Αφηρημένο

Η MUC4 βλεννίνη είναι ένα υψηλού μοριακού βάρους, δεσμευμένη σε μεμβράνη, και ιδιαίτερα γλυκοζυλιωμένη πρωτεΐνη. Είναι μια πρωτεΐνη πολυ-τομέα που πιθανώς διασπάται σε ένα μεγάλο ομοιάζουν με μουκίνη υπομονάδα (MUC4α) και ένα Ο-τερματικό αυξητικό παράγοντα σαν υπομονάδα (MUC4β). MUC4 παίζει κρίσιμο ρόλο σε φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις και είναι παρεκκλίνοντα υπερεκφράζεται σε διάφορους καρκίνους, συμπεριλαμβανομένων εκείνων του παγκρέατος, του τραχήλου, του μαστού και του πνεύμονα. Είναι επίσης ένας πιθανός βιολογικός δείκτης για τη διάγνωση, την πρόγνωση και την εξέλιξη πολλών κακοηθειών. Περαιτέρω, MUC4 παίζει ποικίλες λειτουργικές ρόλους στην έναρξη του καρκίνου και την εξέλιξη όπως είναι προφανές από τη συμμετοχή της στην ογκογόνο μετασχηματισμό, πολλαπλασιασμός, αναστολή της απόπτωσης, την κινητικότητα και την εισβολή, και την αντίσταση στη χημειοθεραπεία σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα. Έχουμε παράγεται προηγουμένως ένα μονοκλωνικό αντίσωμα 8G7, το οποίο κατευθύνεται κατά της περιοχής TR του MUC4, και έχει χρησιμοποιηθεί εκτενώς για να μελετηθεί η έκφραση του MUC4 σε πολλές κακοήθειες. Εδώ, περιγράφουμε την παραγωγή αντι-MUC4 αντισώματα που κατευθύνονται έναντι των περιοχών μη-TR του MUC4. Ανασυνδυασμένη γλουταθειόνη-δ-τρανσφεράσης (GST) -συγχωνευμένο θραύσματα MUC4α, τόσο ανάντη (MUC4α-Ν-Ter) και κατάντη (MUC4α-C-Ter) της περιοχής ΤΚ, χρησιμοποιήθηκαν ως ανοσογόνα για την ανοσοποίηση ποντικών BALB /c. Μετά την κυτταρική σύντηξη, τα υβριδώματα υποβλήθηκαν σε διαλογή με τη χρήση των προαναφερθέντων ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών λύματα διαφημίσεων από ανθρώπινες κυτταρικές σειρές του παγκρέατος. Τρεις αντι MUC4α-Ν-Ter και ένα αντι-MUC4α-C-Ter χαρακτηρίστηκαν με διάφορες inmmunoassays συμπεριλαμβανομένων ανοσορροφητική δοκιμασία συνδεδεμένη με ένζυμο (ELISA), ανοσοκηλίδωση, immunofluorescene, κυτταρομετρία ροής και ανοσοκαθίζηση χρησιμοποιώντας MUC4 εκφράζουν ανθρώπινη παγκρεατική καρκινικές κυτταρικές σειρές. Τα αντισώματα αντέδρασαν επίσης με την MUC4 σε τομές ανθρώπινου παγκρεατικού όγκου σε ανοσοϊστοχημική ανάλυση. Τα νέα περιοχή-ειδικά αντι-MUC4 αντισώματα θα χρησιμεύσουν ως σημαντικό αντιδραστήρια για τη μελέτη της σχέσης δομής-λειτουργίας των MUC4 τομείς και για την ανάπτυξη διαγνωστικών και θεραπευτικών MUC4 με βάση

Παράθεση:. Jain Μ, Venkatraman G, Moniaux Ν, Kaur S, Kumar S, Chakraborty S, et al. (2011) μονοκλωνικά αντισώματα που αναγνωρίζουν τα Επαναλάβετε Περιφερειών μη Tandem του Ανθρώπου Βλεννίνης MUC4 στον καρκίνο του παγκρέατος. PLoS ONE 6 (8): e23344. doi: 10.1371 /journal.pone.0023344

Επιμέλεια: Ντχιάνι Chandra, Roswell Park Cancer Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 27 Ιούν, 2011? Αποδεκτές: 12 του Ιούλη του 2011? Δημοσιεύθηκε: 23, Αυγούστου, 2011

Copyright: © 2011 Jain et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς για το έργο αυτό υποστηρίζεται, εν μέρει, από επιχορηγήσεις από το Υπουργείο άμυνας των Ηνωμένων Πολιτειών (BC074639, BC083295, BC09742, και PC074289) και τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (R21 CA156037, RO1 CA78590, UO1 CA111294, RO1 CA131944, RO1 CA133774, RO1 CA138791, RO3 CA 139.285 και Ρ50 CA127297). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ανθρώπινο MUC4 είναι μια εξαιρετικά γλυκοζυλιωμένη συνδεδεμένη με μεμβράνη βλεννίνης, που αποτελείται από ένα μεγάλο 850-kD βλεννίνη σαν υπομονάδα MUC4α, και μια δεσμευμένη σε μεμβράνη 80 kD υπομονάδα ανάπτυξης παράγοντα όπως MUC4β [1], [2] . MUC4α περιέχει έναν τομέα κεντρικό διαδοχική επανάληψη (TR) που περιέχει μεταβλητούς αριθμούς 16 αμινοξέων μοτίβα υπολειμμάτων που θα μπορούσαν να επαναληφθεί μέχρι και 400 φορές ανά μόριο. Ο τομέας TR πλαισιώνεται από ένα C-τερματικό πλούσια σε κυστεΐνη τομέα και έναν Ν-τερματικό τομέα ο οποίος περιέχει τρεις επαναλήψεις των υπολειμμάτων 123 αμινοξέων [1]. MUC4β περιέχει μια πλούσια σε κυστεΐνη περιοχή, μια περιοχή πλούσια σε θέσεις Ν-γλυκοζυλίωσης και τρεις περιοχές τύπου EGF [1]. MUC4 θεωρείται ότι είναι ένα ανθρώπινο ομόλογο του αρουραίου σιαλο-βλεννίνης συγκρότημα (SMC, αρουραίος MUC4) λόγω των ομοιοτήτων στην δομική οργάνωση [1], [3], [4]. SMC είναι ετεροδιμερής γλυκοπρωτεΐνη που αποτελείται από μια Ο-γλυκοζυλιωμένη υπομονάδα βλεννίνης, ασκίτης σιαλογλυκοπρωτεϊνη (ASGP-1), σφικτά δεσμευμένο σε ένα Ν-γλυκοζυλιωμένη διαμεμβρανική υπομονάδα, ASGP-2, το οποίο περιέχει δύο επιδερμικό αυξητικό παράγοντα που μοιάζει με τομείς στην εξωκυττάρια πλευρά της [ ,,,0],3], [4].

