Αφηρημένο

Ιστορικό

Το κακόηθες μελάνωμα είναι μια επιθετική όγκων του δέρματος και φαίνεται να είναι ανθεκτικά στην τρέχουσα θεραπευτική προσεγγίσεις. Μελανοκυτταρικούς μετατροπή πιστεύεται ότι συμβαίνει με διαδοχική συσσώρευση γενετικών και μοριακών αλλαγών σε θέση να ενεργοποιήσετε την Ras /Raf /MEK /ERK (ΜΑΡΚ) και /ή την PI3K /AKT (ΑΚΤ) μονοπατιών σηματοδότησης. Συγκεκριμένα, οι μεταλλάξεις Β-RAF ενεργοποιούν ΜΑΡΚ μονοπάτι με αποτέλεσμα πρόοδο του κυτταρικού κύκλου και την πρόληψη της απόπτωσης. Σύμφωνα με τα ευρήματα αυτά, ΜΑΡΚ και μονοπάτια ΑΚΤ μπορεί να αντιπροσωπεύει πολλά υποσχόμενη θεραπευτική στόχους για μια κατά τα άλλα καταστροφική ασθένεια.

Αποτέλεσμα

Εδώ μπορούμε να δείξουμε ένα υπολογιστικό μοντέλο είναι σε θέση να προσομοιώνουν τις βασικές βιοχημικές και μεταβολικές αλληλεπιδράσεις με το PI3K /AKT και ΜΑΡΚ ενδεχομένως εμπλέκονται στην ανάπτυξη μελανώματος. Συνολικά, αυτή η υπολογιστική προσέγγιση μπορεί να επιταχύνει τη διαδικασία ανακάλυψης φαρμάκων και ενθαρρύνει την ταυτοποίηση νέων ενεργοποιητών οδού με επακόλουθη ανάπτυξη νέων antioncogenic ενώσεων για να ξεπεράσει την αντίσταση των καρκινικών κυττάρων με τα συμβατικά θεραπευτικούς παράγοντες. Ο πηγαίος κώδικας των διαφόρων εκδόσεων του μοντέλου είναι διαθέσιμα ως S1 Αρχείο

Παράθεση:. Pappalardo F, G Russo, Candido S, M Pennisi, Cavalieri S, Motta S, et al. (2016) Υπολογιστική Μοντελοποίηση της PI3K /AKT και ΜΑΡΚ μονοπάτια σηματοδότησης στον Καρκίνο μελάνωμα. PLoS ONE 11 (3): e0152104. doi: 10.1371 /journal.pone.0152104

Επιμέλεια: Suzie Chen, Πανεπιστήμιο Rutgers, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 22η Ιανουαρίου 2016? Αποδεκτές: 8 Μαρ, 2016? Δημοσιεύθηκε: 25 Μαρτίου, 2016

Copyright: © 2016 Pappalardo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του χαρτιού και ως υποστήριξη αρχείο πληροφοριών

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή έχει υποστηριχθεί εν μέρει από το FIR 2014 Πανεπιστήμιο της Κατάνια, Ιταλία επιχορήγησης. Δεν υπήρχαν άλλες πηγές χρηματοδότησης που υποστηρίζουν αυτό το έργο. FIR 2014 χρηματοδοτήθηκε εν μέρει το έργο. Το υπόλοιπο προσπάθεια προέρχεται από την εργασία με το εσωτερικό προσωπικό

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

RAS /RAF /MEK /ERK και PI3K /οδοί /mTOR ΑΚΤ αντιπροσωπεύουν θεμελιώδη μεταγωγής σηματοδότησης και ρυθμιστικά δίκτυα για την πλειοψηφία των κυτταρικών φυσιολογικές διαδικασίες, όπως ο πολλαπλασιασμός, η διαφοροποίηση και την επιβίωση των κυττάρων.

Αυτά τα μονοπάτια κυρίως ενεργοποιούνται από μεταβολές στην Ras, Β-RAF, ΡΙ3Κ , και τα γονίδια ΡΤΕΝ [1]. Η ενεργοποίηση αυτών των μονοπατιών είναι υπεύθυνος του ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό των κυττάρων και μπορεί να συμβάλει στην αντοχή φαρμάκου. Θεραπείες συνδυασμού με φαρμακολογική αναστολείς αυτών των οδών μπορεί να έχει πιθανές χρήσεις για την καταστολή του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων και τη σειρά του μπορεί να είναι η αποτελεσματικότητα να επανέλθει αντίσταση. Κακόηθες μελάνωμα είναι ένα καλό μοντέλο όγκου να ερευνήσει την ενεργοποίηση του RAS /RAF /MEK /ERK και τις οδούς ΡΙ3Κ /ΑΚΤ /mTOR καθώς επηρεάζεται συχνά από Β-RAF

μετάλλαξη V600E που προκαλεί την ενεργοποίηση του ΜΑΡΚ μονοπατιού [2 ]. Είναι ένα επιθετικό όγκο του δέρματος με κακή πρόγνωση για τους ασθενείς με προχωρημένη νόσο και φαίνεται να είναι ανθεκτική σε τρέχουσες θεραπευτικές προσεγγίσεις.

