Αφηρημένο

Τα υψηλά επίπεδα της ενδοκυτταρικής αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) σε κύτταρα αναγνωρίζεται ως μία από τις κύριες αιτίες του καρκίνου κυτταρικής απόπτωσης και έχει εξελιχθεί σε μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτική στρατηγική για την θεραπεία του καρκίνου. Ωστόσο, αν συνδέονται απόπτωση βιοφυσικές ιδιότητες των καρκινικών κυττάρων που σχετίζονται με την ενδοκυτταρική λειτουργίες ROS είναι ακόμα ασαφής. Εδώ, για πρώτη φορά, προσδιορίσαμε τις αλλαγές του βιοφυσικές ιδιότητες που συνδέονται με την ROS μεσολάβηση οισοφαγικό καρκίνο απόπτωση κυττάρων KYSE-150 χρησιμοποιώντας υψηλής ανάλυσης μικροσκοπία ατομικής δύναμης (AFM). Oridonin αποδείχθηκε ότι επάγει ROS απόπτωση που διαμεσολαβείται από κύτταρο KYSE-150 σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο, η οποία θα μπορούσε να αντιστραφεί με Ν-ακετυλοκυστεΐνη (NAC) προεπεξεργασία. Με βάση την AFM απεικόνισης, η μορφολογική βλάβη και υπερδομικές αλλαγές KYSE-150 κύτταρα βρέθηκαν να συνδέονται στενά με τις ROS μεσολάβηση oridonin επαγόμενη απόπτωση των κυττάρων KYSE-150. Οι αλλαγές του κυττάρου ακαμψία προσδιορίζεται με μέτρηση ισχύος AFM απέδειξαν επίσης ROS μεταβολές που εξαρτώνται από oridonin επαγόμενη απόπτωση των κυττάρων KYSE-150. Τα ευρήματά μας παρέχεται όχι μόνο νέες γνώσεις σχετικά με τις αντικαρκινικές επιδράσεις του oridonin, αλλά και υπογράμμισε τη χρήση του AFM ως ποιοτική και ποσοτική nanotool για την ανίχνευση ROS μεσολάβηση των καρκινικών κυττάρων απόπτωσης βασίζεται σε βιοφυσικές ιδιότητες των κυττάρων, προσφέροντας νέες πληροφορίες από τους ρόλους των ROS σε απόπτωση των καρκινικών κυττάρων σε νανοκλίμακα

Παράθεση:. Pi J, Cai Η, Jin Η, Yang F, Jiang J, Wu A, et al. (2015) Ποιοτική και ποσοτική ανάλυση των ROS-Mediated Oridonin-Induced καρκίνο του οισοφάγου KYSE-150 κυτταρικής απόπτωσης με μικροσκοπία ατομικής δύναμης. PLoS ONE 10 (10): e0140935. doi: 10.1371 /journal.pone.0140935

Επιμέλεια: Etienne Dague, LAAS-CNRS, Γαλλία

Ελήφθη: May 25, 2015? Αποδεκτές: 30η Σεπτεμβρίου, 2015? Δημοσιεύθηκε: 23, Οκτωβρίου 2015

Copyright: © 2015 Pi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Ταμείο Ανάπτυξης Μακάο Επιστήμης και Τεχνολογίας (Νο 028/2014 /Α1), https://www.fdct.gov. mo /

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) μέσα στα κύτταρα, όπως υπεροξείδιο του υδρογόνου, το υπεροξείδιο ανιόντα και ρίζες υδροξυλίου, ενεργούν ως δεύτεροι αγγελιαφόροι στη ρύθμιση πολλών σημαντικών κυτταρικών γεγονότων, συμπεριλαμβανομένης της ενεργοποίησης της μεταγραφής του παράγοντα, η γονιδιακή έκφραση και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση και γήρανση [1]. ROS έχουν επίσης εμπλακεί στην μεταβολική επαναπρογραμματισμό των καρκινικών κυττάρων, που παίζουν σημαντικό ρόλο στη μύηση του όγκου, της προόδου και της μετάστασης [2]. Και με βάση τη διαφορετική κατάσταση οξειδοαναγωγής των φυσιολογικών και καρκινικών κυττάρων, μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτική στρατηγική που βασίζεται στην φάρμακα που αυξάνουν την παραγωγή ROS και επάγουν απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα βγαίνει για τη θεραπεία του καρκίνου [3]. Τα υψηλά επίπεδα των ROS μπορεί να επάγει απ ‘ευθείας οξειδωτική βλάβη σε λιπίδια, πρωτεΐνες και νουκλεϊκά οξέα, ως εκ τούτου σκοτώνουν τα καρκινικά κύτταρα με τη διατάραξη του μεταβολισμού και μεταγωγή σήματος. Η αυξημένη παραγωγή ROS είναι πάντα εμπλέκονται στην αντικαρκινική μηχανισμό των πιθανών αντικαρκινικών φαρμάκων, και συμμετέχει επίσης σε ορισμένες κλινικές χρησιμοποιημένα αντικαρκινικά φάρμακα, όπως είναι η πακλιταξέλη, η 5-φθοριοουρακίλη και δοξορουβικίνη [4-6].

Rabdosia rubescens, ένα το είδος της βοτανικής ιατρικής, έχει χρησιμοποιηθεί παραδοσιακά στην Κίνα για τη θεραπεία της φαρυγγίτιδας και καρκίνωμα του οισοφάγου. Oridonin, η κύρια φαρμακολογική δραστική ουσία του rubescens rabdosia με διάφορες φαρμακολογικές και φυσιολογικές επιδράσεις, έχει χαράξει μια αυξανόμενη προσοχή για τους βιολόγους του καρκίνου που οφείλεται σε αξιόλογες δραστηριότητες αντι-όγκου της [7, 8]. Έχει αναφερθεί ότι oridonin μπορεί να επάγει την απόπτωση ή αυτοφαγία σε διάφορα είδη καρκινικών κυττάρων, όπως κυττάρων πολλαπλού μυελώματος [9], ορθοκολικό καρκίνο κυττάρων [10], κύτταρο καρκινώματος ηπάτωμα [11], κύτταρα καρκίνου του προστάτη [12], καρκίνωμα του τραχήλου κύτταρα [13] and.oesophageal καρκινικών κυττάρων [14]. Και πολύ ενδιαφέροντα τρόπο, η έκθεση αυτών των καρκινικών κυττάρων να oridonin ως αποτέλεσμα μια σημαντική αύξηση στην παραγωγή ROS και η καθαριστή ROS, όπως Ν-ακετυλοκυστεΐνη (NAC), προστατεύει πλήρως αυτά τα καρκινικά κύτταρα από προκαλούμενη oridonin κυτταρικό θάνατο [9-13]. Ως εκ τούτου, oridonin θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως μια ιδανική αντικαρκινικό παράγοντα για τη μελέτη των ROS μεσολάβηση απόπτωση στα καρκινικά κύτταρα.

