Αφηρημένο

Ιστορικό

Μια ολοκληρωμένη έρευνα για το DNA μεθυλιωμένο γονίδια που ταυτοποιούνται γονίδια καταστολής όγκων υποψήφιες που έχουν αποδειχθεί ότι εμπλέκονται στην αποπτωτική διαδικασία του

ρ53

οδό. Σε αυτή τη μελέτη, ερευνήσαμε

p53

μετάλλαξη σε σχέση με αυτές τις επιγενετικές μεταβολές στην πρωτογενή καρκίνο του στομάχου

Μέθοδοι

Τα προφίλ μεθυλίωσης των γονιδίων 3:.

PGP9

.

5

,

NMDAR2B

, και

CCNA1

, οι οποίες συμμετέχουν στο ρ53 ογκοκατασταλτικό οδού σε συνδυασμό με

p53

μετάλλαξη ήταν εξέτασε 163 πρωτογενή γαστρικού καρκίνου. Η επίδραση των επιγενετικών αναστροφής σε συνδυασμό με χημειοθεραπευτικά φάρμακα σε απόπτωση αξιολογήθηκε επίσης ανάλογα με τον όγκο

Κατάσταση p53

μετάλλαξης.

Αποτελέσματα

p53

γονίδιο μεταλλάξεις βρέθηκαν σε 44 πρωτογενείς γαστρικών όγκων (27%), και υπερ-υψηλής μεθυλίωσης οποιουδήποτε από τα 3 γονίδια βρέθηκε μόνο σε περιπτώσεις με άγριου τύπου

ρ53

. Υψηλότερες

p53

οδό εκτροπή βρέθηκε σε περιπτώσεις με το ανδρικό φύλο (p = 0,003), εντερικό τύπο (p = 0.005), και μη διηθούντα τύπου (p = 0,001). Η

p53

οδό εκτροπή ομάδα εκτίθενται λιγότερο υποτροπής στους λεμφαδένες, απομακρυσμένα όργανα, και του περιτοναίου από το

p53

ομάδα μη εκτροπή. Στο γαστρικού καρκίνου κυτταρική σειρά NUGC4 (

p53

άγριου τύπου), επιγενετική θεραπεία επαυξημένης απόπτωσης με χημειοθεραπευτικά φάρμακα, εν μέρει μέσω

δραστηριότητας μεταγραφής ρ53

. Από την άλλη πλευρά, στην κυτταρική σειρά καρκίνου ΚΑΤΟ III (

ρ53

μεταλλαγμένο), επιγενετικές θεραπεία μόνη της επαγόμενης ισχυρή απόπτωση, χωρίς trans-ενεργοποίηση του

p53

.

συμπέρασμα

Σε καρκίνο του στομάχου,

p53

υπάρχουν σχετικές και μη σχετικές οδούς, και οι όγκοι είτε με τον τύπο της οδού εκτίθενται μοναδικά κλινικά χαρακτηριστικά. Επιγενετικές θεραπείες μπορεί να προκαλέσουν απόπτωση εν μέρει μέσω της

p53

ενεργοποίηση, ωστόσο αποπτωτικά αποτελέσματά τους μπορεί να εξηγηθεί σε μεγάλο βαθμό από το μηχανισμό άλλο από μέσα

p53

μονοπάτια

Παράθεση:. Waraya Μ, Yamashita Κ, Έμα Α, Katada Ν, Kikuchi S, Watanabe Μ (2015) Αποκλειστική Σύλλογος

p53

Μετάλλαξη με υπερυψηλής μεθυλίωση των γονιδίων Ογκοκατασταλτικής στο

p53

Διαδρομή σε ένα μοναδικό Γαστρικό του καρκίνου φαινότυπο. PLoS ONE 10 (10): e0139902. doi: 10.1371 /journal.pone.0139902

Επιμέλεια: Qian Τάο, το Κινεζικό Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 31 του Μάρτη 2015? Αποδεκτές: 18 Σεπτεμβρίου, 2015? Δημοσιεύθηκε: 8 Οκτωβρίου 2015

Copyright: © 2015 Waraya et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από την Grant-in ενισχύσεις για την Έρευνα του Καρκίνου από το Υπουργείο Υγείας, εργασίας και Πρόνοιας της Ιαπωνίας και από το Ίδρυμα Ιάπωνες για διεπιστημονική αντιμετώπιση του καρκίνου. Οι οργανισμοί χρηματοδότησης είχαν κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή δεδομένων, ή ανάλυση? στην ερμηνεία των αποτελεσμάτων? στην προετοιμασία του χειρογράφου? ή στην απόφαση να υποβάλει το χειρόγραφο προς δημοσίευση

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η μεθυλίωση του DNA παίζει κεντρικό ρόλο στην. γονιδιακή σίγηση του όγκου γονίδια καταστολής στον καρκίνο του ανθρώπου. Ένα γονίδιο μεθυλίωσης ειδική για τον καρκίνο είναι μια σπάνια οντότητα, και συχνή εκτροπή της μεθυλίωσης στην πρωτοβάθμια καρκινικούς ιστούς είναι ακόμη πιο σπάνιο [1, 2]. Εντοπίσαμε τον καρκίνο ειδικά μεθυλιωμένα γονίδια σε κάθε όργανο χρησιμοποιώντας μια φαρμακολογική αποκάλυψη των μικροσυστοιχιών (PUM) [1, 2] και ένα τροποποιημένο PUM [3-5]. Εντοπίσαμε πολλά γονίδια καταστολής υποψηφίου όγκου (ΕΠΠΕ), όπως

PGP9

.

5

στο κεφάλι και το λαιμό ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα (HNSCC) [2], του οισοφάγου SCC (ESCC) [6] , γαστρικό καρκίνο [4], και άλλους καρκίνους [7],

NMDAR2B

στο ESCC [3] και του γαστρικού καρκίνου [8], και

CCNA1

στο HNSCC [2]. Τα προφίλ της μεθυλίωσης των γονιδίων αυτών έχουν επικυρωθεί από άλλες ομάδες ή /και ακόμη και σε άλλους καρκίνους [9-14]. Γονίδια που έδειξε πάνω από 60% μεθυλίωση σε ιστούς όγκων ορίστηκαν ως ιδιαίτερα χρήσιμο μεθυλιωμένα γονίδια (HRMGs) [15]. Επιπλέον, περαιτέρω σε σύγκριση με τη συχνότητα των εν λόγω ανώμαλης μεθυλίωσης του υποψηφίου HRMGs με άλλες εκθέσεις του γαστρικού καρκίνου [16], και οι υποψήφιοι γονίδιο περιοριστεί σε συγκεκριμένα γονίδια.