MUC4 εκφράζεται σε διάφορους επιθηλιακούς ιστούς, συμπεριλαμβανομένου του επιθήλια των εμβρυϊκών πνευμόνων και του ενήλικου αναπνευστικής οδού από την τραχεία στο αγωγών συλλογής πνεύμονα τραχεία [5], του παχέος εντέρου [6], ενδοτράχηλου [7], επιπεφυκότα [8], κερατοειδή [9], τους σιελογόνους αδένες [10], το μέσο αυτί και ευσταχιανής σάλπιγγας [11]. Σε πρόσφατες μελέτες, μια προοδευτική αύξηση στην έκφραση MUC4 έχει παρατηρηθεί στα παγκρεατικά ενδοεπιθηλιακή νεοπλαστικές αλλοιώσεις, υποδεικνύοντας τον ρόλο της στην ανάπτυξη της ασθένειας [12]. Προηγούμενες μελέτες από το εργαστήριο μας έχουν δείξει ότι η αναστολή της έκφρασης MUC4 χρησιμοποιώντας αντι-νόημα ή βραχείας παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) ολιγονουκλεοτίδια ειδικά για τα αποτελέσματα MUC4 σε μειωμένη ογκογονικότητα και τη διάδοση των καρκινικών κυττάρων [13]. Περαιτέρω, πρόσφατες μελέτες μας έχουν δείξει ότι MUC4 καταλήγει σε ογκογόνο μετασχηματισμό των ινοβλαστών ποντικού [14], συμβάλλει στην φαρμακευτικής αντίστασης των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων με την ενεργοποίηση αντι-αποπτωτικών οδών [15], και συμμετέχει στην μεσεγχυματικά επιθηλιακά-to- μετάβαση σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών [16]. Αυτές οι μελέτες από το εργαστήριο μας και άλλες ομάδες που υποδεικνύουν την πιθανή σημασία αυτής της βλεννίνης σε διάφορες πτυχές της βιολογίας των όγκων.

Έχουμε παράγονται προηγουμένως ένα πάνελ μονοκλωνικών αντισωμάτων που κατευθύνονται κατά της περιοχής TR του MUC4 [17]. Ένα από τα αντισώματα αντι-MUC4 TR, 8G7, έχει χρησιμεύσει ως πολύτιμη αντιδραστήριο για να μελετηθεί η έκφραση του MUC4 βλεννίνης σε διάφορους ιστούς και να ξετυλίγει τη συμμετοχή της σε διάφορες κακοήθειες, συμπεριλαμβανομένων, του παγκρέατος [12], [18], γαστρικό [19] , του τραχήλου της μήτρας [20], των ωοθηκών καρκίνους [21], επιπλέον ηπατικό καρκίνωμα του χοληφόρου πόρου [22], χολαγγειοκαρκίνωμα [23], και δερματικό καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων. Ωστόσο, MUC4 περιέχει πολλές δομικές και λειτουργικές επικράτειες τόσο ανάντη και κατάντη της περιοχής του TR [1], [2], και πολλές ματισμένων μορφών MUC4 είναι εντελώς άνευ TR περιοχής [24], [25]. Περαιτέρω, η περιοχή TR είναι σε μεγάλο βαθμό Ο-γλυκοσυλιωμένη. Δεδομένης της μεταβολής στην κατάσταση γλυκοζυλίωση των στερεών όγκων, είναι πιθανό ότι αντιδραστικότητα με το αντίσωμα μπορεί να επηρεαστεί σε ορισμένες κακοήθειες. Έτσι, η δομική πολυπλοκότητα του MUC4, η ύπαρξη πολλών παραλλαγών ματίσματος και γλυκομορφές, και βαρέα Ο-γλυκοζυλίωσης στο πεδίο TR δικαιολογείται η δημιουργία πρόσθετων αντισωμάτων να κατανοήσουν πλήρως τη σχέση δομής-λειτουργίας των διαφόρων MUC4 domains υπό φυσιολογικές και παθολογικές συνθήκες.

Εδώ, αναφέρουμε τη δημιουργία και τον χαρακτηρισμό ενός νέου αντι-MUC4 MAbs που αναγνωρίζουν τις περιοχές της MUC4α τόσο ανάντη και κατάντη της περιοχής TR. Καθαρισμένα κλάσματα ανασυνδυασμένης MUC4, συντήκονται σε πλαίσιο με την GST, χρησιμοποιήθηκαν ως ανοσογόνα και επιλέχθηκαν θετικοί κλώνοι με βάση την αντιδραστικότητα τους σε ELISA. Επιλεγμένοι κλώνοι χαρακτηρίζονται από την αντιδραστικότητά τους προς MUC4 σε ανοσοστύπωμα, ανοσοκατακρήμνιση, ανοσοφθορισμό και κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Τα μη-TR αντι-MUC4 MAbs που αναπτύχθηκε στην παρούσα μελέτη μπορεί να είναι πολλά υποσχόμενη αντιδραστήρια για την ανάπτυξη δοκιμασιών για την ποσοτικοποίηση των MUC4 σε ιστούς και βιολογικά υγρά, για τη μελέτη του λειτουργικού ρόλου του MUC4 σε διάφορες ασθένειες και ενδεχομένως για την ανοσοθεραπεία.

Αποτελέσματα

Η σχηματική δομή της MUC4 και οι ανασυνδυασμένες τομείς που αναφέρονται στο Σχήμα 1α. Μετά την κυτταρική σύντηξη, υπερκείμενα καλλιέργειας από σταθερών υβριδωμάτων υποβλήθηκαν σε διαλογή και οι θετικές υβριδώματα που εμφανίζουν υψηλή αντιδραστικότητα με την ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη και αρνητική αντιδραστικότητα με GST κλωνοποιήθηκαν με τρεις γύρους περιοριστικής αραίωσης. Επτά σταθεροί κλώνοι που αντιδρούν με MUC4α-Ν-Ter και τρεις κλώνοι που αντιδρούν με MUC4α-C-Ter ελήφθησαν (Πίνακας 1 και Σχήμα 1 b). MAbs 2172, 2173, 2175, 2212, 2213, 2214 και 2382 παρουσίασαν ειδική αντιδραστικότητα προς MUC4α-Ν-Ter, ενώ MAbs 2103, 2106 και 2107 ήταν ειδικά για MUC4α-C-Ter. Περαιτέρω, κανένα από τα επιλεγμένα αντισώματα έδειξαν καμία αντιδραστικότητα προς καθαρίστηκε MUC4 TR πεπτιδίου, BSA ή GST (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ομοίως, προηγουμένως δημιουργηθέντα αντι-MUC4 TR αντίσωμα 8G7 ή K2G6 αντίσωμα αντι-ΚΙΗ δεν έδειξε αντιδραστικότητα προς τα ανασυνδυασμένα domains MUC4.

