Αφηρημένο

miRNAs έχουν προταθεί για να είναι κύριοι ρυθμιστές της εξέλιξης και της μετάστασης του καρκίνου. Ωστόσο, η κατανόηση των ρόλων τους και μοριακών μηχανισμών που είναι αναγκαία για τη βαθύτερη ιδέες για την καλύτερη θεραπευτική ευκαιρίες. Σε αυτή τη μελέτη διερευνήσαμε το ρόλο και μηχανισμό miR-493 στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου μη μικρού κυττάρου του πνεύμονα (NSCLC). Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι η έκφραση του miR-493 ήταν σημαντικά μειωμένη σε πνευμονικό καρκίνωμα. Η έκτοπη έκφραση του miR-493 εξασθενημένη κυτταρική ανάπτυξη και εισβολή in vitro και in vivo. Μηχανικά, miR-493 στοχευμένη συνήθως άμεσα E2F1, η οποία κατέληξε σε μια ισχυρή μείωση της έκφρασης του mRNA και της πρωτεΐνης. Αυτό το αποτέλεσμα, με τη σειρά του, μείωσε την ανάπτυξη, εισβολή και μετάσταση των καρκινικών κυττάρων του πνεύμονα. Τα ευρήματά μας υπογραμμίζουν τη σημασία της δυσλειτουργίας του miR-493 στην προώθηση της ανάπτυξης του όγκου, και εμπλέκουν miR-493 ως πιθανό θεραπευτικό στόχο για τον καρκίνο του πνεύμονα

Παράθεση:. Gu Υ, Cheng Υ, Τραγούδι Υ, Zhang Ζ, Ντενγκ Μ, Wang C, et al. (2014) microRNA-493 καταστέλλει την ανάπτυξη όγκων, εισβολή και μετάσταση του καρκίνου του πνεύμονα με τη ρύθμιση E2F1. PLoS ONE 9 (8): e102602. doi: 10.1371 /journal.pone.0102602

Επιμέλεια: Rana Pratap Singh, Πανεπιστήμιο Jawaharlal Nehru, Ινδία

Ελήφθη: 28, Μαρ, 2014? Αποδεκτές: 19 Ιουν 2014? Δημοσιεύθηκε: 8 Αυγ 2014

Copyright: © 2014 Gu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη χρηματοδοτήθηκε από επιχορηγήσεις από το Ίδρυμα Επιστημών της Κίνας Μεταδιδακτορικός (Κωδικός Έργου: 2012M521588), https://jj.chinapostdoctor.org .cn /V1 /Program1 /Default.aspx. Ο χρηματοδότης δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η πιο διαδεδομένη υποτύπου ιστολογική καρκίνου σε όλο τον κόσμο [1]. Επειδή η πλειοψηφία των ασθενών με επεμβατικές, μεταστατική νόσο [2], η κατανόηση της βάσης της εξέλιξης του καρκίνου του πνεύμονα είναι ζωτικής σημασίας. Πολλοί παράγοντες, συμπεριλαμβανομένων καταστολείς όγκων και ογκογονίδια, που εμπλέκονται στην πνευμονική ογκογένεση ή εξέλιξη. [3], [4]. Πρόσφατα, τα κλασικά μέλη των γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες έχουν επεκταθεί για να περιλάβει έναν τύπο μορίου RNA μη-κωδικοποίησης πρωτεΐνης γνωστή ως microRNA (miRNA) [5], [6], [7]. miRNAs είναι 19-24 νουκλεοτίδια σε μήκος, και ρυθμίζουν την γονιδιακή έκφραση μέσω ατελής σύζευξη βάσεων με συμπληρωματικές αλληλουχίες που βρίσκονται κυρίως, αλλά όχι αποκλειστικά, στην 3 ‘αμετάφραστες περιοχές (UTRs) του mRNAs στόχου. Ως εκ τούτου, miRNAs αντιπροσωπεύουν μία από τις μείζονες ρυθμιστικών οικογένειες γονιδίων σε ευκαρυωτικά κύτταρα, και λειτουργούν με διέγερση μεταφραστικής καταστολής και μεταγραφής αποδόμησης [8], [9]. Ταχέως αναδυόμενες στοιχεία δείχνουν έντονα ότι miRNAs διαδραματίζουν καίριο ρόλο στην ογκογένεση και την εξέλιξη [10], [11], [12]. Για παράδειγμα, miR-34 αποτρέπει φέρεται έναρξη και την εξέλιξη του καρκίνου σε αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα [13]. miRNA-218, ένα νέο ρυθμιστής της HMGB1, καταστέλλει φέρεται κυτταρική μετανάστευση και εισβολή σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα [14]. Παρ ‘όλα αυτά, η περαιτέρω γνώση των μοριακών μηχανισμών της miRNA είναι αναγκαία για να παρέχει πολύτιμες πληροφορίες για την ανάπτυξη καλύτερων θεραπευτικών ευκαιριών για τους ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα.

Στην πρόσφατη μελέτη μας (Chen, et, al. Αδημοσίευτο χαρτί), που χρησιμοποιείται μια μικροσυστοιχία miRNA για να διαπιστώσει ότι η έκφραση miR-493 ήταν σημαντικά μειωμένη σε 95d κύτταρα, μια ιδιαίτερα μεταστατικό καρκίνο του πνεύμονα κυτταρική γραμμή, σε σύγκριση με HBE, αθανατοποιημένη ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κυτταρική γραμμή. Έτσι, υποθέσαμε ότι miR-493 θα μπορούσε να διαδραματίσει ένα σημαντικό ρόλο στην ογκογένεση και την εξέλιξη του καρκίνου του πνεύμονα.

Για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, εξετάσαμε την έκφραση του miR-493 χρησιμοποιώντας qRT-PCR σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου του πνεύμονα και 6 65 ο καρκίνος του πνεύμονα ιστών δείγματα στην παρούσα μελέτη. Τα δεδομένα έδειξαν ότι η έκφραση του miR-493 ήταν σημαντικά μειωμένη σε πνεύμονα καρκινικά κύτταρα και ιστούς. Λειτουργικές in vitro και in vivo δοκιμασίες έδειξαν ότι miR-493 ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του καρκίνου του πνεύμονα, εισβολή και μετάσταση με άμεση στόχευση του 3′-UTR του E2F1 να αποσπάσει μια συγκεκριμένη και ισχυρή knockdown της πρωτεΐνης. Τα ευρήματά μας υπογραμμίζουν τη σημασία της δυσλειτουργίας του miR-493 στην προώθηση της εξέλιξης του όγκου και ογκογένεση? και εμπλέκουν miR-493 ως πιθανό θεραπευτικό στόχο για τον καρκίνο του πνεύμονα.