Το πιο σημαντικό, αυτά τα γονίδια καταστολής υποψήφιος του όγκου ήταν αναφέρεται ότι είναι στο

p53

ογκοκατασταλτικό οδού (Σχήμα 1). Για παράδειγμα,

PGP9

.

5

αλληλεπιδρά άμεσα με το

p53

και σταθεροποιεί

p53

αναστέλλοντας την αποικοδόμηση της μέσω του πανταχού παρόντες δρόμους στο ηπατοκυτταρικό [17] , του μαστού [18], και ρινοφαρυγγικού καρκίνου του [19].

NMDAR2B

επάγει την απόπτωση μέσω άμεσης αλληλεπίδρασης του με το

DAPK

[20], η οποία, με τη σειρά της, έχει δειχθεί να εξουδετερώσει ογκογονίδιο επαγόμενη μεταμόρφωση ενεργοποιώντας ένα

p19ARF

/

p53

εξαρτώμενο αποπτωτικό σημείο ελέγχου [21].

CCNA1

είναι ένα

p53

επαγόμενη γονίδιο που μεσολαβεί απόπτωση, G2 /M σύλληψης, και μιτωτική καταστροφή σε ανθρώπινο νεφρικό, ωοθήκης, καρκίνο του πνεύμονα και κυττάρων [22]. Ως εκ τούτου, η

p53

οδός αποκόπτεται σε ιστούς όγκων των πρωτοπαθών καρκίνων σε μια επιγενετική τρόπο μαζί με άγριου τύπου

p53

, ωστόσο, δεν έχει υπάρξει καμία έκθεση σχετικά με τη σύνδεση των

p53

μετάλλαξη και επιγενετικές αλλαγές στην πρωτοβάθμια ιστούς όγκων.

η

στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε η κατάσταση μεθυλίωσης του DNA των γονιδίων στο

p53

μονοπάτι που είναι ασυνήθιστα ρυθμιζόμενη σε μια επιγενετική τρόπο στην πρωτοβάθμια γαστρικού καρκίνου, και σε σύγκριση με μοτίβο μεθυλίωσης τους με το

p53

κατάσταση μετάλλαξης, προκειμένου να προσδιοριστεί η κλινική σημασία του

p53

εκτροπή φαινοτύπων.

Μέθοδοι

κυτταρικές γραμμές και δείγματα ιστών

Οι κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου, KatoIII, NUGC4, ΑΖ521 και SH10 αγοράστηκαν από την RIKEN Bioresource Center (Ibaraki, Japan). Και η κυτταρικής σειράς ηπατοκυτταρικού καρκινώματος HepG2 αγοράστηκε από την American Type Culture Collection (Manassas, VA). Αυτές οι κυτταρικές γραμμές εκτός ΑΖ521 και HepG2 αναπτύχθηκαν σε RPMI 1640 (GIBCO, Carlsbad, CA) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό. ΑΖ521 και HepG2 αναπτύχθηκαν σε μέσο ϋΜΕΜ (GIBCO), συμπληρωμένου με 10% FBS.

Ζεύγη (n = 163) από σταθεροποιημένο με φορμαλίνη, εγκλεισμένα σε παραφίνη (FFPE) του ιστού του όγκου και της αντίστοιχης κανονικής βλεννογόνου δείγματα λαμβάνονται σε τουλάχιστον 5 cm από την άκρη του όγκου ελήφθησαν από ασθενείς που υποβάλλονται σε χειρουργική επέμβαση από την 1η Ιανουαρίου, 2000, και στις 31 Δεκεμβρίου, 2010. όλοι οι ασθενείς με στάδιο ΙΙ /ΙΙΙ GC είχε υποστεί μια δυνητικά θεραπευτική εκτομή για την πρωτογενή GC, και υποβλήθηκε σε επικουρική S -1 χημειοθεραπεία μετά τη χειρουργική επέμβαση (S-1 καθιερωμένη θεραπεία). Νεο-επικουρική θεραπεία δεν διεξήχθη σε αυτό το κοόρτη ασθενών. Όγκοι ταξινομούνται με βάση την ταξινόμηση ΤΝΜ σύμφωνα με την 7

η έκδοση της Ένωσης για θέματα Διεθνούς Ελέγχου του Καρκίνου (UICC) και του 14

η έκδοση του ιαπωνικού Ταξινόμηση γαστρικού καρκινώματος (JCGC). Τα χαρακτηριστικά των ασθενών παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. Όλα τα δείγματα ιστών συλλέχθηκαν στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Kitasato, και γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς και υγιείς δότες πριν από τη συλλογή του δείγματος. Η παρούσα μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Πανεπιστημίου Kitasato.

Η

Ανάλυση των μεταλλαγμένων

p53

γονιδίων με τη χρήση πολυμορφισμού μονόκλωνης διαμόρφωσης (SSCP)