Ως μέλος της μικροσκοπίας σάρωσης σήραγγας (STM) τεχνικές, μικροσκοπία ατομικής δύναμης (AFM) είναι πολύ χρήσιμο στην τοπογραφία απεικόνισης, μηχανικό αποφασιστικότητα και μόνο έρευνα μόριο δύναμη βασίζεται στην ανίχνευση της εκτροπής προβόλου που προκαλείται από τις δυνάμεις μεταξύ του άκρου AFM και το δείγμα. Με βάση αυτά τα πλεονεκτήματα, AFM έχει γίνει ένα από τα πιο ισχυρά νανοτεχνολογιών για

in situ

μόνο μόριο απεικόνιση των κυττάρων, ειδικά για ανιχνεύσεις κυτταρικής μεμβράνης [15]. Πρόσφατα, AFM έχει εισαχθεί για τη μελέτη του καρκίνου του κυτταρικού θανάτου που επάγεται από φαρμακευτική αγωγή, η οποία όχι μόνο παρέχει την υψηλή ανάλυση μορφολογικής πληροφορίες, αλλά τονίζει επίσης τις βιο-μηχανικές αλλαγές κατά τη διάρκεια του κυτταρικού θανάτου [16-18]. Τα έργα αυτά αποδεικνύουν ότι η AFM είναι πολύ χρήσιμο για τη μελέτη της αντικαρκινικής αποτελέσματα φαρμάκων με βάση τα κυτταρικά βιοφυσικές ιδιότητες. Προηγούμενες AFM μελέτες έχουν αποδείξει ότι ο καρκίνος κυτταρικής απόπτωσης είναι στενά συνδεδεμένη με την ενδοκυτταρική επίπεδο ROS [19-21]. Αλλά υπάρχει ακόμα καμία συστηματική AFM μελέτη ή ανάλυση σχετικά με τις αλλαγές των βιοφυσικών ιδιοτήτων σε ROS-απόπτωση καρκίνο.

Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιώντας υψηλής AFM ανάλυση, εμείς ερευνηθεί συστηματικά οι βιοφυσικές ιδιότητες του ανθρώπινου οισοφάγου καρκίνου KYSE -150 κύτταρα, τα οποία βρέθηκαν να σχετίζονται στενά με ROS-απόπτωση που προκαλείται από oridonin. Oridonin βρέθηκε να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό, να διαταράξει το δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης και να επάγει απόπτωση των KYSE-150 κύτταρα σε όλη τη διάρκεια της παραγωγής ROS σε KYSE-150 κύτταρα. Όλες αυτές οι επιδράσεις της oridonin για KYSE-150 κύτταρα θα μπορούσε να αντιστραφεί από την NAC ROS-οδοκαθαριστής, αναφέροντας τις ROS μεσολάβηση αντικαρκινικές δράσεις της oridonin για KYSE-150 κύτταρα. Στη συνέχεια, η υψηλή ανάλυση AFM εφαρμόστηκε για την ανάλυση των αποτελεσμάτων των αντικαρκινικών oridonin επί KYSE-150 κύτταρα με βάση τις βιοφυσικές ιδιότητες των κυττάρων. Και κυρίως, βρήκαμε ότι, για πρώτη φορά, AFM ανιχνεύεται μορφολογική βλάβη, μεμβράνη υπερδομικές αλλαγές και εμβιομηχανική μεταβολές των αποπτωτικών KYSE-150 κυττάρων που επάγεται από oridonin επίσης στενά συνδεδεμένη με το επίπεδο ROS ενδοκυτταρικής του KYSE-150 κύτταρα, καταδεικνύοντας τη χρήση του AFM ως ένα ισχυρό nanotool για τη μελέτη των ROS μεσολάβηση των καρκινικών κυττάρων σε απόπτωση.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά |

Oridonin (≥98%, HPLC) λαμβάνεται από Mingwang biotechology (Κίνα). Ορός εμβρύου μόσχου (FCS), πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη, τροποποιημένο Eagle Medium του Dulbecco (DMEM), και κιτ θρυψίνη λαμβάνονται από την Gibco (ΗΠΑ). Η παραφορμαλδεΰδη αγοράζεται από τη Sigma (USA). 3- (4, 5) -dimethylthiazo (-Z-Y1) -3,5-diphenyt- etrazoliumromide (ΜΤΤ), Ν-ακετυλο-L-κυστεΐνη (NAC), Annexin V-FITC /ΡΙ (αννεξίνη V-Φλουορεσκεΐνη Ισοθειοκυανική /ιωδιούχου προπιδίου) κιτ ανίχνευσης απόπτωσης, DCFH-DA (2 ‘, 7’-dichlorodihydrofluorescein διοξική) κιτ δοκιμασίας αντιδραστικά είδη οξυγόνου, ροδαμίνη 123, ακτίνη Tracker πράσινο (phalloidin- φλουορεσκεΐνη ισοθειοκυανική), 2- (4-αμιδινοφαινυλ) -6 οι διυδροχλωρική -indolecarbamidine (DAPI) και ανάλυση του κυτταρικού κύκλου κιτ (ιωδιούχο προπίδιο) αγοράστηκε από Beyotime Ινστιτούτο Βιοτεχνολογίας, Κίνα.

καλλιέργειας κυττάρων

Ανθρώπινο οισοφαγικού καρκίνου κυτταρική γραμμή KYSE-150 αγοράζεται από βιβλιοθήκη κυττάρου όγκου της κινεζικής Ακαδημίας Ιατρικών Επιστημών (Πεκίνο, Κίνα), οι οποίες καλλιεργούνται με μέσο ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FBS, 100 U /mL πενικιλλίνη, και 100 g /mL στρεπτομυκίνη σε μία υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2 στους 37 ° C.

