Αφηρημένο

Για την αναγνώριση κατάλληλων υποψηφίων για την επιθετική θεραπεία όπως ως ριζική προστατεκτομή ή ακτινοθεραπεία εντοπισμένο καρκίνο του προστάτη (PCA), μυθιστόρημα προγνωστική βιολογικών δεικτών του προστάτη επιθετικότητα είναι απαραίτητη. Core2 β-1,6-

Ν

-acetylglucosaminyltransferase-1 (GCNT1) είναι ένα ένζυμο κλειδί που σχηματίζει πυρήνα 2-διακλαδισμένης

O

-γλυκάνες. Η έκφρασή του συσχετίζεται με την πρόοδο διαφόρων καρκίνων. Έχουμε δημιουργήσει ένα μονοκλωνικό αντίσωμα IgG ποντικού (mAb) εναντίον GCNT1 και εξέτασε τη σχέση της έκφρασης GCNT1 στην κλινικοπαθολογοανατομικών ιδιότητα του προστάτη. Παραφίνη-ενσωματωμένες δείγματα προστάτη αναλύθηκαν με ανοσοϊστοχημεία για την έκφραση GCNT1 χρησιμοποιώντας ένα νεοσύστατο ποντίκι αντι-GCNT1 mAb από τους εαυτούς μας. GCNT1 θετικών όγκων έδειξε σημαντικά υψηλότερη Gleason σκοράρει και μεγαλύτερο όγκο του όγκου. Ο αριθμός των GCNT1-θετικών περιπτώσεων ήταν σημαντικά χαμηλότερη στις περιπτώσεις ασθένειας οργανο-περιορίζεται από τις περιπτώσεις του εξωκαψικής επέκτασης. GCNT1-αρνητικούς όγκους συσχετίστηκαν με σημαντικά καλύτερη ειδικού προστατικού αντιγόνου (PSA) -δωρεάν επιβίωση σε σύγκριση με GCNT1 θετικούς όγκους. Η πολυπαραγοντική ανάλυση έδειξε ότι η ανίχνευση της έκφρασης GCNT1 ήταν ένας ανεξάρτητος παράγοντας κινδύνου για την PSA υποτροπής. Ιδρύσαμε νέες μέθοδοι για την ανίχνευση GCNT1 από δείγματα του προστάτη. Ανοσοαποτύπωση χρησιμοποιήθηκε για την εξέταση του ορθού εξέταση (DRE) στα ούρα μετα-ψηφιακή από ασθενείς του προστάτη. Πάνω από το 90% των GCNT1-θετικούς ασθενείς προστάτη με υψηλές συγκεντρώσεις του PSA έδειξε extracapsular επέκταση. Εν κατακλείδι, η έκφραση GCNT1 συνδέει στενά με την επιθετική δυναμικό του προστάτη. Περαιτέρω έρευνα στοχεύει να αναπτύξει την ανίχνευση GCNT1 στην μετα-DRE ούρα ως δείκτης για προστάτη επιθετικότητα

Παράθεση:. Kojima Υ, Yoneyama Τ, Hatakeyama S, Mikami J, Sato Τ, Mori K, et al. (2015) Ανίχνευση Core2 β-1,6-

Ν

-Acetylglucosaminyltransferase στη μετα-δακτυλική εξέταση ούρων είναι ένας αξιόπιστος δείκτης για την εξωκαψική επέκταση του καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 10 (9): e0138520. doi: 10.1371 /journal.pone.0138520

Συντάκτης: Μινγκ Tat Λινγκ, Queensland University of Technology, ΑΥΣΤΡΑΛΙΑ

Ελήφθη: 27, Απριλίου, 2015? Δεκτές: 1 Σεπ, 2015? Δημοσιεύθηκε: 21, Σεπτέμβρη 2015

Αυτό είναι ένα ανοικτό άρθρο πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 δημόσιο τομέα αφοσίωση

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση: Ιαπωνία Εταιρείας για την Προώθηση της Επιστήμης (https://www.jsps.go.jp/), Grant-in-ενισχύσεις για Νέους επιστήμονες (Β) 24.791.631 και Grant-in-ενισχύσεις για την Επιστημονική Έρευνα (C) 15K10569 (YT)? Ιαπωνία Εταιρείας για την Προώθηση της Επιστήμης (https://www.jsps.go.jp/), Grant-in-Ενισχύσεις για την Επιστημονική Έρευνα (Β) 22390301, Grant-in-Ενισχύσεις για την Επιστημονική Έρευνα (Α) 15H02563 και δανειοληπτικής in-ενισχύσεις για Αμφισβήτηση αναγνωριστικής έρευνας 24659708 (CO)? Εθνικό Επιχορηγήσεις Ινστιτούτα Υγείας UO1 CA168924 (MF)? Το Ίδρυμα Έρευνας Suzuki Ουρολογικό, επιχορήγηση για έρευνα το 2014 (ΥΤ). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Συντομογραφίες : DRE, δακτυλική εξέταση? GCNT1, Core2 β-1,6-