Μελανοκυτταρικοί μετασχηματισμός πιστεύεται ότι συμβαίνει με διαδοχική συσσώρευση γενετικών και μοριακών μεταβολών [3 , 4]. Παρά το γεγονός ότι, οι παθογόνοι μηχανισμοί που υπόκεινται στην ανάπτυξη μελανώματος είναι ακόμη σε μεγάλο βαθμό άγνωστη, έχουν διάφορα γονίδια και μεταβολικών οδών δειχθεί ότι μεταφέρει μοριακές αλλαγές σε μελάνωμα. Τα μελανώματα έκθεμα μεταλλάξεις στο μονοπάτι RAS /RAF /μιτογόνο ενεργοποιημένη πρωτεΐνη κινάση (ΜΑΡΚ). Έχει αποδειχθεί ότι το 50% δερματικά μελανώματα παρουσιάζουν B-RAF

μεταλλάξεις V600E, η οποία οδηγεί σε υποκατάσταση αμινοξέος στη θέση 600 σε Β-RAF, από μια βαλίνη (V) σε ένα γλουταμινικό οξύ (Ε). Αυτή η μετάλλαξη είναι γνωστό ότι παίζει βασικό ρόλο στην επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μελανώματος, μέσω της ενεργοποίησης του μονοπατιού ΜΑΡΚ [5]. Συγκεκριμένα, αυτό συμβαίνει εντός του τμήματος ενεργοποίηση της περιοχής κινάσης και αυτό οδηγεί σε μια αυξημένη δραστηριότητα της ίδιας της κινάσης. Συστατική ενεργοποίηση της δραστικότητας κινάσης οδηγεί σε unresponsitivity αρνητικής μηχανισμούς ανάδρασης στο εσωτερικό της ΜΑΡΚ μονοπάτι [6].

Επιπλέον, μια αλληλεπίδραση μεταξύ του ΜΑΡΚ και την phosphatidylinositide 3-κινάσης (ΡΙ3Κ) /οδοί ΑΚΤ έχει βρεθεί σε δερματικό μελάνωμα [7]. Είναι ενδιαφέρον ότι, αυτές οι μελέτες δείχνουν ότι οι ΜΑΡΚ και AKT μονοπάτια ενεργοποιούνται παράλληλα και η απόδειξη ότι PI3K /AKT και ΜΑΡΚ /ERK1 είναι /2 καταρράκτες διασυνδέονται περιγράφεται σε μεγάλο βαθμό [8, 9, 10]. Υπάρχουν πολλαπλά σημεία cross-talk μεταξύ αυτών των δύο οδών, των οποίων η συντονισμένη δράση καθορίζει την κυτταρική μοίρα [11]. Δεν είναι έκπληξη το γεγονός ότι οι οδοί PI3K /AKT και ΜΑΡΚ αλληλοεπηρεάζονται σε διάφορα στάδια της διάδοσης του σήματος, τόσο αρνητικά και θετικά, με αποτέλεσμα την δυναμική και σύνθετη cross-talk. Σύμφωνα με τα ευρήματα αυτά, ΜΑΡΚ και AKT μονοπάτια θα μπορούσε να αποτελέσει υποσχόμενη θεραπευτικοί στόχοι για μια κατά τα άλλα καταστροφική ασθένεια.

Οι προσομοιώσεις υπολογιστών και υπολογιστικών μοντέλων είναι χρήσιμα για την ανάλυση και να αυξήσει τις γνώσεις των μεταβολικών οδών και σύνθετες αλληλεπιδράσεις τους με στόχο την κατανοήσουν τους μηχανισμούς αντοχής στη συμβατική φαρμακευτική θεραπεία σε μελάνωμα [12, 13, 14].

στην παρούσα εργασία αναπτύσσουμε ένα υπολογιστικό μοντέλο που προσομοιώνει μονοπάτια τόσο PI3K /AKT και ΜΑΡΚ και τις αλληλεπιδράσεις τους, προκειμένου να αναλύσει οι αντιδράσεις καταρράκτη υπεύθυνος για την ανάπτυξη μελανώματος. Επιπλέον, το πρότυπο της συμπεριφοράς του κακοήθους κυτταρικής γραμμής μελανώματος Α375, που φιλοξενούν B-RAF

μετάλλαξη V600E, υπό την θεραπείαν Dabrafenib, ενός εμπορικού εκλεκτικός αναστολέας Β-RAF, που εγκρίθηκε πρόσφατα για τη θεραπεία των ασθενών με BRAF V600E mutation- θετικό προχωρημένο μελάνωμα [15].

