Αφηρημένο

ορθοτοπική ξενομοσχεύματα καρκίνου της ουροδόχου κύστης είναι απαραίτητη για τη δοκιμή νέων θεραπειών και επεμβάσεων σε κυτταρικές σειρές

στο vivo

. Τρέχουσες ξενομοσχεύματα βασίζονται σε ενοφθαλμισμό των νεοπλασματικών κυττάρων από ενδοκυστική ενστάλαξη ή άμεση ένεση στο τοίχωμα της ουροδόχου κύστης. Ενστάλαξης περιορίζεται από την έλλειψη κυτταρικών γραμμών που είναι ογκογονικά όταν παραδίδονται με αυτόν τον τρόπο. Η επεμβατική μοντέλο προκαλεί νοσηρότητα επί των ποντικών από την ανάγκη για λαπαροτομία και κινητοποίηση της ουροδόχου κύστης. Επιπλέον, η διαδικασία είναι πολύπλοκη και χρονοβόρα. Τρεις κύστης καρκινικές κυτταρικές σειρές (UM-UC1, UM-UC3, UM-UC13) εμβολιάστηκαν σε 50 αθυμικά γυμνά ποντίκια με διαδερμική έγχυση υπό υπερηχογραφική καθοδήγηση. PBS για πρώτη φορά με ένεση μεταξύ των μυών τοιχώματος και του βλεννογόνου να διαχωριστούν αυτά τα στρώματα, και τα καρκινικά κύτταρα στη συνέχεια εγχέονται σε αυτό το χώρο. Η βιοφωταύγεια και υπερηχογράφημα χρησιμοποιήθηκαν για την παρακολούθηση της ανάπτυξης του όγκου. Αυξημένης αντίθεσης υπέρηχη χρησιμοποιήθηκε για τη μελέτη αλλαγές στην αιμάτωση του όγκου μετά από συστημική θεραπεία γεμσιταβίνης /σισπλατίνης. Για να καταδειχθεί η απόδειξη της αρχής ότι θεραπευτικοί παράγοντες μπορούν να εγχυθούν σε εγκατεστημένων ξενομοσχευμάτων υπό υπερηχογραφική καθοδήγηση, ογκολυτική ιού (VSV) εγχύθηκε σε όγκους UM-UC3. Ξενομοσχεύματος ιστός συλλέχθηκε για ανοσοϊστοχημεία μετά 23-37 ημέρες. Διαδερμική έγχυση των κυττάρων του όγκου εντός του τοιχώματος της ουροδόχου κύστης πραγματοποιήθηκε αποτελεσματικά (μέσος χρόνος: 5.7 λεπτά) και χωρίς επιπλοκές σε όλα τα 50 ζώα. Υπέρηχοι και βιοφωταύγεια επιβεβαιώθηκε η παρουσία του όγκου στο πρόσθιο τοίχωμα της ουροδόχου κύστης σε όλα τα ζώα 3 ημέρες αργότερα. Οι μέσες όγκοι του όγκου αυξήθηκε σταθερά κατά τη διάρκεια της περιόδου της μελέτης. UM-UC13 όγκων έδειξε αξιοσημείωτη μείωση του όγκου και αιμάτωσης μετά τη χημειοθεραπεία. Η ανοσοϊστοχημική χρώση για VSV-G καταδεικνύεται η πρόσληψη του ιού σε όλους τους όγκους UM-UC3 μετά εντός του όγκου ένεση. Έχουμε αναπτύξει μια νέα μέθοδο για τη δημιουργία ορθοτοπική ξενομοσχεύματος καρκίνου της ουροδόχου κύστης σε ένα ελάχιστα επεμβατικές τρόπο. Στα χέρια μας αυτό έχει αντικαταστήσει το παραδοσιακό μοντέλο απαιτεί λαπαροτομία, διότι το μοντέλο αυτό είναι περισσότερο χρόνο αποτελεσματική, πιο ακριβή και συνδέεται με μικρότερη νοσηρότητα για τα ποντίκια

Παράθεση:. Jäger W, Moskalev Ι, Janssen C, Hayashi Τ , Awrey S, Gust KM, et al. (2013) Υπερηχογράφημα-Καθοδηγούμενη Τειχών Εμβολιασμός των ορθοτοπική καρκίνο της ουροδόχου κύστης Ξενομοσχεύματα: Μια Προσέγγιση μυθιστόρημα υψηλής ακρίβειας. PLoS ONE 8 (3): e59536. doi: 10.1371 /journal.pone.0059536

Επιμέλεια: Xiaolin Zi, του Πανεπιστημίου της Καλιφόρνια Irvine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 7 Ιαν του 2013? Αποδεκτές: 15 Φλεβάρη 2013? Δημοσιεύθηκε: 26, Μαρτίου του 2013

Copyright: © 2013 Jäger et al. . Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση: Επιχορήγηση χρηματοδότηση παρασχέθηκε μέσω DFG (WJ? www.dfg.de/en? JA 2117 /1-1:1), το καναδικό Αντικαρκινική Εταιρεία Research Institute (PCB? www.cancer.ca/Research.aspx? 2010 – 700.527) και ένα Mentored Ιατρός Επιστήμονας Βραβείο από το Βανκούβερ Παράκτια Ινστιτούτου Ερευνών Υγείας (PCB? https://www.vch.ca/about_us/awards_ _recognition? F08-04967). Η πλατφόρμα απεικόνισης υπερήχων χρηματοδοτήθηκε από το Ίδρυμα καναδική Καινοτομίας (PCB? Www.innovation.ca? 27.255). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνου της ουροδόχου κύστης είναι η τέταρτη πιο κοινή μορφή καρκίνου στους άνδρες και η ένατη πιο κοινή μορφή καρκίνου στις γυναίκες στις αναπτυγμένες χώρες [1]. Το 2010 υπήρχαν 70.530 νέες περιπτώσεις και 14.680 θάνατοι από καρκίνο της ουροδόχου κύστης στις ΗΠΑ [2]. Περίπου τα τρία τέταρτα των περιπτώσεων είναι μη επεμβατική μυών [3]. Αυτά έχουν μια υψηλή ροπή για υποτροπή και ένα υποσύνολο είναι σε κίνδυνο για εξέλιξη σε διεισδυτική νόσο [4]. Το υπόλοιπο ένα τέταρτο των περιπτώσεων υπάρχει σαν τον καρκίνο των μυών της εισβολής της ουροδόχου κύστης. Παρά τη βέλτιστη πολυτροπικών θεραπεία, περίπου το ήμισυ των ασθενών με μυϊκή διηθητικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης θα υποκύψει στην ασθένεια τους [5]. Δεν έχουν σημαντικές ανακαλύψεις έχουν γίνει κατά τις τελευταίες δύο δεκαετίες για να ενισχυθεί η συστηματική θεραπεία αυτού του πληθυσμού ασθενών [6].