Αποτελέσματα

miR-493 είναι μειωτικά στον καρκίνο του πνεύμονα και αρνητικά που σχετίζονται με την επιβίωση

Για να εντοπίσετε την απορύθμιση του miRNA-493 στον καρκίνο του πνεύμονα, εξετάσαμε την έκφραση του miR-493 χρησιμοποιώντας PCR πραγματικού χρόνου σε 6 κυτταρικές γραμμές που προέρχονται από καρκίνο του πνεύμονα και μία γραμμή ινοβλαστών πνεύμονος (MRC5)? καθώς και αθανατοποιημένα ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα (ΗΒΕ). Τα δεδομένα έδειξαν ότι miR-493 έκφραση ήταν σημαντικά μειωμένη σε καρκινικά κύτταρα πνεύμονα, ιδιαίτερα στον 95d, ένα εξαιρετικά μεταστατικό καρκίνο του πνεύμονα κυτταρική γραμμή (σχήμα 1Α). Επιπλέον, συγκρίναμε τα επίπεδα έκφρασης miRNA-493 σε 65 νωπά ιστούς καρκίνου του πνεύμονα με πραγματικού χρόνου PCR. Ομοίως, η έκφραση του miR-493 ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε ιστούς καρκίνου του πνεύμονα σε σχέση με το αντίστοιχο φυσιολογικό ιστούς των πνευμόνων (σχήμα 1Β). Για να καθοριστεί αν η ρύθμιση προς τα κάτω του miR-493 επιπτώσεων, των φαινοτύπων του καρκίνου του πνεύμονα ή κλινικά παθολογικά χαρακτηριστικά, χρησιμοποιήσαμε μια ανάλυση συσχέτισης και διαπίστωσε ότι το επίπεδο έκφρασης του miR-493 ήταν αντιστρόφως ανάλογη με μετάσταση όγκου (p = 0.038), αλλά όχι άλλων παθολογικών παραμέτρων, όπως ως το κλινικό στάδιο (πίνακας 1). Επιπλέον, μια ανάλυση επιβίωσης Kaplan-Meier διεξήχθη χρησιμοποιώντας ασθενής συνολική επιβίωση (OS, εικόνα 1C) και την επιβίωση ελεύθερη νόσου (DFS? Σχήμα 1D) να αναλύσει τη σημασία των miR-493 περαιτέρω άποψη της κλινική πρόγνωση. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι ασθενείς με χαμηλή έκφραση miR-493 είχε βραχύτερη μέση OS και DFS σχέση με τους ασθενείς με υψηλή έκφραση miR-493 (Ρ = 0,006 για το OS, Ρ = 0,000 για DFS? Σχήμα 1C και D). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η ρύθμιση προς τα κάτω του miR-493 συμβάλλει στην καρκινογένεση του καρκίνου του πνεύμονα και την πρόγνωση.

(Α) Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης του miR-493 σε 6 κυτταρικές γραμμές που προέρχονται από καρκίνο του πνεύμονα και γραμμή ινοβλαστών ένα πνεύμονα (MRC5 ), καθώς και μια αθανατοποιημένη ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα (ΗΒΕ) προσδιορίσθηκαν με qRT-PCR. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσες τιμές ± SEM από τουλάχιστον 3 ξεχωριστών πειραμάτων * ρ & lt?. 0.05, ** ρ & lt? 0,01. (Β) Τα επίπεδα έκφρασης miR-493 σε 65 ζεύγη ανθρώπινο NSLCC και αντίστοιχοι φυσιολογικοί ιστοί εξετάστηκαν με πραγματικού χρόνου PCR, χρησιμοποιώντας ΟΑΡϋΗ ως εσωτερικός έλεγχος. Η τιμή έκφρασης (ΔCt (Ν) – ΔCt (T)) αντιπροσωπεύει την διαφορά στα επίπεδα miR-493 μεταξύ φυσιολογικού ιστού και νεοπλασίας. Η τιμή της έκφρασης & gt? 1 δείχνει ότι τα επίπεδα miR-493 αυξάνεται σε όγκους. Η τιμή της έκφρασης & lt? 1 δείχνει ότι τα επίπεδα miR-493 είναι μειωμένη σε όγκους. Μια δοκιμασία paired t (μονοπαραγοντική) χρησιμοποιήθηκε για να συγκριθεί η διαφορά μεταξύ της κανονικής ομάδας και της ομάδας καρκίνου. (Γ) Χαμηλά επίπεδα miR-493 συσχετίζεται με βραχύτερη επιβίωση. Οι καμπύλες OS και DFS για όλους τους ασθενείς που μελετήθηκαν με υψηλή ή lowmiR-493 έκφρασης.

Η

Η υπερέκφραση του miR-493 παρεμποδίζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και εισβολή

Για να αξιολογήσει τις βιολογικές επιδράσεις της υπερεκφράζουν miR-493 στα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα, σταθερή έκτοπη υποσύνολα υπερέκφραση κυττάρων 95δ κατασκευάστηκαν /miR-493 και σε συνδυασμό κύτταρα ελέγχου τους H1975 /miR-493 και. Μια ανάλυση qRT-PCR έδειξε ότι η διαμόλυνση ήταν επιτυχής (Σχήμα 2Α). Προσδιορίσαμε ότι η υπερέκφραση του miR-493 σε 95d και H1975 κυττάρων εμφανώς μειωμένη πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε σύγκριση με τους ελέγχους χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία ρυθμός ανάπτυξης κυττάρου (Σχήμα 2Β), η κατανομή του κυτταρικού κύκλου (σχήμα 2Γ) και μια δοκιμασία σχηματισμού αποικίας (σχήμα 2D) . Επιπλέον, ελέγξαμε αν miR-493 θα μπορούσε να παίξει ένα ρόλο στην ανάπτυξη του όγκου με τη χρήση μοντέλων ξενομοσχεύματος γυμνών ποντικών (έξι ποντικοί ανά ομάδα). 95d κύτταρα επιμολυσμένα είτε με miR-493 ή ένα κωδικοποιημένο ελέγχου μεταμοσχεύθηκαν σε γυμνούς ποντικούς και αναπτύχθηκε σε στερεούς όγκους σε 25 ημέρες. Ωστόσο, η ανάπτυξη του όγκου ήταν σημαντικά μειωμένη όταν miR-493 εκφράστηκε σταθερά σε κύτταρα 95d (Σχήμα 2Ε). Αυτά τα αποτελέσματα να εννοηθεί ότι το miR-493 μπορεί να καταστείλει έντονα την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων.

