Αφηρημένο

Στόχοι

Επειδή τα ηπατικά καρκινικά βλαστικά κύτταρα (HCSCs) πιστεύεται ότι προκύπτουν από τη μετατροπή των ηπατικών φυσιολογικά βλαστικά κύτταρα (HNSCs), ο προσδιορισμός των διαφορών που διακρίνουν HCSCs από HNSCs είναι σημαντικό.

Μέθοδοι

το μοντέλο HCC ιδρύθηκε σε αρουραίους F344 με επαγωγή DEN . Χρησιμοποιώντας την ανάλυση FACS, πλευρά πληθυσμός κυττάρων από HCC (SP-HCCs) απομονώθηκαν από τα επιθηλιακά κύτταρα που μοιάζουν με των ιστών HCC, και τα πλευρικά πληθυσμού κυττάρων από φυσιολογικό ήπαρ (SP-NLCS) απομονώθηκαν από συγγενικά κανονικά κύτταρα ήπατος. Η έκφραση των δεικτών των βλαστικών κυττάρων ανιχνεύθηκε στα δύο προσφάτως απομονώθηκε και ενισχύθηκε υποπληθυσμών. Μετά την επαγωγή με HGF, η διαφοροποίηση του κάθε υποπληθυσμό αναλύθηκε με ανίχνευση των πρώιμων και όψιμων δείκτες ήπατος. In vivo, τα βιολογικά χαρακτηριστικά του SP-HCCs και SP-NLCS αναλύθηκαν με την επισκευή τραυματίες συκώτια ή σχηματίζουν όγκους σε γυμνούς ποντικούς. Επιπλέον, η έκφραση των miRNAs εξετάστηκε σε δύο πληθυσμούς από σειρά miRNA και QRT-PCR.

Αποτελέσματα

SP-NLCS και SP-ΕΑΣ ήταν 4,30 ± 0,011% και 2,100 ± 0,010% του συνόλου του πληθυσμού, αντίστοιχα. Τόσο SP-NLCS και SP-ΕΑΣ εμφανίζεται μεγαλύτερη έκφραση των δεικτών των βλαστικών κυττάρων (CD133 και EpCAM) από ό, τι NSP-NLCS και NSP-HCCs, αντιστοίχως (

P

& lt? 0.01), τόσο μετά φρέσκο ​​απομόνωση και ενίσχυση. Μετά την επαγωγή HGF, SP-NLCS δημιουργούνται πολλά θετικά κύτταρα ALB και λίγα CK-7 κύτταρα θετικά, αλλά NSP-NLCS θα μπορούσε να δημιουργήσει μόνο θετικά κύτταρα ALB. Σε αντίθεση, SP-HCCs προκάλεσαν μόνο θετικά κύτταρα AFP. Όπως λίγα όσο 5 × 10

5 SP-NLCS ήταν ικανά επισκευή ηπατική βλάβη, ενώ ο ίδιος αριθμός NSP-NLCS δεν μπορούσε να επισκευάσει το συκώτι. Επιπλέον, μόνο 1 × 10

4 SP-ΕΑΣ ήταν απαραίτητες για την έναρξη ενός όγκου, ενώ NSP-ΕΑΣ δεν θα μπορούσε να αποτελέσει έναν όγκο. Σε σύγκριση με την SP-NLCS, 68 έως ρυθμιζόμενα και 10 κάτω-ρυθμίζονται miRNAs ήταν παρόντες σε SP-ΕΑΣ (

P

& lt? 0,01).

Συμπέρασμα

Με βάση την οι αποφασιστικό ρόλο κάποιων miRNAs στη γένεση της HCSCs, miRNAs μπορούν να συμβάλλουν με τα διαφορετικά χαρακτηριστικά που διακρίνουν SP-ΕΑΣ από SP-NLCS

Παράθεση:. Liu Wh, Tao Ks, μπορείτε Ν, Liu Zc, Ζανγκ ht, Dou KF (2011) διαφορές στα προφίλ Ιδιότητες και Mirna Έκφραση μεταξύ Side πληθυσμοί από καρκίνο ηπατικά κύτταρα και κανονικά κύτταρα ήπατος. PLoS ONE 6 (8): e23311. doi: 10.1371 /journal.pone.0023311

Επιμέλεια: Xin Wei Wang, Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 2 Σεπ 2010? Αποδεκτές: 15 του Ιουλίου του 2011? Δημοσιεύθηκε: 3 Αυγούστου 2011

Copyright: © 2011 Liu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 30772102) και Φύση Ίδρυμα Επιστημών της επαρχίας Shaanxi (Αρ 2007K09-05 (7)). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

αύξηση στοιχεία έχουν δείξει ότι οι καρκίνοι περιέχουν ένα μικρό υποσύνολο των δικών τους βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν, που ονομάζεται «τα βλαστικά κύτταρα του καρκίνου» (ΚΕΠ) [1], [2], [3], οι οποίες πλήττονται περισσότερο από τόσο καταστολείς όγκων και επαγωγείς του καρκίνου [4], [5], [6]. HCC περιέχει επίσης ηπατική ΚΕΠ (HCSCs), τα οποία έχουν τις μεγαλύτερες δυνατότητες να πολλαπλασιάζονται και να εισβάλλουν περιβάλλοντα ιστό [7]. Πρόσφατες δημοσιεύσεις έχουν δείξει ότι HCSCs μπορούν να προέρχονται από την ηπατική φυσιολογικών αρχέγονων κυττάρων (HNSCs) [8]. Ακόμα και το αρχικό γεγονός που μετατρέπει HNSCs να HCSCs προτείνεται να είναι μια μορφή της απορρύθμισης των HNSCs αυτο-ανανέωση [9]. Έτσι, συγκρίνοντας τα χαρακτηριστικά του HNSCs και HCSCs είναι σημαντική. Κανονική συκώτι είναι πλούσιο σε HNSCs [10], και η υπόδειξη ότι αυτά τα HNSCs μπορεί να χρησιμεύσει ως το βέλτιστο έλεγχο για τη μελέτη των χαρακτηριστικών των HCSCs είναι λογικό. Ωστόσο, μοριακούς δείκτες που προσδιορίζουν τα δύο HCSCs και HNSCs παραμένουν αμφιλεγόμενα? Ως εκ τούτου, η απομόνωση των κυττάρων πλευρά πληθυσμού (SP) έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως για τον εμπλουτισμό και τους δύο τύπους βλαστοκυττάρων [11]. τα κύτταρα SP έχει αποδειχθεί ότι είναι ανώριμα και μη διαφοροποιημένα κύτταρα και να εκφράζουν υψηλά επίπεδα ορισμένων ειδικών δεικτών των βλαστικών κυττάρων [12]. Ως εκ τούτου, η απομόνωση των κυττάρων SP είναι μια εναλλακτική πηγή βλαστικών κυττάρων, η οποία είναι ιδιαίτερα χρήσιμη σε καταστάσεις στις οποίες βλαστικών κυττάρων δείκτες είναι άγνωστος [12]. Σε ποντικούς και αρουραίους, ο φαινότυπος SP εμφανίζεται να είναι ένα κοινό χαρακτηριστικό των βλαστικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των φυσιολογικών και καρκινικών βλαστικών κυττάρων [13], [14], [15]. Στο ήπαρ, έχουν αυτά τα κύτταρα SP έχουν δειχθεί να εξυπηρετήσει ένα κεντρικό ρόλο στην αναγέννηση του ήπατος και καρκίνο του ήπατος [16]. Ως εκ τούτου, τα κύτταρα SP μπορούν να θεωρηθούν κατάλληλες εναλλακτικές λύσεις για τη μελέτη HNSCs και HCSCs.

