Αφηρημένο

αναστολή αγγειογένεση είναι μια σημαντική θεραπευτική στρατηγική για τον προχωρημένο καρκίνο του προστάτη σταδίου. Προηγούμενη εργασία από το εργαστήριο μας έδειξαν ότι η παρατεταμένη διέγερση Rap1 από 8-pCpT-2′-O-Me-cAMP (8CPT) μέσω ενεργοποίησης της EPAC, ένα Rap1 GEF, ή με έκφραση ενός ουσιαστικά δραστικής μεταλλαγμένο Rap1 (cRap1) καταστέλλει την ενδοθηλιακή κύτταρο χημειοταξία και την επακόλουθη αγγειογένεση. Όταν ελέγξαμε αυτό το μοντέλο, στο πλαίσιο ενός ξενομοσχεύματος όγκου του προστάτη, βρήκαμε ότι 8CPT δεν είχε σημαντική επίδραση στην ανάπτυξη του όγκου του προστάτη και μόνο. Ωστόσο, σε κύτταρα που φιλοξενούν cRap1, 8CPT ανέστειλε δραματικά όχι μόνο την ανάπτυξη του όγκου του προστάτη, αλλά επίσης VEGF έκφραση και την αγγειογένεση μέσα στο μικροπεριβάλλον του όγκου. Μετέπειτα ανάλυση του μηχανισμού αποκάλυψε ότι, σε επιθηλιακά κύτταρα όγκου του προστάτη, 8CPT ενήργησε μέσω διέγερσης του ΡΚΑ παρά EPAC /Rap1. ΡΚΑ ανταγωνίζεται Rap1 και υποξικών επαγωγή έκφρασης πρωτεΐνης 1α, παραγωγή VEGF και, τελικά, την αγγειογένεση. Μαζί αυτά τα ευρήματα παρέχουν ενδείξεις για μια νέα αλληλεπίδραση μεταξύ Rap1, EPAC και PKA που ρυθμίζει τον όγκο στρωματικά επαγωγή της αγγειογένεσης

Παράθεση:. Menon J, Doebele RC, Gomes S, Bevilacqua Ε, Reindl KM, Rosner MR (2012) Ένα μυθιστόρημα Αλληλεπίδραση μεταξύ Rap1 και PKA Ρυθμίζει επαγωγή της αγγειογένεσης στον καρκίνο του προστάτη. PLoS ONE 7 (11): e49893. doi: 10.1371 /journal.pone.0049893

Επεξεργαστής: Ο Carl G. Μάκη, του Πανεπιστημίου Rush Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 17 Σεπτεμβρίου 2012? Αποδεκτές: 15 του Οκτ, 2012? Δημοσιεύθηκε: 15 Νοέμβρη 2012

Copyright: © 2012 Menon et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από PC094476 – Department of Defense (DOD) Καρκίνος του προστάτη Πρόγραμμα Έρευνας (PCRP) Μεταδιδακτορικός Fellowship (JM) και το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας /National Cancer Institute R01-CA109278 (MRR). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη είναι η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο που σχετίζονται με τους άνδρες στις Ηνωμένες Πολιτείες [1]. Η υψηλή νοσηρότητα και θνησιμότητα που σχετίζεται με την έναρξη της ορμονικά ανθεκτικών, μεταστατικό καρκίνο του προστάτη εντολές στην ανάγκη για καινοτόμα θεραπευτικά σχήματα για να βελτιώσει την πρόγνωση της ασθένειας αυτής. Αρκετές στρατηγικές έχουν χρησιμοποιηθεί για τη στόχευση της αγγειογένεσης στον καρκίνο του προστάτη, συμπεριλαμβανομένων αποκλεισμός της προ-αγγειογόνοι παράγοντες, όπως αγγειακό ενδοθηλιακό αυξητικό παράγοντα (VEGF) μέσω μονοκλωνικών αντισωμάτων ή αναστολέων μικρών μορίων στόχευσης καθοδικών πορειών τελεστή σηματοδότησης όπως το μονοπάτι VEGF υποδοχέα τυροσίνης κινάσης [2], [ ,,,0],3], [4]. Ωστόσο, το μεγαλύτερο μειονέκτημα αυτής της προσέγγισης είναι ο σημαντικός αριθμός των προ-αγγειογόνων παραγόντων εκτός από τον VEGF, που μπορεί να επάγει την αγγειογένεση και έτσι να αποφύγει αυτούς τους παράγοντες. Μια εναλλακτική λύση για την αναστολή μιας ή περισσοτέρων από τις προ-αγγειογόνους παράγοντες είναι να ταυτοποιηθούν μόρια σηματοδότησης που λειτουργούν για να ρυθμίζουν την αγγειογένεση [5].

Αρκετές μελέτες έχουν ενοχοποιηθεί Rap1 ως μεσολαβητής της αγγειογένεσης [5], [6] , [7], [8], [9], [10], [11]. Ελαττωματικά αγγειογένεση και την αιματοποίηση παρατηρήθηκαν σε ποντίκια που στερούνται Rap1a ή Rap1b, και ένα μηχανισμό που περιλαμβάνει ιντεγκρίνες και τους υποδοχείς του VEGF στα ενδοθηλιακά κύτταρα αναφέρθηκε πρόσφατα [12], [13], [14], [15], [16], [17] , [18]. Έτσι, η απώλεια του Rap1 αναστέλλει την αγγειογένεση κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης, σύμφωνα με τα παιχνίδια ρόλο Rap1 στο κελί σηματοδότηση, διαμεσολαβούμενη από ιντεγκρίνη προσκόλλησης κυττάρου και κόμβους κυττάρου-κυττάρου, λειτουργίες που είναι σημαντικές για το σχηματισμό σωληνοειδούς δομής. Το στρατόπεδο παράγωγο 8CPT-2Me-cAMP (8CPT) είναι ένας ισχυρός αγωνιστής της EPAC, ένας παράγοντας ανταλλαγής νουκλεοτιδίων γουανίνης για Rap1, και το αδύναμο αγωνιστή της PKA [18], [19]. Προηγούμενη εργασία από το εργαστήριο μας έδειξαν ότι, σε πρωτογενή ανθρώπινα μικροαγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα, η παρατεταμένη διέγερση Rap1 είτε με ενεργοποίηση EPAC μετά από θεραπεία 8CPT ή με έκφραση ιδιοσυστατικά ενεργοποιημένης Rap1 A63E (cRap1) αναστέλλει τη χημειοταξία και την αγγειογένεση [8], [9]. Έτσι, η αγγειογένεση μπορεί επίσης να ανασταλεί σε ενδοθηλιακά κύτταρα, όταν Rap1 υφίσταται παρατεταμένη διέγερση από φάρμακα ή μετάλλαξη. Μαζί αυτές οι μελέτες προτείνουν ότι ο βαθμός ενεργοποίησης Rap1 είναι κρίσιμο για την αγγειογενετική διαδικασία.