Ν

-acetylglucosaminyltransferase-1? HRP, υπεροξειδάση αρμορακίας? mAb, μονοκλωνικό αντίσωμα? Προστάτη, καρκίνο του προστάτη? PSA, προστατικό ειδικό αντιγόνο? RLU, σχετικές μονάδες φωτός

Εισαγωγή

Στις Ηνωμένες Πολιτείες και την Ευρώπη, ο καρκίνος του προστάτη (PCA) είναι η πιο κοινή κακοήθεια στους άνδρες και η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο σχετίζονται [1 , 2]. Η συχνότητα εμφάνισης του προστάτη φέρεται να είναι χαμηλό σε ασιατικές χώρες [3]. Ωστόσο, η επίπτωση της αυξάνεται ταχύτατα στην περιοχή της Ασίας-Ειρηνικού [4]. Μερικά από τα πιο κρίσιμα ζητήματα που σχετίζονται με την PCA σε κλινική πρακτική είναι υπερδιάγνωσης και υπερθεραπεία [5]. Η έλλειψη εξειδίκευσης του αντιγόνου (PSA) ειδικού προστατικού έχει οδηγήσει σε μια συζήτηση σχετικά με τη χρησιμότητα του PSA προσυμπτωματικό έλεγχο του προστάτη [6, 7]. Επιπλέον, περιττή θεραπεία για νωχελικός προστάτη με χαμηλό κακόηθες δυναμικό είναι ένα σημαντικό ζήτημα, όπως επιθετική θεραπεία του προστάτη είναι μερικές φορές που σχετίζονται με ανεπιθύμητες ενέργειες. Μια εναλλακτική τροπικότητα πολλά υποσχόμενη για την πρόληψη υπερθεραπεία είναι ενεργή επιτήρηση [8]. Ωστόσο, η ταυτοποίηση των κατάλληλων ασθενών οι οποίοι είναι καλοί υποψήφιοι για επιθετική θεραπεία συνδέεται με δυσκολίες. Μέχρι σήμερα, δεν υπάρχουν τέλεια εργαλεία για την ακριβή ανίχνευση καλός υποψήφιος για την ενεργό εποπτεία της [9]. Ως εκ τούτου, ο προσδιορισμός και η επικύρωση των βιολογικών δεικτών του προστάτη επιθετικότητα είναι σημαντικά στην πρόληψη του προστάτη υπερθεραπεία.

Η προεγχειρητική επίπεδα PSA ορού και βιοψία Gleason βαθμολογίες είναι συμβατικές και ισχυρό προάγγελοι των βιολογικών αποτελεσμάτων μετά από ριζική προστατεκτομή για την PCA [10, 11] . Για να βελτιωθεί η διαστρωμάτωση του κινδύνου για την PCA υποτροπή μετά την αρχική θεραπεία σε ασθενείς με εντοπισμένο προστάτη, πολλοί ερευνητές έχουν αναζητήσει βιοδείκτες που αντανακλούν την επιθετική δυναμικό του προστάτη [12]. Ωστόσο, η πλειονότητα των βιοδεικτών δεν έχουν επικυρωθεί για να παρέχουν πληροφορίες που είναι πιο χρήσιμο από αυτό που προβλέπεται από τις συμβατικές κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους. Με ένα νέο βιοδείκτη που αντιπροσωπεύει το κακόηθες δυναμικό των προστάτη, πιο ακριβή πρόβλεψη της επανεμφάνισης PSA και η κατάλληλη επιλογή της θεραπείας μπορεί να είναι δυνατή.

Οι δομές υδατανθράκων της κυτταρικής επιφάνειας μεταβάλλεται κατά τη διάρκεια της καρκινογένεσης και παίζουν σημαντικό ρόλο στη μετάσταση του καρκίνου [13, 14 ]. Η παρουσία του σιαλυλ Lewis Χ, το οποίο είναι ένα από τα λειτουργική δομή τερματικό, στην κυτταρική επιφάνεια του καρκίνου του παχέος εντέρου συσχετίζεται θετικά με φτωχή πρόγνωση [15]. Κατά παρόμοιο τρόπο, η υψηλή Gleason στείλει δείγματα καρκίνου του προστάτη που εκφράζονται σιαλυλ Lewis Χ [16]. Διακλάδωση γλυκάνης έχουν αυξηθεί μια λειτουργική δομή τερματικό, και συγγένεια δέσμευσης για συγκεκριμένες λεκτίνες [17]. Σε προηγούμενη μελέτη, μαννοζυλο (άλφα-1,6 -) – γλυκοπρωτεΐνη β -1,6-

Ν

ακετυλο-γλυκοζαμινυλοτρανσφεράση (MGAT5) και Core 2 β -1, 6

N

-acetylglucosaminyltransferase-1 (GCNT1) που σχηματίζεται ΟΙοΝΑο β1,6 διακλάδωσης γλυκάνης αυξημένη επιθετικότητα προστάτη [18, 19].