Οι μεταλλάξεις στο εξώνια 5, 6, 7 και 8 του

p53

γονίδιο υποβλήθηκαν σε διαλογή με ανάλυση μη ραδιενεργό μονόκλωνης διάπλασης πολυμορφισμού (SSCP), η οποία πραγματοποιήθηκε με τη χρήση προηγουμένως καθιερωμένες μεθόδους μας [23]. δείγματα του προϊόντος PCR 10 μΙ αραιώθηκαν τριπλός με ρυθμιστικό φόρτωσης πηκτής (95% απιονισμένο φορμαμίδιο, 20 mmol /L EDTA, 0.01% κυανό βρωμοφαινόλης και 0.01% ξυλόλιο κυανόλη) και θερμάνθηκε στους 95 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από απόσβεση στον πάγο. Κλάσματα των 3 μΐ τοποθετήθηκαν σε τροποποιημένους πηκτές πολυακρυλαμιδίου (PAFG: 18% πολυακρυλαμιδίου-δις (49: 1), 0,5Χ ΤΒΕ, 10% γλυκερόλη, 10% φορμαμίδιο, 0.05% υπερθειικό αμμώνιο, και 30 ml ΤΕΜΕϋ) διαστάσεων 120 mm χ 150 mm χ 0,35 mm. Διεξήχθη ηλεκτροφόρηση με 1,5χ ΤΒΕ ρέον ρυθμιστικό στα 500 V και 30 mA για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Συγκροτήματα ανιχνεύθηκαν με βαφή πηκτών χρησιμοποιώντας μια χρωστική αργύρου συν kit (Bio-Rad, Hercules, CA), που ακολουθείται από στερέωση, έκπλυση, την ανάπτυξη, και το σταμάτημα της αντίδρασης. Μεταλλαγμένα ζώνες ανιχνεύθηκαν με PCR-SSCP ήταν εμφανής σε 1:64 αραίωση των μεταλλαγμένων αλληλόμορφων.

κατεργασία όξινου θειώδους του εκχυλισμένου DNA

Γονιδιωματικό DNA από ιστούς FFPE και κυτταρικές σειρές εκχυλίζεται χρησιμοποιώντας το QIAamp DNA FFPE κιτ ιστού (QIAGEN Sciences, Maryland, MD) και το DNA QIAamp Mini Kit (QIAGEN) σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή. Για DNA μετουσίωση, 2 μg γονιδιωματικού DNA επωάστηκε με 5 μg DNA σπέρματος σολωμού σε 0,3 mol /l NaOH για 20 λεπτά στους 50 ° C. Το δείγμα DNA αραιώθηκε στη συνέχεια με 500 μΐ ενός διαλύματος που περιέχει 2,5 mol /l μεταδιθειώδες νάτριο (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, ΜΟ) /125 mmol /l υδροκινόνη (Sigma) /διάλυμα υδροξειδίου του νατρίου 0,4 mol /l, και επωάστηκε στους 70 ° C για 1,5 ώρες. Το δείγμα στη συνέχεια εφαρμόστηκε σε μία στήλη (Wizard DNA Clean-UP System, Promega Inc., Madison, WI), επωάστηκαν με 0,3 mol /l NaOH για 10 λεπτά και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 3 mol /l οξικού αμμωνίου για 5 λεπτά. Το δείγμα καταβυθίστηκε σε 100% αιθανόλη, και το DNA επαναιωρήθηκε σε 50 μΐ LOTE που περιέχει 10 μΜ Tris-HCl, ρΗ 8 και 2,5 μΜ αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξικό οξύ (EDTA), ρΗ 8, και στη συνέχεια ενισχύεται από ένα αλυσίδας πολυμεράσης αντίδραση (PCR). Κατεργασία όξινου θειώδους αποτέλεσμα την χημική τροποποίηση των μη μεθυλιωμένα, αλλά όχι μεθυλιωμένη, κυτοσίνες σε ουρακίλες, επιτρέποντας τη διάκριση μεταξύ μεθυλιωμένων και μη μεθυλιωμένων γενωμικού DNA.

Ποσοτική-μεθυλίωση-ειδική PCR (Q-MSP)

για την ποσοτική ανάλυση μεθυλίωσης, TaqMan μεθυλίωσης ειδική PCR (Q-MSP) πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του iQ ™ Multiplex Powermix (Bio-Rad) εις τριπλούν για την iCycler iQ ™ πραγματικό χρόνο σύστημα ανίχνευσης PCR (Bio-Rad). Οι συνθήκες και οι αλληλουχίες PCR παρέχονται στον Πίνακα S1. Διαδοχικές αραιώσεις του θειώδους τροποποιημένων CpGenome καθολικής μεθυλιωμένο DNA (Chemicon International, Temecula, CA) χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή της καμπύλης βαθμονόμησης σε κάθε πλάκα ως μεθυλίωση θετικοί έλεγχοι και CpGenome καθολικής μη μεθυλιωμένο DNA (Chemicon International) χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Η αξία μεθυλίωση (τιμή TaqMeth) ορίστηκε ως ο λόγος της μεθυλιωμένο

PGP9

.

5

,

NMDAR2B

,

CCNA1

, ή

DAPK

κανονικοποιημένη σε μεθυλιωμένο

β-ακτίνη

, το οποίο στη συνέχεια πολλαπλασιάζεται επί 100.

Ανοσοϊστοχημική χρώση PGP9.5, NMDAR2B και CCNA1

για ανοσοχρώση, αποκάλυψη αντιγόνου διεξήχθη με αυτόκλειστο μούλιασμα, ενδογενής δραστικότητα υπεροξειδάσης αποκλείστηκε με επώαση σε 3% η

2O

2 /μεθανόλη για 5 λεπτά, και δεσμευτική μη ειδικό αντίσωμα μπλοκαρίστηκε με επώαση με 1% αραιωμένο φυσιολογικό ορό αλόγου για 30 λεπτά. Οι τομές στη συνέχεια επωάστηκαν στους 4 ° C όλη τη νύκτα με τα ακόλουθα αντισώματα: PGP9.5 πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού (αραίωση 1:. 200, Nonus Biogenesis), κουνέλι NMDAR2B πολυκλωνικό αντίσωμα (αραίωση 1: 100, Millipore), ή ποντίκι Κυκλίνη Α μονοκλωνικό αντίσωμα (6E6, αραίωση 1:50, Leica Biosystems Newcastle. Ltd). Τα ανοσοσύμπλοκα ανιχνεύθηκαν με το κιτ Vectastain Elite ABC (Vector Laboratories, Inc, Burlingame, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Αυτά τα ανοσοσύμπλοκα ανιχνεύθηκαν με τη χρήση του υποστρώματος 3,3′-διαμινοβενζιδίνη (Vector) ως χρωμογόνο (PGP9.5 1,5 λεπτά, NMDAR2B 6 λεπτά, CCNA1 10 λεπτά). Οι τομές με αιματοξυλίνη.

