Αφηρημένο

JAG1 είναι ένας συνδετήρας Notch που διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο σε πολλαπλά μονοπάτια σηματοδότησης. Ωστόσο, η λειτουργικότητα του JAG1 σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC), δεν έχει ερευνηθεί διεξοδικά. Με σύγκριση του γονιδίου σε μεταγραφή RNA προφίλ στο ζεύγος κυτταρική γραμμή με διαφορική ικανότητα εισβολής, εντοπίσαμε JAG1 ως δυνητικός ενισχυτής μετάσταση στον καρκίνο του πνεύμονα. Έκτοπη έκφραση JAG1 για τον καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων ενισχυμένη κυτταρική μετανάστευση και την εισβολή, καθώς και μετάσταση

in vitro

και

in vivo

. Αντιστρόφως, knockdown του JAG1 με siRNA σε εξαιρετικά επεμβατικές καρκινικά κύτταρα οδήγησε στη μείωση της μετανάστευσης και εισβολής. Στην κλινική ανάλυση, η έκφραση JAG1 mRNA ήταν υψηλότερη σε όγκους από ό, τι στις παρακείμενες φυσιολογικούς ιστούς σε 14 από 20 ασθενείς με καρκίνωμα των πλακωδών κυττάρων (SCC). SCC ασθενείς με υψηλότερα μεταγραφή JAG1 είχε κακή συνολική επιβίωση από εκείνους με χαμηλή μεταγραφή JAG1. ανάλυσης μικροσυστοιχιών έδειξαν ότι η επιβολή μεταγραφή JAG1 συσχετίστηκε με αυξημένο μεταγραφή HSPA2 RNA, το οποίο έπαιξε σημαντικό ρόλο στην προώθηση της μετανάστευσης των καρκινικών κυττάρων και την εισβολή. Εν κατακλείδι, αυτή είναι η πρώτη μελέτη που έδειξε ότι JAG1 θα μπορούσε να λειτουργήσει ως ένα πιθανό προγνωστικό δείκτη και του άξονα JAG1 /HSPA2 μεσολαβεί κακοήθειας του καρκίνου του πνεύμονα, τουλάχιστον εν μέρει

Παράθεση:. Chang WH, Ho π.Χ., Χσιάο YJ, Τσεν JS, Yeh CH, Chen ΗΥ, et al. (2016) JAG1 συνδέεται με κακή επιβίωση μέσω της πρόκλησης μετάσταση στον καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 11 (3): e0150355. doi: 10.1371 /journal.pone.0150355

Επιμέλεια: Srikumar Π Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center & amp? Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 28η Σεπτεμβρίου του 2015? Αποδεκτές: 12 Φεβ του 2016? Δημοσιεύθηκε: 1 Μαρ 2016

Copyright: © 2016 Chang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Μικροσυστοιχία τα αρχεία CEL, κανονικοποιημένα δεδομένα και πειραματικά στοιχεία έχουν κατατεθεί στο Gene Expression Omnibus και είναι διαθέσιμα από τον αριθμό προσχώρησης GSE14995

Χρηματοδότηση:. η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από τις επιχορηγήσεις από το Υπουργείο Επιστήμης και Τεχνολογίας, την Ταϊβάν, ROC (NSC98-2314-B-002-038-MY2, NSC101-2911-Ι-002-303, 103-2320-B-002 -052, 104-2.320-B-002 -030). Ο χρηματοδότης δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο σχετίζονται με όλο τον κόσμο [1]. Η μετάσταση είναι ο κύριος καθοριστικός συμβάλλει στην εξέλιξη του καρκίνου και τη θνησιμότητα, και κυτταρική κινητικότητα και εισβολή είναι το αρχικό βήμα [2]. Γενικά, οι περισσότεροι καρκίνος μπορεί να αποδοθεί σε έναν αυξανόμενο αριθμό των γενετικών αλλοιώσεων, οι οποίες περιλαμβάνουν ογκογονίδιο ενεργοποίηση ή απενεργοποίηση γονιδίου καταστολής όγκων [3, 4]. Σε προηγούμενες μελέτες μας, έχουμε δημιουργήσει μια σειρά από καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικών σειρών με ποικίλες εισβολής [5] και θα προσδιορίζονται και να επικυρώνονται πολλά ογκογονίδια ή καταστολείς των όγκων αυτών μοντέλο κυτταρικές σειρές [6-8]. Η ανακάλυψη αυτών των μεταβολών μπορεί να ωφελήσει τους ασθενείς με καρκίνο ως δείκτες καρκίνου ή druggable [9] στόχους. Ωστόσο, οι περισσότερες εναλλαγές δεν έχουν ακόμη διαλευκανθεί πλήρως.

JAG1 είναι ένα από τα κανονικά συνδέτες για υποδοχείς Notch. Μετά την αλληλεπίδραση προσδεμάτων με τους υποδοχείς, υποδοχείς Notch υφίστανται πρωτεολυτικές διασπάσεις, και ο Notch ενδοκυττάρια περιοχή μετατοπίζονται μέσα στον πυρήνα και τελικά σχετικά με την έκφραση των γονιδίων στόχων Notch, με αποτέλεσμα στην κυτταρική διαφοροποίηση, τον πολλαπλασιασμό, την επιβίωση και την απόπτωση [10]. Στην ανθρώπινη ασθένεια, JAG1 έχει αναφερθεί ότι σχετίζεται με το σύνδρομο Alagille [11, 12]. Επιπλέον, JAG1 εκφράζεται έντονα σε μυελοβλαστώματος και του παχέος εντέρου [13, 14], και προκαλεί φτωχότερη συνολική επιβίωση στον καρκίνο του μαστού [15]. Σε μη-μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα, JAG1 έχει ταυτοποιηθεί σε εννέα γονίδιο-υπογραφές οι οποίες μπορούν ενδεχομένως να χρησιμοποιηθούν ως γενετικοί δείκτες [16]. Παρά αυτές τις κλινικές παρατηρήσεις, η μοριακή συμβολή και τη λειτουργικότητα των JAG1 σε νεοπλασματικές ασθένειες μένει να αποδειχθεί.

Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε την επίδραση της JAG1 στην εισβολή του καρκίνου του πνεύμονα και

in vitro

και

in vivo

. Η ανάλυση μικροσυστοιχιών χρησιμοποιήθηκε για να διερευνηθεί η πιθανή κατάντη σηματοδότησης του JAG1. Κλινικά, η συσχέτιση των JAG1 μεταγραφής και οι επιβιώσεις της NSCLC Αναλύθηκαν επίσης.

Υλικά και Μέθοδοι

καλλιέργειας κυττάρων

CL1-0 και CL1-5 κύτταρα συσταθεί και χαρακτηρίστηκε όπως περιγράφεται προηγουμένως [5]. Α549 και H226 αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό και 1% πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη (Invitrogen, Carlsbad, CA) στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2.

κατασκευή πλασμίδιο, επιμόλυνση και σταθερών κλώνων

Οι JAG1 και HSPA2 πλασμιδίων που εκφράζουν, pcDNA3.1-JAG1-V5 και pcDNA3.1-HSPA2-V5, κατασκευάστηκαν με κλωνοποίηση του πλήρους μήκους ανθρώπινου JAG1 ή HSPA2 cDNA με Ο-τερματική ετικέτα V5 στον φορέα pcDNA3.1 (Life Technologies, Grand Island, ΝΥ), αντίστοιχα. Δύο siRNA που χρησιμοποιούνται για την εξουδετέρωση του mRNA JAG1 αγοράστηκαν από σιλανσιέ

® Επιλέξτε siRNA (Cat. S1175 και s1176) (Life Technologies, Grand Island, Νέα Υόρκη). Όλα τα πειράματα επιμόλυνσης πραγματοποιήθηκαν με Lipofectamine

® αντιδραστήριο 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. CL1-0 κύτταρα μορφομετατράπηκαν με pcDNA3.1-JAG1 ή pcDNA3.1 κενό φορέα. Μετά από καλλιέργεια σε μέσο που περιέχει 1 mg /mL του γενετικίνη (G418) για 2-3 εβδομάδες, συνενώθηκαν σταθεροί κλώνοι απομονώθηκαν. Οι κλώνοι που εκφράζουν την περιοχή κωδικοποίησης JAG1 cDNA διατηρήθηκαν σε μέσο που περιέχει 0.5 mg /mL του γενετικίνης και χρησιμοποιήθηκε για περαιτέρω έρευνα.

πραγματικού χρόνου ποσοτική RT-PCR

Ολικό RNA απομονώθηκε από το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Life Technologies, Grand Island, ΝΥ) και 1 μg του ολικού RNA που χρησιμοποιούνται στη σύνθεση του cDNA με τυχαίους εκκινητές εξαμερών χρησιμοποιώντας αντίστροφη μεταγραφάση Superscript II (Life Technologies, Grand Island, ΝΥ). 20 ng RNAs ή 10 ng οϋΝΑδ χρησίμευσε ως πρότυπο για την ανίχνευση έκφρασης mRNA με πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR με Syber Green. Το σχετικό επίπεδο έκφρασης του mRNA του γονιδίου-στόχου καθορίστηκε ως -ΔCT = – [CT

στόχου-CT

TBP]. Η αναλογία στόχου /ΤΒΡ mRNA υπολογίστηκε ως 2-ΔCt × K, στην οποία Κ είναι μια σταθερά. Η αλληλουχία λεπτομέρεια εκκινητή για κάθε γονίδιο στόχο πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR εισήχθη στον Πίνακα S1.

ανοσοαποτύπωσης

Η παρασκευή των προϊόντων λύσης ολικού κυττάρου και ανάλυση κηλίδας Western περιγράφηκαν, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [7 , 8]. Εν συντομία, τα κυτταρικά λύματα για ανοσοστύπωμα παρασκευάστηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα RIPA (1% ΝΡ-40, 0.5% δεοξυχολικό νάτριο, 0.1% SDS, 50 mM Tris-HCl, ρΗ 7.5) που περιέχει 1Χ πλήρης κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Roche, Indianapolis, ΙΝ). Τα δείγματα πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με 8% ~ 12% SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη πολυ (βινυλιδενο διφθοριούχο) (Merck Millipore, Billerica, ΜΑ). Πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν με ειδικά αντισώματα, ορατές με κιτ δοκιμασίας χημειοφωταύγειας (Merck Millipore, Billerica, ΜΑ) και ανιχνεύεται με FUJIFILM LAS-3000 σύστημα ECL (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν για ανοσοστυπώματος ήταν ως εξής: αντι-JAG1, αντι-NICD-3 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), αντι-NICD-1, αντι-NICD-2, αντι-NICD-4 (GeneTex, Irvine , CA), αντι-β-ακτίνης (Sigma, St Louis, ΜΟ), και αντι-V5 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Η φθορίζουσα χρώση ανοσοϊστοχημείας σε βιοψία του όγκου των ασθενών ήταν descripted σε S1 Text.

Μετανάστευση και εισβολή δοκιμασίες

In vitro

προσδιορισμούς μετανάστευσης κυττάρων και εισβολής διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [ ,,,0],17] χρησιμοποιώντας Transwell θαλάμους (8 μm μέγεθος πόρου? Costar, Cambridge, ΜΑ). Στην δοκιμασία μετανάστευσης, 1 × 10

5 κύτταρα σπάρθηκαν πάνω από τα πολυανθρακικά φίλτρα και επωάστηκαν για 8 ώρες. Τα φίλτρα σκουπίστηκε με ένα μάκτρο βάμβακος, σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη και στη συνέχεια χρωματίζονται με διάλυμα Giemza (Sigma, St Louis, ΜΟ). Για τη δοκιμασία εισβολής, τα φίλτρα καλύφθηκαν με Matrigel (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), και 1 χ 10

5 κύτταρα σπάρθηκαν επί του Matrigel και επωάστηκαν για 18 ώρες. Τα κύτταρα που συνδέονται με την κάτω επιφάνεια του φίλτρου μετρήθηκαν υπό οπτικό μικροσκόπιο (μεγέθυνση χ 100).