GCNT1 [20, 21] είναι ένα ένζυμο κλειδί που συνθέτει πυρήνα 2-διακλαδισμένη

O

-γλυκάνες καταλύοντας την μεταφορά του

Ν

-ακετυλογλυκοζαμίνης από ουριδίνη diphosphate-

Ν

-ακετυλογλυκοζαμίνης με β1, 6-σύνδεση με α-

Ν

– ακετυλογαλακτοζαμίνη από έναν πυρήνα 1

O

-γλυκάνη (Σχήμα 1Α). Μια προηγούμενη μελέτη αναλύθηκαν

GCNT1

έκφραση mRNA σε φρέσκα δείγματα ορθοκολικού όγκου και έδειξε ότι η έκφραση του πυρήνα 2-διακλαδισμένη

O

-γλυκάνες συσχετίζεται στενά με την κακοήθη δυναμικό του καρκίνου του παχέος εντέρου [22]. Αυτό ισχύει επίσης για πνευμονική αδενοκαρκίνωμα [23]. Σε ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιώντας πολυκλωνικό αντίσωμα [21], αποδείξαμε ότι η έκφραση GCNT1 είναι στενά συνδεδεμένη με την επιθετική δυναμικό του προστάτη [18], ο καρκίνος των όρχεων [24], και καρκίνου της ουροδόχου κύστης [25]. Σε πρόσφατη μελέτη, ένας πίνακας έκφρασης γονιδίου έδειξαν GCNT1 υπερεκφράστηκε σε ιστό καρκίνου του προστάτη [26]. Ωστόσο, η δημιουργία ενός μονοκλωνικού αντισώματος αντι-GCNT1 είναι απαραίτητη για την περαιτέρω έρευνα, συμπεριλαμβανομένων των μελετών επικύρωσης για να αποσαφηνιστεί η κλινική χρησιμότητα των GCNT1 ως βιοδείκτη.

(Α) βιοσυνθετικών οδών για

O

γλυκάνες. (Β) δείγματα προστάτη επωάστηκαν με αντι-Core 2 β-1,6-

N

-acetylglucosaminyltransferase-1 (GCNT1) μονοκλωνικό αντίσωμα (mAb), που ακολουθείται από ένα υπεροξειδάση (HRP) δευτερογενές αντίσωμα . Αντιχρωματισμός διεξήχθη χρησιμοποιώντας αιματοξυλίνη. GCNT1-θετικά καρκινικά κύτταρα είναι καφέ. (Γ) τις περιόδους επιβίωσης χωρίς αντιγόνο προστάτη-ειδικό συγκρίθηκαν μεταξύ GCNT1-θετικών και GCNT1-αρνητικά δείγματα. Επιβίωση αναλύθηκε χρησιμοποιώντας καμπύλες Kaplan-Meier.

Η

Εδώ, θέσαμε ένα μονοκλωνικό αντίσωμα (mAb) έναντι GCNT1 με ανοσοποίηση ενός ποντικού με GCNT1 συγκεκριμένο πεπτίδιο (S1 File) για να αξιολογήσει τις δυνατότητες του τελευταίου ως δείκτης της PCa επιθετικότητας. Στην παρούσα μελέτη, αποδείξαμε ότι η αντι-GCNT1 mAb έδειξαν υψηλή ειδικότητα έναντι του ανθρώπινου GCNT1 και ότι η έκφραση GCNT1 σε δείγματα προστάτη από ριζική προστατεκτομή συσχετίζεται με προστάτη επιθετικότητα. Επιπλέον, η ανίχνευση των GCNT1 στην μετα-δακτυλική εξέταση (DRE) ούρα με το αντι-GCNT1 mAb προβλέψει εξωκαψική επέκταση του προστάτη. Ως εκ τούτου, η ανίχνευση των GCNT1 στην μετα-DRE ούρα μπορεί να χρησιμεύσει ως μια ελάχιστα επεμβατική μέθοδος για την πρόβλεψη του προστάτη επιθετικότητα.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά |

Το αντιδραστήριο ISOGEN II αγοράστηκε από Nippon Gene (Ιαπωνία). Ένα αντίσωμα αντι-ποντικού IgG καθαρισμένο κουνελιού (γ-αλύσου) αγοράστηκε από την Zymed. Μια υπεροξειδάση (HRP), συζευγμένης IgG αίγας αντι-κουνελιού (Η + L) αντίσωμα και ένα αντίσωμα συζευγμένο με HRP κατσίκας αντι-ποντικού IgG αποκτήθηκαν από Cell Signaling Technology. Ένα αντι-ποντικού IgG αντίσωμα συζευγμένο με HRP κατσίκας αποκτήθηκε από την Millipore. Η καθαρισμένη πρωτεΐνη μυελώματος ποντικού από MOPC 21 (IgG, κ), 2-μερκαπτοαιθανόλη, και λευκωματίνη βόειου ορού (BSA) αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich. Tween-20 αγοράστηκε από Wako Pure Chemicals (Ιαπωνία), όπως ήταν ϋΜΕΜ και του Ham F12 μέσο. Πενικιλλίνη G /στρεπτομυκίνη λύση ήταν από την Hyclone. Precision Plus Protein πρότυπα Διπλή χρώμα ήταν από την Bio-Rad, και το αποβουτυρωμένο γάλα ήταν από Yukijirushi (Ιαπωνία).