α) Σχηματική δομή του MUC4 και ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη. MUC4 είναι πιθανώς διασπάται στη θέση GDPH για να παράγει ένα Ν-τερματικό βλεννίνης τύπου υπομονάδας MUC4-α και ένα Ο-τερματικό αυξητικός παράγοντας τύπου-υπομονάδας MUC4-β. Οι σημαντικές περιοχές της MUC4 σήμανση. Η ανασυνδυασμένη περιοχές MUC4- α που αντιστοιχεί στα θραύσματα ανάντη και κατάντη του δίδυμου-επανάληψης (TR) περιοχή κλωνοποιήθηκαν και εκφράστηκαν όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι και ονομάζεται MUC4-α-Ν-ter και MUC4-α-C-Ter, αντίστοιχα. Οι αριθμοί νουκλεοτιδίων που αντιστοιχεί στα όρια των ανασυνδυασμένων περιοχών που σημειώνονται και περιγράφονται στο Moniaux et al. και Choudhury et al (Ref 1 και 24, αντίστοιχα) σύμφωνα με την αρχική αρίθμηση. Cys-κυστεΐνη περιοχή πλούσια EGF-επιδερμικού αυξητικού παράγοντα που μοιάζει τομέα? τομέα TM-διαμεμβρανική? CT-κυτταροπλασματική ουρά. β) ELISA που δείχνει την αντιδραστικότητα του αντι-MUC4 MAbs σε ανασυνδυασμένο ανοσογόνα. Τα αναφερόμενα MAbs επωάστηκαν με τα 2.5 μg /ml του GST-tagged Ν-τερματικά και διαδοχική επανάληψη ανασυνδυασμένη πεδία MUC4. Οι εξειδικεύσεις ελέγχθηκαν επίσης κατά του πεπτιδίου MUC4 TR, GST και ένα μη ειδικό αλβουμίνη βόειου ορού πρωτεΐνη ελέγχου και τα αντισώματα εμφάνισαν αρνητική αντιδραστικότητα έναντι αυτών των αντιγόνων. Η δοκιμασία περιλαμβάνεται επίσης μια μη ειδική ισότυπο K2G6 ελέγχου.

Η

Τα αντισώματα εξετάστηκαν περαιτέρω για την ικανότητά τους να αναγνωρίζουν ειδικά την πρωτεΐνη MUC4 στα προϊόντα λύσης του MUC4 εκφράζουν παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές με ανοσοκηλίδωση. Από τα επτά MUC4α-Ν-Ter-ειδικά αντισώματα μόνο MAbs 2214, 2175 και 2382 αναγνώρισε την πρωτεΐνη MUC4 στα προϊόντα λύσης κυττάρων (Σχήμα 2). MAbs 2215 και 2382 αναγνωρισμένη υψηλή ζώνες μοριακού βάρους πρωτεΐνη στα προϊόντα λύσης των θετικών κυττάρων MUC4 (ΗΡΑΡ /CD18, Colo357, QGP1 και Τ3Μ4) (Σχ. 2α και 2c) και το πρότυπο αντιδραστικότητας ήταν παρόμοια με εκείνη του αντι-TR MAb 8G7 (Εικ. 2d). Κάθε μία από τις θετικές κυτταρικές σειρές MUC4 παρουσίασαν χαρακτηριστικά διακριτό μέγεθος μπάντα η οποία είναι συνεπής με τις προηγούμενες εκθέσεις μας πολυμορφισμών VNTR σε MUC4 με ΗΡΑΡ /CD18, Colo357 και QGP1 δείχνει ένα ενιαίο συγκρότημα και Τ3Μ4 εκφράζουν δύο ζώνες (αλληλομόρφων VNTR πολυμορφισμού). Σε αντίθεση με MAbs 2175, 2382 και 8G7, MAb 2214 αντιδρά κυρίως με τη μορφή χαμηλού μοριακού βάρους MUC4 αλλά με το μοτίβο ζώνη που αντιστοιχεί στο πολυμορφισμού VNTR (Σχήμα 2β). Mab 2214 έδειξε επίσης πολύ ασθενή δραστικότητα με το υψηλό μοριακό συγκρότημα που αντιστοιχούν σε εκείνες που αναγνωρίζονται από άλλα αντισώματα σε QGP1 και Τ3Μ4 λύματα. Η ανάλυση ανοσοκηλιδώσεως της β-ακτίνης στο SDS-PAGE προϊόντων λύσης επιλυθεί υποδεικνύεται ίσης φόρτωσης πρωτεΐνης (Εικόνα 2, ένθετο). Δεν αντιδραστικότητα δεν παρατηρήθηκε με οποιονδήποτε αντισώματος με το προϊόν της λύσης του αρνητική κυτταρική σειρά MUC4 MiaPaCa. Κανένα από τα αντισώματα αντι-MUC4α-C-Ter αντέδρασε με MUC4 στα προϊόντα λύσης κυττάρων σε ανοσοστύπωμα (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα).

Ένα σύνολο 20 μg πρωτεΐνης από κυτταρικά εκχυλίσματα αναλύθηκε με ηλεκτροφόρηση σε 2% γέλη SDS-αγαρόζης, μεταφέρθηκε σε μεμβράνη PVDF και επωάζονται με 2 μg /ml του MAbs 2175 (a), 2214 (b), 2382 (γ) ή 1 μg /ml του αντι-MUC4 TR Mab 8G7 (δ). Η μεμβράνη στη συνέχεια ανιχνεύθηκε με υπεροξειδάση αρμορακίας-επισημασμένο κατσίκα αντι-ποντικός ανοσοσφαιρίνη. Το σήμα ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ αντιδραστηρίου ECL. Η θέση των ζωνών ανιχνεύεται υποδεικνύεται από τα βέλη. Για τον έλεγχο φόρτωσης, ανοσοστυπώματος για την ανίχνευση του β-ακτίνης (ένθετο α) έγινε σε προϊόντα λύσης των αντίστοιχων κυττάρων διαχωρίστηκαν σε 10% SDS-PAGE.