In vivo

μετάστασης

Η μελέτη σε ζώα εγκρίθηκε από το ιδρυματική φροντίδα των ζώων και Χρήση επιτροπή του Εθνικού Πανεπιστημίου της Ταϊβάν με IACUC Νο 20080239. Για δοκιμασία μετάστασης [7], 1 × 10

6 κύτταρα πλύθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε 100 μl PBS. Στη συνέχεια, τα κύτταρα εγχέονται στην πλευρική φλέβα της ουράς 6 εβδομάδων SCID ποντίκια (που παρέχονται από το Εργαστήριο Κέντρο Ζώων του Κολεγίου Ιατρικής, Εθνικό Πανεπιστήμιο της Ταϊβάν, Ταϊπέι, Ταϊβάν). Μετά την εμφύτευση των 10 εβδομάδων, οι πνεύμονες των ποντικών αφαιρέθηκαν και μονιμοποιήθηκαν σε 10% φορμαλίνη και ο αριθμός των πνευμονικών βλαβών μικρομεταστατικών μετρήθηκε κάτω από ένα ανατομικό μικροσκόπιο. Ενσωματωμένα ιστοί σε φέτες και χρώση με αιματοξυλίνη-ηωσίνη για ιστολογική ανάλυση.

Ασθενείς και δείγματα ιστών

Αυτή η έρευνα έγινε μετά από έγκριση από το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review του Εθνικού Πανεπιστημίου της Ταϊβάν Νοσοκομείο με NTUH ΣΑ Όχι πρωτόκολλο 200812077R. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς. Όλα τα δείγματα ιστού όγκου ήταν θεραπεία naive διότι κανένας από τους ασθενείς είχαν λάβει νεο-επικουρική χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία πριν από την επέμβαση. Δείγματα ιστού καρκίνου του πνεύμονα και του τμήματος μη-όγκου του πνεύμονα που λαμβάνεται στο χειρουργείο αμέσως συμπληρωματικό καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C μέχρι τη χρήση. Η ιστολογική ταξινόμηση αυτών των όγκων με βάση τα κριτήρια του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας. Το μέγεθος του όγκου, η τοπική εισβολή και μετάσταση λεμφαδένα προσδιορίστηκαν σε παθολογική εξέταση. Το τελικό σταδιοποίηση της νόσου προσδιορίστηκε από ένα συνδυασμό χειρουργικής και παθολογικών ευρημάτων, σύμφωνα με το τρέχον σύστημα όγκου-node-μετάσταση για σταδιοποίηση του καρκίνου του πνεύμονα. Παρακολούθηση δεδομένων θα πρέπει να ληφθεί από την ιατρική διαγράμματα των ασθενών και αναφέρθηκαν από την υπηρεσία μητρώου του όγκου μας. Υποτροπή χρόνος υπολογίζεται από την ημερομηνία λειτουργίας μέχρι την ημερομηνία της ανίχνευσης της τοπικής υποτροπής ή συστηματική μετάσταση. χρόνος επιβίωσης υπολογίστηκε από την ημερομηνία λειτουργίας μέχρι την ημερομηνία του θανάτου. Ασθενείς πεθαίνουν από μετεγχειρητικές επιπλοκές εντός 30 ημερών μετά το χειρουργείο αποκλείστηκαν από την ανάλυση επιβίωσης, ώστε να αποφευχθεί η προκατάληψη. Η ανάλυση της έκφρασης JAG1 mRNA σε ασθενείς ήταν descripted στο S1 Κείμενο.

μικροσυστοιχιών ανάλυση

Για την ανάλυση cDNA μικροσυστοιχιών, cDNA προετοιμασία και την υβριδοποίηση σειρά διεξήχθησαν σύμφωνα με την Affymetrix GeneChip Ανάλυση έκφρασης Τεχνικό Εγχειρίδιο. Εν συντομία, το 8 μg ολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα με την παρουσία ενός εκκινητή Τ7 (One-κύκλος cDNA Synthesis kit? Affymetrix, Santa Clara, CA). Το προϊόν cDNA εκαθαρίσθη και μεταγράφηκε

in vitro

με βιοτίνη σημασμένο ριβονουκλεοτίδια (IVT Labeling Kit? Affymetrix, Santa Clara, CA). Ένα τμήμα του βιοτινυλιωμένου RNA ήταν κατακερματισμένη και υβριδοποιήθηκε όλη τη νύχτα προς τα ανθρώπινα U133 γονιδίωμα συν 2,0 GeneChip (Affymetrix, Santa Clara, CA). Το GeneChip πλύθηκε και αναπτύχθηκε από το πρωτόκολλο χρώσης ενίσχυση που παρέχεται από Affymetrix. Το GeneChip σαρώθηκε από Affymetrix GeneChip Scanner 3000 7G, και οι εικόνες εκχυλίζονται με Affymetrix GeneChip Λογισμικό Λειτουργικό (GCOS) έκδοση 1.4. Όλα τα πειράματα υβριδισμού διεξήχθησαν σε βιολογικά τριπλούν με ανιχνευτές cDNA που παρασκευάστηκε από CL1-0 /JAG1 και ελέγχου /φορέα CL1-0. Τα δεδομένα φιλτράρονται από 2-φορές αλλαγές υπό την προστασία του FDR (

σ

& lt? 0,05) με τη χρήση Genespring GX 12.6 (Sillicon Γενετικής, Redwood City, CA). Τα αρχεία CEL μικροσυστοιχιών, κανονικοποιημένα δεδομένα και πειραματικά στοιχεία έχουν κατατεθεί στο Gene Expression Omnibus, και είναι διαθέσιμα από τον αριθμό προσχώρησης GSE14995. Η λεπτομέρεια πειραματική διαδικασία και ακολούθησε ταυτοποίηση των JAG1 κατάντη γονιδίων descripted σε S1 Κείμενο

Η στατιστική ανάλυση

Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και αναλύθηκαν με ANOVA (Excel, Microsoft? Ταϊπέι, Ταϊβάν). .

σ

αξία & lt? 0,05 θεωρείται στατιστικά σημαντική. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση ± SD.