κυτταρική βιωσιμότητα μέτρηση

δοκιμασία ΜΤΤ χρησιμοποιήθηκε για να δοκιμαστεί η βιωσιμότητα κυττάρου των KYSE-150 κύτταρα εκτέθηκαν σε oridonin. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων με πυκνότητα 5 χ 10

3 κύτταρα /φρεάτιο για 24 ώρες και επωάζονται με διαφορετική συγκέντρωση oridonin για 24 ώρες. Για να σαρώνουν τα ROS παράγονται από oridonin, τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με 2.5 mM NAC για 1 ώρα και στη συνέχεια κατεργάζεται με oridonin για 24 ώρες. Μετά τη θεραπεία oridonin, αντιδραστήριο ΜΤΤ (10 μΙ, 5 mg /mL) προστέθηκε στη συνέχεια σε κάθε επώαση καλά για 4 ώρες, το μέσο απομακρύνθηκε, και τα κύτταρα αιωρήθηκαν σε 150 μι DMSO να επωαστούν για 10 λεπτά. Ένα φασματοφωτόμετρο (TECAN, Switzer-γης) χρησιμοποιήθηκε για τη δοκιμή της απορρόφησης στα 490 nm.

Η ενδοκυτταρική ROS αποφασιστικότητα επίπεδο

Το επίπεδο των ROS ενδοκυτταρική των KYSE-150 κυττάρων προσδιορίστηκε από DCFH-DA με βάση κιτ προσδιορισμού αντιδραστικά είδη οξυγόνου. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων με πυκνότητα 1 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο για 24 ώρες και επωάστηκαν με διαφορετική συγκέντρωση oridonin για 3 ώρες. Για να σαρώνουν τα ROS παράγονται από oridonin, τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με 2.5 mM NAC για 1 ώρα και στη συνέχεια κατεργάζεται με oridonin για 3 ώρες. Μετά oridonin κατεργασία, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν τριπλό με PBS και επωάστηκαν με διάλυμα DCFH-DA για 30 λεπτά σε σκοτάδι στους 37 ° C. Η κυτταρομετρία ροής (BD, USA) χρησιμοποιήθηκε για να ανιχνεύσει το ενδοκυτταρικό επίπεδο ROS μετά τα κύτταρα συλλέχθηκαν και πλύθηκαν δύο φορές με PBS.

κυτταρικής απόπτωσης

ανίχνευση

Annexin V-FITC /ΡΙ κιτ ανίχνευσης απόπτωσης χρησιμοποιήθηκε για να ανιχνευθεί η απόπτωση των oridonin αγωγή KYSE-150 κυττάρων σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων με πυκνότητα 1 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο για 24 ώρες και επωάστηκαν με διαφορετική συγκέντρωση oridonin για 24 ώρες. Για να σαρώνουν τα ROS παράγονται από oridonin, τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με 2.5 mM NAC για 1 ώρα και στη συνέχεια κατεργάζεται με oridonin για 24 ώρες. Μετά επωάστηκαν με oridonin, KYSE-150 κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν τριπλό με PBS, αιωρήθηκαν σε αννεξίνης V ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης, και επωάστηκαν με ΡΙΤΟ-επισημασμένο αννεξίνης V και ΡΙ για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου σε σκοτάδι. Στη συνέχεια, τα δείγματα αναλύθηκαν αμέσως με κυτταρομετρία ροής (BD, ΗΠΑ).

μεμβράνη μιτοχονδριακού δυναμικού ανάλυση

Rhodamine 123 με βάση κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των μεταβολών του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης (ΜΜΡ ) της KYSE-150 κύτταρα κατά την αγωγή oridonin. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων με πυκνότητα 1 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο για 24 ώρες και επωάστηκαν με διαφορετική συγκέντρωση oridonin για 24 ώρες. Για να σαρώνουν τα ROS παράγονται από oridonin, τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με 2.5 mM NAC για 1 ώρα και στη συνέχεια κατεργάζεται με oridonin για 24 ώρες. Τα συλλεγέντα και πλυμένα κύτταρα KYSE-150 επωάστηκαν με ροδαμίνη 123 για 60 λεπτά σε σκοτάδι στους 37 ° C. Η κυτταρομετρία ροής (BD, USA) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση του σήματος φθορισμού ροδαμίνης 123 μετά τα κύτταρα συλλέχθηκαν και πλύθηκαν δύο φορές με PBS.

παρασκευή AFM δείγμα

Για μετρήσεις AFM, KYSE-150 κύτταρα συλλέχθηκαν με 0.25% θρυψίνη και καλλιεργήθηκαν σε πυκνότητα 5 χ 10

4 κύτταρα /φρεάτιο σε γυάλινες καλυπτρίδες σε πλάκα έξι. Μετά από ολονύκτια επώαση, oridonin προστέθηκε στο μέσο καλλιέργειας για 24 ώρες διέγερση. Για να σαρώνουν τα ROS παράγονται από oridonin, τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με 2.5 mM NAC για 1 ώρα και στη συνέχεια κατεργάζεται με oridonin για 24 ώρες. Μετά από αυτό, τα κύτταρα πλύθηκαν τριπλό με PBS, μονιμοποιήθηκαν με διάλυμα παραφορμαλδεΰδης 4% επί 10 λεπτά, πλύθηκαν τριπλά με αποσταγμένο νερό και ξηραίνεται στον αέρα για μορφολογία απεικόνιση στον αέρα ή αμέσως χρησιμοποιούνται για μετρήσεις ισχύος σε διάλυμα PBS. Για ζουν μετρήσεις κυττάρων ακαμψία, KYSE-150 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς oridonin και NAC για 24 ώρες, και στη συνέχεια πλύθηκε με ρυθμιστικό διάλυμα PBS για να απορρίψει τις εναιώρησης κυττάρων στο μέσο. Τα κύτταρα στη συνέχεια χρησιμοποιούνται για μετρήσεις μέτρο του Young σε μέσο DMEM με AFM.