ΡΚΑ έχει επίσης συνδεθεί με την αγγειογένεση καθώς και οι δύο ένα θετικό και αρνητικός ρυθμιστής [20], [21], [22], [ ,,,0],23], [24], [25], [26]. Η αυξημένη δραστηριότητα της ΡΚΑ προάγει τον σχηματισμό ενδοθηλιακών σωλήνων, προωθώντας έτσι την αγγειογένεση [27]. Αντιστρόφως, η ενεργοποίηση ΡΚΑ προκαλεί τη φωσφορυλίωση του μεταγραφικού καταστολέα ID1 [28] και διαταράσσει πυρηνο-κυτταροπλασματική παλινδρόμηση του, αναστέλλοντας έτσι την αγγειογένεση [29]. Επιπλέον, είτε υπερ-έκφραση της καταλυτικής υπομονάδας της ΡΚΑ ή φαρμακολογική ενεργοποίηση του ΡΚΑ επάγει το θάνατο των ενδοθηλιακών κυττάρων με απόπτωση, καταστέλλοντας την αγγειογένεση [22], [23]. Συνολικά αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η αγγειογένεση αποτελέσματα από μια ισορροπία των προ-και αντι-αγγειογόνους παράγοντες συμπεριλαμβανομένων Rap1 και ΡΚΑ, και είτε ακραίες θα έχει αρνητικές επιπτώσεις.

Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να προσδιορίσει αν Rap1 ρυθμίζει την αγγειογένεση σε όγκων του προστάτη. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι συστατική ενεργοποίηση Rap1 σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του προστάτη προωθεί επαγωγή υποξική του VEGF και η αγγειογένεση, και ΡΚΑ ανταγωνίζεται αυτό το αποτέλεσμα. Επιπλέον, οι μελέτες μας δείχνουν ότι η θεραπεία 8CPT μπορεί να αναστείλει την αγγειογένεση μέσω δύο διαφορετικών μηχανισμών που περιλαμβάνουν ενεργοποίηση ΡΚΑ σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη, όπως φαίνεται εδώ, και ενεργοποίηση EPAC /Rap1 σε ενδοθηλιακά κύτταρα [8].

(Α και Β)

Αριστερό πλαίσιο

: ο όγκος του όγκου (που εκφράζεται σε mm

3) ανθρώπινης PC3 και PC3-cRap1 ξενομοσχεύματα αντιμετωπίζονται ως υποδεικνύεται μετρήθηκε όπως περιγράφεται στις μεθόδους. Ημέρα 0 αντιπροσωπεύει την πρώτη ημέρα της θεραπείας? * P

& lt?

0.05, η = 7 για κάθε ομάδα.

Δεξιά Panel

: Εικόνες ενός αντιπροσωπευτικού όγκου από κάθε ομάδα αγωγής, στο τέλος του πειράματος (Ημέρα 28). (Γ) Ο όγκος του όγκου (που εκφράζεται σε mm

3) ανθρώπινης PC3 και ξενομοσχευμάτων PC3-cRap1 αντιμετωπίζονται ως υποδεικνύεται μετρήθηκε όπως στο Α? * P

& lt?

0.05, η = 7 για κάθε ομάδα. (Δ) όγκοι από τον πίνακα C ζυγίστηκαν στο τέλος του πειράματος (Ημέρα 28) και εκφράζεται σε γραμμάρια? * P & lt? 0,05? (

n

= 7).

Η

Υλικά και Μέθοδοι

Καρκίνος του προστάτη κυτταρικές σειρές, θεραπείες, αντισώματα, πλασμίδια, και αντιδραστήρια

EPAC ενεργοποιητής 8- (4-χλωροφαινυλθειο) -2-Ο-μεθυλ-cAMP (8CPT) και ΡΚΑ ενεργοποιητή Ν6-Benzoyladenosine- 3 ‘, 5’-κυκλικής μονοφωσφορικής (6-Bz-cAMP) αγοράστηκαν από BIOLOG ζωής Ινστιτούτο Επιστημών (Bremen , Γερμανία). LNCaP κύτταρα και PC3 κύτταρα, ελήφθησαν από Αμερικανική Συλλογή Tissue Culture (Manassas, Virginia), διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2 σε Mediatech RPMI 1640 με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, 50 μg /mL πενικιλλίνη και 50 U /mL στρεπτομυκίνη. Όλα τα μέσα και τα αντιδραστήρια ανάπτυξης αγοράστηκαν από την Gibco BRL (Grand Island, ΝΥ). Τα κύτταρα επωάστηκαν για 24 ώρες με μέσο ελεύθερο ορού πριν από κάθε θεραπεία. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία επί μία νύκτα με 10 μΜ 8CPT ή 10 μΜ 6Bz-cAMP διαλυμένο σε PBS ή PBS μόνο ως μέσο ελέγχου. Τα κύτταρα περαιτέρω επεξεργασία για 6 ώρες (εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά) με 10 μΜ CoCl

2 για να μιμηθεί συνθήκες υποξίας ή με SDF-1α σε 200 ng /ml για 20 λεπτά. Τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με την ΡΚΑ αναστολείς H-89 (10 μΜ) για 30 λεπτά πριν CoCl

2 θεραπεία. Αντισώματα στην EPAC και τουμπουλίνης λήφθηκαν από Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Ποντικού αντι-ανθρώπινο CD31 και αντι-ανθρώπινο VEGF κουνελιού αγοράστηκαν από Abcam (Cambridge, ΜΑ). SDF-1α ελήφθη από R &? Συστήματα D (Minneapolis, ΜΝ) και Η-89 αγοράστηκε από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ), μυριστοϋλοποιημένες PKI ήταν από την Invitrogen (Grand Island, ΝΥ), και αντισώματα προς VASP ή phosphoVASP ήταν από τη Cell Signaling (Boston, MA).

(Α και Β) CD31 και VEGF ανοσολογική αντίδραση στο PC3 και οι όγκοι PC3-cRap1. Η ανοσοχρώση μετρήθηκε όπως περιγράφεται στις Μεθόδους.