Cells

κύτταρα ωοθήκης κινέζικου χάμστερ (CHO) διατηρήθηκαν στην τροποποίηση άλφα του αετού ελάχιστο βασικό μέσο (α-ΜΕΜ) συμπληρωμένο με 100 U /mL πενικιλλίνη, 100 μg /mL στρεπτομυκίνης και 10% βόειο εμβρυϊκό ορό (FBS).

Ανοσοϊστοχημική ανάλυση προστάτη δείγματα

Μεταξύ 2005 και 2011, 250 ασθενείς προστάτη υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ριζική προστατεκτομή στο Τμήμα Ουρολογίας, Χιροσάκι Πανεπιστήμιο Graduate School of Medicine, Hirosaki, Ιαπωνία. Τα δείγματα όγκων σταθεροποιημένο με φορμαλίνη και εγκλείστηκαν σε παραφίνη. Αποπαραφινωθείσες δείγματα επωάστηκαν με 5 μg /mL του ποντικού αντι-ανθρώπινου GCNT1 mAb (κλώνος HU127), ακολουθούμενη από επώαση με συζευγμένο με HRP κατσίκας αντι-ποντικού IgG αντίσωμα (H + L? Millipore).

ανάλυση ανοσοαποτύπωσης μετα-DRE δείγματα ούρων

μετα-DRE ούρα πληρώθηκε εντός 50 κωνικά σωληνάρια mL, καταψύχθηκαν αμέσως και αποθηκεύθηκαν στους -80 ° C μέχρι την ανάλυση. Μετα-DRE δείγματα ούρων συλλέχθηκαν από 35 ασθενείς που υποβλήθηκαν σε ριζική προστατεκτομή 2010-2013 στο Τμήμα Ουρολογίας, Χιροσάκι Πανεπιστήμιο Graduate School of Medicine, Hirosaki, Ιαπωνία. Τα κατεψυγμένα δείγματα αποψύχθηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C και εν συντομία φυγοκεντρούνται (5000 χ

g

, 5 λεπτά) για το διαχωρισμό του υπερκειμένου και στερεών. Πενήντα μικρολίτρα του υπερκείμενου κηλιδώθηκαν σε μια μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Η μεμβράνη στερεώνεται με μετα-DRE πρωτεΐνη στα ούρα επωάστηκε με ένα αντι-GCNT1 mAb (HU127), ακολουθούμενο από ένα συζευγμένο με HRP δευτερογενές αντίσωμα. Σήματα που αντιπροσωπεύουν GCNT1 ενζυματικά ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας το Κιτ Αντιδραστηρίου Novex® ECL Χημειοφωταυγές υπόστρωμα (Life Technologies) και οπτικοποιούνται σε μια + Σύστημα ChemiDocXRS (Bio-Rad). μέσες τιμές σήματος μετρήθηκαν με λογισμικό Lab εικόνας (Bio-Rad). Ποσό της έκφρασης GCNT1 υπολογίστηκε με βάση τις μέσες τιμές του σήματος της ανασυνδυασμένης ανθρώπινης GCNT1 (R &? Συστήματα D, 7248-GT). σήματα Auto-chemiliminescent αφαιρέθηκαν από το σύνολο των σημάτων. Η συνολική συγκέντρωση πρωτεΐνης των δειγμάτων ούρων μετά DRE μετρήθηκαν με ένα BCA Protein Assay Kit (Pierce). Ενημερωμένη συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς. Όλοι οι ασθενείς παρέχεται γραπτή συγκατάθεση τους να συμμετάσχουν σε αυτή τη μελέτη. Η επιτροπή δεοντολογίας του Πανεπιστημίου Χιροσάκι ενέκρινε το πρωτόκολλο της μελέτης αυτής (η μελέτη για την αλλαγή δομής των υδατανθράκων στην ουρολογική ασθένεια? Αριθμός έγκρισης: 2014-195). Η μελέτη διεξήχθη σύμφωνα με τις ηθικές προδιαγραφές της Διακήρυξης του Ελσίνκι.

σταδιοποίηση και την ταξινόμηση των όγκων

Όλοι οι ασθενείς προεγχειρητικά αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας DRE, δοκιμές ορού PSA, η σάρωση των οστών, πυελική υπολογιστικής τομογραφία, και διορθικό υπερηχογράφημα. Χρησιμοποιώντας μια βελόνα 18-G, 6-12 δείγματα βιοψίας βελόνας του προστάτη ελήφθησαν υπό υπερηχογραφική καθοδήγηση. Η σταδιοποίηση έγινε χρησιμοποιώντας την αμερικανική μεικτής επιτροπής του 2002 για τον Καρκίνο Σταδιοποίηση Εγχειρίδιο [27], ενώ το σύστημα ταξινόμησης Gleason χρησιμοποιήθηκε για την ταξινόμηση των όγκων [28].