Τα miRNAs εμφανίζονται ως σημαντικοί ρυθμιστές της γονιδιακής ρύθμισης μετα-μεταγραφικά. Η σημασία των miRNAs υπογραμμίζεται από το γεγονός ότι συχνά απελευθερωθεί κατά τη διάρκεια της καρκινογένεσης [17], [18], [19], [20]. Μερικά miRNAs μπορούν να προωθήσουν την ανάπτυξη του όγκου μέσω κοινών μηχανισμών που συμβάλλουν στην miRNA-ρυθμίζονται έλεγχο του κυτταρικού κύκλου [21]. Επιπλέον, έχουν miRNAs έχει αποδειχθεί ότι είναι ένα αναπόσπαστο συστατικό της ρύθμισης των βλαστικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων φυσιολογικών αρχέγονων κυττάρων (NSCs) και ΚΕΠ [22]. Μια διαταραχή των βασικών δικτύων miRNA-mRNA σε NSCs έχει προταθεί να είναι ένα σήμα κατατεθέν της ΚΕΠ [23]. Στην πραγματικότητα, ένα ενιαίο ογκογονίδιο (miRNA-145) έχει αποδειχθεί να επαναπρογραμματίσει πρωτογενή κύτταρα για να εμφανιστεί ένα φαινότυπο ΚΕΠ [24]. Έτσι, ο προσδιορισμός των κοινών και μοναδικά πρότυπα έκφρασης των miRNAs μεταξύ HCSCs και HNSCs είναι απαραίτητη.

Σε αυτή τη μελέτη, εφαρμόσαμε ανάλυση SP σε δύο διαφορετικούς πληθυσμούς των πρωτογενών καλλιεργημένων επιθηλιακών κυττάρων. Ένας τύπος κυττάρου που απομονώνονται από ιστούς HCC αρουραίου που επάγεται από diethylinitrosamine (DEN) και ο άλλος τύπος κυττάρου απομονώθηκε από ήπαρ αρουραίου συγγενικά ιστούς. Side πληθυσμών από φυσιολογικά ηπατικά κύτταρα (SP-NLCS) και από την ΕΑΣ (SP-ΕΑΣ) εκφράζεται έντονα δείκτες βλαστικών κυττάρων.

In vitro

, και τα δύο κύτταρα SP είχαν υψηλές ικανότητες για να πολλαπλασιαστούν και θα μπορούσαν να διαφοροποιηθούν σε ώριμα κύτταρα μετά από επαγωγή με αυξητικό παράγοντα ηπατοκυττάρων (HGF).

In vivo

, SP-NLCS θα μπορούσε να βοηθήσει σε μεγάλο βαθμό στην επισκευή ένα τραυματισμένο ήπαρ του αρουραίου. Σε αντίθεση, SP-HCCs μπορούσε να κινήσει όγκους τόσο σε υποδόρια και ήπαρ ιστούς μη-παχύσαρκα διαβητικά /σοβαρή συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια ποντικούς (NOD /SCID). Υποθέτοντας ότι αυτές οι διαφορές που σχετίζονται με τις πολύ διαφορετικές μορφές έκφρασης των miRNAs μεταξύ αυτών των δύο κυτταρικών πληθυσμών, εξετάσαμε τα προφίλ miRNA της SP-NLCS και SP-ΕΑΣ. Επειδή οι HCSCs προτείνεται να HCC έναρξη κύτταρα, εντοπίζοντας τις διαφορές μεταξύ SP-ΕΑΣ και SP-NLCS, συμπεριλαμβανομένων απελευθερωθεί miRNAs, μπορεί να βοηθήσει σημαντικά στην κατανόηση της γένεσης της HCSCs και την ογκογένεση του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος.

Υλικά και Μέθοδοι

1. Συλλογή Δείγματος

Τριάντα αρσενικό Fisher 344 αρουραίους (από το Εθνικό Εργαστήριο Τρωκτικό Πόρων ζώων, Σαγκάη, Κίνα) χωρίστηκαν τυχαία σε ομάδες ελέγχου και δοκιμών. Οι αρουραίοι της ομάδας δοκιμής υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 0,05% DEN (Sigma Οο, USA) στο πόσιμο νερό τους για 6 εβδομάδες και στη συνέχεια άλλαξαν σε κανονική πόσιμο νερό [25], ενώ οι αρουραίοι της ομάδας ελέγχου δόθηκε μια κανονική δίαιτα. Τρεις αρουραίοι από κάθε ομάδα θυσιάστηκαν κάτω από αναισθησία σε 2, 6, 10, 14 και 18 εβδομάδες μετά την επαγωγή DEN. Και οι δύο οζίδια HCC από τη δίκη ομάδα και φυσιολογικά ήπατα από την ομάδα ελέγχου συλλέχθηκαν. Τμήματα αυτών των ιστών μονιμοποιήθηκαν σε 10% ουδέτερη φορμαλίνη ρυθμισμένου με φωσφορικό και συνήθως υποβάλλονται σε επεξεργασία και χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε) για ιστολογική εξέταση. Τα υπόλοιπα ιστοί χρησιμοποιήθηκαν άμεσα στα πειράματα που περιγράφονται παρακάτω. Όλα τα πειράματα σε ζώα διεξήχθησαν σύμφωνα με τα πρωτόκολλα μελέτης των ζώων [26] και εγκρίθηκε από την Επιτροπή Φροντίδας και Χρήσης Έρευνας Ζώων στην τέταρτη Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο. Ο αριθμός πρωτοκόλλου ζώο ήταν SYXK2008-005.