Μοντέλα ποντικών ανθρώπινου καρκίνου χρησιμοποιώντας κυτταρικές σειρές που προέρχονται από όγκους των ασθενών (ξενομοσχεύματα) είναι ένα απαραίτητο εργαλείο για την έρευνα για τον καρκίνο. Θα μας επιτρέψει να ανακρίνουν βιολογία του όγκου με το μοριακό χειραγώγηση, για τον εντοπισμό σχετικών διαγνωστικών και προγνωστική βιολογικών δεικτών, και να δοκιμάσει αντινεοπλασματική επιπτώσεις των νέων θεραπειών. Για τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης, εμβολιασμό ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές μέσα στην ουροδόχο κύστη του ποντικού (ορθοτοπική ξενομόσχευμα) είναι το πρότυπο αναφοράς [7], [8]. Αυτό εμβολιασμός μπορεί να επιτευχθεί είτε με ενδοκυστική ενστάλαξη των κυττάρων του όγκου ( «ενδοκυστική μοντέλο») [9] ή άμεση ένεση στο τοίχωμα της ουροδόχου κύστης ( «εντός των τειχών μοντέλο») [10]. Εναλλακτικές μοντέλα περιλαμβάνουν τον ενοφθαλμισμό του ποντικού κύτταρα καρκίνου της ουροδόχου κύστης σε ανοσοεπαρκείς ποντικούς (συγγενικό μοντέλο) [11], καθώς και διαγονιδιακά μοντέλα [12]. Παρόμοια μοντέλα είναι επίσης δυνατή σε αρουραίους [13], [14].

Κάθε Orthoptic μοντέλο ξενομοσχεύματος έχει τις ελλείψεις του. Ενδοκυστική έγχυση οδηγεί στο σχηματισμό όγκων επί ουροφόρων επιφάνεια της ουροδόχου κύστης που είναι επιδεκτικοί σε μετέπειτα ενδοκυστική έγχυση νέων φαρμάκων. Ωστόσο, έχει αποδειχθεί ότι είναι εξαιρετικά δύσκολο, χρησιμοποιώντας αυτή τη μέθοδο για να επιτευχθεί αξιόπιστη όγκου αναλάβει με οποιοδήποτε κυτταρικές σειρές εκτός από KU7 [9], τα οποία έχουμε επιδείξει πρόσφατα να είναι HeLa [15]. Επιπλέον, ενδοκυστική ενοφθαλμισμό των κυττάρων είναι χρονοβόρα και μπορεί να οδηγήσει σε ανεξέλεγκτη αύξηση του όγκου σε γειτονικά όργανα (ουρήθρα, ουρητήρα, της νεφρικής πυέλου) [16]. Τέλος, η θέση του όγκου εντός της ουροδόχου κύστης είναι απρόβλεπτη, έτσι ώστε η ανάπτυξη γύρω από τα στόμια του ουρητήρα μπορεί να προκαλέσει σοβαρή απόφραξη των άνω οδό πριν ποντικοί φθάσουν θεραπευτικά τελικά σημεία.

Η άμεση έγχυση καρκινικών κυττάρων εντός του τοιχώματος της ουροδόχου κύστης οδηγεί στο σχηματισμό της διεισδυτικής όγκοι της ουροδόχου κύστης που είναι κατάλληλα για συστηματικές θεραπείες [10]. Παρά το γεγονός ότι αρκετές κυτταρικές σειρές μεγαλώνουν αξιόπιστα ως ξενομοσχεύματα σε αυτό το μοντέλο, η εφαρμογή περιορίζεται από την νοσηρότητα που υφίσταται ο ποντικούς από την ανάγκη για λαπαροτομία και κινητοποίηση της ουροδόχου κύστης [17]. Είναι επίσης τεχνική πρόκληση για την εξασφάλιση επαρκούς ένεση στο τοίχωμα της ουροδόχου κύστης, και η μέθοδος αυτή σχετίζεται με μια σημαντική καμπύλη εκμάθησης.

Έχουμε αναπτύξει μια νέα προσέγγιση για την αντιμετώπιση αυτών των περιορισμών της τειχών εμβολιασμό ξενομοσχευμάτων καρκίνου της ουροδόχου κύστης, και με τον τρόπο αυτό δυνητικά να ενισχύσει την ακρίβεια και την επαναληψιμότητα του μοντέλου αυτού. Έχουμε βελτιστοποιηθεί η διαδερμική, υπερηχογραφικό ένεση των καρκινικών κυττάρων κύστης στον πρόσθιο τοίχωμα της ουροδόχου κύστης. Επιπλέον, είμαστε σε θέση να παρακολουθεί την ανάπτυξη του ξενομοσχεύματος και αιμάτωσης

in vivo

κατά μήκος κατά τη διάρκεια της θεραπείας [18], [19], και είμαστε σε θέση να κάνετε την ένεση θεραπευτικών παραγόντων απευθείας εντός του όγκου υπό υπερηχογραφική καθοδήγηση. Εδώ έχουμε καταδείξει τη σκοπιμότητα και την επαναληψιμότητα των υπερήχων-καθοδηγούμενη τειχών εμβολιασμό των ορθοτοπική ξενομοσχευμάτων καρκίνου της ουροδόχου κύστης, καθώς και μετέπειτα εικόνα καθοδηγείται χειραγώγηση και τον έλεγχο.

