Αφηρημένο

Φλοιοεπινεφριδιακή καρκίνωμα (ACC) είναι μια πολύ σπάνια ενδοκρινική όγκου, με μεταβλητή πρόγνωση, ανάλογα με το στάδιο του όγκου και το χρόνο της διάγνωσης. Ωστόσο, είναι γενικά μοιραία, με συνολική επιβίωση των 5 ετών από την ανίχνευση. Ακτινοθεραπεία χρησιμότητα για τη θεραπεία ACC έχει ευρέως συζητηθεί και φαίνεται να εξαρτάται από μοριακές αλλαγές, οι οποίες με τη σειρά τους οδηγούν σε αυξημένη ραδιο-αντίσταση. Πολλές μελέτες έχουν δείξει ότι η απώλεια της ρ53 είναι ένας σημαντικός παράγοντας κινδύνου για κακοήθεις φλοιού των επινεφριδίων έναρξης του καρκίνου και έχει αναφερθεί ότι σωματικές μεταλλάξεις εις

ΤΡ53

γονίδιο εμφανίζονται σε 27 με 70% των ενήλικων σποραδικές ΚΕΠ. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε το ρόλο των σωματικών μεταλλάξεων του

ΤΡ53

γονιδίου σε απόκριση σε ιοντίζουσα ακτινοβολία (IR). Μελετήσαμε την κατάσταση της ρ53 σε δύο κυτταρικές σειρές του φλοιού των επινεφριδίων, H295R και SW-13, που φιλοξενούν μορφές μη λειτουργία αυτής της πρωτεΐνης, λόγω της έλλειψης των εξονίων 8 και 9 και ένα σημείο μετάλλαξης στο εξόνιο 6, αντίστοιχα. Επιπλέον, αυτές οι κυτταρικές γραμμές δείχνουν υψηλά επίπεδα ρ-Akt και

IGF2

, ειδικά H295R. Παρατηρήσαμε ότι η αποκατάσταση της δραστηριότητας ρ53 οδήγησε σε αναστολή της ανάπτυξης μετά από παροδική επιμόλυνση των κυττάρων με άγριου τύπου ρ53. Αξιολόγηση των απόκρισή τους σε IR σε όρους πολλαπλασιασμού των κυττάρων και η βιωσιμότητα προσδιορίστηκε με τη βοήθεια του αριθμού των κυττάρων και προσδιορισμού TUNEL.

wtp53 υπερέκφραση αυξήθηκε επίσης κυτταρικού θανάτου με απόπτωση μετά την ακτινοβολία στις δύο κυτταρικές σειρές. Επιπλέον, RT-PCR και κηλίδωση Western ανάλυση μερικών γονιδίων στόχων ρ53, όπως

BCL2

,

IGF2

και Akt έδειξαν ότι η ενεργοποίηση της ρ53 μετά από IR οδήγησε σε μείωση σε ποσοστό

IGF2

έκφρασης. Αυτό συσχετίστηκε με μείωση της δραστικής μορφής του Akt. Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματα αυτά υπογραμμίζουν το ρόλο της p53 σε απάντηση στην ακτινοβολία των κυτταρικών σειρών ACC, γεγονός που υποδηλώνει τη σημασία της ως προγνωστικός παράγοντας για την ακτινοθεραπεία σε κακοήθεις περιπτώσεις του φλοιού των επινεφριδίων όγκοι

Παράθεση:. Sampaoli C, Cerquetti L, Gawhary RE , Bucci Β, Amendola D, Marchese R, et al. (2012) p53 Σταθεροποίηση επάγει τον κυτταρικό Αναστολή Ανάπτυξης και επηρεάζει

IGF2

Διαδρομή σε απάντηση Ακτινοθεραπεία σε καρκινικά κύτταρα του φλοιού. PLoS ONE 7 (9): e45129. doi: 10.1371 /journal.pone.0045129

Επιμέλεια: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesu », Ιταλία

Ελήφθη: 23 Απρ, 2012? Αποδεκτές: 14 Αυγούστου, 2012? Δημοσιεύθηκε: 19 Σεπ του 2012

Copyright: © Sampaoli et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το ιταλικό Υπουργείο Πανεπιστημίων και έρευνας (20085P5S49_005), από Sapienza Πανεπιστήμιο της Ρώμης (C26A1097KR), από το Ίδρυμα Guido Berlucchi per la Ricerca sul Cancro, ερευνητικό πρόγραμμα: «Tumori del sistema Endocrino» Borgonato di Corte Franca – Μπρέσια, Ιταλία . Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Φλοιοεπινεφριδιακή καρκίνωμα (ACC) είναι μια πολύ σπάνια ενδοκρινική όγκου, με συχνότητα που εκτιμάται σε περίπου 1 έως 2 περιπτώσεις

ανά

1 εκατομμύριο ανθρώπους κάθε χρόνο στον πληθυσμό γενικά ενηλίκων [1], [ ,,,0],2], ενώ στον πληθυσμό της βρεφικής τροφής της νότιας Βραζιλίας η συχνότητα αυτής της κακοήθειας είναι σχετικά υψηλό, που κυμαίνονται από 3,4 έως 4,2

ανά

εκατομμύριο παιδιά [3], [4]. Στατιστική ηλικιακή κατανομή ακολουθεί μια δικόρυφη τάση, με μια πρώτη κορυφή που συμβαίνουν στην πρώιμη παιδική ηλικία και ένα δεύτερο στην τέταρτη και πέμπτη δεκαετία της ζωής [2], [5].

ΚΕΠ δείχνουν μεταβλητή πρόγνωση, ανάλογα με όγκο στάδιο και το χρόνο της διάγνωσης, αν και είναι γενικά μοιραία, με συνολική επιβίωση των 5 ετών από την ανίχνευση [6]. Συχνότητα της μετάστασης που σχετίζονται με ACC ποικίλλει ανάλογα με τη μελέτη, που κυμαίνονται από 30% έως 85% των ασθενών με μακρινή μετάσταση κατά τον χρόνο της παρουσίασης [7].

Επί του παρόντος, η θεραπεία που φαίνεται να παράγουν καλύτερα αποτελέσματα σε ACC περιπτώσεις είναι η χειρουργική εκτομή των επινεφριδίων μάζα. Ωστόσο, μετεγχειρητική ελεύθερη νόσου επιβίωση στα 5 χρόνια είναι μόνο περίπου 30% και τα ποσοστά υποτροπής είναι έως και 85%. Η φαρμακευτική θεραπεία με ο, p’DDD (ορθο, παρα ‘, διχλωρο-, διφαινυλο-, διχλωροαιθάνιο, ή μιτοτάνη) και άλλων κυτταροτοξικών φαρμάκων περιορίζεται από σημαντικές παρενέργειες. Ως εκ τούτου, οι άλλες επιλογές επικουρική θεραπεία μετά την πλήρη αφαίρεση του όγκου που απαιτείται [8], [9].

