Abstract

καλλικρεϊνες Ανθρώπινος ιστός (KLKs) είναι μέλη μιας πολυγονιδιακής οικογένειας πρωτεασών σερίνης παρεκκλίνοντα εκφράζεται σε πολλούς τύπους καρκίνου. Στον καρκίνο των ωοθηκών, οι 12 KLKs ρυθμίζεται προς τα πάνω, και από αυτά τα KLK5, 6 και 10 ήταν το επίκεντρο των ερευνών σε νέες διαγνωστικές και προγνωστικές βιοδείκτες. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά σχετικά με τις συμβολές KLK5, 6 και 10 έως παθοφυσιολογία του καρκίνου των ωοθηκών.

Σε αυτή τη μελέτη, ένας πίνακας από 13 ανθρώπινες κυτταρικές σειρές του καρκίνου των ωοθηκών υποβλήθηκε σε διαλογή με ELISA για έκκριση KLK5, 6, 8 , 10, 13, και 14. Η κυτταρική γραμμή ES-2, στερείται αυτών καλλικρεϊνών, διαμολύνθηκε με φορείς έκφρασης του KLK5, 6 και 10 ατομικά ή σε ζεύγη. Συν-έκφραση του KLK5, 6 και 10 συσχετίστηκε με μειωμένες επιθετικότητα των κυτταρικών σειρών καρκίνου των ωοθηκών, όπως ορίζεται από μειωμένο σχηματισμό αποικίας σε μαλακό άγαρ και ογκογονικότητα σε γυμνούς ποντικούς. ES-2 κλώνοι που υπερεκφράζουν KLK5, 10/5, 10/6, 5/6 έκανε σημαντικά λιγότερες αποικίες σε μαλακό άγαρ. Σε σύγκριση με τα ποντίκια ελέγχου, η επιβίωση των ποντικών που ενέθηκαν με ES-2 κλώνοι που υπερεκφράζουν KLK10, 10/5, 10/6, 5/6 ήταν σημαντικά μεγαλύτερη, ενώ KLK6 ήταν μικρότερη. Όλες οι ομάδες εμφανίζοντας ένα πλεονέκτημα επιβίωσης διέφερε επίσης ποσοτικά και ποιοτικά σε παρουσίαση τους ασκίτη, τόσο με μια μειωμένη επίπτωση της ασκίτη και την απουσία των κυτταρικών συσσωματωμάτων εντός αυτών ασκίτη. Το πλεονέκτημα που παρέχει η επιβίωση KLK10 υπερέκφραση μπορεί να ανακεφαλαιωθούν με την εξωγενή χορήγηση ενός ανασυνδυασμένου KLK10. Συμπερασματικά, τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι KLK5, 6 και 10 μπορεί να ρυθμίζει την εξέλιξη του καρκίνου των ωοθηκών, και να αλληλεπιδρούν μεταξύ τους για να μεταβάλλουν παθοφυσιολογία του όγκου. Επιπλέον, τα αποτελέσματα υποστηρίζουν το υποτιθέμενο ρόλο του KLK10 ως καταστολέας των όγκων και δείχνουν ότι μπορεί να κατέχει θεραπευτικό δυναμικό στον καρκίνο των ωοθηκών

Παράθεση:. Pepin D, Shao ZQ, Huppé G, Wakefield Α, Chu CW, Σαρίφ Ζ, et al. (2011) καλλικρεϊνες 5, 6 και 10 διαφορικά Alter Παθοφυσιολογία και τη συνολική επιβίωση σε καρκίνο των ωοθηκών μοντέλο ξενομοσχεύματος. PLoS ONE 6 (11): e26075. doi: 10.1371 /journal.pone.0026075

Επιμέλεια: Rakesh Κ Srivastava, Το Πανεπιστήμιο του Κάνσας Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 23, 2011? Αποδεκτές: 19 Σεπ 2011? Δημοσιεύθηκε: 15, Νοεμβρίου 2011

Copyright: © 2011 Pepin et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από μια υποτροφία από την υποτροφία του Οντάριο Graduate στην Επιστήμη και την Τεχνολογία στην Δ Pepin. Αυτό χρηματοδότης δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Κύρια χρηματοδότηση για την έρευνα που παρέχονται από IBEX Pharmaceuticals, Inc., τα οποία χρησιμοποιούνται μερικές από τις συγγραφείς που συνέβαλαν στο σχεδιασμό των μελετών και τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων. Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση ελήφθη για τη μελέτη αυτή

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Z.-Q. Shao, Γ Huppé, Α Wakefield και C.-W. Chu ήταν υπάλληλοι του IBEX Pharmaceuticals, Inc., κατά τη στιγμή της συλλογής των δεδομένων. Δ Pepin, Ζ Σαρίφ και π.Χ. Vanderhyden απασχολούνται σήμερα από IBEX Pharmaceuticals, Inc. Δεν υπάρχουν διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλους PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Οι ανακαλύφθηκε πρόσφατα καλλικρεϊνών ιστού είναι μια οικογένεια πρωτεασών σερίνης που περιλαμβάνει 15 μέλη (KLK1- 15) των οποίων τα γονίδια (KLK1-15) είναι συγκεντρωμένα σε συνδυασμό σε μια περιοχή 300 kb στο χρωμόσωμα 19q13.4 [1]. Οι KLK πρωτεΐνες ανιχνεύονται σε πολλές βιολογικά υγρά συμπεριλαμβανομένου του αίματος, σπερματικό πλάσμα, τον ιδρώτα, το σάλιο, εγκεφαλονωτιαίο υγρό, το γάλα, και ενδιάμεσους χώρους όπου μπορούν να ενεργοποιηθούν και /ή αδρανοποιούνται με ενζυμική διάσπαση [2]. KLKs διασπούν ένα ευρύ φάσμα υποστρωμάτων, συμπεριλαμβανομένων εξωκυτταρικής μήτρας (ECM), πρωτεΐνες δέσμευσης όμοιου με ινσουλίνη αυξητικού παράγοντα, οι υποδοχείς πρωτεάση που ενεργοποιείται (PAR), άλλα καλλικρεϊνες και ακόμη και οι ίδιοι [2]. Επιπλέον, KLKs εκφράζονται συχνά σε ομάδες, όπως KLK3, 4, 5, 6, 8, 10, 13 και 14 στο μαστό ή KLK2, 3, 4, 5, 11, και 15 στον προστάτη [2]. Αυτές οι παρατηρήσεις έχουν οδηγήσει στην υπόθεση ότι μπορεί να δράσει καλλικρεϊνες σε έναν καταρράκτη να μεσολαβήσει βιολογικές επιδράσεις τους, επίσης γνωστή ως η activome KLK [3]. Για παράδειγμα, τα προκαταρκτικά στοιχεία δείχνουν ότι KLK5 μπορεί να είναι ένας εκκινητής από KLK καταρράκτες, ικανά ενεργοποίησης προ-KLK2, 3, 6, 7, 11, 12, 14, με αποτέλεσμα την υποβάθμιση της ECM συστατικά του σπέρματος, και υγροποίησης [4] .