μέτρηση του PSA και τον ασθενή

παρακολούθηση

ορού επίπεδα PSA προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ΙΜχ (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). Μετεγχειρητική επίπεδα του PSA θεωρήθηκαν να αυξηθεί (υποτροπή PSA) αν ήταν ≥ 0,2 ng /mL κατά τη διάρκεια δύο διαδοχικών επισκέψεων σε διάστημα 1 μήνα. Ο χρόνος μηδέν ορίστηκε ως η ημέρα της χειρουργικής επέμβασης. Οι ασθενείς με σταθερά ανιχνεύσιμα επίπεδα PSA (& lt? 0.001 ng /mL) μετά από χειρουργική επέμβαση καταγράφηκαν ως υποτροπές σε χρόνο μηδέν. Παρακολούθηση διαστήματα υπολογίστηκαν από την ημερομηνία της επέμβασης στο τελευταίο καταγράφεται παρακολούθησης (διάμεση τιμή, 48,4 μήνες? Εύρος, 13,2 έως 82,9 μήνες).

Η στατιστική ανάλυση

Η chi-τετράγωνο δοκιμή χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση της συσχέτισης του καθεστώτος GCNT1 με κλινικά και ιστοπαθολογικά παραμέτρους. PSA επιβίωση χωρίς αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας καμπύλες Kaplan-Meier και οι διαφορές μεταξύ των ομάδων αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας την δοκιμασία log-rank. Χρησιμοποιήσαμε το SPSS 21.0 πακέτο λογισμικού (SPSS, Chicago, IL) για όλες τις στατιστικές αναλύσεις. Βέλτιστη PSA και GCNT1 έκφραση τιμές cut-off υπολογίστηκαν η χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο: cut-off = (1 – ευαισθησία)

2 + (1 – ειδικότητα)

2 [29, 30]

Αποτελέσματα

GCNT1 έκφραση σε προστάτη συσχετίζεται θετικά με την εξέλιξη του καρκίνου και της PSA επανεμφάνιση

για να επιβεβαιωθεί η ειδικότητα του αντισώματος για GCNT1, ένα αντι-ανθρώπινο αντίσωμα GCNT1 ποντικού καθαρίστηκε από το υπερκείμενο υβριδώματος. Δόση εξαρτώμενη σύνδεση του ποντικού αντι-ανθρώπινου GCNT1 mAb (κλώνος HU127) σε ακινητοποιημένο ανασυνδυασμένο ανθρώπινο GCNT1 (rhGCNT1) ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας ΗΚΡ-συζευγμένου αντισώματος κατσίκας αντι-ποντικού IgG σε ένα ένζυμο-συνδεδεμένη ανοσορροφητική δοκιμασία (ELISA) (S1A Εικ). Σε περίπτωση απουσίας του ακινητοποιημένου rhGCNT1, δεν παρατηρήθηκε δέσμευση του αντισώματος (S1B Εικ). Στην ανάλυση ανοσοκηλίδωσης, η HU127 αντι-ανθρώπινο GCNT1 mAb δεσμεύεται ειδικά με rhGCNT1, αλλά όχι να rhGCNT3 (S1c Εικ). HU127 αντι-ανθρώπινο GCNT1 mAb ανιχνεύθηκε επίσης ειδικά παροδική έκφραση του GCNT1 σε κύτταρα CHO (S1D και S1E Εικ). Στην περίπτωση της HU127 αντι-ανθρώπινου GCNT1 mAb προαναμιγνύεται με πεπτιδικό αντιγόνο GCNT1 πριν από την επώαση επί ανοσοϊστοχημεία και ανοσοκηλίδωση, τα σήματα GCNT1 ήταν ελαττωμένη (S1F και S1G Εικ). Τα αποτελέσματα έδειξαν επίσης ότι HU127 αντι-ανθρώπινο GCNT1 mAb πραγματοποιήθηκε υψηλή ειδικότητα έναντι GCNT1.

Για να αξιολογηθεί ο ρόλος του GCNT1 στην πρόοδο PCa, δείγματα προστάτη αναλύθηκαν με ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιώντας το HU127 αντι-ανθρώπινο GCNT1 mAb. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι GCNT1 ήταν ασθενώς εκφράζεται σε υγιείς αδένες του προστάτη. Αντίθετα, μερικά ποσοστό κυττάρων προστάτη εκφράζουν σημαντικά επίπεδα GCNT1 (Σχήμα 1Β). Όταν αντιπαραβάλλονται με αυτά τα κριτήρια, προστάτη δείγματα από 250 ασθενείς παρουσίασαν διαφορετικές κλινικές παραμέτρους (S1 πίνακα). έκφραση GCNT1 σε δείγματα προστατεκτομή συσχετίζεται θετικά με τη μετεγχειρητική βαθμολογία Gleason. Πάνω από το 80% των δειγμάτων όγκου με εξωκαψική επέκταση του προστάτη (ρΤ3 και pT4) εκφράζεται GCNT1, και GCNT1-θετικούς όγκους ήταν σημαντικά μεγαλύτερο από GCNT1-αρνητικούς όγκους (S2 πίνακα).