Η ακτινοθεραπεία έχει συχνά θεωρηθεί αναποτελεσματικό για τη θεραπεία ACC. Στην πραγματικότητα, μέχρι και 58% των ασθενών δεν δείχνουν σημαντική απόκριση. Παρά το γεγονός ότι τα δεδομένα που συλλέγονται από ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με ακτινοβολία κρεβάτι επικουρική όγκου έδειξαν ότι η ακτινοθεραπεία μπορεί να είναι αποτελεσματική στη μείωση του υψηλού ποσοστού της τοπικής υποτροπής του ACC, η υψηλή μεταβλητότητα στις παρατηρούμενες επιδράσεις υποδηλώνει ότι οι περισσότερες έρευνες προκειμένου να κατανοήσουμε πλήρως την αποτελεσματική θεραπευτικό ρόλο της ακτινοθεραπείας [8], [10]. Προς το παρόν, θεωρείται ότι η ακτινοθεραπεία θα πρέπει να εξατομικεύεται, ενώ λαμβάνοντας υπόψη παραμέτρους όπως το μέγεθος του όγκου, την κατάσταση εκτομή, Ki-67 index και την εξάπλωση του όγκου [11].

Επιπλέον, η μεταβλητότητα των απαντήσεων που παρατηρήθηκαν τόνισε τη σημασία της αναγνώρισης των γενετικών και μοριακών μεταβολών που εμπλέκονται στην αντοχή ορισμένων όγκων σε ραδιοθεραπεία [2], [12]. Προς το παρόν, η γνώση των γενετικών αλλαγών που οδηγούν σε ACC προδιάθεση είναι αρκετά φτωχή. Ωστόσο, πολλές μελέτες έχουν δείξει ότι η απώλεια της ρ53 είναι ένας σημαντικός παράγοντας κινδύνου για κακοήθεις φλοιού των επινεφριδίων εμφάνιση όγκων. Οι ασθενείς που πάσχουν από το σύνδρομο Li-Fraumeni, που κληρονομούν τις μεταλλάξεις βλαστικής γραμμής του

ΤΡ53

, είναι πιο πιθανό να αναπτύξουν κακοήθεις όγκους του φλοιού των επινεφριδίων. Επιπλέον, μία ειδική μετάλλαξη στο κωδικόνιο 337 (R337H) φαίνεται να είναι υπεύθυνος για την πλειοψηφία των περιπτώσεων ACC στον πληθυσμό παιδί της Νότιας Βραζιλίας. Επιπλέον, έχει επίσης αναφερθεί ότι σωματικές μεταλλάξεις στο

TP53

γονίδιο εμφανίζονται σε 25-70% των ενηλίκων σποραδικές ΚΕΠ [2], [9].

Στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε η ρόλος του p53 ως απόκριση σε ιοντίζουσα ακτινοβολία (IR) στη θέση ACC

in vitro

μοντέλα. Συγκεκριμένα, ανάλυση της κατάστασης της

ΤΡ53

γονίδιο σε δύο ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές ACC, H295R και SW-13, και βρήκαμε ότι αυτό το γονίδιο είναι μεταλλαγμένο σε αμφότερες τις κυτταρικές γραμμές, οι οποίες είναι εν μέρει ανθεκτικό σε IR σε μία δόση 6 Gy, όπως καταδείχθηκε προηγουμένως [13]. Η υπερέκφραση του

IGF2

mRNA είναι ένα άλλο τυπικό χαρακτηριστικό της ACC βρεθεί σε κυτταρική σειρά H295R. Εδώ, δείξαμε ότι η αποκατάσταση της δραστηριότητας ρ53, με επιμόλυνση άγριου τύπου ρ53 (

wtp53), οδήγησε σε αναστολή της ανάπτυξης και επαγόμενο κυτταρικό θάνατο μέσω απόπτωσης μετά από χορήγηση IR σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές. Παρατηρήσαμε επίσης μια αξιόπιστη μείωση του

IGF2

γονιδιακή έκφραση και η μείωση στην ενεργοποίηση Akt μετά από αγωγή IR σε κύτταρα που υπερεκφράζουν άγριου τύπου ρ53.

Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υπογραμμίζουν τη σημασία της ρ53 στην κυτταρική απόκριση σε IR σε ACC κυτταρικές σειρές. Επίσης, αναφέρουν ένα μοριακό μηχανισμό που περιλαμβάνει IGF2, ενισχύοντας έτσι την αποτελεσματικότητα της ακτινοθεραπείας ως επικουρική θεραπεία στην ACC.

Αποτελέσματα

TP53

ανάλυση mRNA

ένα προηγούμενο έγγραφο από την ομάδα μας [13], μια μεγάλη διαγραφή στο

TP53

γονιδίων, επηρεάζοντας εξόνια 8 και 9, ανακαλύφθηκε στην κυτταρική σειρά H295R. Πραγματοποιήσαμε ανάλυση αλληλουχίας του

ΤΡ53

αλληλουχία κωδικοποίησης σε αυτά τα κύτταρα να αξιολογηθεί το αποτέλεσμα αυτής της εξάλειψης της παραγωγής mRNA. Βρήκαμε ότι ένα βραχύτερο mRNA μεταγράφεται, όπου το εξόνιο 7 συνδέεται άμεσα στο εξώνιο 10 (Σχήμα 1, πλαίσιο Α, κορυφή). Συνεπής με αυτό, RT-PCR ανάλυση του

ΤΡ53

, διεξήχθη χρησιμοποιώντας εναρκτήρες που πλευρίζουν τα εξόνια 8 και 9 περιοχή. Αυτό αποκάλυψε ένα μικρότερο προϊόν mRNA, λείπει 211 ζεύγη βάσεων (Εικόνα 1, πίνακας Β).