Ένα σταθερό έκτοπη υπερέκφραση του miR-493 παρήχθη στο κελί υποσύνολα 95δ /miR-493 και H1975 /miR-493. qRT-PCR χρησιμοποιήθηκε για την επαλήθευση της διαμολύνσεως. ** Σημαίνει ρ & lt? 0.001 (t-test). Β, καμπύλες ανάπτυξης απέδειξαν ότι τα κύτταρα του πνεύμονα ήταν ικανά πολλαπλασιασμού. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 12-φρεατίων σε επιθυμητές συγκεντρώσεις κυττάρων και διατηρήθηκαν σε μέσο που περιέχει 10% FBS. Η τιμή απορρόφησης των κυττάρων μετρήθηκε στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία εις τριπλούν και οι ρυθμοί ανάπτυξης τους καταγράφηκαν. * Σημαίνει ρ & lt? 0,05 (t-test). C, ο κύκλος διανομής κύτταρα των καρκινικών κυττάρων του πνεύμονα αναλύθηκε με FACScan κυτταρόμετρο ροής. Ο δείκτης πολλαπλασιασμού (ΡΙ) χρησιμοποιήθηκε για να περιγράψει την δυνατότητα του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. PI = G2 + κλάσμα S) /(G1 + G2 + S) × 100%. Αριστερά, η αντιπροσωπευτική εικόνα του κυτταρικού κύκλου ποσοστό αλλαγής. Δεξιά, η στατιστική ανάλυση του ποσοστού κυτταρικού κύκλου, τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM από 3 ανεξάρτητα πειράματα * σημαίνει ρ & lt? 0,05 (t-test). D, δοκιμασίες σχηματισμού αποικίας χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί η επίδραση της miR-493 για τη μακροχρόνια επιβίωση των κυττάρων. Αριστερά, η περιοχή που καλύπτεται σε κάθε πλάκα από τις αποικίες μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα σύστημα απεικόνισης και παρουσιάζεται σαν το ποσοστό της συνολικής περιοχής της πλάκας. Δεξιά, η επίδραση του miR-493 υπερέκφραση στον σχηματισμό αποικίας των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα: κάθε στήλη αντιπροσωπεύει μια μέση τιμή των τριπλών πειραμάτων σε κάθε ομάδα. Τα δεδομένα είναι μέσες ± SEM. * Σημαίνει ρ & lt? 0,05 (t-test). Ε, miR-493 ανέστειλε την ανάπτυξη πνευμονικής όγκου σε μοντέλα ξενομοσχεύματος ποντικού (12 ζώα). Αριστερά, εκπρόσωπος όγκοι απομονώθηκαν από ποντίκια 25 ημέρες μετά την υποδόρια ένεση 95d κύτταρα που διαμολύνθηκαν σταθερά με το miR-493 που εκφράζουν ή ελέγχου φορέα. Δεξιά, Τα δεδομένα είναι μέση τιμή ± SEM. * Ρ & lt?. 0.05, (t test)

Η

Εκτός από την αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων, η επίδραση της miR-493 στην εισβολή και μετάσταση όγκου εξετάστηκε επίσης σε αυτή τη μελέτη. Μία δοκιμασία για επούλωση της πληγής έδειξαν ότι miR-493 θα μπορούσε να καταστείλει δραματικά την κινητικότητα των καρκινικών κυττάρων in 95d κυττάρων σε σύγκριση με τα κενά κελιά φορέα-επιμολυσμένα (σχήμα 3Α). Επιπλέον, ένας προσδιορισμός εισβολή πραγματοποιήθηκε επίσης. Το αποτέλεσμα έδειξε ότι miR-493 θα μπορούσε να καταστείλει την επεμβατική ικανότητα των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα (Σχήμα 3Β). Ένα πειραματικό ζωικό μοντέλο χρησιμοποιήθηκε για να διερευνηθεί περαιτέρω το αποτέλεσμα καταστολής του miR-493 σε μετάσταση όγκου, 95d /miR-493 κύτταρα εγχύθηκαν μέσα στις φλέβες της ουράς γυμνών ποντικών (πέντε ποντικοί ανά ομάδα). Κενά κύτταρα (95d /έλεγχος) φορέα-επιμολυσμένα χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι. Οι ποντικοί θανατώθηκαν και οι πνεύμονες αποκόπηκαν και τα μεταστατικές αλλοιώσεις του πνεύμονος στη συνέχεια ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Bruker μικρό σύστημα απεικόνισης ζώων (Γερμανία) μετά από 28 ημέρες. Τα πεδία του σχηματισμού μεταστατικές αλλοιώσεις στον πνεύμονα ήταν σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (εικόνα 3C). Αν και ορατή μεταστατικών οζιδίων δεν παρατηρήθηκαν στην επιφάνεια του πνεύμονα, μεταστατικές αλλοιώσεις ανιχνεύθηκαν στον πνεύμονα με αιματοξυλίνη και χρώση ηωσίνης (εικόνα 4D). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι miR-493 θα μπορούσε να καταστείλει αποτελεσματικά μετάσταση όγκου in vitro και in vivo.