δεξί πάνελ

: Εκπρόσωπος μικροφωτογραφίες.

Αριστερό Πάνελ

: Ποσοτικοποίηση των ανοσοϊστοχημική χρώση τομών του όγκου? * P & lt? 0,05? n = 7? Α.υ. = Αυθαίρετες μονάδες. (Γ) Ο όγκος του όγκου (που εκφράζεται σε mm

3) των ανθρώπινων ξενομοσχευμάτων PC3-cRap1. κύτταρα PC3-cRap1 εγχύθηκαν ως ξενομοσχεύματα την Ημέρα 0 και αφέθηκαν να αναπτυχθούν για 10 ημέρες πριν από μια οσμωτική μικροαντλία που περιέχει τις θεραπείες εμφυτεύθηκε για συνεχή έγχυση (Ημέρα 10, αντλία). Οι όγκοι μετρήθηκαν σε επεξεργασία όπως υποδεικνύεται, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους? * P & lt? 0,05? n = 8 για κάθε ομάδα. (Δ) Το βάρος του όγκου των ανθρωπίνων ξένων μοσχευμάτων PC3-cRap1. Όγκοι από τον πίνακα C ζυγίστηκαν στο τέλος του πειράματος (Ημέρα 38) και εκφράζεται σε γραμμάρια? * P & lt? 0,05? (

n

= 8).

Η

Δήλωση Ηθικής

Όλες οι διαδικασίες που αφορούν τα ποντίκια συμμορφωθεί με τις πολιτικές του Πανεπιστημίου του Σικάγο Θεσμικών φροντίδα των ζώων και την Επιτροπή Χρήση (IACUC ) και εγκρίθηκαν από IACUC βάσει του πρωτοκόλλου # 1196. Τα ποντίκια στεγάστηκαν στο Ιχθυοτροφείο στον Gordon Κέντρο Ολοκληρωμένης Επιστήμης στο Πανεπιστήμιο του Σικάγο το ειδικό δωμάτια με αεριζόμενους κλουβί με HEPA-φιλτραρισμένο αέρα (12 ωρών φωτός /σκότους). Ποντίκια είχαν πλήρη πρόσβαση σε νερό και τρόφιμα. Οι ποντικοί παρακολουθούνται καθημερινά από το ερευνητικό προσωπικό. Η ικανότητα στα τρόφιμα πρόσβασης και το νερό, την κινητικότητα των πίσω άκρων, φυσιολογική αναπνοή, η κανονική βάδιση και την κοινωνική συμπεριφορά αξιολογήθηκαν. Εάν ένα ζώο φάνηκε να είναι άρρωστος αυτό παρακολουθήθηκε για 24 ώρες και στη συνέχεια αναισθητοποιούνται με ισοφλουράνιο και θυσιάστηκαν με αέριο παράγοντα ακολουθούμενη από αυχενική εξάρθρωση. Τα ζώα επίσης ευθανασία σχετικά με τη σύσταση του κτηνιάτρου ή κλινικό προσωπικό. Όλες οι διαδικασίες πραγματοποιήθηκαν υπό κεταμίνη /ξυλαζίνη αναισθησία, και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία.

Μοντέλο Ξενομοσχεύματος του Ανθρώπινου Καρκίνος του προστάτη

Άντρας αθυμικά ποντίκια (15-20 g, 4-6 εβδομάδες της ηλικίας, του National Cancer Institute, Frederick, MD) εμβολιάσθηκαν υποδορίως στην κάτω αριστερή πλευρά με 1 × 10

6 PC3 (PC3-GFP) ή PC3-cRap1 (PC3-cRap1A63E-GFP) καρκίνου του προστάτη κύτταρα αιωρούνται σε 200 μι PBS. Τα ποντίκια τυχαιοποιήθηκαν για θεραπεία είτε με PBS ή 2,5 μιτιοΙ 8CPT, ή 2,5 μιτιοΙ H-89. Για το σκοπό αυτό, οι ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε ανωτέρω και ωσμωτική μίνι αντλίες (Alzet μοντέλο 2004, Durect Corp, Cupertino, CA) εισήχθησαν υποδορίως για να εμποτίσουν είτε PBS, 8CPT ή Η-89 για 28 ημέρες. Στο τέλος της θεραπείας τα ζώα υποβλήθηκαν σε ευθανασία, οι όγκοι αφαιρέθηκαν, σταθμισμένο και επεξεργασία για ανοσοϊστοχημεία. Ο όγκος του όγκου μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο -1/2 × l × w

2 κάθε δεύτερη μέρα, όπου L = μήκος και w = πλάτος.

(Α) Τα επίπεδα VEGF μετρήθηκαν με ELISA σε PC3 και κύτταρα PC3-cRap1 κάτω από υποξικές συνθήκες παρόμοιες (COCI

2) όπως περιγράφεται στις μεθόδους? * Ρ & lt? 0,05, (n = 3). (Β) Ανάλυση ανοσοαποτύπωσης των πυρηνικών εκχυλισμάτων από PC3 και PC3-cRap1 κύτταρα που κατεργάζονται όπως υποδεικνύεται. επίπεδα πρωτεΐνης HIF-1α προσδιορίστηκαν με ανοσοστύπωμα με ειδικό αντίσωμα? (C) Ανάλυση των επιπέδων του VEGF mRNA με qPCR σε PC3 και τα κύτταρα PC3-cRap1 αντιμετωπίζονται όπως υποδεικνύεται. Δεδομένα κανονικοποιήθηκαν σε επίπεδα GAPDH? * Ρ & lt? 0,05 (

n

= 3)

Η

Ανοσοϊστοχημεία

όγκοςΠοντίκι μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη για 24 ώρες και επωάζονται σε 70% αιθανόλη για. 48 ώρες πριν από την παραφίνη. Τα ενσωματωμένα όγκοι κόπηκαν σε πέντε τμήματα πάχους μικρόν και χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη για να προσδιοριστεί μορφολογία. Τμήματα των όγκων εγχύεται με 8CPT, Η-89 ή PBS ανοσοχρωματίστηκαν για VEGF, CD31 ή Κί67 χρησιμοποιώντας το σημασμένο στρεπταβιδίνης-βιοτίνης μέθοδος για τη μέτρηση της κυτταρικής αγγειογένεση ή πολλαπλασιασμό. Χρωματισμένες τομές έγιναν ορατά και φωτογραφήθηκαν με ένα σύστημα ανάλυσης εικόνας βίντεο (Scion, Inc., Frederick, MD). Ένα αυτοματοποιημένο σύστημα απεικόνισης κύτταρο χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση ανοσοϊστοχημική χρώση VEGF. πυκνότητα τριχοειδών υπολογίστηκε μετρώντας σκάφη ανοσοχρώση με CD31 +. Τουλάχιστον 6 τυχαία πεδία μετρήθηκαν σε ένα αντιπροσωπευτικό τμήμα. Οι τιμές παρουσιάζονται ως μέσο συν ή μείον SEM.

