγμένο BAD2SA, δείχνουν ότι η κακή είναι ένας κρίσιμος ρυθμιστής της απόπτωσης στόχο σηματοδότησης ΡΙ3Κ. Έτσι, η φωσφορυλίωση BAD εμφανίζεται να είναι ένα χρήσιμο βιοδείκτη για να προβλεφθεί η αποτελεσματικότητα κατά του όγκου των αναστολέων ΡΙ3Κ. Ανάλυση των BAD φωσφορυλίωσης είναι ιδιαίτερα σημαντικό δεδομένου ότι άλλα μονοπάτια σηματοδότησης ενεργοποιούνται από κινάσες τυροσίνης υποδοχέα και G-πρωτεΐνη υποδοχείς μπορεί να φωσφορυλιώσει κακό, ακόμη και όταν η οδός ΡΙ3Κ είναι ανενεργός. Έτσι, παρά Akt αποφωσφορυλίωση (χρησιμοποιούνται συνήθως ως δείκτης της δραστικότητας της οδού ΡΙ3Κ), τα κύτταρα μπορεί να μην υφίστανται απόπτωση εάν BAD φωσφορυλιώνεται από άλλες οδούς σηματοδότησης.

Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι BAD αποφωσφορυλίωση από μόνη της είναι ανεπαρκής για να προκαλέσει ταχεία απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα προστάτη. Ανάλυση των μηχανισμών ταχείας απόπτωση που προκαλείται από το συνδυασμό των αναστολέων ΡΙ3Κ και αναστολείς μετάφρασης που προσδιορίζονται MCL-1 ως κρίσιμη απόπτωση-ρυθμιστικό μόριο. Η έκφρασή του, όταν μειώθηκε, συνεργάζεται με BAD στην επαγωγή της απόπτωσης. Τόσο BAD και MCL-1 εκφράζονται παντού σε όγκους του προστάτη [28] και μπορεί να ρυθμίζεται δυναμικά δια φωσφορυλιώσεως [20] (στην περίπτωση των BAD) και αμφότερα φωσφορυλίωση και ubiquitylation (στην περίπτωση του MCL-1) [47].

η υπερέκφραση του MCL-1 έχει συσχετιστεί με προχωρημένο καρκίνο του προστάτη, συμπεριλαμβανομένης υψηλής ποιότητας Gleason πρωτογενείς όγκους και μεταστατικούς όγκους, και αιματοποιητικές κακοήθειες [28], [48]. MCL-1 έχει χαρακτηριστεί ως κρίσιμο ρυθμιστή της επιβίωσης των κυττάρων, και υπόκειται σε πολλαπλά επίπεδα ρύθμισης. Μεταγραφικά, τα επίπεδα MCL-1 mRNA που προκαλείται γρήγορα από έναν αριθμό οδών μεταγωγής σήματος, συμπεριλαμβανομένων των οδών ΜΑΡ /ΕΡΚ, ΡΙ3Κ /Akt, και JAK /STAT, με ανώμαλη ενεργοποίηση σε μια ποικιλία κακοηθειών [49]. MCL-1 mRNA επίσης ρυθμίζεται στενά από mir29 b [50]. MCL-1 πρωτεΐνη έχει ένα υψηλό ποσοστό του κύκλου εργασιών μέσω της υποβάθμισης της πρωτεΐνης ουβικιτίνης-εξαρτώμενη από το πρωτεόσωμα 26 S. Σε υγιή κύτταρα, η περιοχή ΒΗ3 του MULE Ε3 λιγάση δεσμεύεται με το υδρόφοβο αυλάκι του MCL-1 ειδικά και εκτοπίζει την αλληλεπίδρασή της με ΒΑΚ και ΒΗ3-μόνο φρουροί [51]. MCL-1 φωσφορυλιώνεται από την κινάση συνθάση γλυκογόνου-3β (ΟδΚ3β) σε στρεσαρισμένα κύτταρα όπου η ΡΙ3Κ /Akt μονοπάτι είναι ανενεργό, και γεμάτοι για ουβικιτινίωση από το Ε3 λιγάση β-TrCP [27], [47]. Το υψηλό ποσοστό του κύκλου εργασιών της MCL-1 επιτρέπει τη δυναμική ρύθμιση της MCL-1 έκφραση στα επίπεδα της μεταγραφής, μετάφρασης, και την υποβάθμιση. Αυτά τα πολλαπλά επίπεδα ρύθμισης τονίζουν το ρόλο του MCL-1 ως κρίσιμος ρυθμιστής της απόπτωσης και ελκυστικός θεραπευτικός στόχος, καθώς επίσης και μια πιθανή βιοδείκτη.

Νωρίτερα, MCL-1 εμπλέκεται σε αντι-αποπτωτική σηματοδότηση από IL-