Η

Η ικανότητα των αντισωμάτων να αναγνωρίζουν MUC4 στο ανέπαφο κύτταρα μελετήθηκε με ανοσοφθορισμό και κυτταρομετρία ροής. Στα μεθανόλη σταθερών και διαπερατά δοκιμασία ΗΡΑΡ κύτταρα /CD18 όλες οι επιλεγμένες MAbs παρουσίασαν ειδική χρώση για MUC4? δεν παρατηρήθηκε χρώση με το αντι-ΚΙΗ K2G6 αντίσωμα ελέγχου (Σχήμα 3). MAb 2214 παρουσίασαν τόσο μεμβράνη και περιπυρηνική χρώση, ενώ MAbs 2175, 2382 και 2106 έδειξε κυτταροπλασματική μεμβράνη και τη χρώση. Το αντι-TR MAb 8G7 παρουσίασαν ισχυρότερη αντιδραστικότητα λόγω του επαναλαμβανόμενου χαρακτήρα των επιτόπων. Περαιτέρω, κανένα από τα αντισώματα δεν έδειξε αντιδραστικότητα με MUC4 αρνητικό καρκίνο του παγκρέατος κυτταρικές γραμμές MiaPaCa ή PANC1 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Για τη χρώση της κυτταρικής επιφάνειας, (unpermmeabilized) κύτταρα παραφορμαλδεϋδη-σταθερές χρησιμοποιήθηκαν και η δέσμευση των αντισωμάτων αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής. MAb 2214 εμφάνισε την ισχυρότερη αντιδραστικότητα με την επιφάνεια του κυττάρου σε κύτταρα παραφορμαλδεΰδη-σταθερό, ενώ η επιφάνεια αντιδραστικότητα των MAbs 2175 και 2382 ήταν αδύναμη και η μέση ένταση φθορισμού τιμές (MFI) ήταν συγκρίσιμες με τις τιμές που λαμβάνονται με MAb 8G7 (Σχήμα 4).

τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε χαμηλή πυκνότητα επί αποστειρωμένο κάλυμμα-διαφάνειες, μονιμοποιήθηκαν σε παγωμένη μεθανόλη στους -20 ° C και επωάστηκαν με 10 μg /ml μη-TR MAbs του 2214, 2175, 2382 και 2106, ή 2 μg /ml του αντι-MUC4 TR MAb 8G7 (Control) και ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας FITC συζευγμένο δευτερογενές αντίσωμα. Αντι-KLH K2G6 αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος ισοτύπου. Τα κύτταρα τοποθετημένα σε γυάλινες πλάκες χρησιμοποιώντας αντι-ξεθωριάσματος Vectashield μέσο στερέωσης και παρατηρήθηκαν κάτω από ένα ZEISS συνεστιακό λέιζερ μικροσκόπιο σάρωσης (μεγέθυνση, χ 630).

Η

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν μη ενζυματικώς, σταθεροποιήθηκαν με παραφορμαλδεϋδη και επωάστηκαν με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. Μετά την επώαση με δευτερογενές αντίσωμα, τα κύτταρα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας BD FACSCalibur. Οι εντάσεις μέσου φθορισμού (MFI) τιμές που λαμβάνονται με κάθε αντίσωμα ενδείκνυται σε παρενθέσεις.

Η

Τα domain-ειδικά αντι-MUC4 αντισώματα δοκιμάστηκαν επίσης για την ικανότητά τους να ανοσοκαθιζάνουν MUC4 χρησιμοποιώντας το /CD18 λύματος ΗΡΑΡ. MAbs 2382 2175, και 2214 ανοσοκαταβυθίστηκαν πλήρους μήκους MUC4 από τις συνολικές κυτταρολύματα, η οποία οπτικοποιήθηκε όταν τα επεξεργασμένα δείγματα διαχωρίστηκαν σε SAS-αγαρόζης γέλης και ανοσοαποτύπωση με αντι-MUC4-TR MAb 8G7 (Σχήμα 5). Τα ανοσοκαταβυθίστηκαν δείγματα από διάφορα αντισώματα επίσης ανοσοστυπώθηκαν με MAb 2214 λόγω κυρίαρχο αντίδραση με κατώτερη μορφή μοριακού βάρους της MUC4. Όταν ιχνηλατήθηκαν με MAb 8G7, το υψηλότερο ποσό του MUC4 ανοσοκατακρημνίστηκε με 8G7, ενώ MAb 2382 οδήγησε επίσης σε σημαντική εμπλουτισμό των 8G7 ζωνών αντιδρώσα πρωτεΐνη. MAbs 2175 και 2214 ανοσοκατακρημνίσθηκαν επίσης πλήρους μήκους 8G7 αντιδραστική μπάντα, αλλά ο πλουτισμός δεν ήταν τόσο ισχυρή όσο παρατηρείται με MAbs 8G7 και 2382. Anti-C-τερματικό MAb 2106 και αρνητικό μάρτυρα αντι-ΚΙ K2G6 αντίσωμα δεν γκρεμίζουν κάθε 8G7 αντιδραστική πρωτεϊνική ζώνη. Ωστόσο, κανένα από τα εξετασθέντα αντισώματα εκτός 2214, immunopecipitated το MAb 2214-αντιδραστική μορφή χαμηλού μοριακού βάρους MUC4.

προϊόντα λύσης πρωτεΐνης από το MUC4 κύτταρα που εκφράζουν CD18 /ΗΡΑΡ ανοσοκατακρημνίσθηκαν χρησιμοποιώντας 5 μg /ml του 8G7 ( διαδοχική επανάληψη MAb), 2382, 2214 και 2175 (μη διαδοχική επανάληψη MAbs) και K2G6 (ισότυπο ελέγχου mAb) και ανοσοστυπώθηκαν με τη χρήση MAbs 8G7 και 2214 όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι.

Η

Η ικανότητα των αντισωμάτων να ανιχνεύουν MUC4 σε ιστούς όγκων ελέγχθηκε με ανοσοϊστοχημικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν σε παγκρεατικό καρκινικούς ιστούς. MAbs 2214, 2175 και 2382 παρουσίασαν θετική χρώση σε καρκινικό ιστό που προσδιορίστηκε να είναι θετική MUC4 με βάση την αντιδραστικότητα με αντι-TR MAb 8G7 (Σχήμα 6). Το μοτίβο της χρώσης με τα νέα αντισώματα ήταν παρόμοια με αυτή που παρατηρήθηκε με 8G7 δείχνει διάχυτη χρώση τόσο στην μεμβράνη και το κυτταρόπλασμα των κυττάρων του όγκου. Δεν παρατηρήθηκε χρώση με Mab 2106 ή το μη ειδικό ισότυπο ελέγχου MAb K2G6.