Αποτελέσματα

JAG1 ταυτοποιείται ως δυνητικός μετάσταση προαγωγής γονίδιο

Για τον προσδιορισμό των νέων γονιδίων που εμπλέκονται στη μετάσταση του καρκίνου του πνεύμονα, cDNA μικροσυστοιχίες έκφρασης χρησιμοποιήθηκαν για να μελετήσει ένα μοντέλο εισβολή καρκίνου του πνεύμονα σε προηγούμενες μελέτες μας [18]. Μετά τη σύγκριση των προφίλ έκφρασης mRNA των χαμηλών μεταστατικών κυττάρων (CL1-0) και τις ιδιαίτερα επεμβατική κύτταρα (CL1-5), βρήκαμε την έκφραση mRNA του JAG1 ήταν 113 φορές υψηλότερη σε σχέση με το CL1-5 CL1-0 (Σχ 1Α, αριστερά). Η έκφραση μεταγράφου και πρωτεΐνη έκφραση JAG1 σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές CL1-0 και CL1-5 ήταν σύμφωνες με τα αποτελέσματα που λαμβάνονται από την ανάλυση μικροσυστοιχιών (Σχήμα 1Α, μεσαία και δεξιά). Για να επαληθευθεί αν JAG1 διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στη ρύθμιση της μετάστασης του καρκίνου, χρησιμοποιήσαμε υπερέκφραση και RNAi σίγηση προσεγγίσεις για να διαμορφώνει JAG1 μεταγραφική έκφραση και εκτελούνται δοκιμασίες Transwell μετανάστευση και εισβολή. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Β και 1Γ, επιβάλλονται έκφραση JAG1 προώθησε την ικανότητα της κυτταρικής μετανάστευσης και της εισβολής στα χαμηλά μεταστατικών κυττάρων CL1-0. Αντίθετα, νοκ ντάουν της JAG1 ανέστειλε τις δύο δραστηριότητες σε εξαιρετικά επεμβατική CL1-5 κύτταρα. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι JAG1 θα μπορούσε να δράσει ως νέο υποψήφιο που εμπλέκονται στην επιτάχυνση της μετάστασης του καρκίνου του πνεύμονα.

(Α) Προσδιορισμός των JAG1 σε ένα μοντέλο εισβολή του καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων. JAG1 είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω σε εξαιρετικά διηθητικού καρκίνου του πνεύμονα κύτταρα. Αριστερά, επίπεδο JAG1 mRNA εκτιμήθηκε με ανάλυση ολιγονουκλεοτιδίου μικροσυστοιχίας. μεσαίο επίπεδο, JAG1 mRNA μετρήθηκε με πραγματικού χρόνου ποσοτική RT-PCR. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD. Δεξιά, η έκφραση της πρωτεΐνης JAG1 αξιολογήθηκε με στύπωμα Western. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος. (Β) JAG1 προωθεί τη μετανάστευση των κυττάρων και εισβολής

in vitro

. Αριστερά, JAG1 ήταν σταθερώς υπερεκφράζεται σε κύτταρα CL1-0. JAG1 mRNA μετρήθηκε με πραγματικού χρόνου ποσοτική RT-PCR εις τριπλούν. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD. Μέση και Δεξιά, τη μετανάστευση και την ικανότητα εισβολής των κυττάρων CL1-0 με συστατική έκφραση JAG1 και mock κύτταρα μάρτυρες αξιολογήθηκαν με δοκιμασία της μετανάστευσης και της δοκιμασίας Matrigel εισβολής. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσες ± SD τριών πειραμάτων. *:

σ

& lt? 0.05 σε σύγκριση με την ψευδο ομάδα. (C) Νοκ ντάουν της JAG1 αναστέλλει τη μετανάστευση των κυττάρων και εισβολής

in vitro

. Αριστερά, JAG1 mRNA χτυπήθηκε κάτω από τα siRNA σε CL1-5 κύτταρα αναλύθηκαν με πραγματικού χρόνου ποσοτική RT-PCR εις τριπλούν. Δύο διαφορετικά siRNAs (siJAG1-1 και siJAG1-2) χρησιμοποιήθηκαν για να φιμώσουν JAG1. NC, αρνητικός έλεγχος. Μέση και Δεξιά, τη μετανάστευση και την ικανότητα εισβολής των JAG1-φίμωση επιμολύνσεις αναλύθηκαν με προσδιορισμούς μετανάστευσης και matrigel εισβολή. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD? *:

σ

& lt? 0.05 σε σύγκριση με τον αρνητικό μάρτυρα.

Η

JAG1 προωθεί NSCLC κακοήθεια

Για να επιβεβαιώσετε κατά πόσον η ογκογόνο φύση της JAG1 είναι ένα παγκόσμιο φαινόμενο, πραγματοποιήσαμε τη μετάβαση μεταξύ φρεατίων και προσδιορισμούς εισβολής σε άλλες δύο κυτταρικές γραμμές. Αυτό το φαινόμενο ανακεφαλαιωθούν στο άλλο μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα γραμμές. Βρήκαμε ότι παροδικά επιβολή έκφραση JAG1 προωθείται μεταναστεύουν και επεμβατικές δυνατότητες

in vitro

όχι μόνο στην CL1-0 αλλά και στην Α549 και H226 κύτταρα (Σχήμα 2Α). Για να επιβεβαιωθεί κατά πόσο λειτουργεί JAG1 στην προαγωγή μετάστασης

in vivo

, CL1-0 κύτταρα επιμολύνθηκαν με JAG1 εκφράζουν ή κενό φορέα και ενδοφλεβίως εισάγονται σε ποντικούς NOD SCID με ένεση ουρά για την αξιολόγηση των ικανοτήτων μετάσταση τους. Μετά από δέκα εβδομάδες από την ένεση, όλα τα ποντίκια θυσιάστηκαν και ο μεταστατικές εστίες όγκου στους πνεύμονες εξετάστηκαν και μετρήθηκαν. Ποντικοί ενέθηκαν με μορφομετατροπείς JAG1 (n = 13) που έχει αναπτυχθεί περισσότερο πνευμονικά οζίδια μετάσταση από ψευδο μορφομετατροπείς (n = 10) (Σχήμα 2Β, αριστερά και μέση). Μεταστατικές βλάβες σε τυχαία επιλεγμένα τμήματα του πνεύμονα χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη για να επιβεβαιώσει ιστολογικά οζιδίων όγκου (Σχήμα 2Β, δεξιά). Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν περαιτέρω ότι JAG1 διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στη ρύθμιση της μετάστασης του καρκίνου.