Όπως φαίνεται στο Σχ 1C, GCNT1 Θετικοί οι ασθενείς ήταν σε σημαντικά υψηλότερο κίνδυνο PSA υποτροπής μετά από ριζική προστατεκτομή. Σύμφωνα με την πολυπαραγοντική ανάλυση, τα επίπεδα του PSA, το καθεστώς του περιθωρίου κέρδους, και την έκφραση GCNT1 στον όγκο ήταν ανεξάρτητοι παράγοντες κινδύνου για υποτροπή του PSA (Πίνακας 1).

Η

Ανίχνευση GCNT1 στην μετα-DRE ούρα ασθενών προστάτη επιτρέπει πρόβλεψη της extracapsular επέκταση του προστάτη

για να δημιουργήσετε μια ημι-ποσοτική οθόνη υψηλής απόδοσης για έκφραση GCNT1, μετα-DRE δείγματα ούρων, τα οποία περιέχουν υψηλές συγκεντρώσεις των πρωτεϊνών προστάτη, αναλύθηκαν με την μέθοδο dot-κηλίδωση χρησιμοποιώντας το αντίσωμα αντι-ανθρώπινης GCNT1 (Σχήμα 2). Πρόβλεψη extracapsular επέκταση του προστάτη είναι ένας καλός προγνωστικός δείκτης της PSA υποτροπής (S2 σχήμα). Το αρχικό επίπεδο του PSA και της έκφρασης GCNT1 έχουν υψηλή συσχέτιση με εξωκαψική επέκταση του προστάτη σε μια ανάλυση λογιστικής παλινδρόμησης (Πίνακας 2). Οι βέλτιστες τιμές cut-off για τα επίπεδα PSA και έκφρασης GCNT1 προσδιορίστηκαν να είναι 7,52 ng /mL και 79.36 pg /mg από το δέκτη-χειριστή χαρακτηριστική καμπύλη για την πρόβλεψη των extracapsular επέκταση του προστάτη χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο: cut-off = (1 – ευαισθησία)

2 + (1 – ειδικότητα)

2 [29, 30] (Σχήμα 3Α-3C). Με βάση αυτές τις κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους, ιδρύσαμε μετά από υποτροπή διαστρωματώσεις κινδύνου: διπλό αρνητικό κινδύνου (PSA & lt? 7,52 ng /mL, GCNT1 & lt? 79.36 pg /mg), μόνο θετικά κινδύνου (PSA & gt? 7,52 ng /mL ή GCNT1 & gt ? 79,36 pg /mg) και διπλό θετικό κινδύνου (PSA & gt? 7,52 ng /mL και GCNT1 & gt? 79,36 pg /mg). Πάνω από το 90% των ασθενών με διπλή θετική κινδύνου είχαν εξωκαψική επέκταση του προστάτη σε αυτή την διαστρωμάτωση κινδύνου (Σχήμα 3D). Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η συγκέντρωση και GCNT1 υψηλό PSA έκφραση σε μετα-DRE ούρα είναι καλοί προάγγελοι του extracapsular επέκταση του προστάτη.

(Α) μετά την δακτυλική εξέταση δείγματα ούρων συλλέχθηκαν και (Β) φυγοκέντρηση. (Γ) Τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν και κηλίδες πάνω σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. (D) Core2 β-1,6-

N

-acetylglucosaminyltransferase-1 (GCNT1) ανιχνεύθηκε με μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-GCNT1, ακολουθούμενη από μια υπεροξειδάση (HRP), συζευγμένης αντίσωμα. (Ε) Μετά την επεξεργασία με ένα αντιδραστήριο χημιφωταύγειας, το σήμα GCNT1 καταγράφηκε από ένα ChemiDoc + σύστημα.

Η

(Α) ειδικού προστατικού αντιγόνου (PSA) συγκέντρωση και (Β) Core2 β-1,6 –

επίπεδα έκφρασης Ν

-acetylglucosaminyltransferase-1 (GCNT1) ήταν σημαντικά υψηλότερα σε καρκίνο προστάτη (PCA) ασθενείς με εξωκαψική επέκταση ό, τι σε ασθενείς με νόσο όργανο-περιορισμένο. (C) Δέκτης-χειριστή χαρακτηριστική ανάλυση καμπύλης του PSA και GCNT1 αποκάλυψε ότι η περιοχή κάτω από την καμπύλη του PSA ήταν 0,7455 και GCNT1 ήταν 0,7614. (Δ) Κίνδυνος διαστρωμάτωση ιδρύθηκε χρησιμοποιώντας PSA και GCNT1 να προβλέψετε το αποτέλεσμα των τοπικών προστάτη. Διπλό αρνητικό (DN) -Κίνδυνος (PSA & lt? 7,52 ng /mL, GCNT1 & lt? 79.36 pg /mg), και μόνο θετική (SP) -Κίνδυνος (PSA & gt? 7,52 ng /mL ή GCNT1 & gt? 79.36 pg /mg) και το διπλό θετικό (DP) -Κίνδυνος (PSA & gt? 7,52 ng /mL και GCNT1 & gt? 79.36 pg /mg) των ασθενών σε σύγκριση