καλλικρεϊνες έχουν εμπλακεί σε έναν αριθμό ασθενειών όπως η νόσος Αλτσχάιμερ και η σκλήρυνση κατά πλάκας [5], [6], φλεγμονώδη νόσο του εντέρου [7], αρθρίτιδα [8], σηψαιμία [9], τον διαβήτη [10 ], ασθένειες του δέρματος [11] και του καρκίνου [12]. Επειδή οι KLKs εκκρίνονται και εύκολα ανιχνεύσιμα σε βιολογικά υγρά, έχουν αναδειχθεί ως δυνητικά πολύτιμο βιοδείκτες, ιδιαίτερα στον καρκίνο, όπου KLK3 (επίσης γνωστό ως ειδικό προστατικό αντιγόνο) έχει αποδειχθεί ότι είναι χρήσιμη για την παρακολούθηση του καρκίνου του προστάτη. Πιο έκφραση KLK είναι υπό ορμονικό έλεγχο, και η ανταπόκριση των KLK2 και 3 έως ανδρογόνα σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου του προστάτη [13], και KLK6 και 10 σε οιστρογόνα σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού είναι καλά τεκμηριωμένη [14], [15]. Το πρότυπο έκφρασης του KLKs, καθώς και η ορμονική ρύθμιση τους, δείχνει ότι μπορεί να εμπλέκεται στις ενδοκρινικές σχετίζονται αδενοκαρκινώματα του αναπαραγωγικού συστήματος όπως του προστάτη, των όρχεων, του μαστού, του τραχήλου της μήτρας, και των ωοθηκών.

Συσσωρευμένα αποδείξεις υποδηλώνει ότι τουλάχιστον 12 από τις 15 καλλικρεϊνών είναι ρυθμισμένη προς τα πάνω σε καρκίνο των ωοθηκών. Από αυτούς, KLK4, 5, 6, 7, 10, και 15 συνδέονται με δυσμενείς πρόγνωση ενώ η έκφραση της KLK8, 9, 11, 13, και 14 συνδέεται με μια ευνοϊκή πρόγνωση [12]. Αυτή η μελέτη επικεντρώνεται στην KLK5, 6 και 10, τα οποία συχνά υπερεκφράζεται στον καρκίνο των ωοθηκών και βρέθηκαν σε αυξημένα επίπεδα στον ασκίτη και ορό ασθενών [16] – [18]. Αξίζει να σημειωθεί ότι, KLK6 ορού και KLK10 είναι δείκτες κακής πρόγνωσης [19], [20], και την υψηλή KLK6 συνδέεται με βραχύτερη επιβίωση χωρίς υποτροπή και χαμηλότερη συνολική επιβίωση [21]. Τα υψηλά επίπεδα του KLK10 στον ορό σχετίζονται με προχωρημένο στάδιο ορώδεις όγκους με μεγάλη υπολειμματική νόσος και η κακή απόκριση σε χημειοθεραπεία [22], ενώ χαμηλά επίπεδα KLK10 στον όγκο προβλέψουμε κακή συνολική επιβίωση [23]. Οι ιστολογικές υπότυποι των επιθηλιακών καρκίνων των ωοθηκών, όπως ορώδες, βλεννώδες, endometroid, σαφείς κυττάρων και αδιαφοροποίητο όγκοι μπορεί να αντανακλά διακριτές ontogenies και γίνονται ολοένα και πιο σημαντικό στην προσαρμογή της θεραπείας [24]. Η έκφραση της KLKs είναι εντυπωσιακά παρόμοιες σε όλη την ιστολογική υποτύπους. Για παράδειγμα, όλες οι υπότυποι εκφράζουν KLK6, με ίσως μια ελαφρώς υψηλότερη αναλογία διαυγοκυτταρικό όγκων που εμφανίζουν ισχυρή ανοσοϊστοχημική χρώση για τον KLK6 [21], [25]. Παρομοίως, ασθενείς με όγκους του κάθε υποτύπου έχουν ανιχνεύσιμα επίπεδα KLK10 σε κυτοσόλες τους, με μια ελαφρά αλλά σημαντικά υψηλότερο ποσοστό ασθενών υψηλού KLK10 είναι του υποτύπου ορώδους [26]. Τέλος, η έκφραση KLK5 φαίνεται να είναι πιο διαδεδομένη σε ορώδες και αδιαφοροποίητη όγκους [27], [28].