(Α) JAG1 προάγει την κυτταρική μετανάστευση και διεισδυτικότητα

in vitro

. Αριστερά, JAG1 παροδικά υπερεκφράζεται σε Α549 και H226 κύτταρα. JAG1 mRNA μετρήθηκε με πραγματικού χρόνου ποσοτική RT-PCR και ομαλοποιήθηκε ως προς ΤΒΡ εις τριπλούν. Μέση και δεξιά, ικανότητα μετανάστευση και διηθητικότητα των κυττάρων με παροδική υπερέκφραση JAG1 και ελέγχου κύτταρα αξιολογήθηκαν με δοκιμασίες μετανάστευσης και matrigel εισβολή. *:

σ

& lt? 0,05, σε σύγκριση με πλαστή. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD εις τριπλούν. (Β) JAG1 προωθεί μετάσταση

in vivo

. Αριστερά, τον αριθμό των οζιδίων σε SCID ποντίκια. Τα κύτταρα Mock CL1-0 και JAG1-κυτταρικές σειρές που υπερεκφράζουν εμβολιάστηκαν σε σοβαρή συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια (SCID) με ένεση στην ουραία φλέβα. Μετά από 10 εβδομάδες, τα ποντίκια θυσιάστηκαν. Αριθμός των όγκων που προέρχονται από ψευδο και JAG1 μορφομετατροπείς μετρήθηκε κάτω από το μικροσκόπιο ανατομής. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD (η = 10 σε ψευδο ομάδα ελέγχου και η = 13 στην ομάδα μορφομετατροπέα JAG1). *:

σ

& lt? 0,05, σε σύγκριση με πλαστή έλεγχο. Δεξιά, εμφανίσεις των πνευμόνων από ποντικούς που ενέθηκαν με CL1-0 mock και JAG1 επιμολύνσεις και ο αντιπρόσωπος Η &? Ε τμήματα χρώση των πνευμόνων από ποντικούς. Κόκκινο αιχμές βελών δείχνουν μεταστατικά οζίδια όγκων στους πνεύμονες. Μαύρα βέλη δείχνουν την μικρομεταστάσεων του καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων.

Η

Σύλλογος JAG1 mRNA έκφρασης και κλινικά αποτελέσματα

Δεδομένης της σημασίας των JAG1 στην εισβολή του καρκίνου

in vitro

και

in vivo

, εξετάσαμε περαιτέρω την επίδραση της JAG1 σχετικά με την πρόοδο των καρκίνων του πνεύμονα. έκφραση Πρώτη JAG1 mRNA μετρήθηκε σε 63 ζεύγη γειτονικό φυσιολογικό και NSCLC ιστούς με πραγματικού χρόνου ποσοτική RT-PCR. Αν και το

σ

-τιμή δεν έφτασε στατιστική σημασία (

σ

= 0,058), το mRNA JAG1 είχε μια τάση που ήταν άφθονα σε καρκινικό ιστό και όχι σε παρακείμενες σε συνδυασμό φυσιολογικό ιστό (Εικ 3Α). Στη συνέχεια, διαπιστώσαμε ότι JAG1 ήταν διατεθειμένοι να εκφράσουν σε μέρη όγκου σε σύγκριση με το παρακείμενο φυσιολογικούς ιστούς των 14 από τα 20 πλακώδες καρκίνωμα (

σ

= 0,017, σχήμα 3Β). Επιπλέον, ερευνήσαμε εάν η έκφραση του mRNA JAG1 συσχετίζεται με την επιβίωση των ασθενών. Μεταξύ των 90 ασθενών με NSCLC, το επίπεδο του mRNA της JAG1 δεν συσχετιζόταν με τη συνολική επιβίωση των ασθενών (S1 σχήμα,

σ

= 0,9710). Ωστόσο, ακόμα κι αν ήταν μόνο 35 ασθενείς με πλακώδες καρκίνωμα μεταξύ των 90 ασθενών με NSCLC, mRNA χαμηλό επίπεδο JAG1 είχε δείξει μεγαλύτερη συνολική επιβίωση σε ασθενείς με ακανθοκυτταρικό από τους ασθενείς με mRNA υψηλότερο επίπεδο JAG1 φαίνεται από Kaplan-Meier επιβίωσης αναλύσεις και log-rank δοκιμές (

σ

= 0.042, Σχ 3C). Πολυπαραγοντική Cox ανάλυση παλινδρόμησης αναλογικού κινδύνου έδειξε ότι JAG1 μεταγραφή σχετίζεται με τη συνολική επιβίωση του πλακώδους καρκινώματος (ασθενείς με υψηλά έναντι χαμηλό επίπεδο mRNA JAG1, αναλογία κινδύνου [HR] = 2,87, 95% CI = 0,99 – 8,33?

p

= 0.05).

(Α και Β) έκφραση JAG1 mRNA σε όγκο και φυσιολογικό τμήματα του καρκίνου του πνεύμονα. JAG1 mRNA σε όγκους και φυσιολογικούς ιστούς παρακείμενα του NSCLC (Α) και οι ασθενείς υποτύπου πλακώδες καρκίνωμα (Β) εκτιμήθηκε με πραγματικού χρόνου ποσοτική RT-PCR και ομαλοποιήθηκε ως προς ΤΒΡ. (Γ) JAG1 επίπεδο του mRNA και τη συνολική επιβίωση των ασθενών πλακώδες καρκίνωμα υπότυπο. Όλες οι στατιστικές δοκιμασίες ήταν δύο όψεων, και