(α) εκπροσώπηση του

TP53

μεταλλάξεις εντοπίστηκαν σε H295R και SW-13 κυτταρικές σειρές, που δείχνει ένα μεγάλο διαγραφή επηρεάζει 211 ζευγών βάσεων σε κύτταρα H295R (επάνω) και ένα ομόζυγο σημείο μετάλλαξης στο εξόνιο 6 (

r.577c & gt? u

) σε SW-13 κυτταρική σειρά (κάτω). SW-13 κύτταρα εμφανίζουν επίσης ένα πολυμορφικό χώρο που βρίσκεται στο εξόνιο 4 (

r.215c & gt? Ζ

). (Β) Ανεστραμμένη εικόνα σε σχέση με την ανάλυση RT-PCR των εξονίων 7 έως 10 του

ΤΡ53

γονίδιο. Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 2% απεκάλυψε μία κύρια ζώνη του ~575 bp, που αντιστοιχεί σε SW-13 μεταγραφής, και μία μικρή ζώνη ~364 bp, που αντιστοιχεί σε H295R μεταγραφή (DNA ladder, 1 Kb συν). (Γ) Προβλεπόμενη αλληλουχία αμινοξέων της ρ53 σε H295R και κυτταρικές γραμμές SW-13. Η διαγραφή των εξονίων 8 και 9 σε H295R προσδιορίζει μια μετατόπιση πλαισίου που αρχίζει στο κωδικόνιο 261, δημιουργώντας μια μεταγενέστερη κωδικόνιο λήξης στη θέση 274 (κορυφή). Σε SW-13 κύτταρα, μία ομόζυγη μετάλλαξη σημείου στο κωδικόνιο 193 καθορίζει μία αμινο-οξύ υποκατάστασης (ιστιδίνη σε τυροσίνη) στην DBD της πρωτεΐνης (κάτω). (D) κηλίδωση Western ανάλυση της ρ53 σε H295R και SW-13 κύτταρα, που δείχνει την παρουσία μιας μικρότερης πρωτεΐνης σε κυτταρική σειρά H295R, το οποίο μοριακό βάρος είναι ~44 kDa.

Η

Η διαγραφή των εξωνίων 8 και 9 προσδιορίζει μια αλλαγή αλληλουχίας αμινοξέος ξεκινώντας από το κωδικόνιο 261, το οποίο εισάγει επίσης ένα πρόωρο κωδικόνιο τερματισμού στην θέση αμινοξέος 274 (Εικόνα 1, πλαίσιο C, κορυφή). Σύμφωνα με τα προηγούμενα στοιχεία μας, αυτό το mRNA δείχθηκε να μεταφραστεί σε μια μικρότερη πρωτεΐνη, του οποίου το μοριακό βάρος είναι περίπου 44 kDa (Σχήμα 1, πλαίσιο D).

Αλληλούχιση ανάλυση του

ΤΡ53

κωδικοποίησης ακολουθία στη ΝΔ-13 κύτταρα επιβεβαίωσε την παρουσία ενός ομόζυγη μετάλλαξη σημείου στο εξόνιο 6 (

r.577c & gt? u

)., η οποία περιγράφηκε για πρώτη φορά από Reincke

et al

[ ,,,0],14] (Σχήμα 1, πλαίσιο Α, κάτω). Αυτό έχει ως αποτέλεσμα αλλαγή αμινοξέος στο κωδικόνιο 193 (ιστιδίνη σε τυροσίνη) (Σχήμα 1, πλαίσιο C, κάτω). Επιπλέον, ταυτοποιήσαμε έναν πολυμορφισμό στο κωδικόνιο 72 (CCC να CGC) (σχήμα 1, πλαίσιο Α, κάτω) σε αυτή την κυτταρική γραμμή, με αποτέλεσμα μία υποκατάσταση αμινοξέος σε αυτήν την θέση (αργινίνη αντί της προλίνης) (Σχήμα 1, πλαίσιο C, κάτω μέρος). Προκύπτουσα πρωτεΐνη ρ53 στα κύτταρα αυτά έχει ένα πρότυπο μοριακό βάρος (Σχήμα 1, πλαίσιο D) και εκφράζεται έντονα σε σύγκριση με κυτταρική σειρά LNCaP, που φιλοξενεί το άγριου τύπου μορφή του ρ53, όπως αποδείχθηκε με κηλίδωση Western ανάλυση (Σχήμα S1).

Επίδραση του άγριου τύπου

TP53

στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την απόκριση σε ιοντίζουσα ακτινοβολία

για να εκτιμηθεί η σημασία των

TP53

μεταλλάξεις στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, που παροδικά επιμολυσμένα H295R και SW-13 κυττάρων με κενό φορέα (ψεύτικο) ή ένα φορέα που εκφράζει το άγριου τύπου μορφή του

ΤΡ53

(WT) και αξιολογείται το αποτέλεσμα επί της κυτταρικής ανάπτυξης 24, 48 και 72 ώρες μετά την επιμόλυνση. Αξιολογήσαμε επίσης την επίδραση του

ΤΡ53

αποκατάσταση σε απόκριση σε ακτινοβολία σε δόση 6 Gy.

Η ίδια ανάλυση πραγματοποιήθηκε σε ωοθηκική αδενοκαρκίνωμα ραδιο-ανθεκτικά κύτταρα SK-OV-3, η οποία κάνει δεν εκφράζουν είτε πρωτεΐνη ρ53 ή mRNA [15].

σε κύτταρα H295R (Εικόνα 2, πλαίσιο Α, αριστερά), καμία σημαντική αναστολή ανάπτυξης παρατηρήθηκε σε κύτταρα που εκφράζουν άγριου τύπου ρ53 σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με άδειο φορέα ( -11% μετά από 48 ώρες και -9% σε 72 ώρες). Αυτό υποδεικνύει ότι η ρ53 μόνη της δεν είναι σε θέση να επάγει μια σταθερή αναστολή της ανάπτυξης σε αυτά τα κύτταρα. IR δεν μετέβαλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε κύτταρα επιμολυσμένα με άδειο φορέα (-4% μετά από 72 ώρες), ενώ η επίδραση της ακτινοβολίας επί της ανάπτυξης των κυττάρων ήταν εμφανής σε κύτταρα που εκφράζουν

wtp53. Αυτή η επίδραση ήταν εμφανής στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση (-18% σε σύγκριση με κοροϊδεύει ακτινοβολημένα κύτταρα? Ρ & lt? 0,05) και να ενισχύεται σε 72 ώρες μετά την επιμόλυνση (48 ώρες μετά την ακτινοβολία), όταν η αναστολή της ανάπτυξης έφθασε -25% (ρ & lt? 0,01).