Υλικά και Μέθοδοι

Ζώα

Πενήντα 10-εβδομάδων θηλυκούς αθυμικούς γυμνούς ποντικούς αγοράστηκαν από την Harlan (Indianapolis, ΙΝ, USA). Όλες οι διαδικασίες ζώων πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του Καναδικού Συμβουλίου Φροντίδας Ζώων (CCAC). Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Φροντίδας Ζώων του Πανεπιστημίου της Βρετανικής Κολομβίας (Αριθμός Πρωτοκόλλου: A10-0192).

όγκων κυτταρικές σειρές

Το ανθρώπινο καρκίνο της ουροδόχου κύστης κυτταρικές σειρές UM-UC1, UM -UC3 και UM-UC13 ευγενικά παρέχεται από το Παθολογίας πυρήνα του Καρκίνου της ουροδόχου κύστης SPORE στο MD Anderson Cancer Κέντρο (Houston, TX, USA) [20] – [22]. ταυτότητες γραμμή κυττάρων επιβεβαιώθηκαν με αποτυπωμάτων DNA χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο AmpFlSTR® Identifiler® Amplification (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) [23]. Όλες οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν για λιγότερο από 3 μήνες σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (ϋΜΕΜ) με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS) στους 37 ° C σε υγροποιημένη 5% CO

2 ατμόσφαιρα.

Για

in vivo μελέτες

, οι κυτταρικές σειρές υποβλήθηκαν σε μεταγωγή με ένα κατασκεύασμα λεντοϊού που φέρει το γονίδιο λουσιφεράσης πυγολαμπίδας για

in vivo

απεικόνισης [9]. Το πλασμίδιο λουσιφεράσης περιείχε ένα γονίδιο αντοχής βλαστισιδίνη επιτρέπουν θετική επιλογή με 10 μg /mL βλαστισιδίνη (Invitrogen, Life Technologies Inc., Burlington, ΟΝ, Canada). Οι κυτταρικές σειρές ελέγχθηκαν για δραστικότητα λουσιφεράσης σε vitro και ο αριθμός των κυττάρων συσχετίσθηκε με βιοφωταύγεια (R & gt? 0,99? δεδομένα δεν φαίνονται), χρησιμοποιώντας το Xenogen IVIS Φάσμα (δαγκάνα Lifesciences, Hopkinton, ΜΑ, USA). Για ξενομόσχευμα μελέτες τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε 70% συρροή και εναιωρήθηκε σε Matrigel® (BD Biosciences, Mississauga, ΟΝ, Canada). Η κυτταρική συγκέντρωση αυτή τροποποιήθηκε με βάση προηγουμένως συσταθεί κινητική ανάπτυξης των τριών διαφορετικών κυτταρικών σειρών (UM-UC1 Luc 9 × 10

6 /mL? UM-UC3 Luc 12 × 10

6 /mL? UM-UC13 Luc 11 × 10

6 /mL).

Διαδερμική τον εμβολιασμό των καρκινικών

όγκου εμβολιασμό έγινε με τη μικρή πλατφόρμα απεικόνισης ζώων Vevo 770 (Visual Sonics, Toronto, ON, Καναδάς). Μια υψηλή συχνότητα RMV 706 υπερήχων στην κεφαλή σάρωσης (20-60 MHz), η οποία επέτρεψε μια πλευρική ανάλυση 30 μικρόν και το πλαίσιο ποσοστά έως και 240 fps, χρησιμοποιήθηκε.

Οι ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν με ισοφλουράνη και τοποθετημένο στο απεικόνισης τραπέζι με συνεχή παρακολούθηση των ζωτικών σημείων [Σχ. 1Α]. Η κοιλία απολυμάνθηκε με εφαρμόστηκε αλκοόλη και στείρο υπερήχων γέλη. Η κύστη οπτικοποιήθηκε στην οθόνη [Σχ. 1Β] και ο αυλός κύστη πληρώθηκε με στείρο, θερμό φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (PBS) μέσω ενός αγγειοκαθετήρα 24 gauge σε ένα επιθυμητό όγκο 50-100 μΙ.

A. Οι ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν με ισοφλουράνη και τοποθετημένο στο θερμαινόμενο τραπέζι απεικόνισης με συνεχή παρακολούθηση των ζωτικών σημείων. Μετά την οπτικοποίηση της ουροδόχου κύστης με μικρή πλατφόρμα απεικόνισης των ζώων του Vevo 700® το δέρμα διάτρητο με βελόνα 30G. B. Ultrasound οπτικοποίηση της κανονικής κύστη ποντικού σε οβελιαία τομή με τυπικές διαστάσεις που αναφέρονται (διαστάσεις αυλό 4,4 × 6,5 mm? Πάχος τοιχώματος 0,25 mm).

Η

Μία σύριγγα 1.0 mL γεμίζονται με PBS και συνδέεται σε ένα 30 μετρητή, ¾ ιντσών βελόνα (Kendall, Mansfield, ΜΑ, USA) έφερε στο δέρμα ακριβώς πάνω από το ηβικό οστό σε γωνία 30 ° με το φάλτσο κατευθύνεται εμπρός. Μετά την ανίχνευση της βελόνας στην οθόνη υπερήχων [εικ. 2a], αυτό πέρασε μέσα από το δέρμα και τους κοιλιακούς μυς τοίχο [Σχ. 2b]. Το σώμα της βελόνας στράφηκε κατά 180 ° (που κατευθύνεται προς τα πίσω) πριν εισαχθεί η άκρη στο τοίχωμα της ουροδόχου κύστης χωρίς διείσδυση του βλεννογόνου [εικ. 2C]. PBS (50 μL) ενέθηκε μεταξύ της μυϊκής στιβάδας και του βλεννογόνου για να δημιουργήσει ένα χώρο [Σχ. 2D] και η βελόνα αποσύρθηκε. Μία δεύτερη σύριγγα 1,0 ml (γεμάτο με καρκινικά κύτταρα αιωρούνται σε Matrigel®, (BD Biosciences)) με μία διαμετρήματος 30, ¾ ιντσών βελόνα οδηγείται μέσα στο ίδιο διάστημα [Σχ. 2Ε]. 40 μL (UM-UC1 Luc) ή 50 μL (UM-UC3 luc, UM-UC13 Luc) του κυτταρικού εναιωρήματος εγχύθηκαν σε αυτό το χώρο [Σχ. 2F].