VEGF ELISA

Κύτταρα (5 × 10

4) απλώθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων. Όταν τα κύτταρα ήταν 70-80% συρροή, αυτά υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφεται παραπάνω. Μέσο συλλέχθηκε από τα φρεάτια και τα επίπεδα VEGF προσδιορίστηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή για ανθρώπινο VEGF ανάπτυξης ELISA kits (PeproTech, Rocky Hill, NJ).

Απομόνωση RNA και αντίστροφη μεταγραφή /πραγματικό χρόνο Αντίδρασης Αλυσίδας Πολυμεράσης

RNA απομονώθηκε από τα κύτταρα χρησιμοποιώντας QIAshredder και RNeasy

R MINIKIT από Qiagen Biosciences και υποβλήθηκε σε RT-PCR χρησιμοποιώντας κιτ αντίστροφης μεταγραφάσης του cDNA υψηλής χωρητικότητας (Applied Biosystems, Carlsbad, CA). Ποσοτική πραγματικό χρόνο αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (qPCR) εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας Gene δοκιμασίες έκφρασης από την Applied Biosystems και 2Χ κύριου μείγματος από την Applied Biosystems ή AbGene επί της Applied Biosystems 7300 με StepOne Plus Real-Time PCR System. Τα αποτελέσματα ποσοτικοποιήθηκαν ως τιμές Ct, όπου Ct ορίζεται ως ο κύκλος κατώφλι της PCR στην οποία ενισχυμένο προϊόν ανιχνεύεται αρχικά, και καθορίζεται ως σχετική γονιδιακή έκφραση (ο λόγος του στόχου /ελέγχου). Όλες οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και κανονικοποιήθηκαν ως προς GAPDH (Applied Biosystems, Carlsabad, CA).

Παρασκευή πυρηνικών εκχυλισμάτων και κηλίδωση Western

Υπό-συρρέουσες PC3 και PC3-cRap1 κύτταρα λύθηκαν σε κρύο πυρηνικό ρυθμιστικό διάλυμα (10 mM HEPES, ρΗ 7,9, 1,5 mM MgCl2, 0,5 mM DTT, και 5% γλυκερίνη), που περιέχει πλήρες αναστολείς πρωτεάσης (EMD Chemicals, Paulsboro, NJ). Το παρασκεύασμα φυγοκεντρήθηκε στα 10.000 g για 15 λεπτά. Το ίζημα επαναιωρήθηκε σε 50 μΐ ρυθμιστικού υψηλού άλατος (10 mM HEPES, ρΗ 7,9, 400 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 0,5 mM DTT, και 5% γλυκερίνη) και επωάστηκαν σε πάγο για 20 λεπτά. Μετά από φυγοκέντρηση στα 14.000 g για 20 λεπτά, το υπερκείμενο συλλέχθηκε και λαμβάνεται ως το πυρηνικό κλάσμα και αποθηκεύθηκε στους -80 ° C. Πυρηνικές πρωτεΐνες (50 μg /φρεάτιο) από τον έλεγχο και 8CPT επεξεργασμένα κύτταρα κάτω από την υποξία σαν συνθήκες διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση SDS-πολυακρυλαμιδίου 7.5% και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ). Οι μεμβράνες επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα επί μία νύκτα (HIF-1α, 1:500? Novus Biologicals, Inc., Littleton, CO) ακολουθούμενο από 1 ώρα επώαση με δευτερογενές αντίσωμα αντι-ποντικού, συζευγμένο με υπεροξειδάση (1:2500? Sigma, St. Louis, ΜΟ). Χημειοφωταύγειας αντιδραστήρια χρησιμοποιήθηκαν για την οπτικοποίηση των ανοσοαντιδραστικές ζώνες. α-τουμπουλίνης (1:3000? Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) χρησίμευσε ως έλεγχος φόρτωσης

siRNA Η επιμόλυνση

EPAC siRNAs (ON-TARGETPlus siRNA, Dharmacon) στα 100 nm. επιμολύνθηκαν σε κύτταρα PC3 με ηλεκτροδιάτρηση (223 V για 23 msec). Τα κύτταρα αναλύθηκαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση.

Δοκιμασία Δραστηριότητα Rap1

επίπεδα Rap1-GTP μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Rap1 Ενεργοποίησης Assay Kit (Cell Biolabs, San Diego, CA) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

Στατιστική Ανάλυση

τα δεδομένα αναλύθηκαν με τη χρήση GraphPad Prism v5 (GraphPad Software, Inc.). Τα δεδομένα δίδονται ως μέση τιμή ± SE και συγκρίνονται με το t-test, δοκιμή Wilcoxon και ενός ή δύο κατευθύνσεων ANOVA, ανάλογα με την περίπτωση, που ακολουθείται από τη σχετική post-hoc t-test για να προσδιοριστεί ρ-τιμές. Μία ρ-τιμή & lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως υποδεικνύεται και τα επίπεδα VEGF μετρήθηκαν με ELISA όπως περιγράφεται στις Μεθόδους.. (Α και Β) PC3 ή PC3-cRap1 κύτταρα? * Ρ & lt? 0,05, η = 3. (C και D) LNCaP ή LNCaP-cRap1 κύτταρα? * Ρ & lt? 0,05, η = 2.

Η

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως υποδεικνύεται, και τα επίπεδα VEGF μετρήθηκαν με ELISA όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. (Α) Αντιστροφή των αποτελεσμάτων 8CPT από H-89 σε κύτταρα PC3-cRap1? * P & lt? 0.05, n = 3. (Β) Αναστροφή 6BzcAMP (6 δισ) επιπτώσεις από την H-89 σε κύτταρα PC3-cRap1? * P & lt? 0.05, n = 3. (C) Αντιστροφή των αποτελεσμάτων 8CPT από H-89 σε PC3-cRap1cells? * P & lt? 0.05, n = 3.