Α, δοκιμασίες πληγή μηδέν διεξήχθησαν επί 95d κύτταρα επιμολυσμένα με miR-493 και αντιστοιχισμένο ελέγχου. Τα αποτελέσματα από 3 ξεχωριστές δοκιμασίες τέθηκαν στον μέσο όρο μαζί και γράφημα. *, P & lt? 0,05 (αριστερά). Αντιπροσωπευτικά εικόνες των προσδιορισμών δείχνονται. Αρχική μεγέθυνση: × 200 (δεξιά). Β, οι επεμβατικές ιδιότητες του H1975 και 95d κύτταρα αναλύθηκαν με μία δοκιμασία χρησιμοποιώντας ένα Transwell Matrigel επικαλυμμένα θαλάμου. Τα κύτταρα που μετανάστευσαν σχεδιάστηκαν ως ο μέσος αριθμός κυττάρων ανά οπτικό πεδίο από 3 διαφορετικά πειράματα, όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι. * P & lt? 0,01 (αριστερά). Αντιπροσωπευτικά εικόνες των προσδιορισμών δείχνονται. Αρχική μεγέθυνση: × 200 (δεξιά). C, in vivo δοκιμασίες μετάσταση χρησιμοποιήθηκαν για να εξεταστεί η ικανότητα μεταστατικό πνεύμονα 95d /miR-493 κύτταρα επισημαίνονται με πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP) και αντιστοιχισμένο κύτταρο ελέγχου 95d /ελέγχου. Πνεύμονα καρκινικά κύτταρα εγχύθηκαν μέσα στις φλέβες της ουράς των πέντε εβδομάδα- ποντικών ηλικίας. Την ημέρα-28, όλα τα ζώα θυσιάστηκαν και οι πνεύμονες αποκόπηκαν. Οι εικόνες μετάσταση πνεύμονα ελήφθησαν με ένα σύστημα Bruker Μικρών Ζώων Imaging. Το πνευμονικό ιστό στη συνέχεια απομακρύνθηκε, σταθερό, εγκλεισμένα σε παραφίνη, τεμαχίστηκαν σειριακά, και υποβλήθηκε σε αιματοξυλίνη και εοσίνη (Η &? Ε) χρώση. Αριστερά, Αναπαράσταση του εντοπισμένου σήματος GFP σε κάθε ένα από τα πέντε ζώα (οι εικόνες επιστρώθηκαν με πράσινο φθορισμό και λευκό φως). Δεξιά, το μεταστατικό πεδίου και ένταση φθορισμού διέφερε σημαντικά μεταξύ της ομάδας 95δ /miR-493 και την ομάδα ελέγχου. Δ, Η ιστολογική εξέταση των πνευμονικών μεταστάσεων από κύτταρα 95δ /ελέγχου 95δ /miR-493 και με χρώση αιματοξυλίνη και ηωσίνη.

Η

Α, ευθυγράμμιση ακολουθίας των microRNAs του miR-493 και του E2F1 3′ UTR. Του E2F1 3′-UTR περιέχει μία προβλεπόμενη miR-493-θέση πρόσδεσης. Οι περιοχές των σπόρων του miR-493 και τα sites σπόρων αναγνωρίζοντας στην E2F1 3′-UTR υποδεικνύεται με κόκκινο χρώμα. Β και Γ, λουσιφεράσης δοκιμασία των 95δ κύτταρα (αριστερή πλευρά) και H1975 κύτταρα (δεξιά πλευρά), που ήταν συν-επιμολυσμένα με miR-493 και ενός ρεπόρτερ λουσιφεράσης που περιέχει την πλήρη E2F1 μήκους 3′-UTR (Luc-κ.β. ) ή ένα προϊόν μετάλλαξης (Luc-mut), στην οποία μεταλλάχθηκαν τα νουκλεοτίδια από την θέση miR-493-πρόσδεσης. Ένα άδειο κατασκεύασμα λουσιφεράσης χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος (Luc-ctrl). Οι λουσιφεράσης μετρήθηκαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. miR-493 κατέστειλε σημαντικά την ενεργότητα λουσιφεράσης σε Luc-wt κατασκευάσματα ανταποκριτή. Τα δεδομένα είναι τα μέσα ± s.e.m. για χωριστή επιμολύνσεις (n = 4). * P & lt? 0,05 έναντι αγωνίζομαι. D και Ε, miR-493 σταθερή επιμόλυνση μειώνει την πρωτεΐνη E2F1 και τα επίπεδα mRNA. F και G, Το επίπεδο του miR-493 αντιστρόφως ανάλογη με την έκφραση E2F1. F, Οι E2F1 επίπεδα έκφρασης μετρήθηκαν με ανοσοϊστοχημεία σε ιστούς όγκων. Αυτές οι εγκλεισμένοι σε παραφίνη δείγματα ιστών ήταν τα ίδια πηγή 65fresh ιστού καρκίνου του πνεύμονα προαναφέρθηκε στο σχήμα 1. Μια αντιπροσωπευτική εικόνα των επιπέδων έκφρασης του E2F1 σε ανθρώπινους ιστούς όγκου πνεύμονα (200 ×) παρουσιάζεται. G, τα δεδομένα είναι μέσες ± S.E.M. * Σημαίνει P & lt?. 0.05

Η

miR-493 στοχεύει άμεσα και αναστέλλει E2F1

Με βάση την παρατήρηση ότι το miR-493 επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την εισβολή και τη μετάσταση, ψάξαμε για τα γονίδια-στόχους του miR-493 που σχετίζονται με την κινητικότητα και τη μετανάστευση, χρησιμοποιώντας δύο στόχους αλγόριθμο σάρωσης (TargetScan και microRNA.org). Ένας μεγάλος αριθμός διαφορετικών γονιδίων-στόχων είχαν προβλεφθεί. Μεταξύ αυτών των γονιδίων υποψήφιος στόχος, E2F1 επιλέχθηκε για περαιτέρω πειραματική επιβεβαίωση, όχι μόνο επειδή αναγνωρίστηκε ως στόχος του miR-493 και από τις δύο βάσεις δεδομένων (σχήμα 4Α), αλλά και λόγω των συχνών απορρύθμιση του σε ιστούς όγκων [15], [16 ], [17]. Μια ανάλυση διπλής λουσιφεράσης έδειξε ότι η συν-έκφραση του miR-493 ανέστειλε σημαντικά την δραστηριότητα της λουσιφεράσης πυγολαμπίδας που πραγματοποιούνται άγριου τύπου αλλά όχι μεταλλαγμένη 3′-UTR του E2F1 (σχήμα 4Β, C) σε κύτταρα 95d και H1975, υποδεικνύοντας ότι miR-493 μπορεί να καταστείλει την έκφραση του γονιδίου μέσω αλληλουχία δέσμευσης του στο 3′-UTR του E2F1. Επιπλέον, η εισαγωγή του miR-493 μείωσε την έκφραση του κυτταρικού mRNA E2F1 και πρωτεΐνης (Εικόνα 4D, E). Ωστόσο, όταν αναστολή ολιγονουκλεοτίδια έναντι miR-493 διαμολύνθηκαν σε κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα 95d ή H1975, δεν παρατηρήθηκε ένας αντίστροφος πρότυπο έκφρασης μεταξύ miR-493 και η πρωτεΐνη E2F1 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Εμείς τεκμαίρεται ότι αυτή η θεραπεία miRNA συνέβαλαν στην ελάχιστη ενδογενείς έκφρασης και στις δύο καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Επιπλέον, το φαινόμενο περαιτέρω επικυρωθεί από ένα αντίστροφο συσχετισμό μεταξύ του επιπέδου της E2F1 πρωτεΐνης, που υποδεικνύεται με χρώση ανοσοϊστοχημείας, και το επίπεδο έκφρασης miR-493 αξιολογήθηκε με Q-PCR στα φρέσκα ιστούς καρκίνου του πνεύμονα που χρησιμοποιούνται στις παραπάνω αναλύσεις (εικόνα 4F , G και το σχήμα 1Β).