Α. Ανίχνευση της βελόνας στην οθόνη υπερήχων. Β διάτρηση του δέρματος και τους κοιλιακούς μυς τοιχώματος. Γ βελόνα εισαγωγής εντός του τοιχώματος της ουροδόχου κύστης χωρίς διείσδυση του βλεννογόνου. D. Η έγχυση PBS (50 μΙ) μεταξύ της μυϊκής στιβάδας και του βλεννογόνου. Ε Προσανατολισμού δεύτερη βελόνα μέσα στο δημιούργησαν τεχνητά χώρο. ΣΤ έγχυση καρκινικών κυττάρων αιωρούνται σε Matrigel®.

Η

Σε δύο επιπλέον αγαρόζης ποντίκια εγχύθηκε με παρόμοιο τρόπο, προκειμένου να καθορίσει την ακριβή τοποθεσία του ξένου μοσχεύματος εμβολιασμό εντός του τοιχώματος της ουροδόχου κύστης. Οι ποντικοί θυσιάστηκαν αμέσως και κύστεων τους απομακρύνθηκαν για ιστολογική ανάλυση.

Ξενομοσχεύματος Growth

Παρακολούθησης

Η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε με βιοφωταύγεια απεικόνισης (BLI) και υπερηχογράφημα κάθε τρίτη ημέρα ξεκινώντας 4 ημέρες μετά τον εμβολιασμό του όγκου . Το σύστημα Xenogen IVIS χρησιμοποιήθηκε για BLI και τα ποντίκια απεικονίστηκαν 10 και 15 λεπτά μετά την ενδοπεριτοναϊκή ένεση D-λουσιφερίνης (150 mg /kg σωματικού βάρους? Firefly, δαγκάνας Life Science). 3D υπερηχογράφημα διεξήχθη σε αναισθητοποιημένους ποντικούς με τη σάρωση της κύστης ως σύνολο σε βήματα 0,1 mm. Το μέγεθος του όγκου προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το πακέτο λογισμικού απεικόνισης Visual Sonics από την ανάλυση της κάθε πέμπτη εικόνα σύμφωνα με το εγχειρίδιο του χρήστη [24].

Απαερωτές Αντίθεση-Enhanced υπερήχων Ανάλυση των Όγκων

Για να δείτε το κατάσταση αιμάτωση των όγκων ξενομοσχεύματος, ένας βρόχος κινηματογραφικής προβολής καταγράφηκε ως η αναφορά. Μία δεύτερη θηλιά cine (1000 καρέ στα 30 Hz) καταγράφηκε 10 δευτερόλεπτα μετά την έγχυση 120 μL μη στοχοθετημένων μικροφυσαλίδων (Visual Sonics) στην ουραία φλέβα αναισθητοποιημένων ποντικών. Το σημείο στο οποίο οι μικροφυσαλίδες μπήκε στο αεροπλάνο προσδιορίστηκε και το πλαίσιο αναφοράς αφαιρέθηκε. Ο όγκος επελέγη ως η περιοχή αντίθεση και αναφοράς αφαιρείται Mean στοιχεία χρησιμοποιήθηκαν. Αλλαγές της αντίθεσης Ποσοστό Περιοχή πάροδο του χρόνου ήταν τεκμηριωμένες και 2D εικόνες καταγράφηκαν στην οποία κάθε εικονοστοιχείο σημαδεύτηκε πράσινο χρώμα όταν μικροφυσαλίδων πέρασε [24].

Θεραπεία

ενδονεοπλασματική ιό-ένεση.

για να αποδείξει το ενδεχόμενο η καθοδηγούμενη με υπέρηχο διαδερμική έγχυση εντός του όγκου των παραγόντων επεξεργασίας σε εγκατεστημένων ξενομοσχευμάτων, έχουμε ένεση ογκολυτικού ιού (VSV) σε UM-UC3 ξενομοσχευμάτων Luc την ημέρα 22 μετά τον εμβολιασμό. φορτίο του όγκου όπως προσδιορίζεται με BLI και υπερήχων χρησιμοποιήθηκε για να χωρίζουν τα ζώα σε δύο σχετικά ίσες ομάδες. Οι όγκοι έγιναν ορατά κατά μήκος με υπερήχους και μια βελόνα 30G εισήχθη στο κέντρο του όγκου [Σχ. 3Α]. VSV (1,05 × 10

7 pfu) εναιωρημένο σε 25 μL PBS εγχύθηκε σε 7 ποντικούς, και μόνο PBS εγχύθηκε στην ομάδα ελέγχου (n = 7).

A. Τα ξενομοσχεύματα έγιναν ορατά με υπερήχους και είτε VSV (1,05 × 10

7 pfu) διαλύονται σε 25 μΙ PBS ή μόνο PBS εγχύθηκε μέσω βελόνας 30G στο κέντρο του όγκου. B. 48 ώρες μετά την ένεση του VSV, όλοι οι όγκοι ξενομοσχεύματος έδειξε θετική χρώση για VSV-G γύρω από το σημείο της ένεσης, που συσχετίζεται με χρώση TUNEL. Γ VSV-G και χρώση TUNEL ήταν αρνητικά μετά και μόνο ένεση PBS.

Η

Η συστηματική χημειοθεραπεία.

Για να καταδειχθεί η δυνατότητα για

in vivo

παρακολούθηση σε πραγματικό χρόνο του ξενομοσχεύματος αιμάτωσης, υποβάλλαμε σε αγωγή UM-UC13 luc ποντικών που φέρουν όγκο με κυτταροτοξική χημειοθεραπεία. Την ημέρα 28 μετά τον εμβολιασμό, τα ποντίκια χωρίστηκαν σε δύο ίσες ομάδες με βάση το φορτίο του όγκου προσδιορίζεται με υπερήχους και BLI. Οκτώ ζώα έλαβαν ενδοπεριτοναϊκή γεμσιταβίνη (120 mg /kg σωματικού βάρους? SANDOZ, Boucherville, QC, Καναδάς) κατά την ημέρα 30 και 35, καθώς και σισπλατίνη (2,5 mg /kg σωματικού βάρους? Hospira, Saint-Laurent, QC, Καναδάς) κατά την ημέρα 31 και 36. Ένα ισοδύναμο όγκο PBS εγχύθηκε στα ίδια χρονικά σημεία στα ζώα ελέγχου (n = 7).