Η

Αποτελέσματα

8CPT Αναστέλλει Ξενομοσχεύματος ανάπτυξη του προστάτη κυττάρων που εκφράζουν Ενεργός Rap1

Για να προσδιοριστεί η επίδραση των ενεργοποιημένων Rap1 για προστάτη την ανάπτυξη του όγκου, ενέθηκε αθυμικούς ποντικούς με κύτταρα PC3 που εκφράζουν ιδιοσυστατικά ενεργοποιημένα Rap1A63E (PC3-cRap1) ή κατεργασία με το παράγωγο 8CPT cAMP. Για την παράδοση 8CPT, τα ζώα υποβλήθηκαν σε αγωγή υποδορίως είτε με PBS ή 8CPT χρησιμοποιώντας μία οσμωτική μινι-αντλία. 8CPT χορηγήθηκε σε μια δόση των 2,5 μmol πάνω από 28 ημέρες, βασίζεται σε προηγούμενη πιλοτική μελέτη που δείχνει ότι αυτός ο ρυθμός έγχυσης ήταν καλά ανεκτή από τους ποντικούς. Κατά τη διάρκεια της περιόδου έγχυσης, τα ζώα διατηρήθηκαν κανονική κατανάλωση τροφής και νερού και δεν παρουσίασε ενδείξεις μειωμένης λειτουργίας του κινητήρα. Δεν ακαθάριστο παθολογικές ανωμαλίες παρατηρήθηκαν σε σημαντικά όργανα, γεγονός που υποδηλώνει έλλειψη τοξικών επιδράσεων στη δόση 8CPT δεδομένη. Η πρώτη ημέρα της έγχυσης ορίστηκε ως ημέρα 0, και τα ζώα θανατώθηκαν μετά από 28 ημέρες θεραπείας.

Ούτε εκφράζουν συντακτικά Rap1 (PC3-cRap1 + PBS) ούτε θεραπεία 8CPT μόνο (PC3 + ​​8CPT) μεταβλήθηκε σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου σε ξενομοσχεύματα PC3 (Εικ. 1Α, 1C). Ωστόσο, 8CPT μείωσε δραματικά την ανάπτυξη του όγκου σε ξενομοσχεύματα PC3-cRap1 (Σχ. 1Β, 1C). Ανάλυση των βαρών όγκου επιβεβαίωσε a & gt? 50% μείωση σε όγκους από PC3-cRap1 ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με 8CPT (Σχήμα 1D.). Τόσο ενεργοποιημένα Rap1 και 8CPT θεραπεία ήταν απαραίτητα για το σκοπό αυτό, αφού δεν παρατηρήθηκε μεταβολή σε όγκους σε 8CPT επεξεργασμένα ξενομοσχεύματα PC3 ή αγωγή με PBS Rap1 ξενομοσχεύματα.

(Α και Β) Ο αναστολέας ΡΚΑ, Η-89 (2,5 μmol), αντιστρέφεται όγκου αναστολή της ανάπτυξης και τη μείωση του βάρους του όγκου που προκαλείται από 8CPT σε PC3-cRap1 ξενομοσχευμάτων. PC3-cRap1 όγκους από ποντικούς εγχύθηκε με PBS, 8CPT, ή Η-89 μετρήθηκαν και ο όγκος του όγκου προσδιορίστηκε όπως περιγράφεται στις Μεθόδους? * P & lt? 0,05? n = 8 για κάθε ομάδα θεραπείας. (Γ) CD31 και VEGF ανοσοαντιδραστικότητα σε PC3-cRap1 όγκοι αντιμετωπίζονται ως υποδεικνύεται. Η ανοσοχρώση μετρήθηκε όπως περιγράφεται στις Μεθόδους.

Άνω Πάνελ

: Εκπρόσωπος μικροφωτογραφίες.

Κάτω Πάνελ

: Ποσοτικοποίηση των ανοσοϊστοχημική χρώση τομών του όγκου? * P & lt? 0,05? n = 8 για κάθε ομάδα αγωγής? Α.υ. = Αυθαίρετες μονάδες.

Η

8CPT αναστέλλει την αγγειογένεση σε PC3-cRap1 Ξενομοσχεύματα

Για την παρακολούθηση της επίδρασης της 8CPT επί της αγγειογένεσης στους όγκους του προστάτη, φορμόλη σταθερό φέτες όγκου ανοσοχρωματίστηκε με αντισώματα προς CD31 και VEGF, ένα ενδοθηλιακό κυτταρικό δείκτη και μία προ-αγγειογόνος παράγοντας, αντίστοιχα. αιμοφόρων αγγείων εντός του όγκου (CD31 +) εντοπίστηκαν από τη μορφολογία των πλοίων και μετρήθηκαν (Εικ. 2Α). Οι όγκοι από την ομάδα PC3 ζώων εγχυθεί με PBS ή 8CPT είχαν παρόμοιους αριθμούς των αιμοφόρων αγγείων και τα επίπεδα του VEGF ανοσοαντιδραστικότητα (Εικ. 2Α, 2Β). Η συνολική ανοσοαντιδραστικότητα VEGF στους όγκους ποντικών PC3-cRap1 αυξήθηκε σε σχέση με τους όγκους PC3 ποντίκι χωρίς να επηρεάσουν σημαντικά τριχοειδή πυκνότητα. Παραδόξως, η θεραπεία με 8CPT, όταν συγκρίνεται με PBS, μείωσε δραματικά τόσο την πυκνότητα αγγείων και την ανοσοαντιδραστικότητα VEGF σε όγκους PC3-cRap1. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ουσιαστικά δραστική Rap1 επάγει την παραγωγή VEGF, και 8CPT ανταγωνίζεται αυτό το αποτέλεσμα. Επιπλέον, 8CPT μειώνει το σχηματισμό αιμοφόρων αγγείων, η οποία μπορεί να συμβάλλει στην αναστολή της ανάπτυξης του όγκου του προστάτη σε αυτά τα ποντίκια.