σ

& lt?. 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Η

HSPA2 είναι ένα μυθιστόρημα καθοδικός τελεστής της JAG1 σε NSCLC

Τέλος, χρησιμοποιείται η ανάλυση μικροσυστοιχιών ολιγονουκλεοτίδιο Affymetrix για τον προσδιορισμό των 10 κορυφαίων διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων σε κύτταρα CL1-0 JAG1-επιμολυσμένα σε σύγκριση με το ψευδο μορφομετατροπέα (S2 και S3 πίνακες). Αξίζει να σημειωθεί ότι, δεν παρατηρήσαμε κάποια σημαντική διαφορά της Notch 1 και Notch2 και κατάντη γονίδια της (ASCL1, HES1, HEY1 και Slug) επίπεδο mRNA, εκτός από τα επίπεδα ίχνος διαφορά επιπέδου Notch3 και Notch4 RNA στα κύτταρα NSCLC (S4 και S5 πίνακες). Για τον εντοπισμό νέων δυνητικών JAG1 μεταγενέστερα μόρια, έχουμε καταρχάς διεξάγεται RT-PCR για την επικύρωση γονιδίων με σημαντικές αλλαγές έκφραση αναλύθηκε με αποτέλεσμα μικροσυστοιχίας είτε μορφομετατροπείς JAG1 ή JAG1 σιγήσει CL1-0, CL1-5, Α549 και κυτταρικές σειρές H226 (S3 Τραπέζι). Μεταξύ όλων των γονιδίων, HSPA2 παρουσίασαν συνεπή και αναμενόμενη τάση μεταξύ αυτών των 10 γονιδίων, όταν το χειρισμό JAG1. HSPA2, των οποίων οι κυτταρικές λειτουργίες στον καρκίνο του πνεύμονα είναι ασαφείς, ήταν υψηλότερη εκφράζεται (1.4 φορές σε κύτταρα Α549 και 1,2 φορές σε H226 κύτταρα) σε προϊόντα επιμόλυνσης JAG1 σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Εικόνα 4Α). Αντιστρόφως, η έκφραση του mRNA του HSPA2 μειώθηκε σε JAG1 knockdown κυττάρων (Σχήμα 4Β). Επιπλέον, η υπερέκφραση του V5-HSPA2 στο CL1-0 αυξημένη μετανάστευση των κυττάρων και τις ικανότητες εισβολής (Σχήμα 4C και 4D). Για να εξαιρέσετε αποτέλεσμα κυτταρική γραμμή, επιβεβαίωσαν περαιτέρω το φαινόμενο αυτό σε περισσότερες κυτταρικές σειρές. Μεταξύ προβληθεί καρκινικές κυτταρικές σειρές έξι πνεύμονα, επιλέξαμε τα πιο δύο κυτταρικές επίπεδο mRNA γραμμές χαμηλής JAG1, Η1299 και H838, για εξωγενή έκφραση JAG1 και τα πιο δύο κυτταρικές επίπεδο mRNA γραμμές υψηλής JAG1, HOP62 και Η322Μ, για JAG1 σίγηση (S2 σχήμα) . Σε Η1299 και κυτταρικές σειρές H838, η έκφραση του mRNA του HSPA2 προκλήθηκε με JAG1 (S3 Εικ). Σε κυτταρικές σειρές HOP62 και Η322Μ, η έκφραση του mRNA της HSPA2 μειώθηκε κατά JAG1 σίγησε (S4 σχήμα). Εξετάσαμε περαιτέρω αν αυτή η JAG1 /HSPA2 άξονα ήταν ανεξάρτητη από τη σηματοδότηση Notch. Κανονικού πρωτεολυτική ιδιότητα του ενδοκυττάρια περιοχή του Notch (NICD) οικογένεια συμπεριλαμβανομένων NICD1, NICD2, NICD3, και NICD4 αναλύθηκαν σε JAG1 χειραγωγείται κυτταρικές σειρές (Σχήμα 5). Επιπλέον, το μετεγγραφικό επίπεδο της DLL1 και άλλη εγκοπή κατάντη μορίων συμπεριλαμβανομένων CBF1, γυμνοσάλιαγκα, snail1, Smad3, HES1, HES3, HES5, HEY1, HEY2, και MYOD1 επίσης αντιμετωπιστεί. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι όλες οι NICDs και το επίπεδο mRNA του κατάντη μορίων (εκτός HES1) δεν είχε καμία σημαντική αλλαγή στην JAG1 υπερεκφράζεται CL1-0 κύτταρα (Σχήμα 5Α). Τα μπορεί να παρατηρηθεί σε JAG1 παρόμοια αποτελέσματα υπερεκφράζεται Η1299 (Σχήμα 5Β και S5 σχήμα) και H838 (Σχήμα 5Β και S6 σχήμα) κυτταρικές σειρές ή JAG1 σιγήσει κυτταρικές γραμμές HOP62 και Η322Μ (Σχήμα 5C), σε σύγκριση με πειράματα ελέγχου. Μόνο HES5 mRNA επηρεάστηκε από JAG1 στην κυτταρική σειρά Η1299. DAPT, ένας αναστολέας γ-σεκρετάσης για το μπλοκάρισμα της σηματοδότησης Notch, ήταν επίσης σε θέση να εξαλείψει HSPA2 μεταγραφική ρύθμιση προς τα πάνω από JAG1 (S7 σχήμα). Αυτό υποστήριξε την πιθανή ΕΓΚΟΠΗ-ανεξάρτητη ρύθμιση, τουλάχιστον σε αυτές τις κυτταρικές σειρές. Τέλος, θα θέλαμε να ελέγξετε αν JAG1 ήταν colocalized με HSPA2 και φθορίζουσα χρώση ανοσοϊστοχημείας εκτελέσθηκε στο τμήμα ιστού ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα ». Το αποτέλεσμα έδειξε JAG1 και HSPA2 ήταν ετερογενώς εκφράζεται σε μέρη όγκου και εν μέρει colocalized (S8 σχήμα). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι HSPA2 ήταν ένα κατάντη γονίδιο του JAG1 και ρυθμίζονται επίσης μετανάστευση καρκινικών κυττάρων και εισβολή.

(Α και Β) JAG1 παροδικά υπερεκφράζεται σε Α549 και H226 (Α) ή knockdown με JAG1 siRNAs σε CL1 -5 (Β). HSPA2 mRNA μετρήθηκε με πραγματικού χρόνου ποσοτική RT-PCR και ομαλοποιήθηκε ως προς ΤΒΡ. (Γ) ικανότητα μετανάστευση κυττάρων CL1-0 με παροδική υπερέκφραση HSPA2 και ελέγχου των κυττάρων εκτιμήθηκε με δοκιμασία μετανάστευσης. *,

σ

& lt? 0,05, σε σύγκριση με πλαστή έλεγχο. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD (η = 3 ανά ομάδα). (D) εισβολής κυττάρων CL1-0 με παροδική υπερέκφραση HSPA2 και ελέγχου κυττάρων, όπως αξιολογήθηκε με προσδιορισμό Matrigel εισβολή. *,

σ

& lt? 0,05, σε σύγκριση με πλαστή έλεγχο. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD (n = 3 ανά ομάδα).