2. Απομόνωση και καλλιέργεια κυττάρων

Ηπατική καρκινικά κύτταρα (ΕΑΣ) απομονώθηκαν σύμφωνα με Hohne et al. [27] με μικρές τροποποιήσεις, και φυσιολογικά κύτταρα ήπατος (NLCS) απομονώθηκαν σύμφωνα με Oertel et al. [28]. Τόσο HCC και φυσιολογικό ήπαρ (NL) ιστοί κιμά σε τροποποιημένο μέσο Eagle του Dulbecco (DMEM) (Invitrogen Οο, USA) με 0,1% κολλαγενάση τύπου IV και 0.005% θρυψίνη (Sigma Οο, USA) και στη συνέχεια επωάστηκαν για 20 λεπτά στους 37 ° C σε ανακινούμενο υδατόλουτρο. Μετά την επώαση, τα υπερκείμενα που περιέχουν τα απελευθερωμένα κύτταρα διήλθαν μέσα από ένα νάιλον πλέγμα 100 μm και φυγοκεντρήθηκε στα 1000 χ g για 8 λεπτά. Τα σφαιρίδια πλύθηκαν δύο φορές με φωσφορικό-ισορροπημένο αλατούχο διάλυμα (PBS) (Invitrogen Οο, USA), και εναιωρήματα μονών κυττάρων συλλέχθηκαν. Το NL απλό κυτταρικό αιώρημα φυγοκεντρήθηκε για 5 λεπτά στα 100 χ g σε ϋΜΕΜ, και συλλέχθηκε το υπερκείμενο. Μία βαθμίδωση Percoll (Invitrogen Οο, USA) παρασκευάστηκε σε ένα σωλήνα των 50 ml με διαδοχική επίστρωση 10 ml 70%, 50% και 30% Percoll. Προστέθηκε ένα σύνολο 20 κ.εκ. NLCS σε PBS, και ο σωλήνας φυγοκεντρείται στα 1000 χ g για 10 λεπτά. Το κλάσμα των κυττάρων στη διεπαφή μεταξύ 30% και 50% Percoll συλλέχθηκε. Αμφότερες NLCS και HCCs καλλιεργήθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων που περιέχουν του William Ε Medium (Sigma Οο, USA) συμπληρωμένο με 10% ο /ο βόειο εμβρυϊκό ορό (Invitrogen Οο, Η.Π.Α.), 5 μg /ml ινσουλίνη (Sigma Οο, USA), 5 μΜ υδροκορτιζόνη, 100 U /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη σε 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2. Προσκολλημένα κύτταρα πολλαπλασιάστηκαν και επεκτάθηκαν ως αποικία μονοστιβάδα μετά από 20 ημέρες σε καλλιέργεια. Συλλέξαμε το μονοκλωνικό κυττάρων πληθυσμού από τις τοπικές πέψη με κλωνοποίηση κυλίνδρους και να μεταφερθούν τα κύτταρα σε ένα νέο δίσκο καλλιέργειας για να συνεχιστεί η διαδικασία καλλιέργειας.

3. SP διαλογή κυττάρων

Τα κύτταρα διαιρούνται σε δύο μέρη: το ήμισυ χρησιμοποιήθηκε απευθείας ως εικονική ταξινομούνται πληθυσμού (SSP), ενώ το άλλο ήμισυ χρησιμοποιήθηκε για διαλογή κυττάρων σε ένα διαλογέα κυττάρου FACS Vantage II (Becton Dickinson Οο , ΗΠΑ). Οι ακόλουθες πληροφορίες περιγράφουν το πρωτόκολλο απομόνωσης μας. Τα κύτταρα σημάνθηκαν με χρωστική Hoechst 33342 (Sigma Οο, USA) σε μια τελική συγκέντρωση 4 mg /ml παρουσία ή απουσία 50 μΜ βεραπαμίλη (Sigma Οο, USA) και επωάστηκαν στους 37 ° C για 90 λεπτά σύμφωνα με τις μεθόδους περιγράφεται από Goodell et al. [11]. Τα βαμμένα κύτταρα πλύθηκαν με παγωμένο PBS που περιείχε 2% αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) και 10 mM HEPES, φυγοκεντρήθηκε στους 4 ° C και επαναιωρήθηκε στο ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα. Ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) (Sigma Οο, USA) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση της βιωσιμότητας των κυττάρων. Hoechst 33342 ήταν ενθουσιασμένος στα 355 nm και φθορισμού της αναλύθηκε σε δύο μήκη κύματος: Hoechst 33342 μπλε στα 450 nm και η Hoechst 33342 κόκκινο στα 675 nm. Ένα δεύτερο λέιζερ αργού στα 488 nm (100 mW) χρησιμοποιήθηκε για να διεγείρει φθορισμός ΡΙ για τον αποκλεισμό των νεκρών κυττάρων. κύτταρα SP έδειξαν χαμηλή χρώση με κύτταρα μη πλευράς πληθυσμού (NSP), Hoechst και έγιναν πιο έντονα χρωματισμένο.

4. Η ανάπτυξη των κυττάρων τεστ

Αυτό το πείραμα χρησιμοποιείται για να αξιολογήσει την πολλαπλασιαστική ικανότητα των κυττάρων από κάθε υποπληθυσμό, συμπεριλαμβανομένων των SP, NSP και SSP. Τα κύτταρα σε κάθε υποπληθυσμό ρυθμίστηκαν σε 2 × 10

6 /ml και σπείρονται σε 32 φιάλες (0.5 × 10

5 κύτταρα ανά φιάλη). Το μέσο καλλιέργειας συμπληρώθηκε με παράγοντα αναστολής λευχαιμίας (LIF) σε συγκέντρωση 10 μg /ml. Κάθε μέρα κατά τη διάρκεια μιας περιόδου 7 ημερών, 4 παράλληλα κυτταρικά δείγματα από κάθε υποπληθυσμό θρυψινοποιήθηκαν και μετρήθηκαν υπό ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο (BX50-32E01, Όλυμπος, Tokyo, Japan).