8CPT Μειώνει τη συνεχή ανάπτυξη των προ-σχηματισμένων προστάτη όγκων που εκφράζουν Rap1

Σε αρχικά πειράματα μας (Εικ. 1), μπορούμε εγχέεται PC3-cRap1 κύτταρα και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 8CPT την ίδια ημέρα (ημέρα 0) για την πρόληψη της ανάπτυξης του όγκου. Για να προσδιορίσετε αν 8CPT θα μπορούσε επίσης να εμποδίσει τη συνεχιζόμενη ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων, που εγχέεται κύτταρα PC3-cRap1 σε ποντίκια και τους επέτρεψε να αναπτυχθούν σε ένα ψηλαφητό όγκο πριν από τη θεραπεία με 8CPT μέσω οσμωτικής μίνι αντλίες (Εικ. 2C). Παρόμοια με την προηγούμενη αγωγή, θεραπεία 8CPT των προϋπαρχόντων όγκων προκάλεσε μείωση περισσότερο από 43% σε βάρος του όγκου σε σύγκριση με PBS εγχύθηκε ζώα (Σχ. 2D). Ανάλυση πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων με ανοσοχρώση με Κί67 αντίσωμα έδειξε μόνο μια μέτρια μείωση μετά από θεραπεία 8CPT, γεγονός που υποδηλώνει ότι η μείωση του αριθμού των κυττάρων οφείλεται επίσης σε απώλεια κυττάρου (Εικ. S1). Ωστόσο, η απόπτωση και μόνο είναι απίθανο να είναι υπεύθυνη, αφού χρώση TUNEL δεν έδειξε σημαντική διαφορά (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι 8CPT όχι μόνο δρα για την πρόληψη της ανάπτυξης του όγκου, αλλά επίσης μειώνει την συνεχιζόμενη αύξηση των προ-σχηματίζονται όγκοι.

8CPT Αναστέλλει Αγγειογονικοί Επαγωγείς σε PC3-cRap1 κύτταρα σε συνθήκες υποξίας

Για να κατανοήσουμε το μηχανισμός με τον οποίο 8CPT καταστέλλει VEGF στον προστάτη ξενομοσχεύματα cRap1 όγκου, έχουμε αναπτύξει συνθήκες καλλιέργειας κυττάρων για να μιμηθούν αυτό το αποτέλεσμα. Στερεά καρκινικά κύτταρα συχνά αναπτύσσονται κάτω από συνθήκες υποξίας και υποξίας προάγει την αγγειογένεση. Ως εκ τούτου, αναλύσαμε τα επίπεδα πρωτεΐνης VEGF σε μέσα που απομονώνονται από κύτταρα προκατεργάστηκαν διάρκεια της νύχτας με 8CPT με μειωμένο ορό και στη συνέχεια περαιτέρω κατεργάζεται με CoCl

2 για 6 ώρες για να δημιουργηθεί υποξία-σαν συνθήκες. Σε κύτταρα PC3-cRap1, θεραπεία 8CPT μειωμένη παραγωγή VEGF μόνο κάτω από υποξικές συνθήκες παρόμοιες (COCI

2) (Εικ. 3Α). Αντίθετα, δεν υπήρξε καμία σημαντική μείωση της παραγωγής VEGF σε κύτταρα PC3 μετά από θεραπεία με 8CPT ταυτόχρονη έκθεση σε CoCl

2 (Σχ. 3Α). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η 8CPT επαγόμενη αναστολή της έκφρασης του VEGF που παρατηρείται σε όγκους PC3-cRap1 μπορούν να ανακεφαλαιωθούν

in vitro

μιμούμενο μία υποξικό περιβάλλον.

HIF-1α είναι ένας ετεροδιμερικός παράγοντας μεταγραφής που ρυθμίζεται αυξητικά σε υποξικά καρκινικά κύτταρα και προάγει την αγγειογένεση επιτρέποντας μεταγραφή των προ-αγγειογενετική γονιδίων όπως ο VEGF [30]. Για να προσδιορίσετε αν HIF-1α αναστολή θα μπορούσε να είναι ο μεσολαβητής του αποτελέσματος 8CPT στα επίπεδα του VEGF, αναλύσαμε HIF-1α έκφραση της πρωτεΐνης σε πυρηνικά εκχυλίσματα από PC3 και τα κύτταρα PC3-cRap1 αντιμετωπίζονται με 8CPT και CoCl

2. Όπως ήταν αναμενόμενο, μια σημαντική αύξηση του επιπέδου της πρωτεΐνης HIF-1α παρατηρήθηκε τόσο στην PC3 και τα κύτταρα PC3-cRap1 εξής CoCl

2 θεραπεία. Ωστόσο, ο HIF-1α επίπεδα πρωτεΐνης μειώθηκαν όταν τα κύτταρα PC3-cRap1 αλλά δεν PC3 κύτταρα προκατεργάστηκαν με 8CPT (Σχ. 3Β). Συνεπής με αυτό το αποτέλεσμα, παρατηρήσαμε μια σημαντική μείωση της VEGF mRNA μόνο σε κύτταρα PC3-cRap1 αγωγή με αμφότερα CoCl

2 και 8CPT (Εικ. 3C).

8CPT Ρυθμίζει VEGF Παραγωγή σε Προστάτη Κυτταρικές Γραμμές κατεργασμένης με ένα φυσιολογικό Activator του Rap1

Rap1 ενεργοποιείται από έναν αριθμό παραγόντων που περιλαμβάνουν ενδογενείς στρωματικά παράγωγα 1α Παράγοντα (SDF-1α), μια χημειοκίνη που προσδένεται στον υποδοχέα CXCR4 και διευκολύνει παλιννόστησης των κυττάρων που προέρχονται από μυελό των οστών [ ,,,0],31], [32]. Όπως φαίνεται προηγουμένως [31], θεραπεία των PC3 κυττάρων με SDF-1α για 20 λεπτά αύξησε σημαντικά το επίπεδο των ενεργοποιημένων ενδογενούς Rap1-GTP (Εικ. S2). Δεν παρατηρήσαμε αυξημένα επίπεδα ενδογενούς Rap1-GTP είτε PC3 ή κύτταρα PC3-cRap1 μετά από ολονύκτια επεξεργασία των κυττάρων με 8CPT. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι είτε οξεία SDF-1α θεραπεία ή συστατική ενεργοποίηση Rap1 αλλά δεν υπέστησαν επεξεργασία 8CPT οδηγεί σε αυξημένη δραστικότητα Rap1 στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη.

Για να προσδιορίσετε αν Rap1 ενεργοποιούνται σε απάντηση προς SDF-1α πράξεις παρόμοια με συστατικά ενεργοποιημένα Rap1, διερευνήσαμε την επίδραση της SDF-1α και 8CPT επί εκκρίνεται VEGF. SDF-1α επαγόμενη παραγωγή VEGF σε κύτταρα PC3 σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα PC3 (Σχ. 4Α), και αυτή η επαγωγή αποκλείστηκε σε κύτταρα PC3 που εκφράζουν Rap1GAP, ένα Rap1 ΟΤΡάσης που αδρανοποιεί Rap1 (Εικ. S3). Επιπλέον, η θεραπεία με CoCl

2 επάγεται περαιτέρω παραγωγή VEGF σε SDF-1α-διεγερμένα κύτταρα PC3, παρόμοια με CoCl

2 επεξεργασία των κυττάρων PC3-cRap1 (Σχ. 4Α, 4Β). Όπως και με τα κύτταρα PC3-cRap1, 8CPT αντέστρεψε την επαγωγή της παραγωγής VEGF σε SDF-1α-αγωγή PC3 κυττάρων υπό συνθήκες υποξίας.

Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν επίσης σε ένα λιγότερο επιθετικό, εξαρτώμενων από ανδρογόνα κυτταρική σειρά όγκου του προστάτη, LNCaP, ότι είτε υποβλήθηκε σε επεξεργασία με SDF-1α ή με σταθερά εκφράζονται συστατική Rap1 (Εικ. 4C, 4D). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ρύθμιση της παραγωγής του VEGF από 8CPT κάτω από συνθήκες υποξίας δεν περιορίζεται σε ένα τύπο κυττάρου και παρατηρείται σε απάντηση φυσιολογικών, καθώς και συστατική ενεργοποίηση της Rap1.

8CPT Ρυθμίζει VEGF Παραγωγή μεταγενέστεροι του Rap1

Για να κατανοήσουμε το ρόλο της ενεργοποίησης Rap1 στη ρύθμιση της παραγωγής του VEGF, παρόμοιες μελέτες που αφορούν 8CPT ή CoCl

2 θεραπεία διεξήχθησαν σε μη διεγερμένα ή SDF-1α-διεγερμένα PC3 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά Rap1GAP. Συνολικά, τα επίπεδα VEGF μειώθηκαν ως αποτέλεσμα της έκφρασης Rap1GAP (Εικ. S4). Παρά το γεγονός ότι η επαγωγή λόγω SDF-1α ήταν εντελώς καταστέλλεται, CoCl

2 διεγείρεται ακόμη παραγωγή VEGF παρουσία Rap1GAP, σύμφωνα με HIF-1α σταθεροποίησης. Επιπλέον, για όλη τη νύχτα προθεραπεία με 8CPT ακόμη μειωμένη CoCl

2-διεγερμένη παραγωγή VEGF, συνεπές με την παρατήρηση μας ότι 8CPT δρα ανάντη του HIF-1α για να μειώσει τα επίπεδα έκφρασης (βλέπε Εικ. 3Β). Τέλος, 8CPT προεπεξεργασία δεν μειώνουν συστατική δραστικότητα Rap1 (Εικ. S2), γεγονός που υποδηλώνει ότι ενεργεί κατάντη του Rap1. Στο σύνολό τους, τα στοιχεία δείχνουν ότι 8CPT αναστέλλει την παραγωγή της πρωτεΐνης VEGF αναστέλλοντας Rap1 ή υποξικό επαγωγή του HIF-1α.

8CPT Ρυθμίζει VEGF Παραγωγής μέσω της PKA στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη

Αν και 8CPT ενεργοποιεί Rap1 μέσω EPAC στα ενδοθηλιακά κύτταρα [8], το παρόν τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι 8CPT ανταγωνίζεται ενεργοποιημένη η λειτουργία Rap1 σε επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα του προστάτη που υποδηλώνει ότι ένας διαφορετικός μηχανισμός είναι υπεύθυνος. Συνεπής με αυτή την υπόθεση, μερική εξάντληση των Epac1 και Epac2 από τα siRNA δεν είχε καμία επίδραση στην εκκρίνεται VEGF σε κύτταρα PC3-cRap1 (Εικ. S5), αν και δεν μπορούμε να αποκλείσουμε ένα ρόλο για ΕΕΚΔ.

8CPT να ενεργοποιήσετε PKA αν και η συγγένειά του για EPAC είναι 107 φορές μεγαλύτερος [19], [33]. Για να δοκιμάσει αυτή τη δυνατότητα, θα καθοριστεί αν 8CPT διεγείρει PKA στα PC3 και PC3-cRap1 κύτταρα χρησιμοποιώντας φωσφορυλίωση VASP ως δείκτης της ενεργοποίησης PKA. 8CPT ενεργοποιημένο ΡΚΑ παρόμοια με 6-Βενζοϋλ-cAMP (6BzcAMP), μια πιο επιλεκτική ενεργοποιητή ΡΚΑ (Εικ. S6). Στη συνέχεια εξετάσαμε την ικανότητα των δύο αναστολέων ΡΚΑ, Η-89 ή ΡΚΙ, να αντιστρέψει την αναστολή της παραγωγής VEGF που διαμεσολαβείται από 8CPT. Η κατεργασία των κυττάρων PC3-cRap1 εκτίθενται σε CoCl

2 και 8CPT με τους αναστολείς ΡΚΑ διασωθεί εν μέρει η αναστολή της παραγωγής VEGF σε κύτταρα PC3-cRap1 (Σχήμα 5Α?. Εικ. S7). Επιπλέον, 6BzcAMP μιμήθηκε 8CPT αναστέλλοντας την παραγωγή VEGF σε κύτταρα PC3-cRap1 υπό συνθήκες υποξίας, και αυτή η αναστολή αντιστράφηκε μερικώς με H-89 ή ΡΚΙ (Σχήμα 5Β?. Εικ. S8). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι 8CPT δρα ως ένας αναστολέας της προ-αγγειογόνων παραγόντων σε υποξικά κύτταρα όγκου προστάτη Rap1 διεγείρεται μέσω ενεργοποίησης της ΡΚΑ.

Για να δοκιμαστεί αυτό το μηχανισμό σε όγκους του προστάτη, προσδιορίσαμε αν η αναστολή ΡΚΑ μπορούσε να αντιστρέψει η ανάπτυξη του όγκου και την αγγειογένεση παρεμπόδιση που προκαλείται από 8CPT