σε γενικές γραμμές, το μοντέλο αυτό μπορεί να χρησιμοποιηθεί για μια in silico εργαστήριο για να μελετήσει τις επιπτώσεις των πιθανών αναστολέων που μπορεί να βελτιώσει την απόκριση σε συνήθεις θεραπείες.

Μέθοδοι

Υπολογιστική μοντέλο των οδών /ΑΚΤ ΜΑΡΚ και ΡΙ3Κ

για να κατανοήσουμε τις επιπτώσεις της Β-RAF αλλαγές και στις δύο RAF-ERK και PI3K-AKT μονοπάτια ξεκινήσαμε από το μοντέλο που αναπτύχθηκε από Brown και συνεργάτες [16]. Στην εργασία τους, οι συγγραφείς παρουσίασε ένα υπολογιστικό μοντέλο του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF) και Παράγοντα Ανάπτυξης Νεύρων (NGF) ενεργοποιείται μονοπατιού ERK σε κύτταρα PC12, που περιέχει 13 διαφορετικά είδη πρωτεϊνών και 16 βιοχημικές αντιδράσεις. Το μοντέλο μας αναπτύχθηκε χρησιμοποιώντας COPASI (συγκρότημα μονοπάτι Simulator), ένα λογισμικό για την προσομοίωση και την ανάλυση των βιοχημικών δικτύων και τη δυναμική τους [17]. Το μοντέλο μας έχει επεκταθεί σημαντικά το μοντέλο Μπράουν. Αποτελείται από 48 είδη και 48 βιοχημικές αντιδράσεις.

Για να συμπεριλάβετε όλες τις οντότητες και τις αντίστοιχες αλληλεπιδράσεις τους χρήσιμη για τον στόχο της παρούσας μελέτης, θα ανακτηθούν όλες τις απαραίτητες πληροφορίες από KEGG (Κιότο Εγκυκλοπαίδεια γονιδίων και γονιδιωμάτων) ΜΟΝΟΠΑΤΙ Βάση δεδομένων [18]. Ειδικότερα, εστιάσαμε στις αλληλεπιδράσεις μεταξύ δύο συγκεκριμένων οδών: ΜΑΡΚ μονοπατιού σηματοδότησης (αναφορά Kegg: ko04010) και PI3K-AKT οδό σηματοδότησης (Kegg αναφορά: hsa04151). Μελετήσαμε τη σύνθετη συμπεριφορά των σημαντικότερων καταρράκτες κινάσης πρωτεΐνης που περιλαμβάνουν τον υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR), φωσφατιδυλινοσιτόλη-4,5-διφωσφορικής 3-κινάσης (PIK3CA), κινάση RAC σερίνης /θρεονίνης πρωτεΐνης (ΑΚΤ) και RAF proto -oncogene κινάσης σερίνης /θρεονίνης πρωτεΐνης (RAF1). Αυτό αναπόφευκτα μας οδηγεί να εξετάσουμε τις άλλες οδούς σηματοδότησης που έδειξαν συσχέτιση με αυτά που μπορούν να προκαλέσουν φαινόμενα αντίστασης Dabrafenib. Για το σκοπό αυτό περιλαμβάνονται επίσης στο μοντέλο οδό σηματοδότησης Ras (Kegg αναφορά: ko04014) και mTOR μονοπάτι σηματοδότησης (Kegg αναφορά: ko041150). Για τη διερεύνηση τυχόν μηχανισμοί δεν παρατηρήθηκε πριν

Σχετική αρχικές συγκεντρώσεις των επιχειρήσεων που περιλαμβάνονται στην μοντέλο μας συγκεντρώθηκαν από GSE22301 διαθέσιμη στις GEO (Gene Expression Omnibus) σύνολο δεδομένων (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), συμπεριλαμβανομένων των χαρακτηριστικών έκφραση αρκετών κυτταρική γραμμή μελανώματος, καθώς και Α375 που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη. Data Matrix μικροσυστοιχιών ομαλοποιήθηκαν με λογαριθμική μετατροπή χρησιμοποιώντας MeV εργαλείο ανάλυσης δεδομένων [19]. Συνοψίζοντας, θα χρησιμοποιηθούν για τη βάση δεδομένων KEGG να κατανοήσουν και να διαμορφώσει τη ροή μονοπάτι και το σύνολο δεδομένων GEO για να πάρει το προφίλ έκφρασης Α375 κυτταρική γραμμή? Επιπλέον, θέτουμε τις τιμές των συγκεντρώσεων των πρωτεϊνών, όπως διαπιστώθηκε από Brown et al.