θεραπεία Επιγενετικές με 5-Αζα-DC και TSA, και χημειοθεραπευτική αγωγή με CDDP

Τα κύτταρα χωρίστηκαν και σπάρθηκαν σε χαμηλή πυκνότητα (1×10

6 /φιάλη Τ-75) 24 ώρες πριν τη θεραπεία. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν τότε σε επεξεργασία κάθε 24 ώρες για 4 ημέρες με είτε 1 ή 5 μΜ 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (5-Αζα-dC? Sigma-Aldrich, St Louis, ΜΟ) διαλύθηκε σε 50% οξικό οξύ ή υποβλήθηκαν σε επεξεργασία ψευδο με PBS συμπεριλαμβανομένης της ίδιας ποσότητας οξικού οξέος. Όπως υποδεικνύεται, 100 ηΜ trichostatinA (TSA? Sigma-Aldrich). Και /ή 12.5 μΜ cis-diaminedichloroplatinum (CDDP) (Nichi-Iko Pharmaceutical Co., Ltd., Japan) προστέθηκε για τις τελικές 24 ώρες

κηλίδωση Western ανάλυση

η ολική πρωτεΐνη εκχυλίστηκε από κυτταρικές σειρές που είχαν επιγενετικώς αγωγή με /χωρίς χημειοθεραπευτική αγωγή, και υποβλήθηκε σε ανάλυση κηλίδωσης Western χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα αντισώματα: μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-ρ53 ποντικού (1C12, αραίωση 1: 1000, Cell Signaling Technology, Inc.) ή αντι-β-ακτίνης IgG

2 α μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού (αραίωση 1: 10.000, Sigma-Aldrich)

δοκιμασίας ρεπόρτερ ρ53

τα κύτταρα (2χ 10

4 κύτταρα /φρεάτιο πλάκας 96) τα οποία επιγενετικώς αγωγή με /χωρίς χημειοθεραπευτική αγωγή επιμολύνθηκαν με ένα

διάνυσμα ρ53

ανταποκριτή (QIAGEN) χρησιμοποιώντας Κιτ Reporter Signal ™ Pathway ( QIAGEN) και το αντιδραστήριο Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Μετά από 24 ώρες επώασης, η δραστικότητα ρεπόρτερ μετρήθηκε με τη χρήση της διπλής λουσιφεράσης Σύστημα Reporter Assay (Promega). Οι επιμολύνσεις πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό SoftMax Pro (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

Προσδιορισμός απόπτωσης

επεξεργασμένα κύτταρα (1 χ 10

5 κύτταρα /δείγμα) βάφτηκαν με αννεξίνη V και 7-AAD (αντιδραστήριο γκουάβα νεξίνη, γκουάβα Technologies, Hayward, CA) για τις διακρίσεις των πρώιμων και όψιμων αποπτωτικών κυττάρων, αντίστοιχα. Το πείραμα διεξήχθη με τη χρήση της PCA Σύστημα γκουάβα, πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας CytoSoft 2.1.5 λογισμικού (γκουάβα Technologies).

Η στατιστική ανάλυση

ακριβές τεστ του Fisher ή το Mann-Whitney U δοκιμή χρησιμοποιήθηκε για τις κατηγορικές μεταβλητές, και Φοιτητών

t-test

χρησιμοποιήθηκε για τις συνεχείς μεταβλητές. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι όροι ± τυπική απόκλιση (SD). Η μέθοδος Kaplan-Meier χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί σωρευτικά ποσοστά επιβίωσης, και οι διαφορές στα ποσοστά επιβίωσης εκτιμήθηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία log-rank. Υποτροπής επιβίωση χωρίς (RFS) και τη συνολική επιβίωση (OS) μετρήθηκαν από την ημερομηνία λειτουργίας μέχρι την ημερομηνία της υποτροπής και θανάτου, ή την τελευταία παρακολούθηση. Όσον αφορά την RFS ή OS, οι ασθενείς που επέζησαν για περισσότερο από 60 μήνες (5 έτη) αναλύθηκαν ως επιζώντες. Ρ & lt? 0,05 θεωρήθηκε για να δείξει στατιστική σημαντικότητα. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τα πακέτα λογισμικού SAS (SAS Institute, Cary, NC).

Αποτελέσματα

προφίλ καθεστώς και μεθυλίωσης p53

γονίδιο του

PGP9

.

5

,

NMDAR2B

,

CCNA1

, και

DAPK

στο pStage ΙΙ-ΙΙΙ γαστρικό καρκίνο

p53

μεταλλάξεις εντοπίστηκαν σε 44 από 163 ασθενείς με πρωτοπαθή καρκίνο του στομάχου (27%) με ανάλυση SSPC.

p53

γονιδιακή μετάλλαξη δεν έχουν προγνωστική σημασία (Σχήμα 2Α). Στη συνέχεια αναλύονται τα προφίλ μεθυλίωσης του

PGP9

.

5

,

NMDAR2B

,

CCNA1

, και

DAPK

σε αυτούς τους ιστούς χρησιμοποιώντας Q-MSP. Η αξία TaqMeth όλων των γονιδίων ήταν υψηλότερη σε πρωτοπαθείς όγκους του καρκίνου του στομάχου με άγριου τύπου

p53

από ό, τι σε εκείνες με μεταλλαγμένο

p53

(γονιδιακή σειρά μεθυλίωση:.

PGP9

5

& gt?

NMDAR2B

& gt?

CCNA1

& gt?

DAPK

) (Σχήμα 3Α και S1 και S2 σχήματα). Μεθυλίωση του υποκινητή DNA ήταν σημαντικά υψηλότερο για

CCNA1

(p & lt? 0.0001) και

PGP9

5

(p = 0,03), και οριακά σημαντικά υψηλότερο για

NMDAR2B

(p = 0.10) και

DAPK

(p = 0.05) κατά την πρωτογενή καρκίνο του στομάχου σε σύγκριση με το αντίστοιχο φυσιολογικό βλεννογόνο. Είναι σημαντικό, μια υπερ-υψηλού επιπέδου μεθυλίωσης του

PGP9

.