Ιστολογίας

UM-UC3 Luc, UM-UC1 Luc και UM-UC13 luc ξενομοσχεύματα συλλέχθηκαν μετά από 24, 28 και 37 ημέρες, αντίστοιχα. Κατά τη νεκροψία, η λεκάνη, οπισθοπεριτόναιου, το ήπαρ και τους πνεύμονες προσεκτικά επιθεωρούνται για πιθανή μετάσταση, καθώς και κάθε ύποπτη ιστός αφαιρέθηκε. Αυτός ο ιστός και το σύνολο κύστες μονιμοποιήθηκαν σε φορμαλίνη, εγκλείστηκαν σε παραφίνη και κόβονται σε 4-μm τμήματα τα οποία χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε). Βάθος εισβολή όγκου προσδιορίστηκε από έναν παθολόγο (LF). Για όγκους UM-UC3 ένα στάδιο Τ εφαρμόστηκε σύμφωνα με την 7

η έκδοση του αμερικανικού μεικτής επιτροπής για τον Καρκίνο /Διεθνής Ένωση κατά του Καρκίνου (AJCC /UICC) ταξινόμηση ΤΝΜ [25].

Ανίχνευση αποπτωτικών κύτταρα από το TUNEL (Terminal δεοξυνουκλεοτιδυλοτρανσφεράσης dUTP nick τέλος επισήμανση) τεχνική διεξήχθη χρησιμοποιώντας Terminal τρανσφεράσης (# 03333566001, Roche Applied Science, Indianapolis, ΙΝ, USA), dATP (D4788, Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ, USA) και DIG-11-dUTP (# 1558706, Roche Applied Science). Χρησιμοποιώντας πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού έναντι της πρωτεΐνης G του VSV (VSV-G? 1:300, ab1874, Abcam, Cambridge, MA, USA) ανοσοϊστοχημική χρώση διεξήχθη από το μοντέλο Autostainer Ventana Ανακαλύψτε XT (Ventana Medical System, Tuscon, AZ, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής ) με σύστημα στρεπταβιδίνης βιοτίνης επισημασμένο με ένζυμο και διαλύτης ανθεκτικά 3,30-diaminobenyidine κιτ χάρτη. Όλα τα δείγματα αναλύθηκαν ακολούθως από έναν παθολόγο (LF) και το ποσοστό των immunoexpression για VSV-G και χρώση για TUNEL ανιχνεύθηκε στα 200 × μεγεθύνσεις.

Στατιστική Ανάλυση

Για στατιστικές αναλύσεις, το σημαίνει βιοφωταύγεια και του όγκου του όγκου με προσδιορίστηκαν οι τυπικές αποκλίσεις τους. Η σημασία των διαφορών μετρήθηκε με δοκιμή t του Student (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) και Ρ & lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική. οικόπεδα παλινδρόμησης χρησιμοποιείται για να περιγράψει τη συσχέτιση μεταξύ βιοφωταύγεια και του όγκου.

Αποτελέσματα

Όγκων Κυττάρων Εμβολιασμός

υπερηχογραφικό έλεγχο του όγκου των κυττάρων εμβολιασμό πραγματοποιήθηκε με επιτυχία σε 50 ζώα (UM- UC1 Luc 20 ζώα, UM-UC3 Luc 15 ζώα και UM-UC13 Luc 15 ζώα) [Πίνακας 1]. Η τυπική πειραματική διάταξη και αντιπροσωπευτικές εικόνες υπερήχων και τις διαστάσεις της ουροδόχου κύστης ποντικού απεικονίζονται στο Σχ. 1. Τα βήματα του εμβολιασμού που φαίνεται στο Σχ. 2. Ο μέσος χρόνος ανά διαδικασία (τοποθέτηση των ποντικών στο τραπέζι μέχρι τελικού ένεση) θα μπορούσε να μειωθεί από 7,7 ± 3,7 min για την πρώτη ομάδα (UM-UC3 Luc) προς 3,4 ± 1,6 min για την τρίτη ομάδα (UM-UC1 Luc ). Κανένα από τα ζώα που υπέστησαν καμία επιπλοκή κατά τη διάρκεια της διαδικασίας. Ένεση γέλης αγαρόζης έδειξε ότι ο εμβολιασμός ήταν αυστηρά βρίσκεται ανάμεσα χόριο και το χιτώνα του μυϊκού [Σχ. 4]

Η οβελιαία H & amp?. Το τμήμα Ε της στο σύνολό της ουροδόχου κύστης ποντικού καταδεικνύει ένα στρώμα γέλης αυστηρά στο χόριο μεταξύ βλεννογόνου και του propria μυϊκό

Η

Ξενομοσχεύματος. η ανάπτυξη

Παρακολούθηση

Όλα 50 ζώα έδειξαν ανιχνεύσιμο όγκο στο πρόσθιο τοίχωμα της ουροδόχου κύστης με υπέρηχο για την 4

ου ημέρα μετά τον εμβολιασμό. Οι όγκοι των όγκων έναρξης και λήξης συνοψίζονται στον Πίνακα 1. Μετά τον εμβολιασμό του UM-UC3 Ιυο, ένας ποντικός έδειξε ενδοπεριτοναϊκή διάδοσης του όγκου και ένας όγκος Περίπλοκο μετά ημέρα 7. Παρόμοια μοτίβα παρατηρήθηκαν με BLI. Όλα τα ποντίκια είχαν ανιχνεύσιμα φωταύγεια στις 4

ης ημέρας, και αυτό αυξήθηκε σταθερά σε όλα εκτός από ένα ποντίκι. Το συνολικό ποσοστό πρόσληψη όγκου ήταν 98%. Τα ευρήματα αυτά επιβεβαιώθηκαν κατά το χρόνο της νεκροψίας.

Κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του όγκου [εικ. 5Α, 5Β], η αναλογία μεταξύ του συνόλου του όγκου του όγκου και BLI δεν ήταν σταθερό αλλά μεταβλητό, ανάλογα με το χρονικό διάστημα μετά τον εμβολιασμό των καρκινικών κυττάρων και το ίδιο το σύνολο του όγκου του όγκου. Παρά το γεγονός ότι υπήρξε μια τάση προς την καλύτερη συσχέτιση κατά τη χρονική πορεία (R

2 = 0,75, 0,82 και 0,92 για το UM-UC1 Luc κατά την ημέρα 16, UM-UC3 Luc κατά την ημέρα 19 και UM-UC13 Luc κατά την ημέρα 34 αντίστοιχα [Σχ. 5C]), μια δραστική μείωση της φωταύγειας ανά όγκο του όγκου mL παρατηρήθηκε σε υψηλή όγκοι του όγκου (τα δεδομένα δεν φαίνονται) Εμείς έδειξαν προηγουμένως ένα ρόλο για υποξία και νέκρωση σε αυτή την συσχέτιση [17].

η ανάπτυξη του όγκου μετρήθηκε σε τακτά χρονικά διαστήματα: A. απεικόνιση βιοφωταύγειας, και Β υπερήχων. Γ Συσχέτιση βιοφωταύγεια και ξενομοσχεύματος όγκου και για τις τρεις κυτταρικές σειρές. Δ H & amp? Ενότητα Ε του εκπροσώπου UM-UC1 Luc ξενομόσχευμα αποδεικνύοντας επεμβατική ανάπτυξη μέσα στο μυ (*) χωρίς εισβολή σε παρακείμενα όργανα. Όλες οι όγκοι προέρχονται από το πρόσθιο τοίχωμα της ουροδόχου κύστης και συχνά καταλαμβάνεται πλέον του αυλού της ουροδόχου κύστης χωρίς διηθούν το οπίσθιο τοίχωμα (**).

Η

Τρία ποντίκια (δύο UM-UC1 Luc και ένα luc UM-UC3) θυσιάστηκαν για ανθρωπιστικούς λόγους που σχετίζονται με την υπερβολική επιβάρυνση του όγκου πριν από το τέλος της προγραμματισμένης παρακολούθησης

Ιστολογίας

από την εξέταση των ξενομοσχευμάτων για την H & amp?. Ε τομές έδειξαν ότι όλοι οι όγκοι ήταν επεμβατική σε μυς και μερικοί σε perivesical λίπος, αλλά δεν υπήρχε καμία ένδειξη εισβολής σε παρακείμενων οργάνων [Σχ. 5D]. Καμία από τις όγκοι αναπτύχθηκαν μέσα από το ίδιο υμένα μέσα στον αυλό της κύστης. Οπισθοπεριτοναϊκή λεμφαδενοπάθεια παρατηρήθηκε στο 60% των UM-UC13 Luc και 20% του UM-UC3 ξενομοσχευμάτων Luc. Αυτό επιβεβαιώθηκε από Η &? Χρώση Ε (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). TNM στάσης ήταν υποδειγματική για όλους τους όγκους luc UM-UC3 με ιστολογική ανάλυση των πρωτογενών όγκων και οπισθοπεριτοναϊκή λεμφαδένες, καθώς και μακροσκοπική ανάλυση ήπαρ και τους πνεύμονες [Πίνακας 2].

Η

Μετά την εντός του όγκου έγχυση του VSV σε UM-UC3 ξενομοσχευμάτων Luc [εικ. 3Α], όλα τα 7 όγκοι εμφάνισαν θετική χρώση για VSV-G. Οι ίδιες περιοχές των όγκων χρώση για VSV-G επίσης καταδειχθεί χρώση στην δοκιμασία TUNEL [Σχ. 3Β]. Αντίθετα, η χρώση VSV-G ήταν αρνητική για ξενομοσχεύματα σε αγωγή με PBS στο αρνητικό μάρτυρα [Σχ. 3C].

ανταπόκρισης στη χημειοθεραπεία

Τα ποντίκια που έφεραν UM-UC13 όγκους Luc έδειξε μια αξιοσημείωτη ανταπόκριση στο συνδυασμό της γεμσιταβίνης και σισπλατίνης. Ο διάμεσος όγκος του όγκου μειώθηκε σημαντικά από 48,6 μL (± 7,7) έως 25,3 μι (± 5,8) μετά από 7 ημέρες θεραπείας, ενώ αυξήθηκε από 48,8 μL (± 14,8) σε 114,5 μί (± 26,8) στην ομάδα ελέγχου [Σχ. 6Α].

Α. Ποντικοί που φέρουν UM-UC13 όγκους Luc έδειξε μια αξιοσημείωτη μείωση στον όγκο του όγκου μετά την συστημική θεραπεία με ένα συνδυασμό γεμκιταβίνης και σισπλατίνη αρχίζοντας την ημέρα # 28 μετά τον εμβολιασμό, σε σύγκριση με τον έλεγχο PBS (** = Ρ & lt? 0,01). B. ξενομοσχεύματος διάχυσης μετρήθηκε με ένεση και απεικόνιση υπερήχων της μη συγκεκριμένης μικροφυσαλίδων σε ξενομοσχεύματα luc UM-UC13 πριν και 5 ημέρες μετά την χορήγηση του παράγοντα ελέγχου (PBS? Αριστερός πίνακας) ή συστηματική χημειοθεραπεία (gemcitabine /σισπλατίνη? Δεξί πάνελ). Αιμάτωσης ήταν ποσοτικά ως ποσοστό αντίθεσης περιοχή. Αντιπροσωπευτικά μεμονωμένων αποτελεσμάτων από 4 μετράται ζώων ανά ομάδα απεικονίζεται.

Η

Η αιμάτωση του όγκου ξενομοσχεύματος μετρήθηκε πριν και μετά τη χορήγηση της συστημικής χημειοθεραπείας με μη ειδική μικροφυσαλίδων. Η χημειοθεραπεία οδήγησε σε μείωση του ρυθμού έγχυσης (Contrast ποσοστό εμβαδού) από 84% έως 66%, ενώ η ίδια παράμετρος παρέμεινε σταθερή μετά την αγωγή με PBS μόνο (79% έναντι 77%) [Σχ. 6Β].