Οι νόμοι που διέπονται τις ενεργοποιήσεις /απενεργοποιήσεις το μοντέλο Μπράουν βασίστηκαν στην κινητική Henri-Michaelis-Menten. Αυτή η κινητική νόμος είναι ένα από τα πιο κοινά μοντέλο του ενζύμου κινητικής. μαθηματική μορφή της είναι η ακόλουθη:

Περιγράφει το ποσοστό των ενζυμικών αντιδράσεων, στην οποία «V» αντιπροσωπεύει το μέγιστο ποσοστό που επιτεύχθηκε από το σύστημα, ενώ Henri-Michaelis-Menten σταθερή (Km) είναι η συγκέντρωση του υποστρώματος σε το οποίο ο ρυθμός της αντίδρασης είναι το ήμισυ του V [20].

Είμαστε ελαφρώς τροποποιημένη την κλασική νόμο Henri-Michaelis-Menten να λαμβάνουν υπόψη τόσο το υπόστρωμα και τον τροποποιητή που παίζει ένα συγκεκριμένο ρόλο, όταν θεωρήσαμε αντιδράσεις που ενεργοποιούνται (ή /και απενεργοποιείται) ειδικές πρωτεΐνες. Η εξίσωση του τροποποιημένου Henri-Michaelis-Menten είναι:

Kcat αντιπροσωπεύει τον αριθμό των ενζυμικών αντιδράσεων που καταλύονται ανά δευτερόλεπτο και η εξίσωση περιλαμβάνει δύο τύπους υποστρωμάτων. Substrate1 συμβολίζει τροποποιητή της αντίδρασης, ενώ Substrate2 είναι η γενική υπόστρωμα. Προκύπτει πιο κατάλληλο για τους σκοπούς μας, διότι αναλύει την αναλογία μεταξύ των αντιδράσεων του συστήματος και τη συγγένειά τους για το υπόστρωμα λαμβάνοντας υπόψη την αποδοτικότητα του τροποποιητή που εμπλέκονται.

Όλες οι βιοχημικές αντιδράσεις που χρησιμοποιούνται στο μοντέλο μας μπορεί να είναι Ως εκ τούτου, χωρίζεται σε τέσσερις βασικές κατηγορίες:

i)

αντιδράσεις απενεργοποίησης ενεργοποίηση /πρότυπο με ένα τροποποιημένο νόμο του Henri-Michaelis-Menten (για παράδειγμα Raf1Inactive ενεργοποιείται (Raf1Active) μέσω RasActive)?

ii)

αντιδράσεις που αδρανοποιούν φυσιολογικά είδη, διαμόρφωσε με τη μαζική νόμο δράσης (για παράδειγμα C3G απενεργοποίηση)?

iii)

πρωτεΐνες υποβάθμιση μοντελοποιηθεί με τη μαζική νόμο δράσης (για παράδειγμα Dabrafenib υποβάθμιση)?

iv)

παραγωγή πρωτεϊνών πρότυπο με μη αναστρέψιμες συνεχή ροή δίκαιο (για παράδειγμα, η παραγωγή των ελευθέρων RTK).

Ένας από τους στόχους του μοντέλου ήταν να αναλύσει τη δυναμική των κρίσιμων κόμβων στο Α375 κυτταρική σειρά μελανώματος που φιλοξενεί B-RAF

μετάλλαξη V600E. Ως εκ τούτου, το πρότυπο αυτό κυτταρική σειρά ως εξής:

i)

παρουσιάσαμε τα νέα είδη bRafMutated με την ίδια αρχική συγκέντρωση bRafInactive 120000 mmol /ml?

ii)

διαγράψαμε την ενεργοποίηση Β-RAF από Rap1 όπως τα νέα είδη bRafMutated δεν επηρεάζεται από αυτό το σηματοδότηση (το ίδιο ισχύει και για Ras)?

iii)

έχουμε ανέστειλε την απενεργοποίηση της Β-RAF από Raf1PPtase (όπως Raf1PPtase δεν πια επηρεάζει B-RAF)?