5

,

NMDAR2B

, και

CCNA1

βρέθηκε αποκλειστικά σε πρωτογενείς όγκους χωρίς

p53

μετάλλαξη, οι τιμές αποκοπής TaqMeth ήταν 50, 163 και 133, αντίστοιχα (Σχήμα 3Α). Τέτοια υπερ-υψηλής μεθυλίωσης του

PGP9

.

5

,

NMDAR2B

και

CCNA1

βρέθηκε σε 14, 19, και 8 δείγματα, αντίστοιχα, και ορισμένα από αυτά τα δείγματα επικαλυπτόμενες (σχήμα 3Β).

DAPK

δεν εμφανίζουν την τάση αυτή, επειδή η

DAPK

επίπεδο μεθυλίωσης ήταν αρκετά υψηλό στους αντίστοιχους φυσιολογικούς ιστούς βλεννογόνου ενός σημαντικού τμήματος των περιπτώσεων (S2 σχήμα).

(Α) σύμφωνα με την

p53

κατάσταση μετάλλαξης του γονιδίου και (Β) σύμφωνα με το

p53

εκτροπή ομάδα.

η

(Α) η μεθυλίωση των γονιδίων που αναφέρονται αναλύθηκε χρησιμοποιώντας Q-MSP και TAqMeth τιμές σε όγκους με

ρ53

άγριου τύπου συγκρίθηκαν με εκείνους με

p53

μετάλλαξη. Η οριακή τιμή για τον προσδιορισμό ότι ένα γονίδιο μεθυλιώνεται προσδιορίστηκε ως η μέγιστη τιμή TaqMeth του

p53

άγριου τύπου. (Β) των όγκων με

ρ53

άγριου τύπου ή

p53

μετάλλαξη συγκρίθηκαν όσον αφορά την παρουσία του υπερ-υψηλής μεθυλίωσης των υποδεικνυόμενων γονιδίων. Super-υψηλής μεθυλίωσης προσδιορίστηκε ότι τουλάχιστον ένα γονίδιο έδειξαν υψηλότερη τιμή TaqMeth από κάθε τιμές κατωφλίου μεταξύ των τριών γονιδίων.

Η

Ανοσοϊστοχημική ανάλυση PGP9.5, NMDAR2N, και η έκφραση πρωτεΐνης CCNA1 σε πρωτογενείς γαστρικό καρκίνο

η ανοσοϊστοχημική χρώση για PGP9.5, NAMDR2B και η έκφραση πρωτεΐνης CCNA1 συνέχεια διεξήχθη τόσο σε περιπτώσεις με υπερ-υψηλή μεθυλίωση και εκείνων με χαμηλό μεθυλίωση αυτών των γονιδίων. Μια ισχυρή μείωση στην έκφραση του PGP9.5, NMDAR2B και CCNA1 παρατηρήθηκε σε πρωτογενή γαστρικού καρκινικούς ιστούς όταν η μεθυλίωση του DNA προαγωγέα ήταν υπερ-υψηλή (Σχήμα 3). Από την άλλη πλευρά, καμία μείωση στην πρωτεΐνη έκφραση του PGP9.5, NMDAR2B, ή CCNA1 βρέθηκε όταν η μεθυλίωση του DNA προαγωγέα ήταν χαμηλή (Σχήμα 4).

Η ανοσοϊστοχημική χρώση του PGP9.5, NMADR2B, και CCNA1 σε πρωτογενή όγκο, με ή χωρίς υπερμεθυλίωση της περιοχής προαγωγέα του αντίστοιχου γονιδίου (αρχική μεγέθυνση, Χ100, κλίμακα bars, 100 μm).

η

κλινικοπαθολογοανατομικές ανάλυση σε πρωτογενή καρκίνο του στομάχου με παθολογικές σταδίου ΙΙ /ΙΙΙ γαστρικό καρκίνο με συνήθη θεραπεία

κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά και πρόγνωση (5-χρόνια RFS και OS) στη συνέχεια αναλύθηκαν με μονοπαραγοντική τρόπο γαστρικό καρκίνο με παθολογικές σταδίου ΙΙ /ΙΙΙ γαστρικού καρκίνου με τη συνήθη θεραπεία (χειρουργική συν μετεγχειρητική S- 1 χορήγηση) (Πίνακας 1). Εμείς κατατάσσονται οι ασθενείς με καρκίνο του στομάχου σε 3 κατηγορίες με βάση το

p53

κατάσταση μετάλλαξης, καθώς και η κατάσταση μεθυλίωσης του DNA των

PGP9

.

5

,

NMDAR2B

και

CCNA1

, το οποίο ορίζεται ως γονιδιωματική και επιγενετικών κατηγορίες, αντίστοιχα (GEC). Αυτές οι τρεις κατηγορίες ήταν

p53

μεταλλαγμένο,

p53

άγριου τύπου με υπερ-υψηλής μεθυλίωσης (SHM) από τα παραπάνω 3

γονίδια p53

οδού (

p53

WT /SHM), και

p53

άγριου τύπου χωρίς (w /o) SHM (

p53

WT w /o SHM).

Είναι ενδιαφέρον, ομάδες ασθενών, ταξινομούνται ανάλογα επί GECS συσχετίζονταν σημαντικά με το φύλο (p = 0,0003), ηλικία (ρ = 0.08), ιστολογία Lauren (σ = 0.005) και το μοτίβο διήθηση (p = 0.001), αλλά όχι με προγνωστικούς παράγοντες όπως οι παράγοντες στάσης. ομάδες ασθενών ταξινομούνται ανάλογα με την GECS επίσης έδειξε ότι

p53

μεταλλαγμένων και

p53

WT /SHM ομάδες ήταν παρόμοιες όσον αφορά τον αριθμό των ασθενών για κάθε κλινική χαρακτηριστικό, αλλά διέφερε από την άποψη αυτή σε σύγκριση με το

p53

WT w /o ομάδα SHM. Έτσι, η νέα ορισθείσα τις πρώην ομάδες (το

p53

μεταλλαγμένο συν τα

p53

WT /ομάδες SHM) όπως το

p53 ομάδα

εκτροπή, και η τελευταία ομάδα (

p53

WT w /o SHM) ορίστηκε ως

p53

ομάδα μη εκτροπή.