η ανάπτυξη των κυττάρων αξιολογήθηκε σε H295R, SW-13 και SK-OV-3 κυτταρικές σειρές επιμολύνθηκαν με άδειο φορέα (ψευδο) ή ρ53-φορέα (WT), είτε ακτινοβολημένων ή μη. (Α) σε κυτταρικές σειρές H295R (αριστερά), ιονίζουσα ακτινοβολία (IR) αγωγή επάγει μία σημαντική αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων σε κύτταρα που εκφράζουν άγριου τύπου ρ53, ξεκινώντας από 48 ώρες μετά την επιμόλυνση (-18% σε σύγκριση με κοροϊδεύει ακτινοβολημένα κύτταρα? Ρ & lt? 0,05 ) και φτάνοντας -25% μετά από 72 ώρες (p & lt? 0,01). Η ακτινοβολία δεν επάγει ένα σταθερό αποτέλεσμα σε SW-13 κύτταρα (δεξιά) επιμολυσμένα με άδειο φορέα, ενώ τα κύτταρα που εκφράζουν άγριου τύπου ρ53 ανέστειλαν σημαντικά στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση (-28%? Ρ & lt? 0,05) μέχρι το τέλος του πειράματος ( -31%? p & lt? 0,01). Στην SK-OV-3 κύτταρα (κάτω), την αποκατάσταση ρ53 επάγει μία ισχυρή επίδραση στην κυτταρική ανάπτυξη, η οποία είναι εμφανής από το 48 από την επιμόλυνση (-20% της αναστολής ανάπτυξης σε δείγμα WT + IR σε σύγκριση με mock + IR? Ρ & lt? 0,01) και υπομένει μέχρι 72 ώρες (-28%? p & lt? 0,01). Τα δεδομένα είναι μέσες ± S.D. τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων που πραγματοποιούνται από διπλότυπα. (Β) Κηλίδωση Western ανάλυση της κυκλίνης Ε και έκφραση D1 κυκλίνης σε κύτταρα H295R σε 72 ώρες μετά την επιμόλυνση αποκάλυψε τα κάτω ρύθμιση αυτών των πρωτεϊνών σε κύτταρα που εκφράζουν

wtp53 αγωγή με IR σε μια δόση των 6 Gy. (C) Ανάλυση της κυκλίνης Ε και έκφραση D1 κυκλίνης σε SW-13 κυτταρική γραμμή με κηλίδωση Western δείχνει μια μείωση στα επίπεδα της πρωτεΐνης σε δείγματα επιμολύνθηκαν με p53-φορέα μετά την ακτινοβόληση. εντάσεις ζώνες »ήταν ποσοτικά με το λογισμικό ImageJ, χρησιμοποιώντας βινκουλίνης για εξομάλυνση. (*, P & lt? 0,05).

Η

Σε αντίθεση με την προηγούμενη έκθεση μας [13], σε αυτό το έργο θα βελτιωθεί η αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης χρησιμοποιώντας φορέα ρΒΑΒΕ-neo-p53, που περιέχει το Επαναλάβετε MMLV Long Terminal. Morgenstern and Land [16] υποστηρίζουν την ικανότητα αυτού του φορέα για να βελτιώσει σε μεγάλο βαθμό την γονιδιακή έκφραση σε πολλές κυτταρικές σειρές.

παρατηρήθηκαν σε κυτταρική γραμμή SW-13 (Σχήμα 2, πάνελ Α, δεξιά) Παρόμοια αποτελέσματα. Κύτταρα επιμολυσμένα με άδειο φορέα ή p53-φορέα έδειξαν πολύ παρόμοια τάση πολλαπλασιασμού. Επιπλέον, η ακτινοβολία δεν επηρεάζει σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε κύτταρα επιμολυσμένα με άδειο φορέα. Αντιθέτως, μια ισχυρή επίδραση της αγωγής IR σε κύτταρα που εκφράζουν

wtp53 ήταν εμφανής στις 24 ώρες μετά την ακτινοβολία (48 ώρες μετά την επιμόλυνση), με 28% της αναστολής της ανάπτυξης των κυττάρων (ρ & lt? 0,05) σε σύγκριση με ακτινοβολημένα κύτταρα επιμολυσμένα με άδειο διάνυσμα. Η επίδραση ήταν ακόμη μεγαλύτερη σε 72 ώρες μετά την επιμόλυνση, όταν παρατηρήσαμε το 31% της αναστολής της ανάπτυξης σε WT ακτινοβολημένα κύτταρα σε σύγκριση με τον έλεγχο (ρ & lt? 0,01).

SK-OV-3 κύτταρα (Σχήμα 2, πάνελ Α, κάτω), η αποκατάσταση του

wtp53 προκάλεσε μία ελαφρά αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης, η οποία, ωστόσο, δεν πρέπει να υπερβαίνει το 17% μετά από 72 ώρες. Παρατηρήσαμε επίσης ότι η θεραπεία IR σε μια δόση 6 Gy προκάλεσε μία αναστολή της ανάπτυξης του -27% (ρ & lt? 0,05) μετά από 24 ώρες σε κύτταρα επιμολυσμένα με άδειο φορέα, ο οποίος έφθασε -35% (ρ & lt? 0,01) μετά από 48 ώρες. Ωστόσο, η παρουσία του

wtp53 ενίσχυσε την επίδραση της θεραπείας IR. Στην πραγματικότητα, παρατηρήσαμε μια αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης κατά 20% (ρ & lt? 0,01) 24 ώρες μετά την ακτινοβόληση σε κύτταρα που εκφράζουν ρ53 σε σύγκριση με εκείνους που μορφομετατρέπονται με άδειο φορέα. Αυτή η επίδραση αυξήθηκε μετά από 48 ώρες (-28%? Ρ & lt? 0,01).

Η σημασία της ρ53 σε SK-OV-3 κύτταρα απόκρισης σε ακτινοβολία επιβεβαιώθηκε περαιτέρω από την παρατήρηση ότι κύτταρα επιμολυσμένα με άδειο φορέα άρχισε να ανακτήσει 72 ώρες μετά την αγωγή IR, ενώ εκείνοι που εκφράζουν

wtp53 συνέχισαν να αναστέλλεται (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

H295R και SW-13 κυτταρικές γραμμές, η επίδραση της σταθεροποίησης ρ53 επί κυκλίνης Ε και κυκλίνης D1 αξιολογήθηκε, καθώς αυτές οι πρωτεΐνες συμβάλλουν στην κυτταρικού πολλαπλασιασμού με επιτάχυνση της G1 φάσης του κυτταρικού κύκλου [17], [18]. Στις 72 ώρες μετά την επιμόλυνση με κενό φορέα (ψεύτικο) ή φορέα ρ53 (WT), παρατηρήσαμε μια μείωση στα επίπεδα κυκλίνης Ε και της έκφρασης κυκλίνης D1 σε δείγματα που εκφράζουν

wtp53 ακτινοβολούνται με μία δόση των 6 Gy, τόσο H295R (Εικόνα 2, πάνελ Β) και SW-13 (Σχήμα 2, πάνελ C) κύτταρα. Αυτό το αποτέλεσμα, ως εκ τούτου δεικνύει ότι η θεραπεία IR είναι σε θέση να επιβραδύνουν το ρυθμό πολλαπλασιασμού των κυτταρικών σειρών μας σε ρ53-εξαρτώμενο τρόπο.

Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η αποκατάσταση του

wtp53 έκφραση σε H295R και SW-13 κυτταρικές γραμμές δεν είναι επαρκής για να ασκήσει μια επίδραση επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Η παρουσία του άγριου τύπου μορφή της ρ53 φαίνεται να είναι θεμελιώδης για την αναστολή της ανάπτυξης αυτών των κυττάρων σε απόκριση σε ακτινοβολία, όπως τα κύτταρα επιμολυσμένα με άδειο φορέα επηρεάστηκε ελάχιστα από αυτή τη θεραπεία. Ωστόσο,

wtp53 κύτταρα που εκφράζουν αναστέλλονται σημαντικά.

SK-OV-3 κύτταρα, η επίδραση του IR είναι ισχυρότερη από ό, τι σε H295R και SW-13 κυττάρων, ακόμη και σε δείγματα επιμολυσμένα με άδειο φορέα, υποδηλώνοντας ότι αυτή η κυτταρική γραμμή είναι πιο ευαίσθητα στην ακτινοβολία από κυτταρικές σειρές ACC. Παρ ‘όλα αυτά, η μέγιστη αναστολή της ανάπτυξης επιτυγχάνεται όταν ο άγριου τύπου μορφή του ρ53 εκφράζεται, υποδεικνύοντας ότι αυτή η πρωτεΐνη εμπλέκεται στην απόκριση σε IR σε SK-OV-3 κύτταρα, όπως καλά.

Σταθεροποίηση της ρ53 σε απόκριση σε ιοντίζουσα ακτινοβολία

άγριου τύπου ρ53 υπερ-έκφραση αξιολογήθηκε με RT-PCR και κηλίδωση Western. επίπεδα ρ53 αυξήθηκε σημαντικά σε H295R και κυτταρικές γραμμές SW-13 στις 24 ώρες μετά την επιμόλυνση με τον φορέα ρΒΑΒΕ-neo-p53 και ήταν μέγιστη στις 48 ώρες. Στις 72 ώρες από την επιμόλυνση, παρατηρήσαμε μια μείωση στα επίπεδα ρ53, η οποία φαίνεται να οφείλεται σε μείωση των

ΤΡ53

mRNA, πιθανώς λόγω της απώλειας των επιμολυσμένων φορείς (Εικόνα S2).

Ωστόσο, σε κύτταρα επιμολυσμένα με άγριου τύπου ρ53 υποβάλλεται σε κατεργασία υπερύθρων, η επίδραση επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων ήταν ισχυρότερη μετά από 72 ώρες μετά την επιμόλυνση (48 ώρες μετά την ακτινοβολία). Ως εκ τούτου, τα επίπεδα έκφρασης της ρ53 αξιολογήθηκαν με RT-PCR και κηλίδωση Western σε H295R, SW-13 και SK-OV-3 κύτταρα στο ίδιο χρονικό σημείο.

Real Time RT-PCR ανάλυση επιβεβαίωσε ότι

ΤΡ53

γονίδιο υπερεκφράζεται σε όλα τα δείγματα που επιμολύνθηκαν με τον φορέα ρΒΑΒΕ-neo-p53 (Σχήμα 3, πάνελ Α, C, Ε), είτε ακτινοβολημένων ή μη. Σε σύγκριση με κοροϊδεύει,

TP53

mRNA ήταν 5 και 3 φορές πιο εκφράζονται σε H295R και SW-13 κύτταρα, αντίστοιχα. Σύμφωνα με Yaginuma και Westphal [15], σε SK-OV-3 κύτταρα, χωρίς

ΤΡ53

mRNA ήταν ανιχνεύσιμο σε εικονικές δείγματα, σε αντίθεση με κύτταρα διαμολυσμένα με p53-φορέα.

Επίπεδα

Έκφραση

ΤΡ53

και πρωτεΐνη ρ53 αξιολογήθηκαν με Real Time RT-PCR και κηλίδωση Western σε H295R, SW-13 και SK-OV-3 κύτταρα 72 ώρες μετά την επιμόλυνση με κενό φορέα (ψεύτικο) ή ρ53-φορέα (WT) . Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με IR σε μια δόση των 6 Gy, όπου ενδείκνυται. (Α) RT-PCR (επάνω) και Real Time RT-PCR (κάτω) ανάλυση των

TP53

έκφραση στα κύτταρα H295R. Δείγματα επιμολυσμένα με ρΒΑΒΕ-neo-p53 φορέα δείχνουν μια 5-πλάσια αύξηση στην

TP53

mRNA σε σύγκριση με πλαστή. (Β) Κηλίδωση Western ανάλυση του ρ53 σε κύτταρα H295R (κορυφή) απεκάλυψε μία κύρια ζώνη του ~53 kDa (

wtp53) και μία μικρή ζώνη ~44 kDa, που αντιστοιχεί στο κολοβωμένη μορφή ρ53 (ρ53

Δ8 -9). Πυκνομετρία δείχνει ότι

wtp53 σταθεροποιείται με κατεργασία IR (κάτω). ανάλυση (C) RT-PCR του

ΤΡ53

mRNA σε SW-13 κύτταρα δεικνύει υπερ-έκφραση του γονιδίου σε δείγματα επιμολύνθηκαν με φορέα ρΒΑΒΕ-neo-p53 (κορυφή). Πραγματικό ανάλυση χρόνου RT-PCR αποκάλυψε ένα 3-πλάσια αύξηση στην

ΤΡ53

μεταγραφής σε δείγματα επιμολύνθηκαν με φορέα ρ53. Η έκφραση του

ΤΡ53

δεν διαμορφώνεται με ακτινοβολία (κάτω). (D) Τα επίπεδα της πρωτεΐνης ρ53 σε SW-13 κυττάρων αυξάνει σημαντικά μετά την αγωγή IR σε κύτταρα επιμολυσμένα με τον φορέα ρΒΑΒΕ-neo-p53, ενώ καμία μεταβολή είναι ανιχνεύσιμη σε δείγματα επιμολυσμένα με άδειο φορέα. (Ε) Σε SK-OV-3 κύτταρα, δεν