iv)

bRafMutated αντικαθιστά τα είδη bRafActive στην ενεργοποίηση της ενεργοποίησης Mek. Το άλλο στόχος του μοντέλου είναι να χρησιμοποιηθεί ως ένας in silico εργαστήριο για την ανάλυση της συμπεριφοράς των ειδικών θεραπευτικών αγωγών κατά του μελανώματος, ιδίως τους μηχανισμούς της αντίστασης, με στόχο να προτείνει νέες στρατηγικές που μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε αυτές τις συνθήκες. Εμείς, ως εκ τούτου, εισάγεται στο μοντέλο τα χαρακτηριστικά για να αναπαράγει την επίδραση του αναστολέα Dabrafenib στα σύνθετη δυναμική του μονοπατιού PI3K /AKT. Για να γίνει αυτό το έργο, προσθέσαμε το είδος Dabrafenib (σε διαφορετικές συγκεντρώσεις, βλέπε τμήμα Αποτελέσματα). Στη συνέχεια διαμορφώνεται δύο ειδικές αντιδράσεις δηλαδή την κανονική αποικοδόμηση του φαρμάκου και το κύριο αποτέλεσμα της Dabrafenib στην αναστολή του είδους bRafMutated. Από τη συγκεκριμένη βιβλιογραφία, αναφέρεται ότι ο χρόνος ημίσειας ζωής της Dabrafenib είναι 10 ώρες (ιστοσελίδα του Ευρωπαϊκού Οργανισμού Φαρμάκων: https://www.ema.europa.eu). Χρησιμοποιήσαμε αυτή την παράμετρο για να ρυθμίσετε το νόμο που σχετίζεται μάζα δράση να αναπαράγει φθορά του.

Μια άλλη σημαντική πτυχή που δεν θεωρούνται σε μοντέλο Brown είναι ότι όλοι οι υποδοχείς είναι πολύ γρήγορα προκαλούνται από EGF και συνεπώς παραμένουν μόνιμα ενεργοποιημένη επειδή το μοντέλο τους δεν λαμβάνει υπόψη οποιαδήποτε αντίδραση της υποβάθμισης των υποδοχέων. Έχουμε πρότυπο αυτή την πτυχή εισάγοντας μια διαδικασία υποβάθμισης βασίζεται σε μια μη αναστρέψιμη νόμο μάζα ενέργειες που επηρεάζουν τόσο τις ελεύθερες και δεσμευμένες υποδοχείς RTK. Επιπλέον, το πρωτότυπο μοντέλο Μπράουν ΕΤΠ δεν περιλαμβάνουν την οδό C3G /Rap1, ένα θεμελιώδες σημείο κλειδί για την ενεργοποίηση των Β-RAF και, κατά συνέπεια, στη δυναμική ΕΚΚ. Για το σκοπό αυτό θα διαμορφωθεί την ενεργοποίηση των ειδών C3G μέσω δεσμευμένου υποδοχέα RTK, και την ενεργοποίηση Rap1 μέσω της ενεργοποιημένης πρωτεΐνης C3G.

Επιπλέον, έχουμε βαθιά ανέλυσε το θεμελιώδη ρόλο της πρωτεϊνικής κινάσης ΑΚΤ στην στιχομυθία μεταξύ των δύο κύριες οδοί που εμπλέκονται. Ειδικότερα, επικεντρώθηκε στο ρόλο της ΑΚΤ στην ενεργοποίηση των mTORC1 οδού και επί των μηχανημάτων ενεργοποίηση /απενεργοποίηση πολλών πρωτεϊνών επί σηματοδότηση ΑΚΤ. Η προκύπτουσα υλοποίηση του μοντέλου οδών, μαζί με την σχετική σειρά διαφορικών εξισώσεων μπορεί να βρεθεί κοιτάζοντας το σχήμα 1 και 2.

αντιδράσεις ενεργοποίησης /απενεργοποίησης (μοντελοποιείται με ένα τροποποιημένο νόμο Henri-Michaelis-Menten) δείχνονται με τον ακόλουθο τρόπο: το τροποποιητή, δηλαδή, ο καταλύτης που προκαλεί την αντίδραση απεικονίζεται από ένα λεπτό φως πράσινη γραμμή τελειώνει με ένα ρόμβος? οι εμπλεκόμενα είδη συνδέονται με βέλη που ξεκινούν με ένα μπλε χρώμα (είδη εισόδου) και τελειώνει με ένα καφέ χρώμα (που προκύπτει είδη). Για παράδειγμα, Raf1Inactive ενεργοποιείται (Raf1Active) μέσω RasActive. Οι αντιδράσεις που αδρανοποιούν φυσιολογικά είδη (μοντελοποιηθεί με τη μάζα του νόμου δράση) απεικονίζεται με ένα βέλος ξεκινώντας με μπλε χρώμα και τελειώνει με ένα καφετί χρώμα, για παράδειγμα C3G απενεργοποίηση. υποβάθμιση των πρωτεϊνών (κατά το πρότυπο με τη μάζα του νόμου δράση) απεικονίζονται με τους θεωρούνται τα είδη που συνδέονται με κατάληξη βέλος με ένα κενό σύμβολο σετ, για παράδειγμα Dabrafenib υποβάθμιση. παραγωγή Πρωτεΐνες (μοντελοποιείται με μη αναστρέψιμες σταθερά του νόμου ροής) απεικονίζονται με τα εξεταζόμενα είδη που συνδέονται με ένα βέλος (για παράδειγμα, η παραγωγή του ελεύθερου RTK). Το λογισμικό Αρκαδία (https://arcadiapathways.sourceforge.net) έχει χρησιμοποιηθεί για την παραγωγή της γραφικής αναπαράστασης του μοντέλου.