Αν και πρόγνωση δεν ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ των ομάδων σε κατηγορίες ανάλογα με GEC (Σχήμα 2Β ), περισσότερες υποτροπές βρέθηκαν στο

εκτροπή ομάδα p53

σε σύγκριση με το

p53

ομάδα μη εκτροπή (Πίνακας 1, δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά). Αυτή η τάση διατηρήθηκε σε όρους του προτύπου επανάληψης του κάθε λεμφαδένων, περιτόναιο, και απομακρυσμένα όργανα (Πίνακας 2), προτείνοντας ότι το

ομάδα p53

εκτροπή είναι πιθανό να παρουσιάζουν κλινικά μοναδικό φαινότυπο ακόμη και από ένα προγνωστική άποψη. Όταν αναλύθηκαν μόνο περιπτώσεις υποτροπών, η

ομάδα p53

εκτροπή και πάλι σχετίζεται σημαντικά με ιστολογία Lauren (πίνακας 2, P = 0,01), ωστόσο δεν υπήρχαν σχέδια επανάληψης που ήταν μοναδική για

p53

εκτροπή.

η

από την άλλη πλευρά, η διάχυτη τύπος του καρκίνου του στομάχου παρουσίασαν σημαντικά καλύτερη πρόγνωση από τον εντερικό τύπο του καρκίνου του στομάχου στο

ομάδα p53

εκτροπή (Σχήμα 5Α). Δεδομένου ότι αυτοί οι ασθενείς είχαν την τάση να διανέμονται σε ένα πιο προχωρημένο στάδιο, αυτά τα δεδομένα επιβίωσης πρότεινε ότι S1 μετεγχειρητική επικουρική χημειοθεραπεία είναι πιο αποτελεσματική για τη διάχυτη τύπου καρκίνο του στομάχου ό, τι για εντερική τύπου γαστρικού καρκίνου σε περιπτώσεις με

p53

οδό εκτροπή (Εικ 5Β).

(καμπύλες Α) επιβίωσης για εντερική τύπου συγκρίθηκαν με εκείνες του διάχυτου τύπου γαστρικό καρκίνο με pStage ΙΙ /ΙΙΙ. (Β) τη διανομή στάδιο του καρκίνου, σύμφωνα με τις

ομάδα p53

εκτροπή και ιστολογικά ευρήματα.

Η

Τέλος, ως στοιχεία αναφοράς (Πίνακας 1), μονοπαραγοντική προγνωστική ανάλυση για RFS και λειτουργικό σύστημα όλων ασθενείς που προσδιορίζονται κλινικά σημαντικές δυνατότητες προγνωστικούς παράγοντες που αντιπροσωπεύουν κακή επιβίωση, όπως το φύλο (Ρ = 0,03, Ρ = 0,1), ηλικίας ≥67 ετών (Ρ = 0,009, Ρ = 0,001), ανώτερη θέση του όγκου (Ρ = 0,06, Ρ = 0,1), το 14

ου JGCA /7

ου UICC pt (P = 0,08, P = 0,4), το 14

ου JGCA ρΝ (P = 0,001, P = 0,06), και το 14

ου JGCA /7

ου σταδίου UICC (P & lt? 0,0001, Ρ = 0,03).

Επιγενετική που προκαλείται από τη θεραπεία έκφραση της πρωτεΐνης p53, σύμφωνη με τη δραστηριότητα της ρ53 μεταγραφικής

Επιγενετική θεραπεία του NUGC4 γαστρικού καρκίνου των κυττάρων γραμμές (άγριου τύπου

p53

) με 5 μΜ 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνης ή 5 μΜ 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνης συν τριχοστατίνη Α σθεναρά επαγόμενη απόπτωση με την απουσία του χημειοθεραπευτικού παράγοντα CDDP. Πρόσθετη θεραπεία με CDDP αυξηθεί περαιτέρω σημαντικά αυτά τα αποπτωτικά αποτελέσματα (Σχήμα 6C). Είναι ενδιαφέρον ότι, CDDP σε συνδυασμό με επιγενετικές θεραπείες αυξήθηκαν σημαντικά το επίπεδο της πρωτεΐνης p53, το οποίο εν μέρει, αλλά όχι εντελώς, η οποία αντικατοπτρίζεται

ρ53

μεταγραφική δραστικότητα ενός γονιδίου αναφοράς της λουσιφεράσης (Σχήμα 6Α και 6Β). Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι το

δραστηριότητας μεταγραφής ρ53

μπορεί να ενεργοποιηθεί από επιγενετικές θεραπείες, ωστόσο, προτείνει, επίσης, ότι η απόπτωση προκαλείται μόνο εν μέρει μέσω του

p53

οδού.

NUGC4 και KATOIII κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τον παράγοντα απομεθυλίωσης, 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (5-αζα-dC) παρουσία ή απουσία του αποακετυλάσης ιστόνης (HDAC) αναστολέα, τριχοστατίνη Α (TSA), και με την παρουσία ή απουσία το χημειοθεραπευτικό αντιδραστήριο, CDDP. 1Α και 5Α, 1 και 5 μΜ 5-αζα-dC? Τ, TSA. Ακολούθως τα κύτταρα αναλύθηκαν για: (Α) έκφραση πρωτεΐνης ρ53 με κηλίδωση Western. (Β) Μια διπλή δοκιμασία ρεπόρτερ για να επιβεβαιώσετε

δραστηριότητας μεταγραφής ρ53

. Η διακεκομμένη γραμμή δείχνει την βέλτιστη τιμή αποκοπής (0.15) για τον προσδιορισμό της δραστικότητας της ρ53. (C) Cell απόπτωση αναλύθηκε χρησιμοποιώντας Δοκιμασία νεξίνη. Μια αντιπροσωπευτική εικόνα εμφανίζεται. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως το ποσοστό των πρώιμων και όψιμων αποπτωτικών κυττάρων. * P & lt? 0,05, ** & lt? 0.001, *** & lt?. 0.0001

Η

Επιπλέον, επιγενετική θεραπεία των κυτταρικών σειρών καρκίνου του στομάχου KATOIII (

p53

null), με 1 μΜ 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνης ή 1 μΜ 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνης συν τριχοστατίνη Α σθεναρά επαγόμενη απόπτωση με την απουσία του CDDP, αλλά επιπλέον θεραπεία CDDP δεν περαιτέρω αυξάνουν σημαντικά τα αποπτωτικά αποτελέσματα (Σχήμα 6C). CDDP σε συνδυασμό με επιγενετικές θεραπείες δεν αύξησε το επίπεδο πρωτεΐνης ρ53, η οποία αντικατοπτρίζεται από την έλλειψη

ρ53

μεταγραφική δραστικότητα ενός γονιδίου αναφοράς της λουσιφεράσης (Σχήμα 6Α και 6Β). Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι το

δραστηριότητας p53

μεταγραφή δεν απαιτείται για απόπτωση με επιγενετικές θεραπείες σε κύτταρα KATOIII (

p53

null κύτταρα).