ΤΡ53

μεταγραφήματος ήταν ανιχνεύσιμη με RT-PCR σε δείγματα επιμολυσμένα με άδειο φορέα, ενώ σε κύτταρα επιμολυσμένα με τον φορέα ρΒΑΒΕ-neo-p53 ένα ισχυρό σήμα, που αντιστοιχεί σε

TP53

mRNA, είναι παρατηρήσιμη (κορυφή). Πραγματική ανάλυση χρόνου RT-PCR δεν δείχνει διαμόρφωση του

TP53

έκφρασης μετά την ακτινοβόληση (κάτω). (F) κηλίδωση Western ανάλυση της ρ53 σε SK-OV-3 κύτταρα απεκάλυψε μία ανιχνεύσιμη ζώνη μόνο σε δείγματα επιμολύνθηκαν με φορέα ρΒΑΒΕ-neo-p53 (κορυφή). Πυκνομετρία δεικνύει ότι τα επίπεδα ρ53 αυξάνουν μετά την ακτινοβολία, υποδεικνύοντας την σταθεροποίηση της πρωτεΐνης (κάτω). Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

GAPDH

και βινκουλίνης χρησιμοποιήθηκαν για την κανονικοποίηση. (*, P & lt? 0,05? #, Σ & lt? 0,01).

Η

Αν και

TP53

επίπεδα mRNA ήταν υψηλότερη σε κύτταρα p53-επιμολυσμένα, δεν διαφέρουν μεταξύ των WT ακτινοβολημένα και μη -irradiated κύτταρα. Αντίθετα, τα επίπεδα πρωτεΐνης ρ53 φάνηκε να είναι σημαντικά υψηλότερη σε ρ53-επιμολυσμένα κύτταρα υποβάλλονται σε κατεργασία IR σε σύγκριση με τα μη-ακτινοβολημένα αυτά. Στην πραγματικότητα, σε κύτταρα H295R τα επίπεδα της άγριου τύπου ρ53 αύξησε 3 φορές σε ακτινοβολημένα κύτταρα WT σε σύγκριση με p53-επιμολυσμένα, μη-ακτινοβολημένα κύτταρα (Σχήμα 3, πλαίσιο Β). Ωστόσο, η ενδογενής μορφή της ρ53 (ρ53

Δ8-9) δεν ρυθμίζεται με αγωγή ακτινοβολίας. SW-13 κύτταρα έδειξαν μία 1,3-πλάσια αύξηση σε ρ53 σε ακτινοβολημένα δείγματα WT σε σύγκριση με WT (σχήμα 3, πλαίσιο D), ενώ ρ53 ήταν 1,5 φορές υψηλότερη σε ακτινοβολημένα κύτταρα SK-OV-3 σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 3, πάνελ F).

η θεραπεία της H295R και SW-13 κύτταρα με διαφορετικές δόσεις ακτινοβολίας (4, 6 και 8 Gy) επιβεβαίωσε ότι

TP53

επίπεδα έκφρασης του mRNA δεν επηρεάστηκαν από IR (Σχήμα S3, πλαίσια Α, C). Η χορήγηση μιας δόσης ακτινοβολίας των 4 Gy δεν προκάλεσε σημαντική μεταβολή στην πρωτεΐνη p53, είτε. Αντίθετα, ρ53 ρυθμίζεται αυξητικά μετά τη χορήγηση δόσεων ακτινοβολίας 6 και 8 Gy? Ωστόσο, δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές μεταβολές μεταξύ αυτών των δύο δόσεων (Εικόνα S3, πάνελ Β, D), υποδεικνύοντας ότι η θεραπεία IR σε μια δόση 6 Gy είναι επαρκής για να προκαλέσει μια σταθεροποίηση της ρ53 σε κυτταρικές γραμμές ACC.

Η αύξηση των επιπέδων της πρωτεΐνης ρ53 που παρατηρήθηκαν σε ακτινοβολημένα δείγματα δεν οφείλεται σε αύξηση του

ΤΡ53

έκφρασης, δεδομένου ότι τα επίπεδα του mRNA δεν επηρεάστηκαν από την ακτινοβολία. Αυτό μπορεί να εξηγηθεί από την ενεργοποίηση της ρ53 με IR, το οποίο μεταφράζεται σε μια σταθεροποίηση αυτής της πρωτεΐνης μόνο σε κύτταρα υποβάλλονται σε αυτή τη θεραπεία. Η σταθεροποίηση του ρ53 μπορούν να θεωρηθούν προγνωστική της ενεργοποίησης του, εξηγώντας έτσι την επίδραση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων παρατηρήθηκε μόνο σε δείγματα που έλαβαν ακτινοβολία.

ανάλυση TUNEL του κυτταρικού θανάτου

Όπως ρ53 είναι μια καλά γνωστό επαγωγέα της αποπτωτικής διεργασίας σε απόκριση σε γενοτοξικό στρες [19], [20], πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία TUNEL, προκειμένου να αναλυθεί η παρουσία της απόπτωσης στα H295R, SK-OV-3 κυτταρικές γραμμές SW-13 και επιμολυσμένα με άδειο φορέα (mock) ή ρ53-φορέα (WT), είτε ακτινοβολημένων ή μη.

Όπως ήταν αναμενόμενο, δεν υπάρχουν ενδείξεις απόπτωσης ήταν ανιχνεύσιμα σε δείγματα που δεν υποβάλλονται σε θεραπεία με IR (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ο αποπτωτικός κυτταρικός θάνατος ήταν επίσης απούσα σε ακτινοβολημένα κύτταρα επιμολυσμένα με άδειο φορέα, ενώ τα δείγματα στα οποία η άγριου τύπου μορφή του ρ53 εκφράστηκε φάνηκε να είναι θετικό σε χρώση TUNEL σε όλες τις κυτταρικές σειρές (Σχήμα 4, πίνακας Α), υποδεικνύοντας ότι η παρουσία του μια λειτουργική ρ53 είναι απαραίτητη για την επαγωγή του κυτταρικού θανάτου ως απάντηση στην ακτινοθεραπεία.