Η

κυττάρων παροδικά υπερεκφράζεται JAG1 από πλασμίδιο έκφρασης ή σιγήσει JAG1 από τη στρατηγική siRNA ακολουθούμενη από ανοσοαποτύπωση με NICD1, NICD2, NICD3 και NICD4 αντισώματα ή πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR ανάλυση για NOTCH κατάντη μορίων επίπεδο mRNA. (Α) JAG1 υπερεκφράζεται σε CL1-0 κύτταρα που ακολουθείται από ανάλυση κηλίδος Western για NICDs πρωτεολυτική ιδιότητα ή πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR ανάλυση για NOTCH κατάντη μορίων επίπεδο mRNA. (Β) JAG1 υπερεκφράζεται σε κυτταρικές σειρές Η1299 και H838 ακολουθούμενη από ανάλυση Western blot για NICDs πρωτεολυτική κατάστασης. (Γ) JAG1 σιγήσει σε κυτταρικές σειρές HOP62 και Η322Μ που ακολουθείται από ανάλυση κηλίδος Western για NICDs πρωτεολυτική κατάστασης. DAPT είναι ένας αναστολέας γ-εκκριτάσης και χρησιμοποιούνται για τον έλεγχο σηματοδότηση Notch. UD, απροσδιόριστο οφείλεται σε μη ανιχνεύσιμα επίπεδα έκφρασης? *,

σ

& lt? 0,05 σε σύγκριση με πλαστή έλεγχο. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD (n = 3 ανά ομάδα).

Η

Συζήτηση

Ανακάλυψη των ογκογονιδίων /ογκοκατασταλτικών γονιδίων και χαρακτηρισμός των υποκείμενων μοριακών μηχανισμών όχι μόνο να διευκρινίσει τον περίπλοκο φύση της ογκογένεσης και της εξέλιξης του καρκίνου, αλλά και να αποτελέσει τη βάση για την ανάπτυξη καλύτερων στρατηγικών στη διάγνωση του καρκίνου, την πρόγνωση, πρόβλεψη και θεραπεία στο μέλλον. Τα ευρήματά μας έδειξαν την ογκογόνο ρόλο των JAG1 στον καρκίνο του πνεύμονα, την προώθηση εισβολή καρκίνου και μετάσταση. Κλινικά δεδομένα έδειξαν ότι η έκφραση του mRNA JAG1 συνδέεται με κακή επιβίωση σε ασθενείς με υπότυπο πλακώδες καρκίνωμα του NSCLC. Σε προηγούμενη μελέτη, η έκφραση του JAG1 στους ιστούς των πνευμόνων της ιδιοπαθούς πνευμονικής ίνωσης, η οποία προδιαθέτει σε καρκίνο του πνεύμονα, ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω. Επιπλέον, η έκφραση της πρωτεΐνης του JAG1 του πλακώδους μεταπλασίας αλλοιώσεων είναι θετική σε 83% των περιπτώσεων προσδιορίστηκε με ανοσοϊστοχημική χρώση [19]. Ως εκ τούτου, η έκφραση JAG1 σε καρκίνους του πνεύμονα, συμπεριλαμβανομένων των πλακωδών καρκίνωμα, μπορεί να έχουν υψηλό αντίκτυπο των κλινικές επιπτώσεις.

Τα μονοπάτια σηματοδότησης Notch είναι συνήθως θεωρείται ότι είναι που επάγεται με συνδέτη [10], και οι υποδοχείς και οι συνδέτες είναι ιδιαίτερα co -expressed σε καρκίνους [15, 20]. Σύμφωνα με τα στοιχεία των μικροσυστοιχιών μας, η υπερέκφραση του JAG1 δεν αποδεικνύονται σημαντικά για σηματοδοτικό μονοπάτι Notch (εκτός NOTCH3 με 1,67 φορές αλλαγή) σε κύτταρα CL1-0 (S4 Πίνακας). Το αποτέλεσμα του πραγματικού χρόνου ποσοτική επικύρωση RT-PCR παρέχεται επίσης σε παρόμοια συμπεράσματα (S5 Πίνακας). Η διφορούμενη έκφραση εγκοπές και κατάντη μορίων σε JAG1 επιμολυσμένα CL1-0 μπορεί να προκύψει από τον πληθυσμό ετερογενών κυττάρων. Επιπλέον, HES1 ήταν ελαφρώς up-ρυθμίζεται JAG1 υπερεκφράζεται CL1-0 κύτταρα (Σχήμα 5Α και S5 Πίνακα). Έτσι, δεν μπορούμε να αποκλείσουμε την εμπλοκή της σηματοδότησης ΕΓΚΟΠΗ ιδιαίτερα την NOTCH3 σηματοδότησης σε CL1-0. Οι συνδέτες Notch έχουν αναφερθεί ότι έχουν δραστικότητα σηματοδότησης ενδογενή συνδέτη ανεξάρτητη από υποδοχείς Notch. Μετά από μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις, πρωτεολυτική επεξεργασία, ενδοκυττάρωση, και της εμπορίας μεμβράνη, συνδέτες Notch θα είναι πολυλειτουργικό [21]. Αυτά τα άφησε να εννοηθεί ότι JAG1 σε τμήματα του NSCLC μπορεί να προκαλέσει noncanonical μονοπάτια σηματοδότησης. Σε αυτή τη μελέτη, αναλύσαμε πλήρως η σηματοδότηση εγκοπή στο JAG1 υπερεκφράζεται καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικές σειρές εξετάζοντας την πρωτεολυτική ιδιότητα του NICD και κατάντη μορίων σηματοδότησης Notch. Μόνο HES5 είχε βρεθεί να μειωθεί σε JAG1 υπερεκφράζεται Η1299 κυτταρική γραμμή (S5 σχήμα). Είτε αυτό είχε σημασία στη μετάσταση των όγκων εξακολουθεί να είναι απαραίτητη για να ερευνηθεί. Λαμβανόμενα μαζί, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι JAG1 είναι επίσης σε θέση να διαμεσολαβεί κυτταρική μετανάστευση, εισβολή και μετάσταση του NSCLC μέσω Notch-ανεξάρτητο μονοπάτι