AFM μορφολογία απεικόνισης και ultrastructure μεμβράνη ανάλυση

AFM χρησιμοποιήθηκε για να διερευνήσει την τοπογραφική και υπερδομής (Bruker, Γερμανικά) οι αλλαγές KYSE 150-κυττάρων που επάγεται από oridonin θεραπεία. Οργανικά μολύνει από τις συμβουλές νιτριδίου πυριτίου που χρησιμοποιείται σε όλες τις μετρήσεις απομακρύνθηκαν με υπεριώδη ακτινοβολία. Οι σταθερές άνοιξη του AFM συμβουλές έχουν βαθμονομηθεί χρησιμοποιώντας τη μέθοδο του θερμικού θορύβου που εφαρμόζονται στο λογισμικό Νθηοδοορθ στην AFM. Πρώτον, η βαθμονόμηση της ευαισθησίας εκτροπής διεξήχθη στις καλυπτρίδες από γυαλί με μια μικρή κατακόρυφη απόκλιση (~ 0 V) ​​στον αέρα. Τότε η καμπύλη θερμικής μελωδία είχε τοποθετηθεί από τον απλό αρμονικό ταλαντωτή τοποθέτηση για τον υπολογισμό της σταθεράς του ελατηρίου. Η ακτίνα καμπυλότητας των AFM συμβουλές (BudgetSensors, Βουλγαρία) που χρησιμοποιούνται για την απεικόνιση της μορφολογίας ήταν 10 nm, και η σταθερά του ελατηρίου από συμβουλές ήταν 0,51 ± 0,02 N /m με ευαισθησία εκτροπή του 52,94 ± 0,96 nm /V. Οι μορφολογικές και υπερδομικές εικόνες KYSE-150 κύτταρα ελήφθησαν στον αέρα σε θερμοκρασία δωματίου σε κατάσταση επαφής. Η υπερδομή του KYSE-150 κύτταρα που λαμβάνονται στις περιοχές που περιβάλλουν τους πυρήνες και το τοπογραφικό ανάλυση επεξεργασίας εικόνας και δεδομένων εκτελέστηκαν χρησιμοποιώντας το όργανο εξοπλισμένο λογισμικό Νθηοδοορθ Analysis. Και για να κάνουν τη γραμμή κλίμακας, οι ετικέτες του άξονα Χ και Υ άξονα ετικέτες των AFM εικόνες πιο ευανάγνωστο, έχουμε εκ νέου writed τη γραμμή κλίμακας και ετικέτες για τα Χ και Υ άξονα σε αυτά τα σχήματα. Για την ανάλυση των παραμέτρων υπερδομή, 30 διαφορετικές 2 × 2 um

2 εικόνες υπερδομή στις 15 διαφορετικά κύτταρα KYSE-150 σε κάθε ομάδα υπολογίστηκαν. Πριν από την ανάλυση των παραμέτρων υπερδομή, AFM εικόνες ισοπεδώθηκαν με την πρώτη παραγγελία Ισοπέδωση από το λογισμικό Νθηοδοορθ Analysis. Μετά από αυτό, το σύνολο υπερδομή εικόνα υπολογίστηκε για διανομή ύψος και την τραχύτητα με λογισμικό ανάλυσης Νθηοδοορθ.

AFM ακαμψία ανάλυση

βιο-μηχανικές ιδιότητες των ζωντανών κυττάρων KYSE-150 μετρήθηκαν σε μέσο ϋΜΕΜ με γυμνά συμβουλές σε λειτουργία Volume Force μέσω AFM (Bruker, γερμανικά). Η σταθερά ελατηρίου των ανιχνευτών νιτριδίου του πυριτίου που χρησιμοποιούνται για τη ζωή μετρήσεις κυττάρων (Bruker, Γερμανικά) βαθμονομήθηκε με τη μέθοδο θερμικού θορύβου σε καθαρό τρυβλίο καλλιέργειας που περιέχει PBS, το οποίο ήταν 0,08 ± 0,01 N /m με ευαισθησία εκτροπή του 16,23 ± 0,71 nm /V. Στη λειτουργία Volume Force, η κορυφή ήταν εναλλάξ πλησίασε στην επιφάνεια του κυττάρου και στη συνέχεια αποσύρεται από 16 × 16 πόντους πάνω από 1 × 1 um

2 περιοχή στην επιφάνεια του δείγματος, ενώ οι καμπύλες δύναμης ήταν συγχρονισμένα καταγράφηκαν. Για τους ζώντες meaurements κυττάρων, περισσότερα από 15 διαφορετικές θέσεις, στις 15 διαφορετικά κύτταρα καταγράφηκαν στην κεντρική περιοχή των κυττάρων σε κάθε ομάδα. μέτρο ελαστικότητας του Young υπολογίστηκε από τις καμπύλες ισχύος από τις βασικές Sneddon μοντέλο, το οποίο περιγράφεται η συμπεριφορά ενός γνωστού indenter γεωμετρία σε επαφή με ένα ελαστικό μισή χώρο πολύ λιγότερο αυστηρό από τη γροθιά του, όπως φαίνεται στην εξίσωση (1) [22] 🙁 1 )

Όπου υ, F, δ, Ε, και α είναι λόγος Poisson, φόρτωση δύναμη, εσοχή, μέτρο του Young, και η γωνία μισό-άνοιγμα κωνικό άκρο, αντίστοιχα. Στο μοντέλο Sneddon, το φορτίο που εξασκείται από το έμβολο συνδέεται με την προκαλούνται βάθος οδόντωση, η οποία δείχνει τη σχέση μεταξύ της εφαρμοζόμενης δύναμης F και το δ οδόντωση στην περίπτωση του κωνικού indenter. Μια αναλογία Poisson του 0,5 είναι κατάλληλη για κύτταρα και έτσι χρησιμοποιούνται στην ανάλυση που ακολουθεί [23, 24].

Στατιστικά

Όλα τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων και τα δεδομένα που παρουσιάζονται εκφράζονται ως η μέση ± SD στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση t-test του Student, εκτός του ότι ο συντελεστής Young εκτελείται χρησιμοποιώντας τεστ Kruskal-Waillis, και ρ & lt.? 0,05 θεωρήθηκε ως στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Oridonin αναστέλλουν τη βιωσιμότητα KYSE-150 κυττάρων από ROS μεσολάβηση της οδού