5. Ανίχνευση των δεικτών των βλαστικών κυττάρων με φθορίζουσα ενεργοποιημένα κύτταρα (FACS)

Η έκφραση των δεικτών των βλαστικών κυττάρων αναλύθηκε με ένα σύστημα FACSCaliburTM (BD Immunocytometry Systems, San Jose, CA) και στα δύο πρόσφατα απομονωμένα υποπληθυσμών και ενισχύονται υποπληθυσμών. Εν συντομία, τα κύτταρα επωάστηκαν σε Γουίλιαμ Ε Medium (που περιέχει 20% FBS) στους 10

6 κύτταρα /ml για 15-30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου για να εμποδίσει μη ειδικές θέσεις για τη δέσμευση του αντισώματος. Τα κύτταρα από διαφορετικούς υποπληθυσμούς πλύθηκαν δύο φορές με PBS και επανα-εναιωρήθηκαν σε 990 μΙ PBS. Ακολούθως, 10 μΐ αντισωμάτων, συμπεριλαμβανομένων CD133 (ΡΕ συζευγμένο, Biolegend, USA) και EpCAM (ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) συζευγμένο, Biolegend, USA), προστέθηκαν σε κάθε εναιώρημα κυττάρων. Μετά από 30 λεπτά επώασης στους 4 ° C στο σκοτάδι, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS, σταθεροποιήθηκαν σε 0,1% φορμαλδεΰδη και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής.

6. επαγωγή κυττάρων με HGF

Τα κύτταρα από κάθε υποπληθυσμό καλλιεργήθηκαν σε επαγωγή των μέσων ενημέρωσης, η οποία ήταν εμπορικό ελεύθερο ορού μέσο (Sigma Οο, USA) συμπληρωμένο με HGF (20 ng /ml). Η διαφοροποίηση των κυττάρων εκτιμήθηκε με ανίχνευση της έκφρασης του ήπατος-ειδικούς δείκτες όπως περιγράφεται κατωτέρω.

7. Ανίχνευση των δεικτών του ήπατος με ανοσοφθορισμό (IF)

Μετά την επαγωγή από HGF, ΕΑΝ διεξήχθη σε ποιοτικά αξιολογηθεί κατά πόσον τα επαγόμενα κύτταρα εξέφρασαν ειδικούς δείκτες του ήπατος. Για τον εντοπισμό αμφίδρομη διαφοροποίηση των διαφόρων πληθυσμών στο NLCS (SP-NLCS, NSP-NLCS και SSP-NLCS), επιλέγονται δύο συγκεκριμένα πρωτογενή δείκτες ήταν: ο ώριμος ηπατική λευκωματίνη δείκτη (ALB) (αραίωση 1:200? Santa Cruz, CA) και η χολική δείκτη κυτοκίνη 7 (CK-7) (αραίωση 1:200? Santa Cruz, CA). Να προσδιορίσει την ωρίμανση των διαφορετικών πληθυσμών στην ΕΑΣ (SP-HCCs, NSP-ΕΑΣ και SSP-ΕΑΣ), οι δείκτες όγκου άλφα εμβρυϊκής πρωτεΐνης (AFP) (αραίωση 1:200? Santa Cruz, CA) και CK-19 (αραίωση 1:200 ? επιλέχθηκαν Santa Cruz, CA). Εν συντομία, με αφαιρείται το μέσο καλλιέργειας, τα κύτταρα του φορείου καλλιέργειας ξεπλύθηκαν δύο φορές με PBS, μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη για 20 λεπτά και στη συνέχεια εμβαπτίζονται σε PBS για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από έκθεση σε 0.01% Triton Χ-100 σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά. Για τον αποκλεισμό μη ειδικών ανοσολογικών αντιδράσεων, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ορό αιγός 6% (Santa Cruz, CA) σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε κάθε διαφάνεια υποβλήθηκαν σε πρωτογενή αντισώματα στους 4 ° C όλη τη νύκτα και πλύθηκαν τρεις φορές με ψυχρό PBS. Το δευτερεύον αντίσωμα φθορισμού FITC-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας αντι-κουνελιού (αραίωση 1:100? Santa Cruz, CA) προστέθηκε και επωάστηκε για 2 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 2- (4-αμιδινοφαινυλ) διυδροχλωρίδιο -6-indolecarbamidine (DAPI) (αραίωση 1:100? Sigma) για 15 λεπτά. Ο φθορισμός παρατηρήθηκε μέσω ενός κατάλληλου φίλτρου χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού (FV1000MPE, Όλυμπος Co, Tokyo, Japan).

8. Ανίχνευση των δεικτών του ήπατος με κηλίδωση Western

Μετά την επαγωγή με HGF, κηλίδωση Western Διεξήχθη την ποσοτική ανίχνευση ειδικών δεικτών του ήπατος στα επαγόμενα κύτταρα. ALB και CK-7 εξετάστηκαν σε SP-NLCS, NSP-NLCS και SSP-NLCS? AFP και CK-19 αναλύθηκαν σε SP-HCCs, NSP-ΕΑΣ και SSP-ΕΑΣ. Τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό εκχύλισης ολικού κυττάρου (ρυθμιστικό διάλυμα RIPA) που περιέχει ένα δισκίο αναστολέα πρωτεάσης κοκτέιλ (Complete Mini-, Roche Diagnostics, Mannheim, Germany). Τα ομογενοποιήματα φυγοκεντρήθηκαν στα 3000 χ g για 20 λεπτά στους 4 ° C και τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν. Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν σε 12% πηκτή SDS-πολυακρυλαμιδίου και μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη Immobilon-P PVDF (φθοριούχο πολυβινυλιδένιο) (Millipore, Billerica, ΜΑ, USA). Τα στυπώματα κορεσμένο με ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού (5% αποβουτυρωμένο γάλα σε ΤΒδ-Τ) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με μονοκλωνικά αντισώματα αντι-ανθρώπινης κουνελιού /αρουραίο /ποντίκι (1:600? Santa Cruz Biotechnology , Inc., Santa Cruz, CA) και ένα αφυδρογονάση 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης (GAPDH) αντίσωμα (1:600? Sigma, Saint Louis, ΜΟ). Μετά πλύθηκαν σε TBS-Τ, οι μεμβράνες επωάστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου με IgG HRP-κατσίκας αντι-κουνελιού (1:2000? Perkin Elmer, Inc., Waltham, ΜΑ). Η ανίχνευση των πρωτεϊνών πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα σύστημα ECL (Cell Signaling Technology, Beverly, ΜΑ, USA). Οι αποχρώσεις του γκρι τιμές της κάθε ζώνης για τις κηλίδες μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας BandScan4.3.