Η

Συζήτηση

Η ανώμαλη γλυκοζυλίωση των κυττάρων. γλυκοπρωτεΐνες επιφάνεια παίζει σημαντικό ρόλο στην έναρξη του καρκίνου, τον πολλαπλασιασμό, την εισβολή και τη μετάσταση [31-33]. Βιοσύνθεση των ολιγοσακχαριτών στις γλυκοπρωτεΐνες γίνεται σε συνεννόηση με αρκετές γλυκοζυλοτρανσφεράσες. Η λειτουργική δομή τερματικό όπως sialy Lewis Χ (sLex) και σιαλυλ Lewis Α (Slea) σχηματίζεται επίσης από γλυκοζυλοτρανσφεράσες [16, 34]. Η sLex και Slea, τα οποία έγιναν ευρέως γνωστού συνδετήρα πρωτεϊνών σύνδεσης σε υδρογονάνθρακες, είναι στενά συνδεδεμένα με τη μετάσταση [35]. Όχι μόνο ΣΕΛ αντιγόνα, αλλά επίσης εσωτερικές δομές, ιδιαίτερα ΟΙοΝΑο beta1,6 διακλάδωσης δομές και πολυλακτοζαμίνες, είναι στενά συνδεδεμένα με κακοήθεια του καρκίνου [22, 31]. GCNT1 είναι μία από τις γλυκοζυλοτρανσφεράσες που σχηματίζει τον πυρήνα 2

O

-γλυκάνες επί της επιφανείας των λεμφοκυττάρων και των διαφόρων καρκινικών κυττάρων [18, 24, 36, 37]. Προηγουμένως, είχε αναφερθεί ότι η έκφραση GCNT1 συνδέεται με την μεταστατικό δυναμικό του καρκίνου του παχέος εντέρου [22], ο καρκίνος του πνεύμονα [23], ο καρκίνος των όρχεων [24] και του προστάτη [18]. Έχει επίσης αναφερθεί ότι οι καρκίνοι που εκφράζουν GCNT1 μπορεί να ξεφύγει από τον ξενιστή ανοσολογική απόκριση [25, 38], ειδικά από ξενιστές φυσικά φονικά κύτταρα τα οποία συνδέονται με γαλεκτίνης-3 επί του πυρήνα 2-διακλάδωση

O

-γλυκάνες [25 , 38].

Αυτή η μελέτη καθιέρωσε ένα mAb κατά GCNT1 και αξιολογείται το δυναμικό του ως ένδειξη της επιθετικότητας του προστάτη. Ανοσοϊστοχημική ανάλυση των δειγμάτων ριζική προστατεκτομή έδειξαν ότι η έκφραση GCNT1 σε κύτταρα προστάτη σχετίζεται στενά με εξωκαψική επέκταση του προστάτη (Σχήμα 1). Επιπλέον, οι ασθενείς με θετικούς GCNT1 PCa παρουσίασαν χειρότερα PSA επιβίωση χωρίς σύγκριση με τους ασθενείς με GCNT1 αρνητικούς όγκους (Σχήμα 1). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η έκφραση GCNT1 συσχετίζεται έντονα με την κακοήθη δυναμικό του προστάτη.

Αν και ανοσοϊστοχημεία παρέχονται πολλές πληροφορίες σχετικά με την έκφραση της πρωτεΐνης σε PCa, η ανάλυση δεν ήταν ποσοτική. Χρησιμοποιώντας μετα-DRE ούρα, δημιουργήσαμε ένα ημι-ποσοτική και υψηλής απόδοσης διαλογή για την κακοήθους δυναμικού του προστάτη (σχήματα 2 και 3). Πρόσφατες μελέτες ανέφεραν ότι το αντιγόνο του καρκίνου του προστάτη 3 και TMPRSS2: ERG σύντηξης ήταν δύο από τα πιο χρήσιμα δείκτες του προστάτη. Οι δείκτες αυτοί επικεντρώθηκαν σε υποψήφιους έλεγχο του προστάτη και την έγκαιρη διάγνωση του προστάτη [39]. Προστάτη αντιγόνο καρκίνου 3 και η TMPRSS2: ERG σύντηξης αναφερθεί σχεδόν μελέτη που βασίζεται στην PCR και δεν παρουσιάζουν επαρκή βιολογικά στοιχεία του προστάτη επιθετικότητας. Έχουμε, επίσης, ανέφερε ότι η ανίχνευση της ανώμαλης γλυκοζυλίωσης του PSA βελτιώθηκε προστάτη διαλογής, αλλά δεν προβλέπουν προστάτη επιθετικότητα [40]. Σε αυτή τη μελέτη, η έκφραση GCNT1 στην μετα-DRE ούρα συσχετίστηκε με εξωκαψική επέκταση του προστάτη. Επιπλέον, ένας συνδυασμός αρχική συγκέντρωση PSA και έκφραση GCNT1 θα μπορούσε να προβλέψει εξωκαψική επέκταση σε πάνω από το 90% του προστάτη. Ως εκ τούτου, η ανίχνευση GCNT1 στην μετα-DRE ούρα βελτιωμένη πρόβλεψη του προστάτη εισβολής.