Oridonin έχει βρεθεί να δείξει ευρέος φάσματος αντικαρκινικό δραστηριότητες κατά των διαφόρων καρκινικών κυτταρικών σειρών [9-13, 25]. Τα αποτελέσματα αντι-πολλαπλασιασμό των oridonin εναντίον ανθρώπινου καρκίνου του οισοφάγου KYSE-150 κύτταρα διερευνήθηκε με ΜΤΤ δοκιμασία, η οποία έδειξε ισχυρές επιδράσεις αναστολής πολλαπλασιασμού της θεραπείας oridonin 24 ώρες επί KYSE-150 κύτταρα, όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α. Η βιωσιμότητα των KYSE-150 κύτταρα μειώθηκε από 100,0 ± 6,3% σε 90,6 ± 7,8%, 73,2 ± 11,9%, 54,8 ± 16,3%, 32,0 ± 15,3% και 16,2 ± 5,6% μετά από 10 μΜ, 20 μΜ, 30 μΜ, 40 μΜ και 50 μΜ θεραπεία oridonin, αντίστοιχα (Σχήμα 1Α). Οι προηγούμενες εργασίες επικεντρώθηκαν στην αντικαρκινική δράση της oridonin υπονοείται ότι τα αποτελέσματα αναστολής της oridonin πάντα συνοδεύεται από την αύξηση του ενδοκυτταρικού επιπέδου ROS στα κύτταρα του καρκίνου [9-13]. Προσδιορίσαμε επίσης το επίπεδο ROS σε KYSE-150 κύτταρα, τα οποία έδειξαν ότι η θεραπεία oridonin θα μπορούσε να επάγει σημαντικά την υπερπαραγωγή ROS σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο και η υπερπαραγωγή ROS επάγονται από oridonin μπορούσε να εξαλειφθεί με την προ-επεξεργασία των κυττάρων με ROS οδοκαθαριστής NAC (Σχήμα 1Β). Η σχετική ενδοκυτταρική επίπεδο ROS σε KYSE-150 κύτταρα αυξήθηκε από 100,0 ± 23,4% για τα κύτταρα ελέγχου σε 125,5 ± 6,9%, 142,1 ± 18,2% και 186,6 ± 15,8% για 10 μΜ, 30 μΜ και 50 μΜ oridonin επεξεργασμένα κύτταρα, αντίστοιχα (Σχ 1C). Με την προεπεξεργασία των 2.5 mM NAC για 1 ώρα, το επίπεδο ROS ενδοκυτταρική σε KYSE-150 κυττάρων κατά 50 μΜ oridonin θεραπεία μειώθηκε στα 114,9 ± 14,8% και το προ-θεραπεία με NAC μόνη δεν έδειξε σημαντικές επιπτώσεις στο επίπεδο ROS σε KYSE-150 κύτταρα με ένα μέσο επίπεδο των ROS από 105,6 ± 2,8% (σχήμα 1Γ). Αυτά τα αποτελέσματα να εννοηθεί ότι oridonin θα μπορούσε να προκαλέσει η υπερπαραγωγή ROS σε KYSE-150 κύτταρα, τα οποία θα μπορούσαν να εξαλειφθούν με NAC προεπεξεργασίας.

(Α) Επίδραση της oridonin στη βιωσιμότητα των KYSE-150 κύτταρα. (Β) DCFH-DA ποσοτικό προσδιορισμό των επιπτώσεων της NAC στην επαγόμενη oridonin παραγωγή ROS σε KYSE-150 κύτταρα. (Γ) Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων της NAC στην επαγόμενη oridonin παραγωγή ROS σε KYSE-150 κύτταρα. (D) Επιδράσεις των ROS οδοκαθαριστής-NAC για oridonin ανέστειλε τη βιωσιμότητα των KYSE-150 κύτταρα, * ρ & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01, *** p & lt? 0.001

Η

Για τον προσδιορισμό των ρόλων. των ROS στην αντικαρκινική δράση της oridonin, μπορούμε επίσης να ανιχνεύσει τις επιπτώσεις της NAC στην oridonin ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων KYSE-150. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1ϋ, η βιωσιμότητα των KYSE-150 κυττάρων ήταν 14,6 ± 2,5% μετά από 50 μΜ oridonin θεραπεία, η οποία αντιστράφηκε να είναι 97,8 ± 1,9% από την 1 ώρα προεπεξεργασίας με 2.5 mM NAC. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν έντονα τις συνέπειες της αναστολής των oridonin στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων KYSE-150 σε ROS μεσολάβηση οδού.

Oridonin που προκαλείται από ROS μεσολάβηση KYSE-150 κυτταρικής απόπτωσης

Η επαγωγή των καρκινικών κυττάρων απόπτωσης έχει μελετηθεί ευρέως κατά τις τελευταίες δεκαετίες, καθιστώντας το ένα από τα πιο κοινά και σημαντικοί δείκτες που πρέπει να ανιχνευθεί για την ανάπτυξη αντικαρκινικών φαρμάκων. Για να διευκρινιστεί περαιτέρω η αντικαρκινική δράση των oridonin σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του οισοφάγου, η απόπτωση των KYSE-150 κυττάρων προσδιορίστηκε με Annexin V-FITC /δοκιμασία ΡΙ. Όπως υποδεικνύεται στο Σχήμα 2Α, oridonin θα μπορούσε να προκαλέσει απόπτωση των KYSE-150 κύτταρα σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο, και η προ-θεραπεία με NAC θα μπορούσε να αναστείλει την απόπτωση που επάγεται oridonin κύτταρο KYSE-150. Ο ρυθμός απόπτωση KYSE-150 κύτταρα αυξήθηκε από 7,3 ± 1,5% για τα κύτταρα ελέγχου σε 10,5 ± 1,9%, 24,8 ± 1,5% και 52,4 ± 3,1% μετά από 10 μΜ, 30 μΜ και 50 μΜ oridonin θεραπεία, αντίστοιχα (Σχήμα 2Β). Και με την προεπεξεργασία των NAC, τα ποσοστά απόπτωσης των KYSE-150 κύτταρα ήταν 13,0 ± 1,3% και 6,7 ± 1,6% με και χωρίς 50 μΜ oridonin θεραπεία, αντίστοιχα (Σχήμα 2Β). Oridonin επαγόμενη απόπτωση KYSE-150 κυττάρων ήταν ως επί το πλείστον όλες αναστραφεί με κατεργασία NAC, η οποία απέδειξε ότι oridonin επάγεται KYSE-150 απόπτωση των κυττάρων ήταν στενά συνδεδεμένη με την υπερ-παράγεται ROS επάγονται από oridonin.