9. μοντέλο τραυματισμού του ήπατος και μεταμόσχευση κυττάρων

SP-NLCS και NSP-NLCS είχαν ανεξάρτητα πλύθηκαν με PBS στο σκοτάδι και επαναιωρήθηκε σε 2 ml διαλύματος χρώσης για την επισήμανση της κυτταρικής μεμβράνης με κόκκινο φθορισμό σε 37 ° C, σύμφωνα με το πρωτόκολλο που παρέχεται με το ΡΚΗ26 κόκκινη φθορίζουσα κιτ κύτταρο συνδετήρα (Sigma Corp., USA). Ορός μέσα που περιέχουν προστέθηκε στο διάλυμα χρώσης για να τερματίσει τη χρώση 5 λεπτά αργότερα. Χρωματισμένα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με PBS και αιωρήθηκαν σε 0.5 ml PBS για μεταμόσχευση. Για την πρόκληση ηπατικής βλάβης, 20 φυσιολογικούς αρουραίους F344 (10 για την SP-NLCS μεταμόσχευση, 10 για έγχυση NSP-NLCS) χορηγήθηκαν CCl

4 ενδοπεριτοναϊκώς σε δόση 1,2 ml /kg βάρους σώματος και έλαβε δύο τρίτα μερική ηπατεκτομή (2/3 PH) τρεις ημέρες αργότερα. Αμέσως μετά PH, τα προετοιμασμένα κύτταρα (5 × 10

5 κύτταρα ανά αρουραίο) ξεχωριστά εγχύθηκαν εντός αυτών των αρουραίων μέσω της πυλαίας φλέβας.

Για κάθε συκώτι, κόβουμε τυχαία τέσσερα κατεψυγμένα τμήματα. Για να αξιολογηθούν τα αποτελέσματα του αποικισμού της SP-NLCS και NSP-NLCS, οι αποκατασταθούν τμήματα του ήπατος παρατηρήθηκαν με ανεστραμμένο μικροσκόπιο. Όταν παρατηρήθηκαν κόκκινες περιοχές στα τμήματα, το αποτέλεσμα ταυτοποιήθηκε ως θετική. Κάτω από κάθε οπτικό πεδίο, οι θετικές περιοχές μετρήθηκαν, και το ποσοστό του θετικού περιοχής σε σχέση με το σύνολο της περιοχής υπολογίστηκε. Ένα τοις εκατό από κόκκινη περιοχή του & lt? 5% ορίστηκε ως αρνητικό (-), 5-25% ως θετικό (+), 25-50% ως μετρίως θετική (++) και & gt? 50% ως έντονα θετική (++ +).

10. πειράματα NOD /SCID με μεταμόσχευση ξενομοσχευμάτων

διαφορετικοί αριθμοί (1 × 10

7, 1 × 10

6, 1 × 10

5 και 1 × 10

4) της SP- HCCs ή NSP-HCCs εγχύθηκαν σε ποντίκια NOD /SCID με υποδόρια ένεση. Κάθε ομάδα περιείχε 4 ποντικών? Έτσι, 32 ποντίκια χρησιμοποιήθηκαν για ξενομεταμόσχευση. Κάθε Mouce έγιναν με 4 ενέσεις, συμμετρικά 2 ενέσεις στο αριστερό πίσω και 2 ενέσεις στο δεξί πίσω. Η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε κάθε 2 ημέρες μετά τη δεύτερη εβδομάδα του εμβολιασμού. Όλοι οι ποντικοί θυσιάστηκαν κατά την ημέρα 60. όλους τους ιστούς όγκων συλλέχθηκαν, μονιμοποιήθηκαν σε 4% φορμαλδεΰδη, και ενσωματωμένα σε παραφίνη για την H & amp? Χρώση Ε για την αξιολόγηση ιστολογία του όγκου. Όλα τα αποτελέσματα κρίθηκαν από τρεις διαφορετικούς ερευνητές ανεξάρτητα. Έχουμε συνοψίζονται τα δεδομένα και υπολογίζεται η μέση διάμετρος των όγκων σε κάθε ομάδα (όπως 1 × 10

7 ομάδα SP-HCCs). Σύμφωνα με το μέσο μέγεθος των όγκων, που χωρίστηκαν σε τέσσερις διαφορετικές κατηγορίες: Βαθμός 1 (-), χωρίς μακροσκοπική όγκου? βαθμού 2 (+), η διάμετρος του όγκου & lt? 0,2 εκατοστά? βαθμού 3 (++), 0.2-0.5 cm? Βαθμός 4 (+++), & gt?. 0,5 εκατοστά

11. Η έκφραση των miRNAs σε κύτταρα SP

Σύνολο RNAs ελήφθησαν τόσο από SP-NLCS και SP-ΕΑΣ από την Totally RNA kit απομόνωσης (Ambion, Austin, TX). Η ποιότητα και η ποσότητα των συνολικών RNAs ελέγχθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 1.5% και υπεριώδη ποσοτικοποίηση. Τα προφίλ έκφρασης των miRNAs στη συνέχεια ανιχνεύεται από τον miRCURY LNA ™ (κλειδωμένο νουκλεϊκό οξύ) microRNA Συστοιχίες Kit (Exiqon Co, Denmark), η οποία καλύπτει όλα τα ανθρώπινα, ποντικού και miRNA αντινόημα αλληλουχίες αρουραίου. Επιπλέον, το κιτ ενσωματώνονται επίσης 144 ανιχνευτές miRPlus ™, οι οποίες παρέχονται από Exiqon Corporation για τα νέα ανίχνευση miRNA. Ένα μικρογραμμάριο RNA από SP-HCCs, SP-NLCS και πισίνες αναφοράς συν-υβριδοποιήθηκαν επί του Array Exiqon miRNA για 16 ώρες στους 56 ° C. Μετά την επώαση με Cy3-επισημασμένο δενδριμερή (Genisphere Inc, Hatfield, ΡΑ) [29], οι μικροσυστοιχίες πλύθηκαν διαδοχικά με ρυθμιστικά διαλύματα πλύσης Α, Β και C. Η σήματα φθορισμού επί του υβριδισμένου συστοιχία συλλήφθηκαν από έναν σαρωτή GenePix 4000B και ποσοτικά με τη χρήση GenePix Pro4.0 (Αχοη Instruments, Burlingame, CA). χειραγώγηση των δεδομένων διευκολύνθηκε με ομαλοποίηση Σουίτα v1.63 (Ινστιτούτο Οντάριο Καρκίνου, Τορόντο, Καναδάς) [30]. Η δοκιμή για την αναλογία αναφοράς για κάθε miRNA ήταν κατά μέσο όρο από το τριπλούν σημεία και μεταξύ των επαναληπτικών πειραμάτων. Αναλογίες μεγαλύτερη ή μικρότερη από δύο φορές θεωρήθηκαν ότι είναι up-ρύθμιση ή κάτω-ρυθμίζονται, αντίστοιχα.