E2F1 συμβάλλει στο φαινόμενο του πολλαπλασιασμού καταστολή και την εισβολή που προκαλείται από miR-493

Επιπλέον, κατασκευάσαμε θραύσματα siRNA που στοχεύει E2F1 να γκρεμίσουμε την έκφραση του E2F1 να διερευνηθεί η συμβολή του E2F1 με την επίδραση της miR-493 σε αυτά τα φαινοτύπους. Βρήκαμε ότι η knockdown E2F1 μπορούσε προσομοίωση εν μέρει την ανάπτυξη των κυττάρων (Σχήμα 5 Β) και την κυτταρική εισβολή (Σχήμα 5C και D) φαινότυπο που επάγεται από την υπερέκφραση του miR-493. Στη συνέχεια, πειράματα διάσωσης διεξήχθησαν με υπερέκφραση του φορέα E2F1-Δ3′- UTR (χωρίς ενδογενή 3′-UTR) στο κύτταρο που εκφράζει το miR-493. Το miR-493 που προκαλείται αρνητική ρύθμιση της E2F1 διασώθηκε μετά την εισαγωγή του E2F1. Επιπλέον, η υπερέκφραση του E2F1 εξασθένησε την αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης (Σχήμα 5Α) και εισβολή (Σχήμα 5C και Ε) που προκαλείται από miR-493. Αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι το miR-493 στοχεύει συγκεκριμένα ειδικότητα E2F1 να συμβάλλουν στο φαινόμενο του για την ανάπτυξη των κυττάρων και την εισβολή.

Α, Ο knock-down του E2F1 προσομοίωση εν μέρει την καταστολή των πνευμόνων ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων που προκαλείται από την υπερέκφραση του miR-493 σε κύτταρα 95δ και H1975. Οι καμπύλες ανάπτυξης κατέδειξαν την ικανότητα του πολλαπλασιασμού κυττάρων του πνεύμονα. Η τιμή απορρόφησης των κυττάρων μετρήθηκε στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία εις τριπλούν και οι ρυθμοί ανάπτυξης τους καταγράφηκαν. Β, υπερέκφραση εξωγενούς E2F1 (χωρίς 3′-UTR του E2F1) διασώθηκε από την καταστολή του πολλαπλασιασμού που προκαλείται από miR-493 σε κύτταρα 95δ και H1975. C, T Οι επεμβατικές ιδιότητες των H1975 και 95δ κύτταρα τα οποία ήταν είτε knock-down ή υπερέκφραση E2F1were αναλύονται με δοκιμασία φρεατίων χρησιμοποιώντας επικαλυμμένα με Matrigel θάλαμο. Τα κύτταρα τα οποία μετανάστευσαν σχεδιάστηκαν ως ο μέσος αριθμός κυττάρων ανά οπτικό πεδίο από 3 διαφορετικά πειράματα, όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι. Τα δεδομένα είναι η μέση τιμή ± SD * σημαίνει ρ & lt?. 0.05. D και Ε, είναι αντιπροσωπευτικά εικόνες των προσδιορισμών δείχνονται. Αρχική μεγέθυνση:. × 200

Η

κανονισμούς E2F1 ERK και PI3K-AKT οδό στην 95d και H1975 κυττάρων

E2F1 διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, η οποία με τη σειρά του προωθεί κύτταρα πολλαπλασιασμό και τη μετάσταση. Ωστόσο, ο ακριβής μηχανισμός της λειτουργίας του E2F1 είναι πολύπλοκη και εξαρτάται από την κυτταρική περιβάλλοντος [18]. Μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι εξέλιξης του όγκου E2F1-εξαρτώμενη πυροδοτήθηκε από την ενεργοποίηση των κυτταροπλασματικής καταρρακτών σηματοδότησης Ras /Raf, όπως οι ΡΙ3Κ-ΑΚΤ [16] και ΜΕΚ-ΕΚΚ μονοπάτια [19], οι περισσότερες από τις οποίες ρυθμίζουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την επιβίωση και εισβολή [20], [21]. Έτσι, ερευνήσαμε t αν miR-493 ρυθμίζει αυτά τα μονοπάτια με στόχευση E2F1. Η αυξητική ρύθμιση του miR-493, μέσω της διαμόλυνσης του miR-493, σε κύτταρα 95d και H1975 μείωσε τα επίπεδα φωσφορυλίωσης της ΑΚΤ και προς τα κάτω στόχος του ΟδΚ3β (Σχήμα 6Α). Παρομοίως, miR-493 κατέστειλε επίσης τα επίπεδα φωσφορυλιωμένης ERK (σχήμα 6Α). Παρατηρήσαμε επίσης ότι η knockdown του miR-493 μέσω επιμόλυνση με αντι-miR-493 στην ΗΒΕ, Α549 και Η1299 κύτταρα, στα οποία το σχετικό επίπεδο έκφρασης του miR-493 ήταν υψηλότερη, αύξησε τα επίπεδα της φωσφορυλιωμένης ΑΚΤ, GSK3b και ERK ( Εικόνα 6β). Αυτά τα western αποτύπωση αποτελέσματα έδειξαν ότι το miR-493 είναι αρνητικός ρυθμιστής της ΑΚΤ και μονοπάτια ERK. Στη συνέχεια, τα πειράματα διάσωσης διεξήχθησαν με υπερεκφράζουν τον φορέα E2F1-Δ3′- UTR (χωρίς ενός ενδογενούς 3′-UTR) σε miR-493-κατεργασμένα κύτταρα. Το miR-493 που προκαλείται από προς τα κάτω ρύθμιση του E2F1 διασώθηκε λόγω της εισαγωγής του E2F1 (σχήμα 6C), και τα επίπεδα φωσφορυλίωσης της ΑΚΤ και ERK μεταβλήθηκαν κατά παρόμοιο τρόπο. Αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν ότι miR-493 αναστέλλει την ΑΚΤ και οδοί ERK με τη στόχευση E2F1.