Ενώ λίγα είναι γνωστά για τη βιολογική βάση για τη συμβολή των KLK5, 6 και 10 του καρκίνου των ωοθηκών, ο ικανότητα του KLK5 και 6 για να διασπάσει τις πρωτεΐνες ECM [4], [29], και ενεργοποίηση του PAR σηματοδότηση [30], υποδεικνύουν ότι εμπλέκονται άμεσα σε διάφορες πτυχές της καρκινογένεσης. Η αποδόμηση των συστατικών ECM μπορεί να διευκολύνει την απόσπαση των κακοήθων κυττάρων από τον όγκο και την εισβολή των φυσιολογικών ιστών, ενώ ορισμένα από τα πεπτίδια απελευθερώνονται ECM μπορεί να έχουν και τα δύο προ και αντι-αγγειογενετική ιδιότητες [29], [31]. Επιπλέον, σηματοδότηση PAR έχει σημαντικούς ρόλους σε vasoregulation, κυτταρική ανάπτυξη και φλεγμονή [32], [32,33]. KLK10 ταυτοποιήθηκε ως ένα υποθετικό καταστολέας όγκων στο μαστό [34] και γαστρικών καρκίνων [35], και συχνά σιγήσει σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών και όγκους [36], παρά την έκφρασή του στον ορό είναι μια δυσμενή προγνωστικός δείκτης. Αυτό το φαινομενικά παράδοξο εξηγεί τη διχοτόμηση της καλλικρεϊνών καθώς και οι δύο θετικές και αρνητικές ρυθμιστές των διεργασιών που εμπλέκονται στην καρκινογένεση, όπως η αγγειογένεση, την ανάπτυξη, την εισβολή και τη μετάσταση [37].

Ενώ η απόδειξη της ανώμαλης έκφρασης των πολλαπλών καλλικρεϊνών στον καρκίνο των ωοθηκών είναι τοποθέτηση, λίγα είναι γνωστά για τη συμβολή τους στην παθοφυσιολογία της νόσου. Στο παρόν αναφέρουμε την πρώτη προσπάθεια για να διαλευκάνουν τις εισφορές των KLK5, 6 και 10 σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος καρκίνου των ωοθηκών, και η πρώτη θεραπευτική χρήση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης KLK10

in vivo

.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρική καλλιέργεια

η προέλευση [38], και το είδος των όγκων που σχηματίζονται σε ξενομοσχεύματα [39] για τις κυτταρικές σειρές καρκίνου ωοθήκης Caov-3 (adenocacinoma [40]), OVCAR -3 (ηπίως διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα ορώδης [41]), OVCAR-4 (αδενοκαρκίνωμα [42]), Ον2008 (endometreoid αδενοκαρκίνωμα με πλακώδους διαφοροποίησης [39]), C13 (endometreoid αδενοκαρκίνωμα με πλακώδους διαφοροποίησης [39]), OVCA433 (αδενοκαρκίνωμα [ ,,,0],43]), SKOV-3 (διαυγοκυτταρικό αδενοκαρκίνωμα [39]), OVCA429 (αδενοκαρκίνωμα σαφές κυττάρων [39]), Hey (αδιαφοροποίητα [39]), ES-2 (αδιαφοροποίητα [39]), OCC-1 (αδιαφοροποίητα [ ,,,0],39]), τα A2780cp (αδιαφοροποίητα [39]), και τα A2780S (αδιαφοροποίητα [39]) που χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη, καθώς και οι συνθήκες καλλιέργειας τους περιγράφηκαν σε προηγούμενη δημοσίευση [39]. Οι κυτταρικές σειρές ΗΤ1080 και ΝΙΗ3Τ3, χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες, προμηθεύτηκε από την ATCC (Manassas, VA, USA) και καλλιεργήθηκαν σύμφωνα με τις συστάσεις τους.

Κατασκευή σταθερώς επιμολυσμένα ES-2 κυτταρικές σειρές που υπερεκφράζουν καλλικρεϊνες

Τα πλασμίδια pcDNA3.1D /V5-His /lacZ (Invitrogen, Mississauga, ON, Καναδάς) με γενετικίνη αντίσταση, και pIRESpuro-2 (Clonetech, VWR, Mississauga, ON, Καναδάς) με αντίσταση πουρομυκίνης χρησιμοποιήθηκαν ως ραχοκοκαλιά και σταθερώς μορφομετατράπηκε εντός κυτταρικής γραμμής ES-2 για την παροχή ελέγχου φορέα. Εν ολίγοις, πολλαπλή κλώνοι σταθερώς επιμολυσμένα με pIRESpuro-2 χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες και μόνο φορέα, και πολλαπλούς κλώνους διαδοχικά επιμολυσμένα με pcDNA3.1.1D /V5-His /lacZ και pIRESpuro-2 χρησιμοποιήθηκαν ως διπλός έλεγχος φορέα. Τα cDNA για KLK5, KLK6 και KLK10, καθώς επίσης και η έκφραση pcDNA-KLK5 κατασκεύασμα σε ένα σκελετό pcDNA3.1D /V5-His-TOPO, παρεσχέθησαν ευγενώς από τον Dr. Ε.Ρ. Διαμαντής (Toronto, ON, Καναδάς). Ο φορέας έκφρασης KLK10 σε pCMV-neo παρεσχέθη από Goyal et al. και έχει περιγραφεί προηγουμένως [44]. Εν συντομία, PCR ενίσχυση, πέψη περιορισμού και προσδέσεως των θραυσμάτων DNA που αντιπροσωπεύει το cDNAs του KLK5, 6, και 10 εντός του φορείς έκφρασης pIRESpuro-2 διεξήχθησαν, και τα προκύπτοντα μορφώματα διαμολύνθηκαν σταθερά σε κύτταρα ES-2. Ένα ελάχιστο 3 κλώνους από κάθε συλλέχθηκαν και ο ένας ήταν τυχαία επιλεγμένα για να προκύψουν οι αντίστοιχες κυτταρικές γραμμές ES-2-KLK5, ES-2-KLK6, και ES-2-KLK10 για