Δύο εξαιρετικά up-ρυθμίζονται miRNAs, τρεις ελαφρά επάνω ρυθμισμένη miRNAs, ένα μεγάλο βαθμό κάτω-ρυθμίζονται miRNA και ένα μέτρια επιλεγεί κάτω-ρυθμίζονται miRNA είχαν ως εκπρόσωπος miRNAs να επικυρωθεί από ποσοτική σε πραγματικό χρόνο αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (QRT-PCR). Ολικά RNAs μεταγραφεί αντίστροφα με MultiScribe (Applied Biosystems) σε μίγματα αντίδρασης που περιέχουν miR-ειδική stem-loop αντίστροφης μεταγραφής (RT) εκκινητές (Πίνακας 1). Οι εκκινητές PCR που παρατίθενται στον Πίνακα 1, και οι παράμετροι του κύκλου για την αντίδραση PCR ήταν 95 ° C για 15 λεπτά που ακολουθείται από 40 κύκλους ένα στάδιο μετουσίωσης στους 95 ° C για 15 δευτερόλεπτα και ένα στάδιο ανόπτησης /επέκτασης στους 60 ° C για 60 sec. Ολες οι αντιδράσεις έτρεξαν εις τριπλούν. Η σχετική ποσότητα του κάθε miRNA στην U6 του RNA που περιγράφεται από την εξίσωση ΔΟ

T = (C

TmiRNA-C

Τυ6) [31]. Η φορές αλλαγή στην miRNAs από SP-ΕΑΣ σε σύγκριση με την SP-NLCS εμφανίζονται χρησιμοποιώντας την εξίσωση 2

-ΔΔCT, όπου ΔΔC

T = (ΔΟ

T SP-ΕΑΣ-ΔΟ

T SP- NLCS).

Η

12. Στόχοι της απελευθερωμένης miRNAs

12.1. . Πρόβλεψη των πιθανών στόχων για απελευθερωμένης miRNAs

Οι πιθανοί στόχοι για τις απελευθερωμένες miRNAs που βρέθηκαν από τις παραπάνω μεθόδους είχαν προβλεφθεί από δύο διαθέσιμες στο κοινό αλγόριθμους, συμπεριλαμβανομένων MiRBase Στόχοι έκδοση 5 (διατίθεται στη διεύθυνση: http: //microrna.sanger .ac.uk /) και Targetscan έκδοση 4.2 (https://www.targetscan.org/).

12.2 Προσδιορισμός των στόχων από ημι-ποσοτική πραγματικό χρόνο αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (sqrt-PCR).

Είμαστε συνόψισε τα αποδεδειγμένη στόχους επτά επικυρωθεί απελευθερωμένης miRNAs. Μεταξύ αυτών των στόχων, οι miR-200a γονίδια * στόχο ZEB1 και ZEB2 [32], [33] αναλύθηκαν τόσο SP-ΕΑΣ και SP-NLCS από sqrt-PCR. Ολικό RNA εξήχθη από κύτταρα χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Molecular Research Center, Cincinnati, ΟΗ), και αντίστροφη μεταγραφή σε cDNA με SuperScript II αντίστροφης μεταγραφάσης σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Invitrogen, Carlsbad, CA). Ίσες ποσότητες cDNA από αυτά τα δύο δείγματα ενισχύθηκαν με τους ακόλουθους ειδικούς εκκινητές: ZEB1 (Sense 5′- AAGAAAGTGTTACAGATGCAGCTG-3 ‘, 5′-Antisense CCCTGGTAACACTGTCTGGTC-3′)? και ZEB2 (Sense 5’-ATACCAGCGGAAACAAGGATTTCA-3 ‘, 5′-Antisense CAGGAATCGGAGTCTGTCAAGTCA-3’). Ο αριθμός των κύκλων της PCR ήταν 35. Ο κάθε κύκλος αποτελείτο από στάδιο μετουσίωσης στους 95 ° C για 30 s, εκκινητήρας σταδίου συγκολλήσεως στους 65 ° C για 30 s και στάδιο επέκτασης στους 72 ° C για 45 s. Τα προϊόντα της PCR αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 1.5% που βάφτηκε με βρωμιούχο αιθίδιο.

13. Στατιστικές αναλύσεις

Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα από τουλάχιστον τρία ξεχωριστά πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων αναλύθηκαν με έκδοση λογισμικού SAM 3.0 χρησιμοποιώντας ένα μαθητή διπλής όψης

t-test

όταν μόνο δύο ομάδες ήταν παρόντες, και η μηδενική υπόθεση απορρίφθηκε στο επίπεδο 0.05.

Αποτελέσματα

1. Οι ιστοί προετοιμασία και κυτταρικής καλλιέργειας

NL ιστούς που λαμβάνονται από την ομάδα ελέγχου ήταν έντονο κόκκινο και εμφανίζεται λείες επιφάνειες (Σχήμα 1Α-i). Όταν αυτά τα ήπατα κόπηκαν σε λεπτές τομές, εντελώς φυσιολογικό ιστό ήπατος αποκαλύφθηκε (Σχήμα 1Α-ϋ). Κατά την H & amp? Χρώση Ε, τα λόβια του ήπατος παρατηρήθηκαν να είναι σε καλή κατάσταση (Σχήμα 1Α-III). Μικρές NLCS επιλέχθηκαν με φυγοκέντρηση Percoll ασυνεχή κλίση (PDGC) και καλλιεργήθηκαν. NLCS σχηματίζονται κλώνοι μετά από περίπου 8 ημέρες καλλιέργειας (Σχήμα 1Α-IV). Μετά από καλλιέργεια για 15 ημέρες, αυτά τα μικρά κύτταρα καλύπτονται περίπου το 65% της πλάκας (Σχήμα 1Α-ν). Μετά από 25 ημέρες, αυτά τα κύτταρα ομοιογενές σχεδόν πλήρως καλυμμένο τις πλάκες (Σχήμα 1Α-VI).