(Α) miR-493 υπερέκφραση μείωσε την δραστηριότητα της ΑΚΤ και οδούς ERK σε 95d και H1975 κυττάρων. (Β) Η knockdown του miR-493 με με αντι-ΜΙΚ 493 αύξησε τη δραστικότητα της ΑΚΤ και σηματοδότησης ERK σε ΗΒΕ, Α549 και Η1299 κύτταρα. (C) miR-493 (ή τον έλεγχο αγωνίζομαι) επιμόλυνσης ακολουθείται από E2F1 (ή παρωδία vector) επιμόλυνση 24 ώρες αργότερα στο 95δ κύτταρα επηρεάζει ΑΚΤ και ERK σηματοδότησης. Η δραστηριότητα AKT οδό μετρήθηκε εξετάζοντας την έκφραση της φωσφορυλιωμένης ΑΚΤ (ρΑΚΤ), ενώ η δραστηριότητα οδός ΕΚΚ μετρήθηκε εξετάζοντας την έκφραση της φωσφορυλιωμένης ERK (pERK).

Η

Συζήτηση

Αν και μια χούφτα μελέτες έχουν προσδιορίσει συγκεκριμένες miRNAs που εμπλέκονται στην καρκινογένεση στον άνθρωπο και την εξέλιξη [10], [11], [12]. Πιστεύουμε επίσης ότι πρέπει να καταβληθούν περισσότερες προσπάθειες για τον εντοπισμό σχετικών miRNAs, καθώς και τους ειδικούς μηχανισμούς με τους οποίους θα ολοκληρώσουν συγκεκριμένες λειτουργίες τους, ιδιαίτερα σε σχέση με την ογκογένεση και την εξέλιξη των διαφόρων τύπων όγκων. Εδώ, έχουμε προσδιορίσει ότι miR-493, ένα δυνητικά καταστολέας υποψήφιος όγκος miRNA [22], [23], ήταν σημαντικά μειωμένη σε καρκίνο του πνεύμονα και ότι η χαμηλότερη έκφραση miR-493 συνδέθηκε με μετάσταση όγκου και κακή πρόγνωση (σχήμα 1C, D και Τραπέζι 1). Η έκτοπη έκφραση του miR-493 εξασθενημένα σημαντικά την ικανότητα των κυττάρων να πολλαπλασιάζονται και να εισβάλλουν στα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα 95d και H1975 in vitro και in vivo.

Μέχρι σήμερα, ο χαρακτηρισμός του miR-493 λειτουργία δεν έχει εκτεταμένη , αν και αρκετοί στόχοι έχουν εντοπιστεί με ένα βασικό ρόλο στη μετανάστευση των κυττάρων και τη μετάσταση οδούς, συμπεριλαμβανομένων των FZD4, Rhoc, ΜΚΚ7 και IGF1R [22], [23], [24]. Εδώ, έχουμε εντοπίσει ένα νέο στόχο του miR-493, E2F1. E2F1 είναι ένας σημαντικός παράγοντας μεταγραφής που παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και είναι στενά ρυθμίζεται από την πρωτεΐνη ρετινοβλαστώματος (Rb) [25]. Η αδρανοποίηση του Rb ελευθερώνει E2F1 από το συγκρότημα κατασταλτική, η οποία, με τη σειρά της, προκαλεί την συνεχή έκφραση των γονιδίων στόχων των οποίων τα προϊόντα προάγουν την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου [26]. Η έκτοπη έκφραση των αποτελεσμάτων E2F1 στο νεοπλασματικό μετασχηματισμό των κυττάρων τρωκτικού [27], [28], και ευρήματα από διαγονιδιακά μοντέλα δείχνουν ότι η αυξημένη δραστικότητα E2F1 σχετίζεται με την ανάπτυξη του όγκου σε πολλούς ιστούς [29], [30], [31] . Ανωμαλίες στην έκφραση γονιδίων E2F1 και /ή γονιδιακή ενίσχυση E2F1 έχουν περιγραφεί σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές γραμμές και τους τύπους όγκων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του πνεύμονα [32], [33]. Αξίζει να σημειωθεί ότι η υπερέκφραση E2F1 συνδέεται συχνά με υψηλού βαθμού όγκους και φτωχή πρόγνωση ασθενούς επιβίωση [29], [31], [34], υποδηλώνοντας ότι ογκογόνος ιδιότητες εκτείνονται πέρα ​​από την ικανότητα να διεγείρει την ανώμαλη αύξηση των νεοπλασματικών κυττάρων. Συνεπής με αυτά τα ευρήματα, τα τελευταία στοιχεία που έχει αποκαλύψει ότι E2F1 είναι πιο σχετικές για τη μετάσταση του καρκίνου και χημειοαντίσταση [18], [19], [35]. Εδώ, δείχνουμε ότι η έκφραση του E2F1 είναι υψηλό στον καρκίνο του πνεύμονα. Εν τω μεταξύ, διαπιστώσαμε ότι το miR-493 στοχεύει άμεσα και αναστέλλει την έκφραση E2F1protein. Μια ανάλυση ρεπόρτερ διπλής λουσιφεράσης έδειξαν ότι miR-493 θα μπορούσε να συνδεθεί με την αλληλουχία στο 3′-UTR του E2F1 (σχήμα 4Β). Επιπλέον, η εισαγωγή του miR-493 μείωσε την έκφραση του κυτταρικού mRNA E2F1 και πρωτεΐνη (Σχήμα 5C, D) .Whereas, όταν αναστολή ολιγονουκλεοτίδια έναντι miR-493 ήταν διαμολύνθηκαν σε HBE, Α549 και H1277 κυττάρων, μια αντίστροφη μορφή έκφρασης ήταν παρατηρήθηκαν μεταξύ miR-493 και η πρωτεΐνη E2F1 (εικόνα 6 Β). Επειδή E2F1 παίζει ένα σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, επιβίωσης και εισβολής, ερευνήσαμε αν E2F1 συμβάλλει στο φαινόμενο του miR-493 σε αυτά τα φαινότυποι των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα. Κατασκευάσαμε θραύσματα siRNA που στοχεύει E2F1 να χτυπήσει κάτω την έκφραση του E2F1, και διαπίστωσε ότι η knock-down του E2F1 μπορούσε προσομοιώνουν εν μέρει την ανάπτυξη των κυττάρων (Σχήμα 5 Α) και την κυτταρική εισβολή (σχήμα 5 D, E) φαινότυπο που επάγεται από την υπερέκφραση του miR-493. Επιπλέον, η υπερέκφραση του E2F1 (χωρίς ενός ενδογενούς 3′-UTR) διασώθηκε την αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης και της εισβολής που προκαλούνται από miR-493 (σχήμα 5Β, D και Ε).

Μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι E2F1- εξέλιξης εξαρτώμενη όγκου που προκαλείται από την ενεργοποίηση των καταρρακτών κυτταροπλασματικής Ras /Raf σηματοδότηση [19], όπως είναι η ΜΕΚ-ΕΚΚ και μονοπάτι ΡΙ3Κ /ΑΚΤ, οι περισσότερες από τις οποίες ρυθμίζουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την επιβίωση και εισβολή. Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι miR-493 μπορεί να αναστέλλει την ιδιοσυστατική δράση των μονοπατιών ΑΚΤ και ERK με στόχευση E2F1. Στη συνέχεια, τα πειράματα διάσωσης έδειξαν ότι η miR-493 που προκαλείται από προς τα κάτω ρύθμιση του E2F1 διασώθηκε λόγω της εισαγωγής του E2F1 (σχήμα 3Β), και τα επίπεδα φωσφορυλίωσης της ΑΚΤ και ERK μεταβλήθηκαν κατά παρόμοιο τρόπο. Αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι το miR-493 αναστέλλει τις οδούς ΑΚΤ και ERK με τη στόχευση E2F1.

Στο σύνολό τους, τα δεδομένα από τη μελέτη μας προτείνει ότι το miR-493 μπορεί να είναι ένας πιθανός όγκος κατασταλτική miRNA που αναστέλλει την κυτταρική διείσδυση και τον πολλαπλασιασμό από μπλοκάροντας E2F1 στον καρκίνο του πνεύμονα, και στη συνέχεια καταστέλλει την κατάντη ΑΚΤ και μονοπατιών σηματοδότησης ERK, για τον έλεγχο του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, εισβολή και ογκογένεση. Ωστόσο, οι μελλοντικές μελέτες θα πρέπει να ανιχνεύσει περισσότερες υποψήφιων στόχων σε επιπλέον τύπους καρκίνου να αποσαφηνίσει πλήρως τη λειτουργία του miR-493 στην ογκογένεση.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές και τον πολιτισμό

ανθρώπινου πνεύμονα καρκινικές κυτταρικές σειρές (H1975, Α549, Η1299, Η446), MRC5, ένα φυσιολογικό διπλοειδή ανθρώπινη κυτταρική σειρά ινοβλαστών πνεύμονα, και αθανατοποιημένα ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα ΗΒΕ ελήφθησαν από και διατηρήθηκαν, όπως συνιστάται από την American Type Culture Collection ( ATCC, Manassas, VA, USA) .Το ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα γραμμή 95d ελήφθη από την Τράπεζα κυττάρων της κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα). Η H1975, Α549, Η1299, Η446, ΗΒΕ και 95d κύτταρα διατηρήθηκαν σε RPMI-1640 (Hyclone, USA), συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS? Hyclone, USA). Τα κύτταρα MRC5 διατηρήθηκαν σε μέσο DMEM (Hyclone, USA), συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό. (FBS? Hyclone, USA) .Τα κύτταρα επωάστηκαν σε ατμόσφαιρα 5% CO2 στους 37 ° C

τα δείγματα ασθενών

Όλα τα δείγματα ιστών συλλέχθηκαν μέσω χειρουργική εκτομή από τους ασθενείς διαγνώστηκαν μεταξύ Μαρτίου 2009 και Μαρτίου 2012 στο Ενταγμένο όγκων Νοσοκομείο Guangzhou Ιατρικό Πανεπιστήμιο (Guangzhou, Guangdong, Κίνα). Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους συμμετέχοντες στη μελέτη. Το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας της Guangzhou Ιατρικό Πανεπιστήμιο.

ανάστροφης μεταγραφάσης (RT) -PCR και qRT-PCR

Το συνολικό RNA εξήχθη από κύτταρα ή ιστούς χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤπζοΙ ( Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), και οι αντιδράσεις RT πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ειδικό εκκινητή miR-493. Οι ειδικοί εκκινητές στελέχους-βρόχου RT για miR-493 και U6 αγοράστηκαν από Ribobio co., Ltd (Guangzhou, Κίνα). Οι αλληλουχίες εναρκτήρα του E2F1 ορίστηκαν ως εξής: Επίθεση εκκινητής: 5′-CCCATCCCAGGAGGTCACTT-3 ‘? Αντίστροφο εκκινητή: 5-CTGCAGGCTCACTGCTCTC-3 ‘. Οι αλληλουχίες εναρκτήρα του GAPDH ορίστηκαν ως εξής: Επίθεση εκκινητής: 5’-CCACATCGCTCAGACACCAT-3 ‘? Αντίστροφο εκκινητή: 5’-TGACAAGCTTCCCGTTCTCA-3 ‘. Real-time PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα τυποποιημένο πρωτόκολλο για την SYBR Green PCR kit (Toyobo, Osaka, Japan). U6 και GAPDH χρησιμοποιήθηκαν ως αναφορές για τα miRNAs και mRNA, αντίστοιχα. Το 2

-ΔΔCt μέθοδος χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των σχετικών ποσοτήτων της γονιδιακής έκφρασης. Κάθε δείγμα αναλύθηκε εις τριπλούν.