Συζήτηση

Η ύπαρξη αξιόπιστων μοντέλα ζώων αποτελεί βασική προϋπόθεση στην ογκολογική έρευνα για την in vivo έρευνα της βιολογίας των όγκων και τη δοκιμή νέων στρατηγικών αντινεοπλασματική θεραπεία. Παρά την ύπαρξη αναπαραγώγιμη συγγενή [11] και διαγονιδιακά [12] ορθοτοπική μοντέλα όγκων του καρκίνου της ουροδόχου κύστης, αυτά δεν χρησιμοποιούνται ευρέως λόγω τόσο εγγενών περιορισμών (π.χ. αμφισβητήσιμη δυνατότητα εφαρμογής του συγγενή μοντέλα καρκίνου ποντικού ουροδόχου κύστης για την ανθρώπινη ασθένεια) και την πολυπλοκότητα των μοντέλα, όπως επίσης και η ένταση του συνδέεται αξιοποίησης των πόρων. Ορθοτοπική μοντέλα ξενομοσχεύματος έχουν αποδειχθεί για να προσφέρουν τη μεγαλύτερη ευελιξία (όσον αφορά την επιλογή των κυτταρικών σειρών) και έχουν την πιο πρακτική χρησιμότητα, και ως εκ τούτου παραμένουν το χρυσό πρότυπο για in vivo μοντελοποίηση καρκίνου της ουροδόχου κύστης [7], [8].

σε αυτή την εργασία, έχουμε δημιουργήσει ένα νέο in vivo μοντέλο της ορθοτοπική ξενομοσχευμάτων καρκίνου της ουροδόχου κύστης μέσω της ενοφθαλμισμό ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων κύστης στην ουροδόχο κύστη του ποντικού και έχουν δείξει ότι είναι ιδιαίτερα αναπαραγώγιμη. Οι όγκοι εγκατεστημένοι στο 98% των ποντικών που εμβολιάστηκαν με τρεις διαφορετικές ανθρώπινες κυτταρικές σειρές. Λόγω της εξαιρετικής οπτική ανάλυση, τα κύτταρα όγκου μπορεί να εμβολιάζονται με υψηλή ακρίβεια αυστηρά στον πρόσθιο τοίχωμα της ουροδόχου κύστης, μειώνοντας έτσι το ποσοστό των αποφρακτικών επιπλοκών και επιτρέποντας μεγαλύτερες περιόδους ανάπτυξης και θεραπεία. Επιπλέον, ο χρόνος ανά εμβολιασμό είναι μικρή σε σύγκριση με τα υπάρχοντα μοντέλα, και μειώνεται γρήγορα με επιπλέον εμπειρία. Η ενιαία παρατηρούμενη επιπλοκή ήταν μια ενδοπεριτοναϊκή διάδοση των καρκινικών κυττάρων η οποία συνέβη σε ένα από τα πρώτα ζώα εγχέονται και μπορούν να αποδοθούν στην ένεση του υπερβολικά μεγάλου όγκου σε σχέση με το μέγεθος του ζώου. Αυτό υποστηρίζεται από το γεγονός ότι η μείωση του όγκου της ένεσης από 50 σε 40 μL οδήγησαν σε καμία περαιτέρω επιπλοκές.

μοντέλο μας είναι μια τροποποίηση του μοντέλου ορθοτοπικό περιγράφηκε προηγουμένως από Dinney et al. [10]. Πιστεύουμε ότι υπερηχογραφικό τον εμβολιασμό του όγκου ενισχύει αυτό το μοντέλο λόγω της ευκολίας, ταχύτητας, ακρίβειας και μειωμένη βαθμό διεισδυτικότητας. Ο τελευταίος παράγοντας δεν είναι μόνο μία καλή διαβίωση των ζώων, αλλά μπορεί επίσης να συμβάλει στην επαναληψιμότητα των πειραμάτων με τη μείωση της σύγχυσης χειρουργικές επιπλοκές. Η ακρίβεια του προτύπου τειχών ένεση μέσω μιας λαπαροτομίας περιορίζεται από την ικανότητα να καθορίζει την ακριβή τοποθέτηση της βελόνας κατά τη στιγμή της ένεσης. Το σχήμα και η κατανομή της κύστης στο τοίχωμα της ουροδόχου κύστης μετά την ένεση θα επιβεβαιώσει συχνά σωστή θέση, αλλά δεν υπάρχει a priori επιβεβαίωση πριν τα κύτταρα εγχέονται. Αυτό σημαίνει ότι ένα ορισμένο ποσοστό των ποντικών θα έχει κύτταρα εγχέονται στον αυλό της κύστης ή χυθεί πάνω στην επιφάνεια ορογόνου υμένα της ουροδόχου κύστης. Με την τεχνική των υπερήχων, ένας χώρος δημιουργείται υποβλεννογόνια στο τοίχωμα της ουροδόχου κύστης με αλατούχο, η οποία δεν ενέχει τον κίνδυνο διαρροής, και η επακόλουθη ενοφθαλμισμό των κυττάρων του όγκου ακολουθεί εύκολα στον ίδιο χώρο κάτω από την άμεση οπτικοποίηση.

Παρακολούθηση όγκος του όγκου με υπερήχων αυξάνει τις πληροφορίες που έχει αποκτηθεί από BLI στο ορθοτοπικό μοντέλο ξενομοσχεύματος. Ενώ BLI έχει γίνει αναπόσπαστο στοιχείο της ανίχνευσης του όγκου και της ανάλυσης της ανάπτυξης, δεν είναι πάντα συσχετίζονται καλά με τον καρκινικό όγκο. Έχουμε δείξει προηγουμένως στο ορθοτοπικό μοντέλο ξενομοσχεύματος που αιμάτωσης όγκου και υποξία συγχύσει τη σχέση μεταξύ του όγκου και η φωταύγεια [17], και το ίδιο είναι πιθανώς υπεύθυνη για τις διαφορές που παρουσιάζονται εδώ. Αυτό ισχύει ιδιαίτερα σε μεγαλύτερους όγκους [26], ενώ νωρίς μετά τον εμβολιασμό μέγεθος υπέρηχος μπορεί να είναι ανακριβείς λόγω του όγκου του εγχυόμενου ρευστού, τον περιβάλλοντα ιστό οίδημα, και το γεγονός ότι μόνο ένα μέρος των κυττάρων ενέθηκαν επιβιώσουν και να αναπτυχθούν.