(Ai) Μορφολογία συκώτια στην ομάδα θεραπείας μη-DEN, (Α-ΙΙ) λεπτής φέτες τμήματα αποκαλύπτουν εντελώς φυσιολογικό ιστό του ήπατος, (Α-ΙΙΙ) ιστολογικά χαρακτηριστικά του φυσιολογικό ήπαρ με μια κανονική δομή. Πρωτογενή καλλιεργημένα NLCS για (Α-IV) από 4 ημέρες, (Α-ν) από 15 ημέρες και 25 ημέρες (Α-VI). Μεσαίο πάνελ: πρωτοβάθμια HCC διαχωρισμό των ιστών και καλλιέργεια κυττάρων. (Bi) Πολλαπλές πρωτογενή οζίδια HCC στο ήπαρ του αρουραίου, ένα από τα οποία υποδεικνύεται από ένα βέλος, (Β-ΙΙ) Μεταστατικό HCC οζίδια στους πνεύμονες αρουραίων, τα οποία υποδεικνύονται από τα βέλη, (Β-ΙΙΙ) ιστολογικά χαρακτηριστικά του μεταστατικού HCC ιστού , στο οποίο η κανονική λόβια πνεύμονα αντικαταστάθηκαν με μάζες καρκίνωμα? Πρωτογενή καλλιεργημένα κύτταρα HCC για το (Β-iv) 4 ημέρες, (Β-v) 15 ημέρες, και (Β-vi) 30 ημέρες. Κάτω πίνακας: η απομόνωση των διαφορετικών υποπληθυσμών. (C-Ι) χωρίς βεραπαμίλη: κύτταρα SP δείχθηκαν ως ποσοστό των NLCS? (C-ii) με βεραπαμίλη: το προφίλ των κυττάρων SP μειωθεί σημαντικά. (C-iii) Χωρίς βεραπαμίλη: κύτταρα SP έδειξαν με χαμηλό φθορισμό στην ΕΑΣ? (C-IV) με βεραπαμίλη: φθορισμός του κλάσματος κυττάρων SP μετατοπίζεται σε ένα υψηλότερο επίπεδο. (C-V) Τα ποσοστά των κυττάρων SP σε διαφορετικές ομάδες αντανακλάται σε ένα γράφημα στηλών. Αρχική μεγέθυνση, 200 × (Α, Β-ΙΙΙ), 100 × (Α, Β-IV, V, VI).

Η

Μικρές όγκοι βρέθηκαν για πρώτη φορά σε αρουραίους θυσιάστηκαν 8 εβδομάδες μετά την επαγωγή DEN. Μετά από άλλες 10 εβδομάδες, τα δύο τρίτα των συκωτιών περιέχονται καρκινικούς ιστούς με τραχιές επιφάνειες (Σχήμα 1Β-i). Βρήκαμε επίσης πολυάριθμες μεταστατικών οζιδίων καρκίνο στους πνεύμονες (Εικόνα 1Β-ΙΙ). Τρεις διαφορετικές παθολόγοι αξιολόγησε το Η &? Χρώση Ε και επαλήθευσε ότι αυτά τα νεοπλάσματα ήταν όλοι ηπατικής προέλευσης (Σχήμα 1Β-III). Τα κύτταρα που απομονώνονται από τους πρωτογενείς ιστούς HCC αυξήθηκε αργά στην αρχή με λίγες μόνο κλώνοι που σχηματίζεται (Σχήμα 1Β-IV). Μετά από 15 ημέρες, τα κύτταρα πολλαπλασιάστηκαν ταχέως και καλύπτονται το 60% κάθε πλάκας (Σχήμα 1 Β-ν). Ένα μήνα αργότερα, τα κύτταρα αυτά καλύπτονται πλήρως τις πλάκες (Σχήμα 1Β-vi).

2. Απομόνωση κυττάρων SP με FACS

Στην ομάδα NLCS, το ποσοστό των κυττάρων SP ήταν 4,300% ± 0,011% (Σχήμα 1 C-i). Όταν αποκλεισμός της χρωστικής αναστάλθηκε από verapamil στην ομάδα ελέγχου, τα κύτταρα SP ήταν σχεδόν ταυτόσημη με το υπόλοιπο των κυττάρων (Σχήμα 1C-ΙΙ). Το ποσοστό των κυττάρων SP στην ομάδα HCCs ήταν 2,100% ± 0,010% (Σχήμα 1 C-III). Όταν ο αποκλεισμός της χρωστικής ανεστάλη με βεραπαμίλη, αυτά τα κύτταρα SP επίσης δεν μπορούσε να διακριθεί από τους ελέγχους τους (Σχήμα 1C-IV). Το προφίλ των κυττάρων SP στο NLCS ήταν σημαντικά υψηλότερη από ότι στην ΕΑΣ (

P

& lt? 0,05). (Εικόνα 1 C-v)

3. Αυτο-ανανέωση των κυττάρων SP

Δύο βασικά χαρακτηριστικά είναι τα χαρακτηριστικά των βλαστικών κυττάρων: αυτο-ανανέωση και πολυδυναμικότητα. Για αυτο-ανανέωση, SP-ΕΑΣ πολλαπλασιαστεί ο πιο γρήγορος κατά τη διάρκεια 7 ημερών καλλιέργειας, που ακολουθείται από SP-NLCS, SSP-HCCs, SSP-NLCS και NSP-ΕΑΣ (η οποία πολλαπλασιάστηκε ομοίως), και, τέλος, το NSP-NLCS (Εικόνα 2Α ). Σε γενικές γραμμές, τα κύτταρα SP πολλαπλασιαστεί πολύ πιο γρήγορα από ό, τι τα δύο κύτταρα NSP και τα κύτταρα SSP (

P

& lt? 0.01), και ΕΑΣ πολλαπλασιαστεί λίγο πιο γρήγορα από ό, τι NLCS. Επειδή ο αρχικός αριθμός κάθε κυτταρικού πληθυσμού ήταν η ίδια, εντελώς διαφορετικούς αριθμούς κυττάρων ήταν παρόντες σε κάθε ομάδα στο τέλος της περιόδου καλλιέργειας (Σχήμα 2Β). κύτταρα SP (Σχήμα 2Β-i, iv) βρέθηκαν να είναι πιο ομοιογενή και πολύ μικρότερα σε μέγεθος από τα δύο κύτταρα NSP (Σχήμα 2Β-II, V) και κύτταρα SSP (Σχήμα 2Β-III, VI) (

P

& lt? 0,01). Ωστόσο, δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές μορφολογικές διαφορές μεταξύ SP-NLCS (Σχήμα 2Β-i) και SP-HCCs (Σχήμα 2Β-IV). Έτσι, αυτές οι δύο πληθυσμοί δεν μπορούσαν να διακριθούν από το άλλο κάτω από ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο. Καμπύλη

(Α) Η ανάπτυξη των κυττάρων επί 7 ημέρες καλλιέργειας. (Β) Μετά την ενίσχυση, διακριτές κυτταρικές πυκνότητες παρατηρήθηκαν στις διάφορες υποπληθυσμούς. (Γ) Η έκφραση των δεικτών των βλαστικών κυττάρων (CD133 και EpCAM) ήταν διαφορετική σε κάθε προσφάτως απομονώθηκε και ενισχύθηκε υποπληθυσμό με FACS. (Δ) Τα ακριβή στοιχεία αντανακλώνται από ένα γράφημα στηλών. CD133 /EpCAM-Fresh δείχνει την έκφραση του CD133 /EpCAM σε προσφάτως απομονωθεί υποπληθυσμών, και CD133 /EpCAM-ενισχυμένου σημαίνει την έκφραση του CD133 /EpCAM σε ενισχυμένο υποπληθυσμών. Αρχική μεγέθυνση, 100 × (Β).