τομές παραφίνης επωάστηκαν με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα δοκιμής και ελέγχου και η σύνδεση ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας VECTOR καθολική κιτ χρώσης. MAb 8G7 χρησιμοποιήθηκε σε συγκέντρωση 2 μg /ml, ενώ όλες οι άλλες αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν σε συγκέντρωση 10 μg /ml.

Η

Συζήτηση

MUC4 είναι μία μεγάλη γλυκοπρωτεΐνη που εμπλέκονται στη φυσιολογία και εμπλέκεται σε διάφορες νοσηρές καταστάσεις. Ιδιαίτερης σημασίας είναι ο ρόλος του στην ανάπτυξη του καρκίνου του παγκρέατος και την πρόοδο [2], [26], [27]. Ορισμένες πρόσφατες μελέτες απέδειξαν το ρόλο της διαμεμβρανικής βλεννίνης MUC4 στην παθογένεση πολλών κακοηθειών. MUC4 αποτελείται από δύο τομείς, ήτοι MUC4α το οποίο έχει την περιοχή διαδοχικής επανάληψης και MUC4β το οποίο έχει την διαμεμβρανική περιοχή και διαθέτει επίσης παράγοντα ανάπτυξης, όπως τομείς [1], [2]. Λόγω του πολυμορφισμού του αριθμού των διαδοχικές επαναλήψεις [28] και την ύπαρξη διαφόρων μορφών ματίσματος εντελώς άνευ τομέα TR [25], τα αντισώματα που αναγνωρίζουν τα μη-διαδοχική επανάληψη περιοχές της πρωτεΐνης που θα μπορούσε να παρέχει χρήσιμες πληροφορίες σχετικά με τη λειτουργία του , είναι δυνατόν να αλληλεπιδρούν οι εταίροι και το πιο σημαντικό μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε ποσοτικούς προσδιορισμούς.

Τρία από τα αντισώματα που δημιουργούνται κατά της περιοχής ανοδικά το κεντρικό πεδίο TR 2214, 2175 και 2382, και ένα από τα αντισώματα που δημιουργούνται έναντι του κατάντη ο τομέας TR, 2106 έδειξε ισχυρή αντιδραστικότητα έναντι των αντίστοιχων ανασυνδυασμένων περιοχών σε ELISA. Κανένα από τα αντισώματα αναγνωρίζουν τα μη-ειδική ανασυνδυασμένη τομείς, GST ή συνθετικά πεπτίδια TR. Αυτά τα αντισώματα μπορούν δυνητικά να χρησιμεύσουν ως χρήσιμα αντιδραστήρια για την ανάπτυξη των βιοπροσδιορισμών MUC4 και μπορεί να συμπληρώσει το υπάρχον αντίσωμα αντι-MUC4 TR ή άλλα αντισώματα που αντιδρούν έναντι των επιτόπων υδατανθράκων που υπάρχουν στο βλεννίνες (DUPAN2, CA 19.9, TAG 72). Καλλιέργεια στοιχεία δείχνουν ότι η MUC4 βλεννίνη, λόγω της υπερέκφρασης της σε διάφορα κακοήθειες, είναι ένας πιθανός δείκτης για τη διάγνωση [27], ιδίως για τον θανατηφόρο καρκίνο του παγκρέατος που έχει καθιερωθεί η σύνδεσή της με τις αρχές της νεοπλασματικές αλλοιώσεις [29]. Μια άλλη πρόσφατη μελέτη έχει δείξει MUC4 να είναι ένα νέο προγνωστικός παράγοντας του καρκινώματος της εξω-ηπατικής χοληφόρου οδού [22]. MUC4 έκφραση συσχετίστηκε με κακή πρόγνωση σε αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα μικρού μεγέθους [30]. Όλες αυτές οι μελέτες έχουν δείξει ότι MUC4 θα μπορούσε να είναι ένας βασικός παράγοντας στην ογκογένεση? Ωστόσο, όλες αυτές οι μελέτες έχουν αναλύσει MUC4 σε δείγματα ιστού, η οποία θα μπορούσε να περιοριστεί από σφάλματα δειγματοληψίας, λόγω της ετερογενούς έκφραση αντιγόνων όγκου. Ως εκ τούτου, θα ήταν λογικό να αναπτυχθούν ποσοτικές αναλύσεις για MUC4 σε βιολογικά υγρά, το οποίο θα είναι μη επεμβατική, οικονομικά αποδοτική και εύκολα αυτοματοποιημένες. Λόγω του μεταβλητού μεγέθους της περιοχής διαδοχικών επαναλήψεων, το αντίσωμα που αναγνωρίζει την περιοχή διαδοχικών επαναλήψεων δεν μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για την ποσοτική σκοπούς. Ο τομέας ειδικά αντισώματα μπορούν δυνητικά να βοηθήσει στην ανάπτυξη

in vitro

διαγνωστικές δοκιμασίες για την ποσοτικοποίηση MUC4 στον ορό και άλλα βιολογικά υγρά.