(Α) αννεξίνης V /PI προσδιορισμό των επιπτώσεων της NAC στην oridonin που προκαλείται KYSE-150 απόπτωση των κυττάρων. (Β) Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων της NAC στην oridonin επαγόμενη απόπτωση των κυττάρων KYSE-150, *** p & lt?. 0.001

Η

Για να προσδιορίσετε εάν η δυσλειτουργία των μιτοχονδρίων επίσης εμπλέκονται στην επαγόμενη oridonin KYSE- 150 κυττάρων απόπτωση, εξετάστηκαν οι δυνατότητες μιτοχονδριακής μεμβράνης (ΜΜΡ) σε απόκριση προς oridonin έκθεση με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας ροδαμίνη 123 ως ανιχνευτή φθορισμού. Τα αποτελέσματα εννοηθεί ότι oridonin θα μπορούσε να προκαλέσει διαταραχή των ΜΜΡ KYSE-150 κύτταρα σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο, και NAC θα μπορούσε επίσης να αντιστραφεί αυτό το αποτέλεσμα (Σχήμα 3Α). Η στατιστική ανάλυση έδειξε ότι η σχετική σήμα φθορισμού ροδαμίνης 123 μειώθηκε από 100.0 ± 1.6% για τα κύτταρα ελέγχου σε 98,1 ± 4,7%, 93,4 ± 1,5% και 77,0 ± 8,2% μετά από 10 μΜ, 30 μΜ και 50 μΜ oridonin θεραπεία, αντίστοιχα ( Σχήμα 3Β). Η προ-θεραπεία με NAC δεν είχε σημαντικές επιπτώσεις στο ΜΜΡ του KYSE-150 κύτταρα, τα οποία έδειξαν μια σχετική τιμή των 99,96 ± 1,82% (Σχήμα 3Β). Και η σχετική σήμα φθορισμού ροδαμίνης 123 αυξήθηκε επίσης σε 97,7 ± 4,4%, με προκατεργασία με NAC και κατεργασία με 50 μΜ oridonin, υποδεικνύοντας ότι η oridonin μπορούσε επίσης να επάγει MPP διατάραξη της KYSE-150 κύτταρα με ROS μεσολάβηση τρόπο. Επιπλέον, η ανάλυση της κατανομής του κυτταρικού κύκλου έδειξαν επίσης ότι oridonin μπορούσε επίσης να επάγει αναστολή του κυτταρικού κύκλου KYSE-150 κυττάρων σε G2 /M φάση (Σχήμα Α στο S1 File). Παρά το γεγονός ότι τα ποσοστά των κυττάρων σε G2 /M φάση δεν επίπεδο ROS ήταν εξαρτημένοι, αλλά η προ-θεραπεία με NAC θα μπορούσε επίσης να αντιστρέψει oridonin που προκαλείται διακοπή του κυτταρικού κύκλου (Σχήμα Α στο S1 File).

(Α) Rhodamine 123 δοκιμασία της οι επιδράσεις της NAC στην oridonin επαγόμενη διατάραξη του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης σε KYSE-150 κύτταρα. (Β) Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων της NAC στην επαγόμενη oridonin διακοπή του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης σε KYSE-150 κύτταρα, ** p & lt?. 0.01

Η

Η θεραπεία της oridonin αύξησε σημαντικά το επίπεδο ROS σε KYSE -150 κύτταρα και η υπερπαραγωγή ROS προκαλούμενη περαιτέρω τη διάσπαση των ΜΜΡ, τη σύλληψη του κυτταρικού κύκλου και την απόπτωση των KYSE-150 κύτταρα. Με την προεπεξεργασία της NAC, που δεν είχε σημαντικές επιπτώσεις στην φυσιολογική κατάσταση της KYSE-150 κύτταρα, αλλά θα μπορούσε να αφαιρέσει την υπερπαραγωγή ROS, oridonin που προκαλείται αναστάτωση MMP, διακοπή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης των KYSE-150 κύτταρα δραματικά αντιστραφεί. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν έντονα ότι οι αντικαρκινικές δραστηριότητες των oridonin σε KYSE-150 κύτταρα διαμεσολαβείται κυρίως από το ενδοκυτταρικό επίπεδο ROS του KYSE-150 κυττάρων που επάγεται από oridonin.

ROS-εξαρτώμενη μορφολογική βλάβη του KYSE-150 κύτταρα

Τα τελευταία χρόνια, AFM έχει αναδειχθεί ως ένα ισχυρό εργαλείο για την νανοκλίμακα απεικόνιση της μορφολογίας και pico-Newton μέτρησης της δύναμης ευαισθησία των κυττάρων σε διαφορετικές φυσιολογική κατάσταση [26-29]. Η υπέρ ανάλυσης και υψηλή ευαισθησία δύναμη του AFM δείχνουν επίσης πολύ ευρείες εφαρμογές για την ανίχνευση του καρκίνου του κυτταρικής απόπτωσης κατά την αγωγή του φαρμάκου, παρέχοντας κάποια νέα πληροφορία σχετικά με τη μορφολογία των κυττάρων, εμβιομηχανική κυττάρου και τις λειτουργίες του υποδοχέα της μεμβράνης [16, 18, 28]. Η μορφολογία των κυττάρων είναι στενά συνδεδεμένη με την κυτταρική φυσιολογία και τις λειτουργίες. Κυτταρικής απόπτωσης συνδέεται πάντα με πολύ τυπικό μορφολογικές αλλαγές, όπως η συμπύκνωση του πυρήνα, διόγκωση της μεμβράνης και συρρίκνωση του κυτταρικού σώματος.