in vivo

πειράματα. Για διπλό επιμολύνσεις, τουλάχιστον 3 ανεξάρτητους κλώνους του pCMV-neo που εκφράζουν KLK10 περαιτέρω επιμολύνθηκαν με το pIRES-puro-2 που εκφράζουν KLK5 ή KLK6 και ένα από το καθένα ήταν τυχαία επιλεγμένα για να δημιουργήσει, αντίστοιχα, το ES-2-KLK5 /10 και ES -2-KLK6 10 κυττάρων /γραμμές. Η κυτταρική γραμμή ES-2-KLK5 /6 δημιουργήθηκε από ένα από τα 3 κλώνων με σταθερά επιμόλυνση της κυτταρικής σειράς ES-2-KLK6 με το pcDNA-KLK5 κατασκεύασμα. Η επιμόλυνση των κυττάρων ES-2 διεξήχθη χρησιμοποιώντας Lipofectomine ™ 2000 (Invitrogen, Mississauga, ΟΝ, Canada) σύμφωνα με το πρωτόκολλο που παρέχεται από τον κατασκευαστή. επιλέχθηκαν και διατηρήθηκαν Οι κλώνοι που περιγράφονται ανωτέρω σε μέσα DMEM (Thermo Scientific, Waltham ΜΑ, USA) που περιείχε γενετικίνη (400 μg /ml) και /ή πουρομυκίνη (10 μg /ml) (Gibco BRL, Carlsbad, CA, USA).

κυτταρικού πολλαπλασιασμού Προσδιορισμός

για να αξιολογηθεί ο πολλαπλασιασμός, η κυτταρική ανάπτυξη αναλύθηκε σε γονικών ES-2 κύτταρα γραμμές και 3 ή περισσότερα κλώνοι σταθερά επιμολυσμένα με κατασκευάσματα για KLK5, KLK6, KLK10, KLK5 /6, KLK5 /10, KLK6 /10 ή ελέγχου φορέα χρησιμοποιώντας πλάκες 12 φρεατίων με αρχική πυκνότητα επιμετάλλωση των 10.000 κύτταρα /φρεάτιο. Μετά από 96 ώρες, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και ακολούθως μετρήθηκαν με έναν Coulter Counter (Beckman Coulter Inc., Fullerton CA, USA).

Anchorage ανάπτυξη ανεξάρτητη

Το πρωτόκολλο που χρησιμοποιήθηκε περιγράφηκε προηγουμένως από τον Μ Pace et al [45]. Εν συντομία, 5 χ 10

3 κύτταρα αιωρήθηκαν σε 3 ml πλήρους μέσου που περιείχε 3,5% αγαρόζης χαμηλής τήξης-σημείο και χύνεται πάνω από το κάτω στρώμα του 7% αγαρόζη στο ίδιο μέσο σε φρεάτια μιας 6-φρεατίων. Media (0,5 ml) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και άλλαξε κάθε 2-3 ημέρες. Ένα διάλυμα από

σ

-iodonitrotetrazolium ιώδες (1 ml) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο κατά την ημέρα 7 και αποικίες βάφτηκαν για 24 ώρες, μετρήθηκαν και φωτογραφήθηκαν.

δοκιμασία Εισβολή

για τον προσδιορισμό εισβολής στο καλλικρεΐνη υπερεκφράζουν κλώνους, χρησιμοποιήσαμε το HTS transwell 96 system® (Corning, Lowell, MA). Εν συντομία, τα transwells επικαλύφθηκαν με εκχυλίσματα της βασικής μεμβράνης σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, και 5 × 10

4 κύτταρα σε 50 μΙ μέσου χωρίς ορό προστέθηκαν στη συνέχεια στην κορυφή του θαλάμου, ενώ 150 μΙ μέσου με 10% ορό ήταν προστίθενται στην δεξαμενή. Η πλάκα επωάστηκε στους 37 ° C σε 5% CO

2 ατμόσφαιρα για 24 ώρες. Τα κύτταρα τα οποία μετανάστευσαν στο κάτω μέρος του ένθετου βάφτηκαν με αιματοξυλίνη σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, και οι μεμβράνες τοποθετήθηκαν σε πλακίδια, σαρώνονται χρησιμοποιώντας τον ScanScope (Aperio, Vista, CA), και η ποσότητα του μπλε εικονοστοιχείων ποσοστώθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικού Aperio (Aperio, Vista, CA). Τα δεδομένα σχεδιάστηκαν ως% εισβολή, όταν συγκρίνεται με την ποσότητα των κυττάρων επί μιας μεμβράνης transwell ελέγχου που δεν επικαλύπτονται με εκχυλίσματα της βασικής μεμβράνης.

Ξενομοσχεύματος

Όλα τα πειράματα σε ζώα που διεξήχθησαν σε αυτή τη μελέτη ήταν σύμφωνα με η

Οδηγίες για τη φροντίδα και χρήση των ζώων

ιδρύθηκε από το καναδικό Συμβούλιο για την φροντίδα των ζώων, και εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Φροντίδας ζώων του Πανεπιστημίου της Οτάβα (πρωτόκολλο ME-196). Γυναίκα CD-1 ηυ /ποντικούς nu (Charles River Laboratory, Wilmington, ΜΑ, USA) ηλικίας 5-6 εβδομάδων στεγάστηκαν με τροφή και νερό

κατά βούληση

, σε ένα κύκλο φωτός της ημέρας 12 ώρες. Η μέθοδος ξενομοσχεύματος IP κυττάρου όγκου περιγράφηκε προηγουμένως [39]. Εν συντομία, μετά από μία εβδομάδα εγκλιματισμού, τα ποντίκια ενέθηκαν ενδοπεριτοναϊκά (ΙΡ) με 10