Όλα τα αντισώματα που αντιδρούν με την περιοχή ανοδικά της περιοχής MUC4 TR ήταν σε θέση να αναγνωρίσει MUC4 στα προϊόντα λύσης κυττάρων των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων που εκφράζουν MUC4. MAbs 2175 και 2382 αναγνώρισε την πλήρους μήκους MUC4 με υψηλό μοριακό βάρος, με μέγεθος μπάντα παρόμοια με αυτή που αναγνωρίζεται από αντι-TR MAb 8G7. Η διαφορά στην ισχύ του σήματος των μη-TR και TR αντισώματα θα μπορούσαν να αποδοθούν με τον αριθμό των επιτόπων διαθέσιμος για την MAb να δεσμεύει, αφού 8G7 αναγνωρίζει την περιοχή διαδοχικών επαναλήψεων, η οποία αντιπροσωπεύεται πολλές φορές σε κάθε μόριο, ενώ οι επίτοποι που αναγνωρίζονται από 2175 και 2382 εκπροσωπούνται μόνο μία φορά ανά μόριο. Αντιθέτως, το mAb 2214 εμφάνισε ισχυρή αναγνώριση πρωτεΐνης ζώνη μικρότερου μεγέθους από εκείνους που αναγνωρίζονται από MAbs 8G7, 2175 και 2382. Παρά τη μείωση του μοριακού μεγέθους τους, αυτές οι ζώνες είναι αντίστοιχη με την αλληλική παραλλαγή που παρουσιάζεται από την πλήρους μήκους MUC4 για τις αντίστοιχες κυτταρικές γραμμές , γεγονός που υποδηλώνει ότι το mAb 2214 ενδεχομένως αντιδρά με ένα ανώριμο ή underglycosylated μορφή MUC4. Πολύ ασθενείς λωρίδες που αντιστοιχούν στο υψηλού μοριακού βάρους ώριμης πρωτείνης ήταν ακόμη ανιχνεύθηκαν σε QGP1 και Τ3Μ4. Όσο ισχυρότερη είναι η ισχύς του σήματος του Mab 2214 με τις χαμηλότερες ζώνες θα μπορούσαν να είναι λόγω της αφθονίας μιας ανώριμη πρωτεΐνη MUC4 στα καρκινικά κύτταρα. Σε καρκινικά κύτταρα είναι καλά τεκμηριωμένο ότι λόγω παρεκκλίνουσα και αναποτελεσματική γλυκοζυλίωση, οι βλεννίνες υπογλυκοποιημένα και αυτές ανώριμων μορφών συνεχώς υποστούν επαναλαμβανόμενους κύκλους της εσωτερίκευσης, με αποτέλεσμα μια πιο ανώριμη μορφή από την ώριμη μορφή. Ωστόσο, με μεμβράνη απογλυκοζυλίωση (ενζυματική ή χημική) του διακριτές ζώνες πρωτείνης δεν ενίσχυσε την αντιδραστικότητα Mab 2214 με τις ώριμες ταινίες MUC4 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ωστόσο, σε paraformadehyde σταθεροποιημένα κύτταρα, MAb 2214 εμφάνισε την υψηλότερη αντιδραστικότητα με την κυτταρική επιφάνεια. Η ανώριμη πρωτεΐνη είναι πιθανό να είναι παρόντες στην κυτταρική επιφάνεια, και, ενδεχομένως, ο καθορισμός των κυττάρων με παραφορμαλδεϋδη εκτεθεί το MAb 2214 αντιδραστικό επιτόπιο. Περαιτέρω χαρακτηρισμός της μορφής χαμηλού μοριακού βάρους που αντιδρούν με MUC4 MAb 2214 είναι σε εξέλιξη. Ανάλυση

Ανοσοφθορισμός έδειξε ειδική χρώση για MUC4 στις μεμβράνες καθώς και στις κυτταροπλασματικές διαμερίσματα των κυττάρων /CD18 ΗΡΑΡ. Το πρότυπο χρώσης ήταν συγκρίσιμη με την αντι TR Mab 8G7 και ειδικότητα τους να MUC4 υποστηρίχθηκε περαιτέρω από την έλλειψη σήματος σε αρνητικά κύτταρα MUC4. Η περιπυρηνική χρώση των Μαο 2214 υποστηρίζει την περαιτέρω αντίδραση του στην ανώριμη πρωτεΐνη.

Λόγω του μεγάλου μεγέθους και σε πολλούς τομείς της οργάνωσης, MUC4 μπορεί να αλληλεπιδράσουν με πολλές πρωτεΐνες και αυτές οι αλληλεπιδράσεις θα μπορούσε να είναι το κλειδί για τις διάφορες λειτουργίες που αποδίδονται να MUC4. αλληλεπίδρασή της με HER2 και την λειτουργική σημασία αυτής της αλληλεπίδρασης έχει μελετηθεί καλά [31], [32]. Ωστόσο, υπάρχουν πολλές άλλες πιθανές εταίρους σύγκρουση των MUC4 που θα μπορούσε να διαδραματίσει ένα σημαντικό ρόλο στην ρύθμιση ή μεσολάβηση λειτουργία MUC4. MAbs 2175 και 2382 ήταν σε θέση να ανοσοκαθιζάνουν την πρωτεΐνη MUC4 από τα προϊόντα λύσης κυττάρου από κύτταρα /CD18 ΗΡΑΡ και θα μπορούσε έτσι να βοηθήσει στην απομόνωση και την ταυτοποίηση των πρόσθετων αλληλεπιδρούν εταίρων MUC4. Περαιτέρω, η κυρίαρχη αντιδραστικότητα του MAb 2214 σε χαμηλότερες MUC4 μοριακό βάρος είναι ενδεικτικό μιας διαφορετικής μορφής MUC4 που συνυπάρχει με την ώριμη πρωτεΐνη. Εάν, στην πραγματικότητα, είναι η ανώριμη μορφή της πρωτεΐνης, τότε η MAb 2214 μπορεί δυνητικά να βοηθήσει στην απομόνωση διαφόρων νέων αλληλεπιδρούν συνεργάτες που μπορούν να αλληλεπιδράσουν με αυτή τη μορφή της MUC4 και ξετυλίγει λειτουργική σημασία της.

MAbs 2214, 2175 και 2382 αναγνωρίζεται επίσης MUC4 εκφράζεται σε ιστούς καρκίνου με ανοσοϊστοχημική ανάλυση με το πρότυπο αντιδραστικότητας παρόμοιο με αυτό που παρατηρήθηκε με αντι-TR Mab 8G7. Καμία από τις κανονικές παγκρεατικών αγωγών βάφτηκαν, η οποία είναι σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες μας που έχουν δείξει την απουσία έκφρασης MUC4 στα μη νεοπλασματικά αγωγών. Τα νέα αντισώματα μπορούν να είναι χρήσιμα εργαλεία για να επιβεβαιωθούν τα αποτελέσματα που λαμβάνονται από 8G7, γεγονός που υποδηλώνει την υπερέκφραση MUC4 σε διάφορες κακοήθειες. Περαιτέρω, λόγω της μη επαναληπτικής φύσεως των αντιδραστικών επιτόπου τους, τα προσφάτως ανεπτυγμένα αντισώματα θα παράσχει μια πιο εύλογο μέτρο της έκτασης της υπερέκφρασης με αναιρώντας τις επιδράσεις των VNTR πολυμορφισμού. Το αντι-TR αντίσωμα 8G7, εντούτοις, θα παρέχει μεγαλύτερη ευαισθησία ανίχνευσης λόγω της πολλαπλότητας των επιτόπων. Έτσι, ο συνδυασμός των αντι-TR και TR MUC4 αντισώματα αντι-μη μπορούν να παρέχουν καλύτερη πληροφόρηση σχετικά με την έκταση των MUC4 υπερέκφραση σε ιστούς όγκων.