Για την επίλυση των ακριβής μορφολογικές αλλαγές του KYSE-150 κυττάρων που επάγεται από oridonin κατεργασία και οι ρόλοι των ROS σε επαγόμενη oridonin μορφολογικές αλλαγές του KYSE-150 κύτταρα, υψηλή ανάλυση AFM λειτούργησε για τη μελέτη της KYSE-150 κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχ 4Α, ελέγχουν KYSE-150 κύτταρα έδειξαν τυπικά ωοειδή σχήματα και τα κύτταρα στενά σε επαφή με άλλα κύτταρα. Μετά από επεξεργασία με 10 μΜ oridonin για 24 ώρες, δεν υπήρχαν αξιοσημείωτες αλλαγές στην μορφολογία του KYSE-150 κύτταρα (Εικόνα 4Β). Μετά από 24 ώρες θεραπείας με 30 μΜ oridonin, KYSE-150 κύτταρα παρουσίασαν κάποια τυπικά μορφολογικά χαρακτηριστικά της απόπτωσης, συμπεριλαμβανομένων και των φορέων των κυττάρων συρρικνωθεί και το συμπυκνωμένο κυτταρόπλασμα (Σχήμα 4C). Και για 50 μΜ oridonin αγωγή KYSE-150 κύτταρα, πιο τυπικά μορφολογικά χαρακτηριστικά της απόπτωσης μπορεί να παρατηρηθεί, όπως η συρρίκνωση των κυτταρικών σωμάτων, συμπύκνωση του κυτταροπλάσματος, τη συμπύκνωση και κατάτμηση του πυρήνα, η εμφάνιση αποπτωτικών σώματος (υποδεικνύεται με πράσινα βέλη) και τα κατεστραμμένα δομές pseudopodium για τις συνδέσεις των κυττάρων (Σχήμα 4D). Για να καταδειχθεί ο ρόλος των αυξημένη ενδοκυτταρική επίπεδο ROS σε επαγόμενη oridonin μορφολογικές αλλαγές του KYSE-150 κύτταρα, η μορφολογία του KYSE-150 κυττάρων με την προεπεξεργασία των 2.5 mM NAC για 1 ώρα και 50 μΜ oridonin για 24 ώρες, διερευνήθηκε επίσης με AFM. Οι εικόνες AFM (Σχήμα 4Ε) άφησε να εννοηθεί ότι KYSE-150 κύτταρα είχαν σημαντικές μορφολογικές αλλαγές μετά από 50 μΜ oridonin μεταχείριση λόγω της προεπεξεργασίας των 2,5 mM NAC. Και η προεπεξεργασία του NAC δεν είχε επίσης αξιόλογα αποτελέσματα σχετικά με την μορφολογία του KYSE-150 κύτταρα (Σχ 4F). Επιπλέον, βρήκαμε επίσης ότι ο έλεγχος KYSE-150 κύτταρα πάντα έδειξε σαφή περιοχές πυρήνα (υποδεικνύεται με μπλε βέλη στο Σχήμα 4), το οποίο εξαφανίστηκε και μετά oridonin θεραπεία και να αντιστραφεί από την προεπεξεργασία με NAC. Αυτές AFM εικόνες υψηλής ανάλυσης πρότεινε ότι oridonin θα μπορούσε να προκαλέσει μορφολογική ζημιές KYSE-150 κύτταρα και αυτές οι μορφολογικές βλάβες θα μπορούσαν επίσης να αναστραφεί με NAC προεπεξεργασία, υποδεικνύοντας ότι η AFM μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως μια ποιοτική nanotool να προσδιοριστεί μορφολογικές αλλαγές ROS μεσολάβηση κυττάρων σε καρκινικές κυτταρικές απόπτωση. Ωστόσο, αυτή η μορφολογική μέθοδος απεικόνισης με βάση AFM περιορίζεται στην ποιοτική ανάλυση των ROS μεσολάβηση των καρκινικών κυττάρων απόπτωση, και δεν είναι κατάλληλη για την ποσοτική ανάλυση.

AFM μορφολογία απεικόνιση του (Α) έλεγχος, (Β) 10 μΜ oridonin αγωγή, (C) 30 μΜ oridonin θεραπεία, (Δ) 50 μΜ oridonin αγωγή, (Ε) 2,5 mM NAC + 50 μΜ oridonin θεραπευθεί και (F) 2.5 mM NAC αγωγή KYSE-150 κύτταρα. (Α1-F1) εικόνες Τοπογραφία και (Α2-F2) τις αντίστοιχες 3D εικόνες KYSE-150 κύτταρα? (Α3-F3) Διευρυμένη εικόνες τοπογραφίας (Α1-F1) και (Α4-F4) τις αντίστοιχες 3D εικόνες KYSE-150 κύτταρα, γραμμή κλίμακας:. 20 μm

Η

ROS-εξαρτώμενη μεμβράνη υπερδομής μεταβολές του KYSE-150 κύτταρα

υπερδομή μεμβράνη των κυττάρων επίσης χρησιμοποιείται ευρέως για την αξιολόγηση της απόπτωσης των καρκινικών κυττάρων με AFM επειδή οι μεταβολές των συστατικών της μεμβράνης, όπως λιπίδιο σχεδία, μεμβράνη πρωτεΐνες και φωσφολιπίδια, επίσης συνδέονται με το κυτταρικό απόπτωση [16, 18, 28, 30, 31]. Με την υψηλή ανάλυση απεικόνισης της AFM, κάποιες παράμετροι που περιγράφουν την ιδιότητα της κυτταρικής μεμβράνης θα μπορούσε να εξαχθεί από τις υπερδομή εικόνες AFM να ​​αποσαφηνίσει τις αλλαγές της κυτταρικής μεμβράνης κατά την απόπτωση. Οι επιδράσεις του oridonin στην υπερδομή μεμβράνη του KYSE-150 κύτταρα προσδιορίστηκαν επίσης με AFM ανάλυση για τη διερεύνηση των πιο λεπτομερείς μορφολογικές μεταβολές του oridonin επάγεται KYSE-150 απόπτωση των κυττάρων. Με διευρυμένη απεικόνιση των κυτταρικών μεμβρανών γύρω από τις περιοχές πυρήνα, οι παράμετροι υπερδομικές μεμβράνη θα μπορούσε να εξαχθεί για την ποσοτική ανάλυση των oridonin επάγεται KYSE-150 απόπτωση των κυττάρων. Όπως φαίνεται στο σχήμα 5, οι αλλαγές της δομής της μεμβράνης ήταν δύσκολο να διευκρινιστεί από την άμεση παρατήρηση των εικόνων ultrastructure μεμβράνης KYSE-150 κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχ 5A4-5F4, τη διανομή ύψος επί της κυτταρικής μεμβράνης και την τραχύτητα των κυτταρικών μεμβρανών (Συμπεριλαμβανομένων Rq και Ra) αυξήθηκαν μετά oridonin θεραπεία, η οποία στη συνέχεια αντιστράφηκε με την προεπεξεργασία των NAC.

AFM μορφολογία και υπερδομή μεμβράνη απεικόνιση του (Α) έλεγχος, (Β) 10 μΜ oridonin αγωγή, (C) 30 μΜ oridonin θεραπεία, (Δ) 50 μΜ oridonin αγωγή, (Ε) 2,5 mM NAC + 50 μΜ oridonin θεραπευθεί και (F) 2.5 mM NAC αντιμετωπίζονται KYSE-150 κύτταρα. (Α1-F1) Topogrphy εικόνες KYSE-150 κύτταρα, γραμμή κλίμακας: 20 μm? (Α2-F2) εικόνες διευρυμένης ultrastructure μεμβράνη στο (Α1-F1) και (Α3-F3) τις αντίστοιχες 3D εικόνες KYSE-150 κύτταρα, γραμμή κλίμακας: 500 nm? (Α4-F4) διανομή ύψος και την τραχύτητα της επιφάνειας των κυττάρων ultrastructure αναλυθεί (Α2-F2).