7 ES-2 κύτταρα, ή ένα από τα παράγωγα τους κλώνους του που επιλέγονται τυχαία από τις κυτταρικές γραμμές σταθερά επιμολυσμένα με KLK5, KLK6, KLK10, KLK5 /6, KLK5 /10, KLK6 /10, Vector μόνο χειρισμό, ή διπλό έλεγχο Vector, επαναιωρήθηκαν σε 0,8 ml αλατούχου φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος. Ομάδες στη συνέχεια τύφλωσε να ionvestigators μέχρι το τέλος του πειράματος την ημέρα 56. Η εξέλιξη της νόσου παρακολουθείται καθημερινά, βασίζεται σε ένα σύνολο γενικών κριτηρίων ευεξίας που καθορίζονται από την επιτροπή φροντίδα των ζώων, και η μάζα του σώματος καταγράφηκε δύο φορές την εβδομάδα μέχρι ένα προκαθορισμένο καταληκτικό σημείο ήταν επιτευχθεί. Ο χρόνος κατά τον οποίο τα συμπτώματα της νόσου πρωτοεμφανίστηκε, όπως ήπια κοιλιακή διάταση, ή μικρό ψηλαφητή μάζα καταγράφηκε. Καταληκτικά σημεία περιελάμβαναν: αφυδάτωση ή /και απώλεια βάρους άνω του 15%, παρά τη θεραπεία με υγρά, όλα τα στοιχεία της αναπνευστικής δυσφορίας, την αύξηση του σωματικού βάρους πάνω από 5 g από το μέσο σωματικό βάρος των ποντικών ελέγχου στην ίδια ηλικία με τον ίδιο πληθυσμό, παρουσία ενός ψηλαφητή κοιλιακή μάζα που παρεμποδίζει την κινητικότητα, σίτιση ή επηρεάζει την ευεξία και τελικά την παρουσία των κοιλιακή διάταση που μειώνει την κινητικότητα ή επηρεάζει ευεξίας ή προξενεί σημαντική αποχρωματισμό εμφανής στη ραχιαία ή κοιλιακό δέρμα.

Κατά τη νεκροψία, δείγματα όγκου ζυγίστηκαν και διαιρείται να είναι είτε αμέσως flash-καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκαν στους -20 ° C, ή σταθεροποιήθηκαν σε 10% ρυθμισμένη φορμαλίνη (VWR, Mississauga, ΟΝ, Canada) για 24 ώρες και φυλάσσεται σε αιθανόλη 70% πριν από την επεξεργασία σε εγκλεισμένα σε παραφίνη μπλοκ, τα οποία κόπηκαν σε τομές 5 μm για αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε) χρώση. όγκος Ασκίτης μετρήθηκε, και τα δείγματα αξιολογήθηκαν μικροσκοπικά για να προσδιορισθεί η παρουσία των κυτταρικών συσσωματωμάτων. Τα δείγματα στη συνέχεια στροβιλίστηκε στα 2500 × g για 10 λεπτά για να συλλεχθεί το υπερκείμενο για αποθήκευση στους -20 ° C για μετέπειτα μετρήσεις των επιπέδων KLK με ELISA.

αίμα δειγματοληψίας

Για το πείραμα επιβίωση, ελήφθησαν δείγματα αίματος μία εβδομάδα πριν από την ένεση και κάθε εβδομάδα μέχρις ότου είτε το ζώο έφτασε τελικό σημείο ή η πειραματική περίοδος έληξε την ημέρα 56. αίμα ελήφθη επίσης πριν από τη νεκροψία όποτε είναι δυνατόν. Για την ανασυνδυασμένη κάθαρση του αίματος και την τοξικότητα πείραμα KLK10, κάθε ομάδα δόσης (0, 0.2, 1, και 5 mg) είχε ένα ζώο ανά χρονική στιγμή (-1 h, 1 ώρα, 2 ώρες, 4 ώρες, 6 ώρες, 8 ώρες, 12 h, και 24 ώρες). Για την ανάκτηση του πλάσματος, 100-200 μl αίματος εξαγοράστηκε από σαφηνούς φλέβας παρακέντηση με βελόνα 25G5 /8 gauge (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) και συλλέγονται σε microvettes® CB300LH (Sarstedt, Γερμανία) επικαλυμμένα με ηπαρίνη, φυγοκέντρηση 5 λεπτά στα 2000 g και το στρώμα του πλάσματος διαχωρίστηκε να αποθηκεύονται στους -20 ° C μέχρι εκτελέστηκαν οι ELISAs.

ELISA του καλλικρεϊνών

για το πάνελ των κυτταρικών γραμμών καρκίνου ωοθηκών, κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων με 5 × 10

4 κύτταρα και 1 ml μέσου ανά φρεάτιο. Δείγματα μέσων συλλέχθηκαν μετά από επώαση στους 37 ° C για 3 ημέρες. ELISA για KLK5 [46], KLK6 [47], KLK8 [48], KLK10 [49], KLK13 [50], και KLK14 [51] διεξήχθησαν σύμφωνα με τα πρωτόκολλα που δημοσιεύθηκε προηγουμένως. ELISA για την KLK5, 6 και 10 διεξήχθησαν σε μέσα του ES-2 κλώνοι μετά από 24 ώρες καλλιέργειας από την ημέρα της εμφύτευσης ξενομοσχεύματος. Ομοίως, ELISA διεξήχθησαν επί δύο δείγματα ανθρώπινου ασκίτη και ορό μυός και δείγματα ασκίτη αραιωμένο από 5 φορές έως 8000-φορές, ανάλογα με τη συγκέντρωση KLK, σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα αραίωσης (50 mM Tris-Cl ρΗ 7.8, με 60 mg /κ.εκ. BSA και 0.5 mg /ml αζιδίου του νατρίου).