Συζήτηση

Αυτή η παρούσα μελέτη είναι η πρώτη αναφορά ότι οι SHM του όγκου γονίδια καταστολής στο

p53

μονοπατιού βρίσκεται αποκλειστικά στην παθολογική στάδιο II /III γαστρικό καρκίνο με άγριου τύπου

p53

(Σχήμα 3). Έχουμε επιλέξει pStage II /III ασθενείς με γαστρικό καρκίνο με συνήθεις θεραπείες για

ανάλυση ρ53

οδός, επειδή διεπιστημονική θεραπείες στους ασθενείς αυτούς να έχουν τις καλύτερες δυνατότητες για την επίτευξη προγνωστικούς βελτίωση με πλήρη ικανότητα σκλήρυνσης [24, 25]. Η εξέταση θα πρέπει να είναι η πρώτη προτεραιότητα κατά την εξέταση περαιτέρω ανάπτυξη νέων θεραπευτικών στρατηγικών.

Σχεδόν πλήρης μεθυλίωση του υποκινητή DNA CpG νησίδων απαιτείται για την πλήρη αδρανοποίηση των γονιδίων, και ακόμη και οι μικρές αναλογίες μη μεθυλιωμένων αλληλόμορφα μπορεί δυναμικά να προκαλέσει την έκφραση του γονιδίου [ ,,,0],1-5]. Στην πρωτογενή ιστούς όγκων, SHM πρέπει να αντιπροσωπεύουν σχεδόν πλήρης μεθυλίωση σε καρκινικά κύτταρα, και SHM στις πρωτογενείς ιστούς όγκου όντως σχετίζεται με μειωμένη πρωτεΐνη έκφραση τέτοιων γονιδίων (Σχήμα 4). Αυτό το αποτέλεσμα πρότεινε ότι SHM των γονιδίων στο

p53

μονοπάτι θα μπορούσε να είναι λειτουργικά ισοδύναμη με

p53

λειτουργική ανωμαλία που εμφανίζεται ως αποτέλεσμα της

p53

μετάλλαξη, δεδομένου ότι αυτά τα 3 μόρια συνάρτηση με τον ίδιο

p53

οδού.

σε καρκίνο του στομάχου, η

p53

εκτροπή της ομάδας ήταν σημαντικά σχετίζεται με μοναδικό κλινικοπαθολογοανατομικές φαινοτύπους όπως εντερική ιστολογία Lauren, το αρσενικό φύλο, παλιά ηλικία, και λιγότερο διηθητική ανάπτυξη (Πίνακας 1). τρέχουσες παρατηρήσεις μας μπορεί να σχετίζεται με τις προηγούμενες αναφορές που έδειξαν ότι

p53

μετάλλαξη συσχετίζεται με το πρώιμο στάδιο του εντερικού τύπου γαστρικό καρκίνο, ή με μεταγενέστερο στάδιο της διάχυτης τύπου γαστρικού καρκίνου [26, 27], ή προχωρημένης ηλικίας [ ,,,0],28], ωστόσο, κλινικοπαθολογοανατομικές ανάλυσή μας περιλαμβάνονται κυρίως μεσαίο στάδιο καρκίνο του στομάχου. Είναι ενδιαφέρον, οδός εκτροπή είναι μοναδική και σταθερή ακόμα και σε επαναλαμβανόμενες ασθενείς (Πίνακας 2).

Θετική προγνωστική σημασία του

p53

μετάλλαξη σε καρκίνο του στομάχου είναι αμφιλεγόμενη και με τα δύο υποστηρικτές [29] και διαφωνούντες [30 ] αυτής της δυνατότητας. Με την πρώτη ματιά τα δεδομένα μας φαίνεται να υποστηρίζουν την τελευταία αυτή ομάδα, ωστόσο, θα πρέπει να ληφθεί υπόψη ότι τα δεδομένα επιβίωσή μας είναι πιθανό να έχουν τροποποιηθεί με μετεγχειρητική επικουρική χημειοθεραπεία (τυποποιημένη θεραπεία στην Ιαπωνία). Ότι, σε αντίθεση με την παρούσα μελέτη, η διάχυτη τύπος του γαστρικού καρκίνου έδειξε χειρότερη πρόγνωση από τον εντερικό τύπο του γαστρικού καρκίνου σε νοσοκομείο δεκαετίες μας πριν [15, 31], τα τελευταία ενημερωμένα δεδομένα επιβίωσης υποστηρίζουν τα αντίθετα αποτελέσματα (δηλαδή, η εντερική τύπος του καρκίνου του στομάχου δείχνει χειρότερη πρόγνωση από τη διάχυτη τύπο του καρκίνου του στομάχου), η οποία είναι πιθανώς οφείλεται σε S-1 μετεγχειρητικές ανοσοενισχυτικά αποτελέσματα [32]. Μετεγχειρητικά ανοσοενισχυτικό S-1 χημειοθεραπεία έχει προταθεί να είναι σημαντικά πιο αποτελεσματική για περιτοναϊκή νόσο από ότι για μετάσταση μακρινό όργανο [24], και είναι πιθανό να είναι πιο αποτελεσματικό για διάχυτη τύπου καρκίνο του στομάχου από ότι για εντερική τύπου γαστρικού καρκίνου [32] . Για τους λόγους αυτούς, η τελευταία ανάλυση επιβίωσης δείχνει ότι η πρόγνωση της διάχυτης τύπο του καρκίνου του στομάχου είναι βελτιωμένη έναντι εκείνης του εντερικού τύπο του καρκίνου του στομάχου.