in vivo

. Μετά την ένεση του αθυμικούς ποντικούς με ενεργά πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα PC3-cRap1, τα ζώα υποβλήθηκαν σε αγωγή υποδορίως με PBS, 8CPT, ή Η-89 + 8CPT χρησιμοποιώντας οσμωτική μινι-αντλίες. Όπως παρατηρήθηκε προηγουμένως σε ποντικούς που έχουν εγχυθεί με κύτταρα PC3-cRap1, οι όγκοι αυξήθηκαν σε μέγεθος συναρτήσει του χρόνου, αλλά η ανάπτυξη του όγκου ήταν σημαντικά μειωμένη κατά την κατεργασία με 8CPT (Σχ. 6Α). Ωστόσο, η ταυτόχρονη θεραπεία με 8CPT και Η-89 αντέστρεψε την αναστολή της ανάπτυξης του όγκου που προκαλείται από 8CPT σε ξενομοσχεύματα PC3-cRap1. Ομοίως, η μείωση 65% του βάρους του όγκου των ζώων που έλαβαν 8CPT διασώθηκε από ταυτόχρονη θεραπεία με H-89 (Σχ. 6Β). Τέλος, όπως φαίνεται στο Σχ. 6C, ανοσοϊστοχημική ανάλυση της έκφρασης της πρωτεΐνης CD31 και VEGF σε τομές από ποντικούς εγχύθηκε με PBS, 8CPT, ή Η-89 + 8CPT ανέφερε ότι ο αναστολέας ΡΚΑ H-89 αντέστρεψε επίσης την μείωση των CD31 και VEGF ανοσοαντιδραστικότητα διαμεσολαβείται από 8CPT στο PC3- cRap1 ξενομοσχεύματα. Στο σύνολό τους, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η αναστολή PKA θα μπορούσε να αντιστρέψει την αναστολή της ανάπτυξης των όγκων και την αγγειογένεση παρεμπόδιση που προκαλείται από 8CPT

in vivo

.

Συζήτηση

Χρησιμοποιώντας ένα συνδυασμό των αναλύσεων από τα δύο

in vitro

και

in vivo

συστήματα, η μελέτη μας παρέχει στοιχεία που αποδεικνύουν ότι μια νέα αλληλεπίδραση μεταξύ Rap1, EPAC και PKA ρυθμίζει τον όγκο μικροπεριβάλλον επαγωγή της αγγειογένεσης. Δείξαμε προηγουμένως ότι υπέστη η ενεργοποίηση των Rap1 από 8CPT /EPAC ή cRap1 αναστέλλει ενδοθηλιακά χημειοταξία κυττάρων και την αγγειογένεση [8], [9]. Για να ελέγξετε τη σημασία της ενεργοποίησης Rap1 σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος όγκου του προστάτη, αναλύσαμε τα αποτελέσματα της 8CPT ή cRap1 σε κύτταρα PC3. 8CPT δεν είχε καμία επίδραση στην ανάπτυξη του όγκου σε γονικά κύτταρα PC3, αλλά μείωσε σημαντικά όχι μόνο το μέγεθος του όγκου, αλλά επίσης VEGF και η αγγειογένεση σε ζώα εγχύθηκαν με κύτταρα PC3 που εκφράζουν cRap1. Παραδόξως, 8CPT ανέστειλε την επαγωγή VEGF και την ανάπτυξη του όγκου του προστάτη με ένα μηχανισμό που περιλαμβάνει PKA παρά την ενεργοποίηση EPAC /Rap1. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η ενεργοποίηση Rap1 σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη προάγει αγγειογένεση κάτω από υποξικές συνθήκες παρόμοιες με HIF-1α και VEGF, και ενεργοποίηση ΡΚΑ ανταγωνίζεται αυτή την επαγωγή (βλέπε σχήμα που απεικονίζεται στο Σχ. 7). Επιπλέον, οι μελέτες μας δείχνουν ότι τα ενδοθηλιακά κύτταρα κατά προτίμηση ενεργοποιούν EPAC σε απάντηση υπέστη επεξεργασία 8CPT ενώ προστάτη επιθηλιακά κύτταρα κατά προτίμηση ενεργοποιήσετε PKA.

Τόσο Rap1 και PKA έχουν συνδεθεί στο παρελθόν με τον καρκίνο σε ένα μοντέλο επιθηλιακών κυττάρων του προστάτη. ανεξάρτητη από κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη ανδρογόνο-εξαρτώμενη και εκφράζουν ενδογενή Rap1 [31], [34]. Rap1 ενεργοποιείται με μία ποικιλία αυξητικών παραγόντων, συμπεριλαμβανομένων του αυξητικού παράγοντα που προέρχεται από αιμοπετάλια (PDGF), επιδερμικό αυξητικό παράγοντα (EGF), ενδοθηλίνη, και λυσοφωσφατιδικό οξύ (LPA) μέσω διαφορετικών μηχανισμών, συμπεριλαμβανομένης της ενεργοποίησης του cAMP της EPAC [35]. Θεραπεία της LNCaP αλλά όχι PC3 κυττάρων καρκίνου του προστάτη με φορσκολίνη ή cAMP προκαλεί φωσφορυλίωση και ενεργοποίηση Rap1 από πρωτεϊνική κινάση Α (ΡΚΑ) [36], και ενεργοποιημένα Rap1 έχει δειχθεί ότι επάγει την οδό ΜΑΡΚ διεγείροντας Β-Raf [37], [ ,,,0],38]. Ωστόσο, τα αποτελέσματα που περιγράφουμε εδώ δείχνουν ότι ένας διαφορετικός μηχανισμός είναι υπεύθυνος για τις παρατηρούμενες επιδράσεις. Πρώτον, βλέπουμε τα αποτελέσματα σε τόσο LNCaP και PC3 κύτταρα. Εξάλλου, αντί ενισχυτικά δραστηριότητα Rap1, ΡΚΑ δρα σε ένα ανταγωνιστικό τρόπο να καταστείλει Rap1 επαγόμενη παραγωγή VEGF.

Rap1 έχει εμπλακεί στην πρόοδο της ογκογένεσης σε μεγάλο βαθμό μέσω της ρύθμισης της πρόσφυσης κυττάρου και κυττάρου-κυττάρου διασταυρώσεις. Για παράδειγμα, Rap1 προάγει εισβολή και τη μετάσταση σε κύτταρα PC3 μέσω ρύθμισης της ιντεγκρινών α4β3 και της ανβ3 [31]. Αντίθετα, μια πρόσφατη μελέτη ανέφερε ότι 8CPT αναστέλλει την κυτταρική μετανάστευση σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη μέσω της ενεργοποίησης της EPAC [39]. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι αυτό το φαινόμενο μπορεί να οφείλεται εν μέρει στην ενεργοποίηση ΡΚΑ από 8CPT, ερμηνεία σύμφωνη με την παρατηρούμενη ανταγωνισμό ανάμεσα Rap1 και ΡΚΑ σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν επίσης ότι ενεργοποιούνται Rap1 σε κύτταρα όγκου προστάτη ευαισθητοποιεί τα κύτταρα προς αναστολή της δράσης της HIF-1α με ΡΚΑ.