η ανασυνδυασμένη KLK10 παραγωγή

KLK10 cDNA ενισχύθηκε με PCR χρησιμοποιώντας ολιγονουκλεοτίδια KLK10FP (TATACGTAGCGCTGCTCCCCCAAAACGACAC) και KLK10RP (GTCCTAGGATCGATTGGAGCGTATGAC) [44] από ένα pCMV-neo φορέα που φέρει KLK10 cDNA. Μετά από διπλή πέψη με

snab

Ι και

Avr

II, το ενισχυμένο θραύσμα DNA εισήχθη εντός pPIC-9, προ-πέψη με

snab

Ι και

Avr

II. Το προκύπτον πλασμίδιο, pPIC-KLK10, στη συνέχεια μετατράπηκε σε

Pichia pastoris

στέλεχος υποδοχής ΚΜ71 με ηλεκτροπόρωση (

Pichia

κιτ έκφρασης, Invitrogen τεχνολογίες ζωής).

Ζύμωση 15-λίτρων της ανασυνδυασμένης KLK10 διεξήχθη με τη χρήση ενός αντιδραστήρα ζύμωσης biostat ® ΕΔ (B.Braun Biotech International, Allentown, PA, USA) και μια διαδικασία που βασίζεται σε Pichia τις κατευθυντήριες γραμμές της διαδικασίας ζύμωσης από την Invitrogen. Εν συντομία, ζυμωτήρας εμβολιάστηκε με ζύμη παρασκευάζεται σε ένα σέικερ φιάλη 2800 ml για ένα αρχικό OD

600 ~ 0,3. Μετά από μια φάση παρτίδας γλυκερίνης 20-ώρες, μία 4-ωρη φάση τροφοδοσίας γλυκερόλης ακολουθήθηκε. Η επαγωγή άρχισε με την έναρξη τροφοδοσίας γλυκερόλης και διήρκεσε περίπου 40 ώρες. Τα κύτταρα απομακρύνθηκαν με φυγοκέντρηση και το υπερκείμενο συλλέχθηκε.

Ο καθαρισμός του KLK10 από το υπερκείμενο εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας ένα CM-Sepharose στήλη (Amersham Biosciences, ΟΝ, Canada) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [49].

η θεραπεία με ανασυνδυασμένη KLK10

Για το πείραμα κάθαρσης του αίματος, ελέγξαμε πρώτα δόσεις ενιαίο bolus IP του ανασυνδυασμένου KLK10 (0, 0.2, 1, και 5 mg σε 1 ml) με 5 ηυ /ηυ ποντικοί ανά δόση και δείγματα του αίματος σε διάφορα χρονικά σημεία, όπως περιγράφεται παραπάνω. Τα ζώα παρακολουθούνται στενά για τις πρώτες 12 ώρες, και στη συνέχεια περιοδικά επί 15 ημέρες προτού θυσιαστούν.

Για το πείραμα τοξικότητας ελέγξαμε δόσεις των 0, 50, 200, και 800 μg σε 1 ml KLK10, χορηγείται ημερησίως ΙΡ σε 3 ζώα ανά ομάδα για 7 ημέρες, που ακολουθείται από 7 ημέρες καθημερινής παρακολούθησης χωρίς θεραπεία πριν θυσιαστούν. Κατά τη νεκροψία, το ήπαρ, τους πνεύμονες, την καρδιά και τα νεφρά απομακρύνθηκαν και διαιρέθηκαν να είναι είτε αμέσως flash-κατεψυγμένα και αποθηκεύονται στους -20 ° C ή σταθεροποιούνται σε 10% ρυθμισμένη φορμαλίνη (VWR, Mississauga, ΟΝ, Canada) για 24 ώρες και φυλάσσεται σε 70% αιθανόλη πριν από την επεξεργασία σε εγκλεισμένα σε παραφίνη μπλοκ, τα οποία κόπηκαν σε τομές 5 μm για την H & amp? χρώση Ε. Οι τομές αναλύθηκαν για ενδείξεις φλεγμονής και βλάβης.

Για τη θεραπευτική πείραμα, τα γυμνά ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε ομάδες ελέγχου και ένα 2 θεραπεία (8 ζώα /ομάδα). Η διάρκεια της θεραπείας ήταν 14 ημέρες και η μελέτη ολοκληρώθηκε στις 8 εβδομάδες μετά ξένου μοσχεύματος. Ζώα ακόμα ζωντανοί στο τέλος της μελέτης θυσιάστηκαν. Την ημέρα 1, τα ζώα ενέθηκαν ΙΡ με 0,2 ml ρυθμιστικού διαλύματος PBS, ή 0,2 ml PBS που περιέχει 5 mg του KLK10 ακολουθείται αμέσως από ένεση 10

7 ES-2 κύτταρα επαναιωρούνται σε 0,8 mL ρυθμιστικού διαλύματος PBS. Από τότε, 1 ml ρυθμιστικό διάλυμα PBS ή 1 ml PBS που περιείχε 5 mg KLK10 ενέθηκαν ΙΡ σε κάθε ζώο είτε καθημερινά ή δύο φορές ημερησίως (όπως υποδεικνύεται) από την ημέρα 2 έως την ημέρα 14.

Για την

in vitro

πείραμα θεραπείας, 10

5 ES-2 κύτταρα ανά φρεάτιο εμβολιάστηκαν σε πλάκα 12 φρεατίων που περιέχει είτε ϋΜΕΜ άνευ ορού ή ϋΜΕΜ με 10% ορό εμβρύου μόσχου, και συμπληρωμένο με 4 δόσεις ή ανασυνδυασμένο KLK10 (0, 300 ng /ml, 3,000 ng /ml και 30.000 ng /ml) για 96 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με αποκλεισμό trypan blue και τα κύτταρα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας έναν μετρητή ViCell (Beckman Coulter, Fullerton, CA).