H295R, SW-13 και SK-OV-3 κυτταρικές σειρές επιμολύνθηκαν με άδειο φορέα (ψευδο) ή ρ53-φορέα (WT) και ακτινοβολούνται σε μια δόση των 6 Gy. δοκιμασίας (Α) TUNEL διεξήχθη στις 48 και 72 μετά την επιμόλυνση. Σε όλες τις κυτταρικές σειρές, TUNEL-θετικά κύτταρα είναι ανιχνεύσιμα μόνο σε ακτινοβολημένα δείγματα που εκφράζουν τον άγριου τύπου μορφή του

ΤΡ53

. Τα κύτταρα επίσης χρωματίστηκαν με Hoechst 33342 και στη συνέχεια οπτικοποιήθηκαν με ένα μικροσκόπιο φθορισμού με μεγέθυνση 40 ×. Εικόνα που εμφανίζεται είναι αντιπροσωπευτικά τριών πειραμάτων που εκτελούνται εις διπλούν. (Β) Ποσοστό απόπτωσης σε H295R, SW-13 και SK-OV-3 υπολογίστηκε με σύγκριση TUNEL-θετικών κυττάρων με ολικά κύτταρα, χρωματίστηκαν με Hoechst 33342. Η απόπτωση αυξήσεις σε κύτταρα επιμολυσμένα με τον φορέα ρ53 σε σύγκριση με ψευδο-ακτινοβολημένα δείγματα, ξεκινώντας από 48 ώρες αφού διαμόλυνση και η επίδραση ενισχύει μετά από 72 ώρες. (*, P & lt? 0,05? #, Σ & lt? 0,01). (C)

BCL2

έκφραση αξιολογήθηκε στην κυτταρική σειρά H295R με RT-PCR. αποκατάσταση ρ53 προκαλεί μια σημαντική μείωση σε

BCL2

έκφραση στις 48 και 72 ώρες μετά την ακτινοβόληση. (D) Inverted εικόνες σε σχέση με την ημι-ποσοτική RT-PCR ανάλυση του

έκφραση BCL2

γονιδίου πραγματοποιήθηκε σε SW-13 κύτταρα, που δείχνει μια σημαντική μείωση στην

BCL2

σήματος σε κύτταρα επιμολυσμένα με ρ53- φορέας μετά τη θεραπεία ιοντίζουσες ακτινοβολίες. (Ε) Η επίδραση της αποκατάστασης ρ53 στο

BCL2

επίπεδα του mRNA σε απόκριση προς ακτινοβολία αξιολογήθηκε σε κυτταρικές σειρές SK-OV-3. αναστέλλει ρ53

BCL2

έκφραση και η επίδραση είναι ισχυρότερη στους 72 ώρες μετά την επιμόλυνση. Οι εικόνες είναι αντιπροσωπευτικές τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

GAPDH

χρησιμοποιήθηκε για την κανονικοποίηση.

Η

Η απόπτωση ήταν ανιχνεύσιμη σε 48 ώρες μετά την επιμόλυνση

ννίρ53 και αυξάνεται σε 72 ώρες μετά την επιμόλυνση (48 ώρες μετά την ακτινοβόληση) σε όλες τις κυτταρικές γραμμές (Σχήμα 4, πάνελ Α, Β? Πίνακας S1). Ο αποπτωτικός κυτταρικός θάνατος αυξήθηκαν κατά 2,6 φορές στις 48 ώρες σε ακτινοβολημένα κύτταρα H295R επιμολυσμένα με p53-φορέα σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με άδειο φορέα (10,3%

vs

3,9%) (ρ & lt? 0,05) και κατά 4,4 φορές στους 72 h (15,1%

vs

3,4%) (ρ & lt? 0,01) (Σχήμα 4, πίνακας Β? Πίνακας S1). Λιγότερο διαχωριζόμενες SW-13 κύτταρα παρουσίασαν επίσης 2-πλάσια αύξηση στην απόπτωση στις 48 h (8,4%

vs

4,3%) (ρ & lt? 0,05) και 3,7-πλάσια αύξηση σε 72 ώρες μετά την επιμόλυνση (16,3 %

vs

4,4%) (ρ & lt? 0,01) σε ακτινοβολημένα δείγμα WT σε σύγκριση με ακτινοβολημένα mock κύτταρα (Σχήμα 4, ομάδα Β? Πίνακας S1). Ομοίως, η επιμόλυνση του κενού φορέα δεν επηρεάζουν σημαντικά τον κυτταρικό θάνατο σε SK-OV-3 κυτταρική γραμμή, είτε, ενώ επιμόλυνση

wtp53 αύξησε σημαντικά το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων σε απόκριση σε θεραπεία ακτινοβολίας κατά 2 φορές σε 48 ώρες (8,7%

vs

4,2%) και κατά 3,5 φορές σε 72 h (17,1%

vs

4,9%) (ρ & lt? 0,05) (Σχήμα 4, πίνακας Β?. Πίνακας S1)

Επειδή πολλές αναφορές έδειξαν ότι ρ53 είναι σε θέση να καταστείλει

BCL2

έκφραση σε απόκριση σε ένα ερέθισμα αποπτωτικά [21] – [23], αναλύσαμε

BCL2

επίπεδα mRNA σε κύτταρα κατεργασμένα με IR , είτε εκφράζουν τον άγριου τύπου μορφή του

ΤΡ53

(WT) ή όχι (mock), στις 48 ώρες και 72 ώρες μετά την επιμόλυνση. RT-PCR ανάλυση έδειξε ότι

BCL2

επίπεδα έκφρασης μειώθηκε σε ακτινοβολημένα κύτταρα μόνο όταν

wtp53 ήταν παρούσα, ενώ διατηρήθηκε σταθερό σε δείγματα επιμολυσμένα με άδειο φορέα. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα του προσδιορισμού TUNEL,

επίπεδα BCL2

άρχισε να μειώνεται ξεκινώντας από 48 ώρες και τα ελάχιστα επίπεδα παρατηρήθηκαν σε 72 ώρες μετά την επιμόλυνση (Σχήμα 4, πλαίσιο C, D, E).

Αυτά τα δεδομένα επιβεβαιώνουν ότι η άγριου τύπου ρ53 είναι απαραίτητη για την επαγωγή του κυτταρικού θανάτου με απόπτωση και ρύθμιση προς τα κάτω του

BCL2

σε απόκριση σε ακτινοβολία σε H295R και SW-13 κύτταρα. Επιπλέον, η απουσία αυτών των επιδράσεων σε ακτινοβολημένα κύτταρα που εκφράζουν μόνο το ενδογενές μεταλλαγμένο ρ53 φαίνεται να δείχνει ότι αυτές οι μεταλλάξεις είναι μη-λειτουργούσα πρωτεΐνες είναι κατά κανένα τρόπο επηρεάζεται από κατεργασία IR.