Οι προσπάθειες βρίσκονται σε εξέλιξη για να μελετήσει τις άμεσες ανασταλτικές επιδράσεις των αντισωμάτων για τον καρκίνο κυτταρική ανάπτυξη, την κινητικότητα και την εισβολή στο πλαίσιο τόσο

in vitro

και

in vivo

συνθήκες. πρόσφατες μελέτες μας έχουν δείξει ότι MUC4 συμβάλλει στην χημειοαντίσταση σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα με την ενεργοποίηση αντι-αποπτωτικών οδών και την προώθηση της κυτταρικής επιβίωσης [15]. Ως εκ τούτου, θα είναι ενδιαφέρον να μελετήσουμε την επίδραση των αντι-MUC4 αντισωμάτων στην επαγωγή απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα και αυξάνοντας την ευαισθησία τους σε χημειοθεραπευτικά φάρμακα. Περαιτέρω, αυτά τα αντισώματα πρέπει επίσης να αξιολογηθούν για τη χρησιμότητά τους σε ραδιοανοσοδιάγνωση και ραδιοανοσοθεραπεία του MUC4 υπερεκφράζουν όγκων. Λειτουργικές μελέτες που χρησιμοποιούν τα μη διαδοχική επανάληψη MAbs μπορεί πιθανώς να παρέχει μια καλύτερη κατανόηση των μηχανισμών που διαμεσολαβούνται από MUC4 στην πρόοδο του καρκίνου. Αυτά τα αντισώματα θα μπορούσαν επίσης να βοηθήσει στην κατανόηση MUC4 σχέσεων δομής-λειτουργίας, ρύθμιση της έκφρασης και, ενδεχομένως, την ταυτοποίηση ενός πιθανή αλληλεπιδρά εταίρος στην επιφάνεια των καρκινικών κυττάρων, η οποία θα μπορούσε να είναι ο λόγος για τον μεταστατικό φαινότυπο.

Εν κατακλείδι, οι μελέτες μας δείχνουν ότι τα MAb 2175 και 2382 είναι πολύ ειδικά στην ανίχνευση της επανάληψης περιοχή μη διαδοχική της βλεννίνης MUC4 από διάφορες ανοσοδοκιμασίες. Αυτά τα ειδικά αντισώματα τομέα θα χρησιμεύσουν ως χρήσιμα αντιδραστήρια για την ανάπτυξη ποσοτικών προσδιορισμών, και είναι πολύτιμα εργαλεία για τη μελέτη MUC4 σχέσεων δομής-λειτουργίας και, ενδεχομένως, στοχεύουν MUC4 για θεραπεία συμπαγών όγκων που υπερεκφράζουν MUC4.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

Η χρήση ζώων για την ανοσοποίηση και απομόνωση της σπλήνας εγκρίθηκε από την Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και χρήση (IACUC) πρωτόκολλο # 94-025-12 με τίτλο «μονοκλωνικό αντίσωμα Πυρήνας διευκόλυνσης ανοσοποίηση πρωτόκολλο» .

Ανθρώπινοι ιστοί του παγκρέατος όγκου ελήφθησαν από το Πανεπιστήμιο της Νεμπράσκα Ιατρικό Κέντρο (UNMC) Tissue Bank και η χρήση τους είχε εγκριθεί μέσω του UNMC Institutional Review Board έγκριση (IRB) # 491-97-EX.

Δημιουργία ανασυνδυασμένων περιοχών MUC4

Περιοχές MUC4-α σε κάθε πλευρά του τομέα TR κλωνοποιήθηκαν και εκφράστηκαν, και καθαρισμένων πρωτεϊνών χρησιμοποιήθηκαν ως ανοσογόνα. Ειδικοί εκκινητές σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας MUC4 AJ000281 ακολουθία για να ενισχύσει τα θραύσματα από τα νουκλεοτίδια 587 – 3.361 [MUC4α-αμινο Terminal (MUC4α Ν-ter)] και από τα νουκλεοτίδια 1-1293 [MUC4α-καρβοξυ τερματικό (MUC4α C-ter), που αντιπροσωπεύουν τις περιοχές αμέσως ανάντη και κατάντη της περιοχής ΤΚ, αντίστοιχα (Σχήμα 1α). BamHI και ένα θέσεις περιορισμού EcoRI προστέθηκαν στο εμπρός και αντίστροφοι εκκινητές, αντίστοιχα, επιτρέποντας εντός πλαισίου κλωνοποίηση με το GST και θέση διάσπασης θρομβίνης του φορέα ρΟΕΧ-2ΤΚ (Pharmacia). Η ενίσχυση έγινε με τη μακρά σύστημα RT-PCR επεκτείνουν (Roche) όπως περιγράφηκε προηγουμένως χρησιμοποιώντας JER103 και JER109 ως μήτρες για αλληλουχία AJ00281 και AJ010901, αντιστοίχως [1]. Τα κατασκευάσματα αλληλουχήθηκαν για να επιβεβαιωθεί η σωστή πλαίσιο ανάγνωσης και διατηρήθηκε σε E.coli BL21 (New England Biolabs Inc.). Μία 5 ml όλη την νύχτα προκαλλιέργεια του κάθε ανασυνδυασμένου στελέχους χρησιμοποιήθηκε για να εμβολιάσει 1 λίτρο του 2 × μέσου YTA (16 g τρυπτόνης, 10 g εκχύλισμα ζύμης, και 5 g NaCl σε 900 ml απιονισμένου νερού, 100 μg /ml αμπικιλλίνη) και αναπτύχθηκαν υπό ανάδευση στους 37 ° C για 3 έως 4 ώρες για να επιτευχθεί απορρόφηση στα 260 nm μεταξύ 0.6-0.8, που προκαλείται από 0,1 mM ΙΡΤΟ, και καλλιεργήθηκαν για μια προσθήκη από 3 έως 4 ώρες. Οι καλλιέργειες φυγοκεντρήθηκαν και πλύθηκαν τρεις φορές σε παγωμένο PBS, επαναιωρήθηκαν σε 5 ml παγωμένου PBS, και υπερηχήθηκε. προϊόντα λύσης πρωτεΐνης διαυγάστηκε με φυγοκέντρηση και με διήθηση σε φίλτρο 0.22 μm. Τα προϊόντα λύσης πέρασαν από ένα Glutathione Sepharose Ταχείας Ροής στήλη 5 ml (Pharmacia), πλύθηκε τρεις φορές με 5 όγκους στήλης PBS, και εκλούστηκε με 10 ml 15 mM ανηγμένη γλουταθειόνη. Τα κλάσματα έκλουσης 1 ml συλλέχθηκαν και 5 υποπολλαπλάσιο μΐ από κάθε κλάσμα αναλύθηκε σε 10% SDS-PAGE και οι πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν με χρώση Coomassie Blue. Τα κλάσματα που περιέχουν καθαρό πρωτεΐνες σύντηξης GST συγκεντρώθηκαν και προσδιορίστηκαν ποσοτικά με τη χρήση της ΒΙΟ-RAD D /C κιτ εκτίμησης πρωτεΐνης (Bio-Rad).