Επιβίωση καμπύλες και στατιστικές αναλύσεις

καμπύλες επιβίωσης Kaplan-Meier απεικονίσθηκαν με τη χρήση GraphPad Prism 4.0 λογισμικό (Graphpad Software, San Diego, CA, USA) και συγκρίθηκε χρησιμοποιώντας ένα τεστ logrank. Παθοφυσιολογικές παραμέτρους όπως τον όγκο ασκίτη και το φορτίο του όγκου (συνολικός μάζας του όγκου αποκόπηκαν) και τα αποτελέσματα από το

in vitro

πειράματα συγκρίθηκαν με μονόδρομη ANOVA που ακολουθήθηκε από μετά τη δοκιμή του Tukey. Αναλογίες όπως συχνότητα των αδρανών υλικών ή ασκίτη συγκρίθηκαν με τετραγωνικό CHI. Η στατιστική σημαντικότητα συναχθεί σε ρ & lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Η έκκριση της καλλικρεϊνών 5, 6 και 10 συσχετίζεται με μειωμένη επιθετικότητα σε ένα πάνελ κυτταρικών γραμμών καρκίνου ωοθηκών, ακόμη είναι ανιχνεύσιμη στον ασκίτη του ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών

η έκφραση του συμπλέγματος καλλικρεΐνης συμπεριλαμβανομένων KLK4 να KLK14 έχει προηγουμένως αναφερθεί σε καρκίνο των ωοθηκών [37]. Ωστόσο, έχει επίσης αναφερθεί ότι διαφορετικά καλλικρεϊνες μπορεί να έχει διαμετρικά αντίθετα αποτελέσματα επί πρόγνωση ασθενή σε μια ποικιλία καρκίνων [37]. Για να βεβαιωθείτε ότι η έκφραση καλλικρεϊνης ανακεφαλαιώνεται σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου των ωοθηκών, μια ομάδα δεκατριών κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών (CaOV-3, OVCAR-3, OVCAR-4, Ον2008, C13, OVCA433, SKOV-3, OVCA429, Hey, ES- 2, OCC-1, A2780cp, τα A2780S) υποβλήθηκε σε διαλογή για έκκριση του KLK 5, 6, 8, 10, 13 και 14 στο μέσο καλλιέργειας με ELISA (Πίνακας S1). Με βάση την έκφραση καλλικρεΐνης, οι κυτταρικές σειρές θα μπορούσαν να διαχωρίζονται σε μη-εκφραστές (SKOV-3, OVCA429, Hey, ES-2, OCC-1, A2780cp, τα A2780S) και εκφραστές (CaOV-3, OVCAR-3, OVCAR -4, OV2008, C13, OVCA433). Στην τελευταία ομάδα, όλοι μοιράζονται κοινή έκφραση της KLK5 /6, και 5 από 6 εκφράζονται KLK10, 4 από τα 6 KLK8, 3 από 6 KLK13 και κανένας εξέφρασε KLK14. Για να διερευνηθεί οποιαδήποτε σχέση μεταξύ της έκφρασης καλλικρεϊνης και επιθετικότητα από τις κυτταρικές γραμμές, αυτές οι δύο ομάδες συγκρίθηκαν για την ικανότητά τους να εισβάλουν σε matrigel, αποικίες μορφή σε μαλακό άγαρ και την ανάπτυξη όγκων ενδοπεριτοναϊκά σε γυμνούς ποντικούς (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Μια χαλαρή συσχέτιση παρατηρήθηκε, αν και με κάποιες εξαιρέσεις, ότι σε αντίθεση με τα μη-εκφραστές, τα κύτταρα που εκφράζουν καλλικρεϊνες δεν εισβάλλουν matrigel, δεν σχηματίζουν αποικίες σε μαλακό άγαρ, και όπως αναφέρθηκε προηγουμένως από εμάς [39], ήταν πολύ κακή στο σχηματισμό όγκων σε γυμνούς ποντικούς (Πίνακας 1).

η

Σταθερό υπερέκφραση KLK 5, 6 και 10, μόνο του ή σε ζεύγη, σε κλώνους της καλλικρεΐνης ανεπάρκεια ES-2 κυτταρική γραμμή, καταλήγει σε αλλοιωθεί αγκύρωση ανάπτυξη ανεξάρτητη αλλά δεν επηρεάζει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό ή επιθετική πιθανότητα

KLK5, 6 και 10 ήταν οι συχνότερα εκφράζονται καλλικρεϊνες στις λιγότερο επιθετικές κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών υποδηλώνοντας μια συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης των εν λόγω καλλικρεϊνών και ογκογόνο δυνητικός. Για να δώσουμε έμφαση χώρια τους ρόλους του κάθε καλλικρεϊνης και τις αλληλεπιδράσεις τους σε ογκογόνο, ES-2 κύτταρα τα οποία δεν εκφράζουν καμία από τις δοκιμασμένες καλλικρεϊνών (Πίνακας 1) διαμολύνθηκαν σταθερά με φορείς έκφρασης για KLK5, 6, 10 μόνο του ή σε ζεύγη. 3 ή περισσότερα από κλώνους KLK5, 6, 10, 5/6, 5/10, 6/10, μαζί με κενό ελέγχου πλασμίδιο και μη τροποποιημένα κύτταρα ES-2 συγκρίθηκαν για ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη, πολλαπλασιασμό και εισβολή (Εικ. 1). Έκφραση των KLK5, 5/6, 5/10, 6/10 και ήταν αρκετή για να μειώσει σημαντικά την ικανότητα των κυττάρων ES-2 για το σχηματισμό αποικιών σε μαλακό άγαρ, σε σύγκριση με τον έλεγχο φορέα μόνο, αλλά δεν μεταβάλλει το ρυθμό πολλαπλασιασμού επί 96 h ή ρυθμίζουν την ικανότητα των κλώνων να εισβάλουν σε μια δοκιμασία Transwell.