Ένα πρόσθετο πλεονέκτημα των υπερήχων είναι η ικανότητα να εγχύσει νέους παράγοντες αγωγή απ ‘ευθείας εντός του όγκου. Εδώ έχουμε επιδείξει την εφικτότητα ενδοογκική διανομή του ογκολυτικού VSV. Η ίδια τεχνική θα είναι επιδεκτικά σε άλλες στρατηγικές θεραπείας για τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης όπως η γονιδιακή θεραπεία ή την εφαρμογή των νανοσωματιδίων [27], [28]. Ως παράδειγμα της συνάφειας του εντός του όγκου έγχυση στη θεραπεία ανθρώπινων καρκίνων, η ενδοογκική ένεση πλασμιδιακού DNA έχει πρόσφατα δοκιμάστηκε στη θεραπεία καρκίνων του παγκρέατος ανεγχείρητων [29].

Έχουμε αποδείξει επίσης τη δυνατότητα να παρακολουθεί την αγγείωση του όγκου κατά τη διάρκεια της φαρμακευτικής αγωγής, σε αυτή την περίπτωση την παραδοσιακή κυτταροτοξική χημειοθεραπεία. Αυτή η δυνατότητα θα είναι ιδιαίτερα χρήσιμη κατά την αξιολόγηση της ανταπόκρισης των όγκων σε νέα θεραπευτικά μέσα, συμπεριλαμβανομένης της ανάπτυξης της αντίστασης που μπορεί να αντανακλάται από μια αποτυχία για τη μείωση των αγγείωση.

Ο κύριος περιορισμός των υπερήχων-καθοδηγούμενη εμβολιασμό του όγκου είναι η εξάρτηση από η πλατφόρμα απεικόνισης υπερήχων, η οποία δεν μπορεί να είναι εύκολα προσβάσιμη για πολλούς ερευνητές. Επιπλέον, το μοντέλο αυτό απαιτεί εξοικείωση με την απεικόνιση υπερήχων. Από την άλλη πλευρά, σύνθετη μοντελοποίηση των ζώων των ανθρώπινων καρκίνων, όπως ακριβώς και πολύπλοκη χειρουργική επέμβαση στο ανθρώπινο ασθενείς, μπορεί να πραγματοποιηθεί καλύτερα με κέντρα αριστείας μέσω επιστημονικών συνεργασιών.

Το μοντέλο μας δεν υποκαθιστά απαραίτητα για την ενδοκυστική έγχυση της ουροδόχου κύστης καρκινικές κυτταρικές γραμμές [9], [30]. Το τειχών μοντέλο είναι ανώτερο από το ενδοκυστική μοντέλο για τις περισσότερες εφαρμογές λόγω της ικανότητας να χρησιμοποιεί πολλαπλές διαφορετικές κυτταρικές σειρές. Η εντός των τειχών μοντέλο, ωστόσο, δεν έχει χρησιμότητα για τη δοκιμή νέων θεραπειών που παραδίδεται ενδοκυστικά, επειδή οι όγκοι δεν διαταράσσουν την επιφάνεια urothelial (lamina propria) στον αυλό της κύστης, και τα φάρμακα ως εκ τούτου δεν είναι εύκολο να διεισδύσει εντός του όγκου. Αυτοί οι όγκοι αναπτύσσονται expansively μακριά από τον αυλό της κύστης, έτσι ώστε τα φάρμακα χορηγούνται εντός του αυλού της κύστης δεν μπορεί να διαπεράσει το πλήρες βάθος του όγκου. Επιπλέον, η εντός των τειχών μοντέλο αντιπροσωπεύει μυϊκή διεισδυτικής νόσου, η οποία δεν αντιμετωπίζεται με ενδοκυστική θεραπεία στην κλινική πρακτική. Στο ενδοκυστική μοντέλο όγκου, από την άλλη πλευρά, η επιφάνεια του όγκου εκτίθεται στον αυλό της κύστης και ο όγκος γενικά δεν αυξάνεται πέραν χορίο για αρκετές εβδομάδες [9], έτσι ώστε τα φάρμακα χορηγούνται μέσα στον αυλό της κύστης μπορεί να διεισδύσει επαρκώς η όγκος. Το πιο σημαντικό περιορισμό στην intravescial μοντέλο, ωστόσο, είναι ο περιορισμός του σε πολύ λίγες κυτταρικές γραμμές οι οποίες, ακόμη και στα πιο έμπειρα χέρια, αναπτύσσεται μόνο σε ένα αναξιόπιστο τρόπο.

Συμπεράσματα

Έχουμε ανέπτυξε με επιτυχία μια τεχνική για υπερηχογραφικό έλεγχο εμβολιασμό των ορθοτοπική ξενομοσχευμάτων καρκίνου της ουροδόχου κύστης που ενισχύει σημαντικά την προ-υπάρχοντα μοντέλα του καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Τα κύρια πλεονεκτήματα αυτού του μοντέλου έγκειται στην ταχύτητα και την ευκολία τον εμβολιασμό του όγκου, καθώς και στην ακρίβεια και επαναληψιμότητα του μοντέλου. Επιπλέον, είμαστε σε θέση να παρακολουθεί τον όγκο του όγκου κατά μήκος με υπερήχους, για τη μέτρηση της in vivo αιμάτωση του όγκου με μικροφυσαλίδων παράγοντες αντίθεσης, και να εισφέρει θεραπευτικούς παράγοντες εντός του όγκου υπό υπερηχογραφική καθοδήγηση.

Ευχαριστίες

θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Ben Deeley για τη βοήθειά του στην απεικόνιση υπερήχων και Eliana Beraldi για τη βοήθειά της με ιογενή μεταγωγή των κυτταρικών σειρών.