Ποντίκια Ανοσοποίηση

Η ανοσοποίηση και η επιλογή των MAbs διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας τις καθιερωμένες διαδικασίες στην Εγκατάσταση UNMC αντίσωμα πυρήνα [17]. Εν συντομία, ξεχωριστές ομάδες ποντικών (BALB /c) ανοσοποιήθηκαν με επανειλημμένες ενέσεις ΙΡ ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών σύντηξης GST MUC4α-Ν-Ter και MUC4α-C-Ter σε διαστήματα δύο εβδομάδων. Σε κάθε ομάδα, η ανοσοποίηση με ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη εναλλάσσεται με το προϊόν της λύσης του MUC4 θετικών ΗΡΑΡ /ανθρώπινα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα CD18 [17]. Οροί από αυτούς τους ποντικούς αξιολογήθηκαν σε δοκιμασίες άμεσης σύνδεσης για αντιδραστικότητα αντισώματος με την ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη σύντηξης MUC4, και GST χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Μόλις παρατηρήθηκε μία κατάλληλη απόκριση αντισώματος σε ELISA, τα ζώα έλαβαν μια τελική αναμνηστική ένεση με την ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη τέσσερις τελευταίες ημέρες πριν να αφαίμαξη και σπληνεκτομή. Τα σπληνοκύτταρα απομονώθηκαν και συντήχθηκαν με κύτταρα NS-1 ή /και Sp2 /0 μυελώματος. Υβριδώματα που παράγουν τα αντισώματα που μας ενδιαφέρουν επιλέγονται με διαλογή για ειδική σύνδεση αντισώματος με το ανοσογόνο ενδιαφέροντος (ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών και ΗΡΑΡ /CD18 λύμα) και την έλλειψη δέσμευσης σε αντιγόνα άσχετο ελέγχου (GST και BSA).

Εξέταση για MUC4-θετικά Hybridomas

πλάκες Immulon επικαλύφθηκαν με 50 μΙ του αντιγονικού παρασκευάσματος (ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες MUC4 ή GST ή πρωτεΐνη προϊόντα λύσης από MUC4 θετικές κυτταρικές γραμμές) σε μια συγκέντρωση 2.5 μg /φρεάτιο σε ρυθμιστικό διάλυμα διττανθρακικού (ρΗ 9.6 ). Οι πλάκες επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Οι πλάκες πλύθηκαν σε PBST και οι ελεύθερες θέσεις σύνδεσης των φρεατίων κορεσμένο να εξαλείψει μη ειδική δέσμευση των ανοσοσφαιρινών με επώαση με 200 μΙ /φρεάτιο 2% άπαχο αποβουτυρωμένο γάλα σε PBS για 2 ώρες στους 37 ° C και πλάκες πλύθηκαν σε PBST. Εκατό μΐ του υπερκειμένου καλλιέργειας μεταφέρθηκε από φρεάτια πλακών καλλιέργειας σε αντίστοιχα φρεάτια σε πλάκες ELISA. Mouse προ-άνοσο ορό χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός μάρτυρας σε κάθε δοκιμασία, επωάζεται για 1 ώρα στους 37 ° C, και στη συνέχεια οι πλάκες πλένονται και πάλι σε PBST. Εκατό μΙ /φρεάτιο της υπεροξειδάσης συζευγμένο αντίσωμα (HRP αντι-ποντικού, Amersham Biosciences, 1:2000 αραίωση σε PBS) προστέθηκε και επωάστηκε για 1 ώρα στους 37 ° C. Οι πλάκες πλύθηκαν σε PBST και 100 μΐ υποστρώματος ΤΜΒ (Dako υπόστρωμα) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και επωάζονται στους 37 ° C. Η αντίδραση συνελήφθη με την προσθήκη 100 μΐ 2 Μ θειικού οξέος και οι πλάκες σαρώθηκαν στα 450 nm σε μια συσκευή ανάγνωσης πλάκας ELISA Biotech.

Ανοσοκαταβύθιση

προϊόντα λύσης πρωτεΐνης από το MUC4 εκφράζουν ΗΡΑΡ /κύτταρα CD18 ανοσοκατακρημνίστηκαν χρησιμοποιώντας 5 μg /ml του 2382, 2214, 2175, 8G7 (αντι-TR αντίσωμα), και K2G6 (ισότυπο ελέγχου mAb που αντιδρούν με KLH). συμπλέγματα αντιγόνου-αντισώματος που σχηματίζεται τραβήχτηκαν κάτω χρησιμοποιώντας σφαιρίδια Protein Α /G (Calbiochem) και τα σύμπλοκα διαλυτοποιημένο χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό SDS-δείγμα που περιείχε 2-μερκαπτοαιθανόλη. Τα δείγματα αναλύθηκαν σε 2% πηκτή SDS-αγαρόζης και ανοσοστυπώθηκαν με τη χρήση 8G7.

ανοσοαποτύπωσης

Μια σειρά παγκρεατικών κυτταρικών γραμμών υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για την εκχύλιση των πρωτεϊνών και κηλίδωση Western με τη χρήση τυποποιημένων διαδικασιών [17] . Εν συντομία, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές σε PBS και αποξέστηκαν σε δοκιμασία ραδιοανοσοκατακρήμνισης (RIPA) ρυθμιστικό [50 mM Tris, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0.25% δεοξυχολικό νάτριο? 1% ΝΡ40 (ρΗ 7.5)], που περιέχει μίγμα αναστολέα πρωτεάσης (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) και αναστολείς φωσφατάσης (5 mM NaF και 5 mM Na3VO4? Sigma Chemicals, St. Louis, ΜΟ), και διατηρήθηκε στους 4 ° C για τουλάχιστον 30 λεπτά.