Η

Οι διαθέσιμες εκδόσεις των μοντέλων Copasi μπορεί να προσεγγιστεί ως S1 Αρχείο.

πολιτισμό γραμμή κυττάρων και θεραπεία

A375 κυτταρική σειρά ελήφθη από την ATCC (LGC Προτύπων, Ιταλία). Αυτή η κυτταρική γραμμή που λαμβάνεται από ένα 54 ετών γυναίκα με κακοήθες μελάνωμα και αντιπροσωπεύει ένα καλό μοντέλο για τη μελέτη του ρόλου των ΜΑΡΚ και ΑΚΤ μονοπάτια επειδή επηρεάζεται από την ενιαία μεταβολή που εμφανίζεται στο γονίδιο Β-RAF (V600E) (Βλέπε Cosmic web site , https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic). Στην πραγματικότητα, η παρουσία άλλων γενετικών αλλοιώσεων, όπως οι μεταλλάξεις στο γονίδιο KRAS ή των ΕΡΑ γονίδια, μπορεί να καθορίσει την ενεργοποίηση της ΜΑΡΚ μονοπάτι.

Η κυτταρική γραμμή μελανώματος Α375, που λαμβάνεται από την ATCC (LGC Πρότυπα, Ιταλία), καλλιεργήθηκαν σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO2 επωαστή στους 37 ° C με RPMI-1640 συμπληρωμένο με 2 mmol /L Ε-γλουταμίνη, 100 IU πενικιλλίνη, 100 μg /ml στρεπτομυκίνη και 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), που αγοράστηκε από την Lonza ( Walkersville, ΗΠΑ). Το Α375 καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία κυτταρικής καλλιέργειας 70 mm σε πυκνότητα 500.000 κύτταρα και μετά από 24 ώρες υποβλήθηκαν σε αγωγή για 48 ώρες με Dabrafenib (Σέλεκ Chemical, USA) σε τελική συγκέντρωση 2, 1, 0.5, 0.25 και 0.125 ηΜ. Διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) (Sigma-Aldrich, USA) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος.

Western ανάλυση κηλίδος

Protein προφίλ των επεξεργασμένων κυτταρικών σειρών Α375 αναλύθηκε με στύπωμα Western χρησιμοποιώντας το αντι-ΜΑΡ Κινάσης ERK1 /ERK2 (pThr202 /pThr204) κουνελιού Ab (cat. αρ. 442685) και αντι-ΜΑΡ κινάσης ERK1 /ERK2 κουνέλι Ab (cat. αρ. 442704) που παρέχεται από την Merck Millipore (Darmstadt, Γερμανία) για την ανίχνευση φωσφορυλιωμένης και ολικής ERK 1 /2 πρωτεΐνες, αντίστοιχα. Το Anti-βήτα τουμπουλίνης Ab (ab 15568- Abcam, Cambridge, UK) χρησιμοποιήθηκε ως γονίδιο καθαριότητας. Χρωμογόνο ανίχνευση πρωτεϊνών διεξήχθη με Novex HRP χρωμογόνο (Invitrogen, USA). εικόνες κηλίδα Western αναλύθηκαν με το λογισμικό εικόνα J. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. t-test του Student χρησιμοποιήθηκε για τη στατιστική ανάλυση.