Αρκετές μελέτες έχουν αναφέρει ότι JAG1 μεσολαβεί πολλαπλά μονοπάτια σηματοδότησης όπως:. ΑΡ-1 , ΜΑΡΚ, EGFR, NF-κβ, και IL-6 σε διαφορετικά κύτταρα όγκου [22-26]. δεδομένα μικροσυστοιχιών μας έδειξαν ότι JAG1 ρυθμίζει πολλά γονίδια όπως προσκόλληση μόριο με Ig επικράτεια 2 που μοιάζει (AMIGO2), Inhibin, Beta Ε (INHBE), θερμικής καταπληξίας 70kDa Πρωτεΐνη 2 (HSPA2), Σπέρματος πρωτεΐνης που σχετίζεται με τον πυρήνα, X-Linked , μέλος της οικογένειας (Spanx), και G πρωτεΐνη υποδοχέα συνδυασμό, Κατηγορία Γ, Ομάδα 5, τα κράτη Β (GPRC5B). HSPA2 έχει βρεθεί να υπερεκφράζουν σε πολλούς τύπους καρκίνου. Επιπλέον, οι ασθενείς με υψηλότερη έκφραση HSPA2 είχαν μικρότερη συνολική επιβίωση σε σύγκριση με τους ασθενείς κάτω HSPA2 [27-30]. Αυτά είναι συνεπείς με μας

in vitro

δεδομένα που HSPA2 παίζει ογκογόνο ρόλο σε κυτταρικές σειρές NSCLC. Σημαντικό, παρέχεται μια νέα παράσταση του μηχανισμού HSPA2 σηματοδότησης.

Αν και ο υποκείμενος μηχανισμός της HSPA2 στη μετάσταση του καρκίνου ήταν λιγότερο τεκμηριωμένη, κρίσιμο ρόλο της στην ανάπτυξη του όγκου και το μεταστατικό δυναμικό είχε υποτεθεί. Με βάση τη συμμετοχή του σχηματισμού του ενεργού συμπλέγματος Β1 CDC2 /κυκλίνη και έκφραση σε όγκους, μπορεί να ρυθμίσει τις ιδιότητες των καρκινικών κυττάρων κακοήθειας, όπως η μετανάστευση και την εισβολή [31-34]. Πρόσφατα, HSPA2 αναφέρθηκε ότι εκφράστηκε σε SCC και όχι σε αδενοκαρκίνωμα και συσχετίστηκε με κακή συνολική επιβίωση, υποστηρίζοντας το εύρημα μας σε SCC [29]. Ήταν πιθανό ότι HSPA2 συσχετίζεται με κακή επιβίωση σε SCC, λόγω της αντι-απόπτωση μέσω κατάντη παράγοντες, όπως φακό αυξητικός παράγοντας που προέρχεται από επιθήλιο (LEDGF) [35]. Πρόσφατα, πρωτεΐνη θερμικού σοκ 70 αναφέρθηκε επίσης να αλληλεπιδράσει με το NICD1 και συμβάλλουν στην NOTCH σηματοδότηση [36]. Σε αυτή τη μελέτη, υπογράμμισε το ρόλο της JAG1 που προκαλείται από μη κανονική σηματοδότηση Notch στην NSCLC. Παρά το γεγονός ότι JAG1 και HSPA2 ήταν colocalized μόνο εν μέρει σε βιοψία του όγκου των ασθενών (S8 σχήμα), η ρύθμιση της HSPA2 από JAG1 θα μπορούσε να είναι ένα σημαντικό εύρημα για τον καρκίνο του πνεύμονα κακοήθεια. Είτε JAG1 μπορούν να αλληλεπιδρούν με υποδοχείς άλλους από εγκοπές και προκαλούν HSPA2 μεταγραφική ρύθμιση προς τα πάνω πρέπει να διερευνηθεί περαιτέρω. Η δυνατότητα HSPA2, μία πρωτεΐνη θερμικού σοκ, να είναι ένας πιθανός θεραπευτικός στόχος μπορεί να αναμένεται. Εν ολίγοις, τα ευρήματά μας είναι η πρώτη που αποτελούν τη βάση που JAG1 χρησιμεύει ως προγνωστικό βιοδείκτη και άξονα JAG1 /HSPA2 συμβάλλει στην κακοήθεια του καρκίνου του πνεύμονα.

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 Εικ. έκφραση JAG1 και την επιβίωση των ασθενών με NSCLC »

doi:. 10.1371 /journal.pone.0150355.s001

(PDF)

S2 Εικ. Η ενδογενής έκφραση mRNA JAG1 σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου του πνεύμονα έξι

doi:. 10.1371 /journal.pone.0150355.s002

(PDF)

S3 Σχ. έκφραση HSPA2 mRNA είναι up-ρυθμίζεται από JAG1 mRNA υπερέκφραση

doi:. 10.1371 /journal.pone.0150355.s003

(PDF)

S4 Εικ. έκφραση HSPA2 mRNA ρυθμίζεται προς τα κάτω από JAG1 mRNA αποσιώπηση

doi:. 10.1371 /journal.pone.0150355.s004

(PDF)

S5 Εικ. mRNA έκφραση του Notch κατάντη μορίων σε JAG1 υπερεκφράζεται Η1299 κύτταρα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0150355.s005

(PDF)

S6 Εικ. mRNA έκφραση του Notch κατάντη μορίων σε JAG1 υπερεκφράζεται H838 κύτταρα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0150355.s006

(PDF)

S7 Εικ. Up-ρύθμιση των HSPA2 από JAG1 ήταν ανεξάρτητη της σηματοδότησης ΕΓΚΟΠΗ

doi:. 10.1371 /journal.pone.0150355.s007

(PDF)

S8 Εικ. Φθορισμού ανοσοϊστοχημική χρώση για JAG1 και HSPA2

doi:. 10.1371 /journal.pone.0150355.s008

(PDF)

S1 πίνακα. Primer αλληλουχίες των γονιδίων στόχων που χρησιμοποιούνται σε SYBR Green πραγματικού χρόνου ποσοτική RT-PCR

doi:. 10.1371 /journal.pone.0150355.s009

(PDF)

S2 Πίνακα.