Η

Στην αρχή του πολιτισμού, τόσο SP-NLCS και SP-ΕΑΣ εκφράζεται περισσότερο από τους δείκτες βλαστικών κυττάρων από NSP-NLCS και NSP-HCCs, αντιστοίχως (

P

& lt? 0,01) (Σχήμα 2C). παρατηρήθηκαν τα ακόλουθα ποσοστά των θετικών κυττάρων σε κάθε υποπληθυσμό: ποσοστά CD133 σε SP-NLCS, NSP-NLCS, SSP-NLCS, SP-HCCs, NSP-ΕΑΣ και SSP-ΕΑΣ ήταν 81,2 ± 7,08, 11,4 ± 1,31, 30,3 ± 3,21 , 86,7 ± 8,32, 12,7 ± 1,39 και 31,6 ± 3,42, αντίστοιχα? ποσοστά EpCAM σε αυτούς τους υποπληθυσμούς ήταν 80,1 ± 8,10, 10,6 ± 1,21, 31,2 ± 3,18, 86,5 ± 3.28, 12.4 ± 1.31 και 32.6 ± 3.67, αντίστοιχα. Στο τέλος της περιόδου καλλιέργειας, SP-NLCS και SP-HCCs ακόμη εκφράζονται περισσότερους από τους σημειωτές βλαστοκυττάρων από NSP-NLCS και NSP-HCCs, αντιστοίχως (

P

& lt? 0,01) (Σχήμα 2D). Επιπλέον, η έκφραση των δεικτών των βλαστικών κυττάρων μειώθηκε πολύ πιο αργά σε κύτταρα SP από ό, τι στις δύο κύτταρα ΣΑΠ και τα κύτταρα NSP (

P

& lt? 0,01). παρατηρήθηκαν τα εξής ποσοστά: τα ποσοστά CD133 σε SP-NLCS, NSP-NLCS, SSP-NLCS, SP-HCCs, NSP-ΕΑΣ και SSP-ΕΑΣ ήταν 78,6 ± 6,98, 3,4 ± 0,33, 20,2 ± 2,03, 80,5 ± 7,86, 3,6 ± 0.30 και 20.7 ± 2.38, αντίστοιχα? ποσοστά ΕρΟΑΜ σε αυτούς τους υποπληθυσμούς ήταν 78,1 ± 7,53, 3,5 ± 0,28, 21,5 ± 2,17, 80,3 ± 8,12, 2,3 ± 0,27 και 20,2 ± 2,28, αντίστοιχα. Κατά την περίοδο πολλαπλασιασμού, τόσο SP-NLCS και SP-HCCs διατήρησε την υψηλή έκφραση των δεικτών των βλαστικών κυττάρων? Αντίθετα, τόσο NSP-NLCS και NSP-ΕΑΣ έχασε σταδιακά την έκφραση των δεικτών των βλαστικών κυττάρων. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι τα κύτταρα SP είναι παρόμοια με τα βλαστικά κύτταρα στην ικανότητα αυτο-ανανέωσή τους.

4. Διαφοροποίηση των κυττάρων SP προκαλείται από HGF in vitro

Υπό τις συνθήκες επαγωγής, κάθε υποπληθυσμό που δημιουργούνται ξεχωριστές αποφύσεις. Επειδή NLCS θα πρέπει να διαφοροποιούνται σε ηπατοκύτταρα ή χολικά επιθηλιακά κύτταρα, έχουμε επιλέξει μία ώριμη ηπατική δείκτη (ALB) και ένα χοληφόρων δείκτη (CK-7) για τον εντοπισμό ώριμων κυττάρων. Οι περισσότεροι SP-NLCS επεκτάθηκε σε φύλλα σφικτά συσκευασμένα κύτταρα που εμφανίζεται τυπική μορφολογία των ηπατοκυττάρων και ταυτοποιήθηκαν ως ALB θετικά κύτταρα (66,9 ± 5,34%). Ένα τμήμα του SP-NLCS διαφοροποιούνται σε CK-7 θετικά κύτταρα (24.6 ± 2.41%) (Σχήμα 3Α). Παρά το γεγονός ότι τόσο NSP-NLCS και SSP-NLCS θα μπορούσε επίσης να δημιουργήσει ALB θετικά κύτταρα, μόνο αρκετά CK-7 θετικά κύτταρα θα μπορούσαν να βρεθούν σε επαγόμενη SSP-NLCS, και δεν CK-7 θετικά κύτταρα βρέθηκαν σε επαγόμενη NSP-NLCS (Εικόνα 3Α) . Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι μόνο SP-NLCS είχε ένα ισχυρό δυναμικό για να διαφοροποιηθούν σε διαφορετικούς τύπους ώριμων κυττάρων. Κηλίδωση Western έδειξε ότι παρόλο που τα κύτταρα που παράγονται από NSP-NLCS εξέφρασε υψηλότερη ALB από τα κύτταρα από SP-NLCS και SSP-NLCS, κόρες του SP-NLCS εκφράζεται πολύ υψηλότερα επίπεδα της CK-7 από τις κόρες του SSP-NLCS και NSP- NLCS (Σχήμα 3C). Ειδικότερα, CK-7 εμφανίζονται σχεδόν καθόλου έκφραση στα κόρες του NSP-NLCS (Σχήμα 3C). Τα δεδομένα αυτά ήταν σύμφωνη με τις παρατηρήσεις ΑΝ.

(Α) Μέσω IF, ALB θετικά κύτταρα (πράσινο, πυρήνες σε μπλε) και CK-7 θετικά κύτταρα (πράσινο, πυρήνες σε μπλε) έχουν διαφορικά που παράγεται από SP- NLCS, NSP-NLCS και SSP-NLCS. Τα ποσοστά των ALB ή CK-7 θετικά κύτταρα φαίνονται σε ένα γράφημα στήλης. (Β) Σε αντίθεση, AFP θετικά κύτταρα θα μπορούσε να βρεθεί μετά SP-HCCs, NSP-ΕΑΣ και την επαγωγή SSP-ΕΑΣ. Τα δεδομένα συνοψίζονται σε ένα γράφημα στήλης.