Αποτελέσματα

Εμείς προσομοίωση το μοντέλο μας υπό κανονικές συνθήκες γενικής αυξητικού παράγοντα (GF) διέγερση για να βεβαιωθείτε ότι έδωσε ένα ισχυρό παροδική ενεργοποίηση της ERK. Τότε προσομοίωση της κυτταρικής σειράς Α375 με τη μετάλλαξη Β-RAF. Σε αυτή την περίπτωση, αναμένεται αυξημένη δραστηριότητα ΕΚΚ που είναι χαρακτηριστικό της Β-RAF

V600E μεταλλαχθεί μελανώματα. Το Σχήμα 3 δείχνει τη δυναμική της τόσο ενεργοποιημένη ERK (pERK) και Β-RAF. Αριστερό πάνελ αναδεικνύει την κανονική περίπτωση κατάσταση? ενώ, δεξιός πίνακας δείχνει B-RAF σενάριο μεταλλαγμένα Α375 κυτταρική γραμμή. Τέλος, η προσομοίωση προβλέπει σωστά την αναμενόμενη συμπεριφορά δηλαδή, τα είδη ErkActive έχει μια σταθερή ανυψωμένη δραστικότητα. Λόγω των μη γραμμικότητες του παρουσιάζονται μοντέλου και του υψηλού αριθμού των κόμβων και των αλληλεπιδράσεων στο εσωτερικό της οδού, έστω και αν υπάρχει σαφής σχέση μεταξύ bRafActive και ErkActive, δεν μπορούμε να πούμε ότι υπάρχει μια γραμμική σχέση μεταξύ των δύο.

Αριστερό πλαίσιο δείχνει τη συμπεριφορά υπό κανονικές διέγερση GF ενώ το δεξί πάνελ απεικονίζει τη δυναμική με B-RAF (bRafMutated) μετάλλαξη σε κυτταρικές σειρές Α375.

η

ειδικότερα, τα υψηλότερα επίπεδα από ErkActive δεν παρατηρούνται πιθανόν οφείλεται στο γεγονός ότι ErkActive είναι ήδη κοντά στα επίπεδα του κατώτατου ορίου του ή /και λόγω της συμβολής των άλλων κόμβων στο μονοπάτι που μπορεί να επηρεάσουν το τελικό αποτέλεσμα.

Επιπλέον, έχουμε προσομοίωση της συμπεριφοράς των Α375 κυτταρικές σειρές κάτω από διαφορετικές συγκεντρώσεις του αναστολέα Dabrafenib. B-RAF αποτελέσματα αναστολής στον περιορισμό της pERK δραστηριότητας. Κατά συνέπεια, στον Πίνακα 1, το ποσοστό της αναστολής της pERK εμφανίζεται ως αποτέλεσμα της αναλογίας pERK και ERK. Συγκλίνουσες αποτελέσματα ελήφθησαν ανάλυση in vitro και in silico δεδομένα.

Η

Η δυναμική της τόσο pERK και Β-RAF μεταλλαγμένη μοντελοποιήθηκαν (Σχήμα 4). ERK στη συγκέντρωση silico ορίστηκε σε 600000 mmol /ml. Οι πέντε πίνακες εμφανίζονται. Κάθε πίνακας απεικονίζει την pERK, Β-RAF μεταλλαχθεί και δυναμική Dabrafenib σε 48 ώρες από την προσομοίωση σε διαφορετικές Dabrafenib δοσολογία δηλαδή, 0,125 ηΜ (Α), 0.250 ηΜ (Β), 0,500 ηΜ (C), 1,0 ηΜ (Δ) και 2,0 ηΜ (ΜΙ). Όταν δεν θεραπεία χορηγείται (DMSO) pERK συγκέντρωση έφθασε 571.950 mmol /ml σε χρόνο 48 ώρες. Με διαφορετικές δοσολογίες Dabrafenib, pERK συγκεντρώσεις έφθασε 529.602 mmol /ml (Α), 368.352 mmol /ml (Β), 207.518 mmol /ml (C), 106.758 mmol /ml (D) και 53.385 mmol /ml (Ε), που δείχνει , αντίστοιχα, το ποσοστό της αναστολής που αναφέρονται στον πίνακα 1.

pERK συγκεντρώσεις μειώνονται κατά τη διάρκεια της θεραπείας Dabrafenib σε Α375 κυτταρική γραμμή μελανώματος. Η συμπεριφορά των pERK συσχετίζεται άμεσα με τη συγκέντρωση Dabrafenib. Διαφορετικές δοσολογίες Dabrafenib εμφανίζονται (1 ηΜ = 1e-9 mmol /ml): 1.25e-10 mmol /ml (Α), 2.5e-10 mmol /ml (Β), 5e-10 mmol /ml (C), 1ε -9 mmol /ml (D) και 2e-9 mmol /ml (Ε). Σε όλες τις επιτροπές οι σωστές y-άξονα διακεκομμένες γραμμές αντιπροσωπεύουν bRafMutated συγκεντρώσεις, ενώ συμπαγείς γραμμές αντιπροσωπεύουν συγκεντρώσεις Dabrafenib.

Η

Η μείωση των συγκεντρώσεων pERK είναι σε συμφωνία με αυτή που παρατηρήθηκε in vitro.