Επίδραση επί

IGF2

έκφραση

IGF-II αντιπροσωπεύει το βασικό δείκτη της ACC [24], [25] και η έκφρασή του ρυθμίζεται αυστηρά από το ρ53 [26], [27]. Επειδή αποδείξαμε ότι

wtp53 είναι σε θέση να μειώσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και διεγείρει απόπτωση σε κυτταρικές γραμμές ACC σε απόκριση IR, διερευνήσαμε επίσης την επίδραση της ενεργοποίησης p53 στο

IGF2

έκφρασης. RT-PCR ανάλυση του

IGF2

έκφραση mRNA σε κύτταρα H295R (Σχήμα 5, πάνελ Α) αποκάλυψε ότι η ακτινοβόληση δεν μετέβαλε

IGF2

επίπεδα σε δείγματα επιμολυσμένα με άδειο φορέα. Ωστόσο,

IGF2

έκφραση μειώθηκε στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση (24 ώρες μετά την ακτινοβολία) και δραματικά μειώνεται σε 72 ώρες μετά την επιμόλυνση (-42%? Ρ & lt? 0,01) σε κύτταρα που εκφράζουν άγριου τύπου ρ53

.

(Α) Ανεστραμμένη εικόνες σε σχέση με ημι-ποσοτική ανάλυση RT-PCR του

IGF2

γονιδιακή έκφραση πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα H295R, δείχνοντας μια τεράστια απώλεια

IGF2

σήματος σε ακτινοβολημένα κύτταρα σε 72 h μετά την επιμόλυνση του p53-φορέα (WT). (Β) RT-PCR ανάλυση του

IGF2

επίπεδα του mRNA εκτελείται σε SW-13 κύτταρα. Μια σημαντική μείωση της

IGF2

έκφραση είναι ανιχνεύσιμη σε κύτταρα επιμολυσμένα με p53-φορέα (WT) μετά από αγωγή ιονίζουσες ακτινοβολίες. Οι εικόνες είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

GAPDH

έκφραση χρησιμοποιήθηκε για την εξομάλυνση και εντάσεις ζώνες »μετρήθηκαν με ImageJ. Band πυκνομετρία παρουσιάζεται στα δεξιά πλαίσια. (*, Ρ & lt? 0,05? #, Ρ & lt? 0,01).

Η

Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν στην SW-13 κυτταρική γραμμή (Σχήμα 5, πλαίσιο Β), αν και αυτά τα κύτταρα εκφράζουν πολύ χαμηλά επίπεδα

IGF2

mRNA. Ακόμη και σε αυτή την περίπτωση, καμία επίδραση στην

IGF2

έκφραση παρατηρήθηκε μετά τη χορήγηση IR σε κύτταρα που εκφράζουν ενδογενή ρ53 μεταλλαγμένη, ενώ μια μεγάλη μείωση του

IGF2

επίπεδα mRNA παρατηρήθηκε σε κύτταρα επιμολυσμένα με

διάνυσμα wtp53. Η μείωση αυτή ήταν μέγιστη στις 72 ώρες μετά την επιμόλυνση (-35%? P & lt? 0,05).

Επίδραση στην ενεργοποίηση της Akt

Τέλος, διερευνήθηκε η επίδραση του IR για Akt ενεργοποίηση σε H295R και ΝΔ -13 κυτταρικές σειρές είτε επιμολυσμένα με φορέα ρ53 (WT) ή όχι (ψευδο). Αυτή η πρωτεΐνη, στην πραγματικότητα, είναι ένας κύριος καθοδικός τελεστής του μονοπατιού σηματοδότησης IGF-II και ενός κλειδιού αρνητικός ρυθμιστής της αποπτωτικής διεργασίας.

κηλίδωση Western ανάλυση του συνολικού Akt και του φωσφορυλιωμένου ενεργή μορφή της στο H295R (Σχήμα 6 , πάνελ Α) και SW-13 (Σχήμα 6, πλαίσιο Β) κύτταρα αποκάλυψε ότι Akt ήταν παρούσα σε όλα τα δείγματα και δεν επηρεάστηκε από

wtp53 έκφραση (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αντιθέτως, πυκνομετρική ανάλυση του ρ-Akt κανονικοποιημένη σε ολική Akt έδειξαν ότι κύτταρα επιμολυσμένα με φορέα ρ53 εμφανίζεται αξιοσημείωτη μείωση στην φωσφορυλίωση της Akt σε απόκριση σε IR σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, που σημαίνει ότι η ενεργοποίηση της ρ53 μπορεί να είναι σε θέση να καταστείλει την ενεργότητα του αντι -apoptotic πρωτεΐνη Akt.

(Α) κηλίδωση Western ανάλυση του συνολικού Akt επίπεδα Akt και φωσφορυλιωμένη, πραγματοποιήθηκε σε ακτινοβολημένα κύτταρα επιμολυσμένα με H295R κενό φορέα (ψεύτικο) και p53-φορέα (WT) στις 48 και 72 ώρες μετά την διαμόλυνση. Η πυκνομετρική ανάλυση των Akt κανονικοποιήθηκαν προς βινκουλίνης και ρ-Ακί

έναντι

Akt δείχνει ότι Akt έκφραση δεν επηρεάζεται από την κατάσταση της ρ53, ενώ η ενεργοποιημένη μορφή της πρωτεΐνης είναι σημαντικά μειωμένη σε

wtp53-εκφράζοντα κύτταρα. (Β) Συνολική λύματα κυττάρων που λαμβάνονται από SW-13 κυτταρική σειρά υποβλήθηκαν σε κηλίδωση Western ανάλυση χρησιμοποιώντας αντισώματα που στοχεύουν Akt και Akt-pSer473. Τα επίπεδα φωσφορυλίωση της Akt μειωθεί σημαντικά με σταθεροποίηση ρ53 σε απόκριση σε ιοντίζουσα ακτινοβολία θεραπεία. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών πειραμάτων. Συγκροτήματα «εντάσεις προσδιορίστηκαν ποσοτικά χρησιμοποιώντας ImageJ και συγκροτήματα» πυκνομετρία δείχνεται στα δεξιά πλαίσια. (*, Ρ & lt? 0,05? #, Ρ & lt? 0,01).

Η

Σύμφωνα με τα δεδομένα μας σχετικά με τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την απόπτωση, η επίδραση επί της φωσφορυλίωσης Akt ήταν εμφανής στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση (-16% σε H295R και -17% σε SW-13 κύτταρα, αντίστοιχα) και ήταν μέγιστη στις 72 ώρες μετά την επιμόλυνση (-53% σε H295R και -51% σε SW-13 κύτταρα? ρ & lt?. 0.01)

Συζήτηση

ACC είναι μια επιθετική και ετερογενή κακοήθεια και οι περισσότεροι από θεραπευτικές επιλογές είναι συχνά ανεπιτυχής, υποδεικνύοντας έτσι ότι οι εναλλακτικές θεραπευτικές στρατηγικές για ACC απαιτείται [8], [9].