Η

Με τον υπολογισμό 30 διαφορετικές τοποθεσίες σε 15 διαφορετικά κύτταρα σε κάθε ομάδα, το μέσο ύψος, Rq (root -mean-τετράγωνο τραχύτητα) και Ra (μέση τραχύτητα) παρουσιάστηκαν στο Σχήμα 6. το μέσο ύψος της κυτταρικής μεμβράνης KYSE-150 αυξήθηκε από 28,9 ± 9,9 nm για τα κύτταρα ελέγχου σε 37,1 ± 14,5 nm, 52,7 ± 25,7 nm και 73,7 ± 31,0 nm για 10 μΜ, 30 μΜ και 50 μΜ oridonin αγωγή KYSE-150 κύτταρα, αντίστοιχα (Σχήμα 6Α). Η δραματική αύξηση του μεγέθους partcle μεμβράνης σε KYSE-150 κύτταρα μετά από 50 μΜ oridonin θεραπεία θα μπορούσε επίσης να εξαλειφθεί με την προεπεξεργασία των NAC, η οποία έδειξε ένα μέσο ύψος 29,3 ± 9,0 nm (Σχήμα 6Α). Και το μέσο ύψος της NAC αντιμετωπίζονται KYSE-150 κυττάρων ήταν 29,0 ± 10,5 nm, δείχνουν σημαντικές επιπτώσεις στην κατανομή ύψος μεμβράνη KYSE-150 κύτταρα (Σχήμα 6Α). Οι τιμές Rq του KYSE-150 κύτταρα αυξήθηκε επίσης από 8,9 ± 2,8 nm για τα κύτταρα ελέγχου σε 10,99 ± 0,69 11,0 ± 3,7 nm, 13,87 ± 1,02 13,9 ± 5,4 nm και 22.6 ± 9.5 nm για 10 μΜ, 30 μΜ και 50 μΜ oridonin αντιμετωπίζονται KYSE-150 κύτταρα, αντίστοιχα (Σχήμα 6Β). Και αν τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με NAC, οι τιμές Rq ήταν 9.6 ± 2.7 nm και 9.1 ± 2.7 nm, με και χωρίς 50 μΜ oridonin θεραπεία, αντίστοιχα (Σχήμα 6Β). Ομοίως, η τιμή Ra ήταν 7,1 ± 2,3 nm για κύτταρα ελέγχου, και αυξήθηκε σε 8,6 ± 2,8 nm, 10,7 ± 4,1 nm και 18.0 ± 7.7 nm μετά από 10 μΜ, 30 μΜ και 50 μΜ oridonin θεραπεία, αντίστοιχα (Σχήμα 6C). Η σημαντική αύξηση του Ρα σε KYSE-150 κύτταρα μετά από 50 μΜ oridonin θεραπεία θα μπορούσε επίσης να αντιστραφεί με την προεπεξεργασία των NAC να δείξει μια τιμή Ra 7,5 ± 2,1 nm (Σχήμα 6C). Και η NAC προεπεξεργασία KYSE-150 κύτταρα χωρίς oridonin θεραπεία έδειξε μια τιμή Ra 7,2 ± 2,1 nm (Σχήμα 6C). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι, παρόμοια με το ενδοκυτταρικό επίπεδο ROS, τόσο η διανομή ύψος μεμβράνη και την τραχύτητα της μεμβράνης του KYSE 150-κυττάρων αυξήθηκε μετά oridonin θεραπεία σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο, και η αυξημένη διανομή ύψος μεμβράνη και την τραχύτητα της μεμβράνης θα μπορούσαν επίσης να αντιστραφεί με NAC προεπεξεργασία.

(Α) κατανομή Ύψος, (Β) ρίζα-μέση-τετράγωνο τραχύτητας (RQ), και (Γ) Η μέση τραχύτητα (Ra) που αναλύθηκαν από 2 × 2 μm εικόνες υπερδομή πλαίσιο της KYSE-150 κύτταρα, n = 30, * ρ & lt? 0,05, *** ρ & lt?. 0.001

η

είναι γνωστό ότι υπερδομή της κυτταρικής μεμβράνης επηρεάζεται από διάφορους περιβαλλοντικούς παράγοντες κατάσταση και υποκυτταρικά όπως η κινητικότητα, η προσκόλληση, και ενδοκυτταρική επαφή, έτσι θα μπορούσε να εξελιχθεί σε πολύ καλούς δείκτες της υγείας ή unnormal κατάσταση των κυττάρων [32]. Η διανομή ύψος και την τραχύτητα της κυτταρικής μεμβράνης καθορίζεται από AFM είναι παράμετροι που περιγράφουν τη δομή της κυτταρικής μεμβράνης. Η αυξημένη κατανομή ύψος μεμβράνη θα μπορούσε να αποδοθεί στη συνάθροιση βιομορίων μεμβράνης. Όπως αναφέρθηκε, η οπή όπως δομές θα οδηγήσει μια τραχιά επιφάνεια των κυττάρων [18]. Και γενικά, περισσότερα μόρια που βρίσκονται σε μεμβράνες πλάσματος, οι μεγαλύτερες τραχύτητα της επιφανείας του κυττάρου θα πρέπει να ανιχνεύεται με AFM [33]. Κυτταρικής απόπτωσης συνδέεται με την έκθεση του εσωτερικού φωσφολιπιδίου μεμβράνης στην επιφάνεια του κυττάρου, το οποίο έτσι παράγει ολοκληρωμένα αλλαγές ηλεκτροστατικό δυναμικό και ενυδάτωση στο εξωτερικό φύλλο της κυτταρικής μεμβράνης [34]. Και σε ROS απόπτωση που διαμεσολαβείται, τα υψηλά ενδοκυτταρικά επίπεδα ROS βρέθηκε επίσης να επηρεάσουν τη δομή ή έκφραση ορισμένων σημαντικών συστατικών μεμβράνη, όπως διαμεμβρανικές κανάλια, υποδοχείς και λιπιδίων σχεδία [35-37].