Σχήμα 5 υπογραμμίζει western αποτύπωση οικοπέδων. Επίσης στην περίπτωση αυτή, έχουμε αποκτήσει καλή συμφωνία με τα αποτελέσματα in silico. Συμπερασματικά, τόσο από τα αποτελέσματα του μοντέλου και από τα in vivo πειράματα, μπορούμε να παρατηρήσουμε ότι τα επίπεδα π-ΕΚΚ πέσει κάτω λόγω δραστηριότητα αναστολέα της Dabrafenib πάνω πρωτεΐνης Β-RAFV600E. Αναλύσαμε ρ-ΕΚΚ καθώς είναι ένα από τα βασικά κινάσης πρωτεΐνης που εμπλέκεται στη σηματοδότηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Μια σημαντική πτυχή που σχετίζεται με την αναστολή της Β-RAFV600E πρωτεΐνη είναι ότι ένα μικρό κλάσμα των ασθενών που έλαβαν μελάνωμα αναπτύσσει μηχανισμούς αντίστασης που κάνουν το θεραπεία όχι περισσότερο αποτελεσματική. Το μοντέλο μπορεί να είναι χρήσιμο για την ανάλυση των πολύπλοκων διαδρομών PI3K /AKT και ΜΑΡΚ, προκειμένου να ανακαλύψουν τις πρωτεΐνες που μπορεί να προκαλέσουν αυτά τα φαινόμενα αντίστασης.

ανάλυση Western blot της p-Erk και ολική ΕΚΚ στην κυτταρική σειρά μελανώματος Α375 μετά τη θεραπεία με διαφορετικές δόσεις Dabrafenib για 48 ώρες (Α). σήμα π-ΕΚΚ ομαλοποιήθηκε με συνολικό σήμα ERK (Β), SD και μέσα από τις κανονικοποιημένες τιμές p-ERK έχουν αναφερθεί.

Η

Συμπεράσματα

Εμείς παρουσίασε ένα υπολογιστικό μοντέλο που προσομοιώνει τόσο PI3K /AKT και ΜΑΡΚ και τις αλληλεπιδράσεις τους, προκειμένου να αναλύσει τις αντιδράσεις καταρράκτη υπεύθυνος για την ανάπτυξη μελανώματος. Έχουμε προσομοίωση μιας παρέμβασης θεραπεία δηλαδή, η χορήγηση ενός γνωστού αναστολέα της Β-RAF, Dabrafenib. Αυτή η μελέτη έχει δείξει πως υπολογιστικά μοντέλα μπορεί να είναι χρήσιμα εργαλεία για τη διερεύνηση και τη σύγκριση της βιολογικής συμπεριφοράς της μεταγωγής σήματος path- τρόπους που μπορεί να προτείνει νέες υποθέσεις για να εξηγήσουν τις παρατηρούμενες βιολογικών δεδομένων και θα βοηθήσει να κατανοήσουν τη δυναμική του πώς οι λειτουργίες του μονοπατιού. Επιπλέον, υπολογιστικά μοντέλα μπορούν να χρησιμοποιηθούν εύκολα για τη διερεύνηση διαφόρων καταστάσεων ασθένειας και δείχνουν πώς φαρμακευτική αγωγή μπορεί να βελτιωθεί για την καταπολέμηση καλύτερα τα αποτελέσματα της ασθένειας. Πιστεύουμε ότι το μοντέλο μας είναι μια καλή αναπαράσταση του PI3K /AKT και ΜΑΡΚ με ενεργό μονοπάτι ERK η οποία μπορεί να επεκταθεί και να εφαρμοστεί στο μέλλον για να διερευνήσει περαιτέρω τη δυναμική των ανθεκτικών μηχανισμών, προκειμένου να προτείνουν νέα παρέμβαση για να προτείνουν νέες θεραπευτικές παρεμβάσεις.

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 Αρχείο. Στο αρχείο zip, υπάρχουν τρεις διαφορετικές διαθέσιμες εκδόσεις του μοντέλου: PI3K_AKT_Final_V2.1.cps αρχείου, φυσιολογικό μοντέλο δηλαδή, δεν υπάρχει μετάλλαξη Β-RAF? PI3K_AKT_Final_V2.1_A375.cps, Α375 μοντέλο γραμμή κυττάρων δηλαδή, αρχείο με μετάλλαξη Β-RAF? αναστολέα PI3K_AKT_Final_V2.1_A375_Dabrafenib.cps αρχείου, πλήρης, το μοντέλο με τις δύο B-RAF μετάλλαξη και Dabrafenib καθορίζονται στο κατώτερο δοσολογία

doi:. 10.1371 /journal.pone.0152104.s001

(Τ.Κ.)