Western ανάλυση κηλίδος

Η συγκέντρωση πρωτεΐνης στα προϊόντα λύσης μετρήθηκε με την πρωτεΐνη BCA Assay Kit (Bio-Rad), και 30 μg πρωτεΐνης αναμιγνύεται με 2 ρυθμιστικού φόρτωσης × SDS φορτώθηκε ανά λωρίδα κυκλοφορίας. Οι πρωτεΐνες στα προϊόντα λύσης διαχωρίστηκαν με 10% SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (Millipore). Στη συνέχεια, οι μεμβράνες επωάστηκαν για 12 ώρες στους 4 ° C με έναν αντιορό που περιέχει αντισώματα έναντι E2F1, ρ-ΕΚΚ, andβ-ακτίνης αγοράστηκαν από την Cell Signaling Technology, Akt, ρ-Akt, ΟδΚ3β και ρ-ΟδΚ3β και ERK που αγοράζονται από την Sigma -Aldrich Τεχνολογίας. Ένα δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση και δυτική αντιδραστήρια ανίχνευσης ECL κηλίδωση χρησιμοποιήθηκαν για να visualisethe πρωτεΐνες-στόχους (ECL New England Biolabs), τα οποία ποσοτικοποιήθηκαν με ένα Bio εικόνας ευφυή Quantifier 1-D (Version 2.2.1, Nihon-bioimage Ltd.). Ένα αντι-β-ακτίνης αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης πρωτεΐνης.

Ανοσοϊστοχημεία

Τα πλακίδια ιστού περιλαμβάνονται 65 δείγματα πρωτογενών πνεύμονα και αντίστοιχοι φυσιολογικοί ιστοί πνεύμονα επιθηλιακά. Ανοσοϊστοχημεία εκτελέστηκε σε εγκλεισμένο σε παραφίνη ιστό μονιμοποιηθεί με φορμαλίνη χρησιμοποιώντας αντι-E2F1 αντίσωμα (Cell Technology σηματοδότηση) και το πρότυπο στρεπταβιδίνης-υπεροξειδάσης μέθοδος χρώσης (κιτ ανίχνευσης βιοτίνης-στρεπταβιδίνης (ABC) IHC, Abcam Inc, ΗΠΑ). αποτελέσματα ανοσοϊστοχημείας βαθμολογήθηκαν ανάλογα με την ένταση (0-4) και το ποσοστό των θετικών κυττάρων σκορ 0: καμία χρώση? 1: 10% θετικά κύτταρα? 2: 11-50% θετικά κύτταρα? 3: 51-75% θετικά κύτταρα? 4: 0,75% θετική cells.The σχετική έκφραση προκύπτει από τον πολλαπλασιασμό της έντασης με το ποσοστό

λουσιφεράσης δημοσιογράφος δοκιμασία

Μια pmirGLO Dual-λουσιφεράσης miRNA φορέα έκφρασης στόχου χρησιμοποιήθηκε για το 3. «-UTR λουσιφεράση δοκιμασίες (Promega). επιλέγονται τα γονίδια-στόχους των miRNA-493 βασίστηκαν σε αλγορίθμους ανίχνευσης στόχου [microRNA.org (https://www.microrna.org/microrna/home.do) και TargetScan (https://www.targetscan.org/) ]. Οι αλληλουχίες εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν ορίζονται ως εξής: E2F1 πρόσθιος εκκινητής: GCCTCGAGGAGATGCTCACCTTGTCTCTG, το αντίστροφο έναυσμα: CTAGCGGCCGCTGGATCTGCTTTTGAGTT. Μεταλλαγμένα E2F1 μπροστά αστάρι: GAGGTGAGTGGGG

ACAAGG

CTGATGTGGGCAGGAGGGGTG, Mutant E2F1 αντιστρέφει αστάρι: CCTGCCCACATCAGCCTTGTCCCCACTCACCTCTCCCATCTC. Bold δείχνει την XhoI (CTCGAG), και υπογράμμιση δείχνει την εσωτερική Notl θέση. Italic (άγρια: GACCTTCA, μεταλλαγμένο: ACAAGG) δείχνει την αλληλουχία-στόχο. Για την δοκιμασία λουσιφεράσης 3′-UTR, κύτταρα 293Τ συν-επιμολύνθηκαν με HSA-miR-493 και pmirGLO Dual-Luciferase miRNA στόχευση φορείς έκφρασης με άγριου τύπου ή μεταλλαγμένη αλληλουχία στόχου χρησιμοποιώντας δοκιμασία λουσιφεράσης Lipofectamine 2000.Τα διεξήχθη χρησιμοποιώντας την Dual-Luciferase Σύστημα Reporter Assay (Promega) 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση τιμή ± SD για πειράματα εις τριπλούν και συγκρίνεται με το επίπεδο των φορέων αλληλουχία άγριου τύπου που λήφθηκε στο φορέα αλληλουχία μεταλλαγμένου τύπου επιμολυσμένα κύτταρα που κανονικοποιούνται στο 100%.

παραγωγή και μόλυνση Lentivirus

Για να κατασκευαστεί ένας φορέας που εκφράζει miR-493, ο πρόδρομος αλληλουχία του miR-493 (MI0003132) συνετέθη, ανόπτηση και στη συνέχεια εισάγεται στο θραύσμα BamHI-HindIII του φορέα PGCI-L3 (GeneCopoeia, Inc., Rockville, MD ΗΠΑ) .Οι lentivirus πλασμίδια συν-επιμολύνθηκαν με pLP1, pLP2, και pLP /VSVG (GeneCopoeia, Inc., Rockville, MD ΗΠΑ) σε κύτταρα 293Τ (Invitrogen), και τα υπερκείμενα που περιέχουν ιό παρασκευάστηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για φακοϊό μόλυνση, τα κύτταρα επωάστηκαν με υπερκείμενα που περιέχουν ιό με την παρουσία 6 μg /ml polybrene. Τα μολυσμένα κύτταρα επιλέχθηκαν με την παρουσία 2 μg /ml πουρομυκίνη για τη δημιουργία δύο ζεύγη σταθερές μονοκλωνικές σειρές (μία σταθερή κυτταρική γραμμή που εκφράζει miR-493, 95d-miR-493, H1975-miR-493 και τον έλεγχο σταθερή κυτταρική σειρά τους, 95d -Έλεγχος ή H1975- ελέγχου). Όλες οι στατιστικές δοκιμασίες ήταν δύο όψεων.