Επειδή GCNT1 δεν είναι ένας καρκίνος-ειδική πρωτεΐνη, η έκφρασή της ήταν ακατάλληλο για την PCA έλεγχο. Ως εκ τούτου, ο συνδυασμός των αναφερόμενων δεικτών ελέγχου προστάτη και GCNT1 μπορεί να βελτιώσει την ανάπτυξη θεραπευτικών στρατηγικών του προστάτη. Αν και ο μηχανισμός της GCNT1 καθοδηγείται ρύθμιση σε εξέλιξη του καρκίνου είναι ελάχιστα κατανοητή, η μελέτη μας δείχνει ότι GCNT1 μπορεί να είναι ένα προγνωστικό του κακοήθους δυναμικού του προστάτη. Περαιτέρω κλινική έρευνα είναι απαραίτητη για να προσδιορίσει τη χρησιμότητα των GCNT1 ως βιοδείκτη του προστάτη.

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 Εικ. Παρασκευή ενός αντι-ανθρώπινου πυρήνα 2 β-1,6-

N

-acetylglucosaminyltransferase-1 μονοκλωνικό αντίσωμα.

(Α) Δέσμευση του Core2 β-1,6-

N

-acetylglucosaminyltransferase-1 (GCNT1) -εξειδικευμένης αντισώματα. Τα υπερκείμενα καλλιέργειας παρασκευάστηκαν από κύτταρα HU127 υβριδώματος. Η δέσμευση του GCNT1 μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-ανθρώπου (mAb, μπλε γραμμή) ή IgG μυελώματος MOPC 21 (έλεγχος, πορτοκαλί γραμμή) σε ακινητοποιημένο ανασυνδυασμένο ανθρώπινο GCNT1 σε εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο (τετμημένη) ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας υπεροξειδάση (HRP) – συζευγμένο αντίσωμα IgG αντι-ποντικού. Οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν την τυπική απόκλιση των μετρήσεων εις τριπλούν. Συγκεντρώσεις του αντισώματος σε υπερκείμενα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα σάντουιτς ELISA. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά δύο πειραμάτων. (Β) Το αντι-ανθρώπινο GCNT1 mAb αναγνωρίζονται ακινητοποιημένο ανασυνδυασμένο ανθρώπινο GCNT1, αλλά όχι BSA. (Γ) Για την επιβεβαίωση αντι-ανθρώπινο ειδικότητα GCNT1 mAb, ανασυνδυασμένη ανθρώπινη GCNT1 και GCNT3 αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση (SDS-PAGE) και μεταφέρθηκαν σε μία μεμβράνη PVDF. Το αντι-ανθρώπινο GCNT1 mAb αναγνωρίζονται ειδικά GCNT1, αλλά όχι GCNT3. (Α) Ανοσοκηλίδωση και (Ε) ανοσοκυτταροχημεία αποκάλυψε την αντι-ανθρώπινο GCNT1 mAb επίσης αναγνωρίζεται ειδικά GCNT1 σε GCNT1-υπερεκφράζεται κύτταρα CHO. δοκιμασία αναστολής πεπτιδίου για (F) IHC και (ζ) τις μεθόδους dot-blotting αποκάλυψε τα σήματα GCNT1 ανεστάλησαν από GCNT1 αντιγόνο πεπτιδίου προ-θεραπεία αντι-ανθρώπινο mAb GCNT1

doi:. 10.1371 /journal.pone.0138520.s001

(ΔΕΘ)

S2 Εικ. Η εξωκαψική επέκταση του καρκίνου του προστάτη ήταν ένα από τα ισχυρό προγνωστικό του ειδικού προστατικού αντιγόνου επανάληψη.

Περιόδους επιβίωσης χωρίς αντιγόνο προστάτη-ειδικό συγκρίθηκαν μεταξύ της νόσου όργανο-περιορισμένο (ρΤ2) και εξωκαψική επέκταση (ρΤ3 και pT4). Επιβίωση αναλύθηκε με καμπύλες Kaplan-Meier

doi:. 10.1371 /journal.pone.0138520.s002

(EPS)

S1 αρχείου. Συμπληρωματικά υλικά και μεθόδους

doi:. 10.1371 /journal.pone.0138520.s003

(DOCX)

S1 πίνακα. . Core2 β-1,6-

Ν

-acetylglucosaminyltransferase-1 κατάστασης και των δεδομένων του ασθενούς

doi: 10.1371 /journal.pone.0138520.s004

(DOCX)

S2 πίνακα. . Core2 β-1,6-

Ν

-acetylglucosaminyltransferase-1 κατάσταση και παθολογικών παραμέτρων

doi: 10.1371 /journal.pone.0138520.s005

(DOCX)

S3 πίνακα. δεδομένα της ορθού εξέταση δειγμάτων μετα-ψηφιακή ούρα των ασθενών

doi:. 10.1371 /journal.pone.0138520.s006

(DOCX)

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς ευχαριστήσω τον Δρ Shigeru Tsuboi για τις χρήσιμες συζητήσεις.