Δεν υπήρχε στατιστική διαφορά στο ποσοστό υποτροπής ή στο μοναδικό sites υποτροπής μεταξύ του

ομάδα p53

εκτροπή και η

p53

ομάδα μη εκτροπή, ωστόσο πιο υποτροπές βρέθηκαν σε κάθε μία από τις περιοχές επανάληψης του

p53

μη εκτροπή ομάδα σε σύγκριση με το

εκτροπή ομάδα p53

. Τα ευρήματα αυτά θα μπορούσαν να υποδηλώνουν ότι το

p53

ομάδα μη εκτροπή έχει μια πιο επιθετική φαινότυπο από το

p53

εκτροπή ομάδα ως σύνολο. Στη μελέτη μας, η διάχυτη τύπο του καρκίνου του στομάχου παρουσίασαν σημαντικά καλύτερη πρόγνωση από τον εντερικό τύπο του καρκίνου του στομάχου στο

εκτροπή ομάδα p53

. Δεδομένου ότι αυτοί οι ασθενείς είχαν την τάση να διανέμονται σε ένα πιο προχωρημένο στάδιο, αυτά τα δεδομένα επιβίωσης πρότεινε ότι S1 μετεγχειρητική επικουρική χημειοθεραπεία είναι πιο αποτελεσματική για τη διάχυτη τύπου καρκίνο του στομάχου ό, τι για εντερική τύπου γαστρικού καρκίνου σε περιπτώσεις με

p53

οδό εκτροπή. Τα ευρήματα αυτά συμφωνούν με προηγούμενες αναφορές ότι μεταλλαγμένα

p53

ή /και ανοσοχρώση των πρωτεϊνών p53 θα μπορούσε να είναι προγνωστική βιολογικών δεικτών για τα θετικά αποτελέσματα της υψηλής δόσης εισαγωγική χημειοθεραπεία σε καρκίνο του στομάχου [30].

Τέλος αξιολογούνται επιγενετικές επιδράσεις της θεραπείας σε συνδυασμό με ένα χημειοθεραπευτικό παράγοντα, προκειμένου να συγκριθεί η σημασία του

ρ53

μονοπάτι προς την επιγενετικών μονοπάτι σε γαστρικό καρκίνο κύτταρα κατεργασμένα με CDDP. Απροσδόκητα, φαίνεται ότι η

p53

οδός ήταν απίθανο να παίξει έναν πολύ σημαντικό ρόλο στην επαγωγή απόπτωσης από CDDP (Σχήμα 6). Απεδείχθη προσφάτως ότι επιγενετικές καρκινογένεση είναι πράγματι δυνατή. Σε αυτό το σύστημα, η συστηματική iPS που επάγεται από τον επαναπρογραμματισμό παράγοντες έχει σαν αποτέλεσμα συστημική εκδήλωση καρκίνου με δυναμικές επιγενετικές μεταβολές, ενώ συστημική αναστροφή αυτών των παραγόντων επαναπρογραμματισμού επανέρχεται καρκινικά κύτταρα σε φυσιολογικά κύτταρα [33]. Γαστρικό καρκίνος είναι πιθανόν να φιλοξενούν λιγότερες μεταλλάξεις των γονιδίων οδηγού [34] από καρκίνο του παχέος εντέρου [35], και, ομοίως, οι μεταλλάξεις εκτός από το

p53

γονίδιο είναι σπάνιες στον καρκίνο του μαστού [35], υποδηλώνοντας ότι επιγενετικές καρκινογένεση είναι μια πιθανή σημαντική αιτιολογία με χρόνια λοίμωξη από ελικοβακτηρίδιο του πυλωρού [36-38]. Έχουμε αποδείξει πρόσφατα το υπερ-μεθυλίωση του

Reprimo

[39], η οποία και πάλι είναι ένα γονίδιο στο

p53

οδού αλλά τα οποία δεν θα μπορούσαν να συμπεριληφθούν σε αυτή τη μελέτη, και

ΗορΧ

[16] και

CDO1

[40] που εμπλέκονται τόσο στην απόπτωση, αλλά πιθανώς όχι μέσω του

p53

οδού. Με βάση τις τρέχουσες λειτουργικές πειράματα μας, ο

ρ53

μονοπάτι συμβολή επιγενετικές επιδράσεις της θεραπείας είναι πιθανό να είναι πολύ μικρότερη από εκείνη των άλλων οδών (Σχήμα 5). Χρησιμοποιήσαμε άλλες κυτταρικές γραμμές (2 κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου και ηπατοκυτταρικού 1 κυτταρική γραμμή καρκίνου) να προσδιοριστεί με ακρίβεια η συμβολή του

ρ53

μονοπάτι στην απόπτωση που επάγεται από CDDP σε συνδυασμό με επιγενετικές θεραπείες. Τα πρόσθετα πειράματα που διεξήχθησαν φαίνεται στο S3 Σχ. κυτταρικές σειρές ΑΖ521 και HepG2 είναι

p53

άγριου τύπου, και το SH10 κυτταρική γραμμή είναι

p53

μεταλλαγμένο.

p53

δραστηριότητα εντοπίστηκε στο

p53

κύτταρα άγριου τύπου, όμως, η δραστηριότητά της ήταν εξαρτάται από την κάθε κυτταρική σειρά. Έτσι,

p53

δραστικότητα ανιχνεύθηκε σε κύτταρα NUGC4 με αγωγή CDDP και ΑΖ521 και HepG2 κύτταρα χωρίς θεραπεία CDDP. Ισχυρή απόπτωση όπως εκτιμήθηκε από προσδιορισμό απόπτωσης (κασπάσης 3 ή Δοκιμασία νεξίνη) δεν αντικατοπτρίζουν απαραίτητα το βαθμό της

p53

μεταγραφική ενεργοποίηση. Στις

ρ53

μεταλλαγμένο (SH10) ή

null κύτταρα p53

,

ρ53

μεταγραφική δραστηριότητα δεν επάγεται καθόλου, ωστόσο η απόπτωση βρέθηκε να είναι παρόμοια με εκείνη