Τρεις ή περισσότεροι κλώνοι της κυτταρικής σειράς ES-2 υπερεκφράζουν KLK5, 6 ή 10 ή ζεύγη KLK5 /6, KLK5 /10 και KLK6 /10 συγκρίθηκαν με τα γονικά κύτταρα ES-2 ή ελέγχου φορέα επιμολυσμένα

in vitro

για ογκογόνο δυναμικό τους. Α) Οι κλώνοι αναπτύχθηκαν σε μαλακό άγαρ και ο αριθμός των αποικιών μετρήθηκε και παριστάνεται ως εκατοστιαία αναλογία των κυττάρων τα οποία σχηματίζονται αποικίες. Β) Οι κλώνοι αναπτύχθηκαν για 96 ώρες σε μέσο που περιέχει ορό και οι αριθμοί των κυττάρων μετρήθηκαν. Γ) κλωνικά κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε μέσο άνευ ορού αποτέθηκαν σε ένα ένθετο επικαλυμμένα με εκχύλισμα βασικής μεμβράνης και αφήνεται να εισβάλουν στο κολύμβησης transwell σε μέσα με 10% ορό για 24 ώρες και μεταναστεύουν κύτταρα ποσοτικά. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος των 3 ή περισσότερα κλώνους +/- SEM, και η σημασία συνάγεται από μονόδρομη ANOVA με μετά τη δοκιμή εάν ρ & lt? 0.05. Διαφορετικά γράμματα πεζά πάνω από κάθε ράβδο υποδηλώνουν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των τιμών (p & lt? 0,05). Στην C, τα δεδομένα κανονικοποιούνται στο γονικό έλεγχο.

Η

Σταθερό υπερέκφραση KLK 5, 6 και 10, μόνο του ή σε ζεύγη, σε κλώνους της καλλικρεΐνης ανεπάρκεια ES-2 κυτταρική γραμμή, τα αποτελέσματα με αλλαγμένη την επιβίωση του ξενομοσχεύματος ποντικού μοντέλο

Για να διερευνηθεί αν η έκφραση απόκλιση καλλικρεΐνη θα μπορούσε να ρυθμίζουν την επιθετικότητα των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών

in vivo

, μια ενδο-περιτοναϊκή (IP) μοντέλο ξενομοσχεύματος εργαζόταν. Για το σκοπό αυτό το ES-2 κυτταρική σειρά καρκίνου των ωοθηκών είναι ιδανική, δεδομένου ότι δεν εκφράζει καλλικρεϊνες 5, 6 και 10 (Πίνακας 1) και εύκολα σχηματίζει επιδεινώνεται ταχέως όγκους ΙΡ σε γυμνούς ποντικούς που συνοδεύονται από ασκίτη, μιμούμενες έτσι την εξέλιξη της νόσου σε ανθρώπους [39]. Οι κλώνοι που προέρχονται από αυτή την κυτταρική γραμμή, σταθερώς εκκρίνουν KLK5, 6, 10, 5/6, 5/10 και 6/10 στο μέσο καλλιέργειας μαζί με τα κατάλληλα κενά στοιχεία ελέγχου φορέα (Πίνακας 2) εγχύθηκαν ΙΡ σε ανοσοανεπαρκείς ποντικούς ηυ /ηυ . Οι ποντικοί εγχύθηκαν με 10

7 κύτταρα κάθε κλώνου ανά ζώο, σε ομάδες των 8, τα οποία στη συνέχεια τυφλή, και να παρακολουθείται στενά για τα τελικά σημεία. Οι μέσοι χρόνοι επιβίωσης για τη γονική γραμμή ήταν 16δ, ενώ το ενιαίο έλεγχο εκφραστής ήταν 19.5d και το διπλό έλεγχο εκφραστής ήταν 15δ. Επιβίωσης της ομάδας που εκφράζουν KLK5 (24.5d) δεν διέφεραν από την ομάδα ελέγχου (Σχ. 2), ενώ επιβίωση των ομάδων που εκφράζουν KLK10 (32.5d), KLK5 /6 (25.5), KLK5 /10 (23,5), και KLK6 /10 (23,5) ήταν σημαντικά μεγαλύτερη από ό, τι ενδεδειγμένους ελέγχους τους με δοκιμή logrank (Εικ. 2). Επιβίωσης της ομάδας που υπερεκφράζουν KLK6 (15δ) μόνο ήταν σημαντικά μικρότερη από την κυτταρική γραμμή ελέγχου αλλά όχι η γονική γραμμή. Οι ομάδες KLK5, KLK10, KLK5 /6 και KLK5 /10 το καθένα είχε μια ελεύθερη νόσου του ποντικιού επιζών, ενώ η ομάδα KLK6 /10 είχε δύο, κατά τη λήξη της μελέτης κατά την ημέρα 56, ενώ όλα τα ποντίκια στις ομάδες ελέγχου εκδήλωσαν νόσο.

Α) οι κλώνοι της κυτταρικής σειράς ES-2 υπερεκφράζουν KLK5, 6 ή 10 ή Β) ζεύγη KLK5 /6, KLK5 /10 και KLK6 /10 ενέθηκαν ΙΡ σε γυμνούς ποντικούς και η επιβίωση σε σύγκριση με τους ποντικούς ελέγχου ξενομοσχεύτηκε με τις κατάλληλες κλώνους φορέα ραχοκοκαλιάς. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως οικόπεδο Kaplan-Meier, και η σημασία χρησιμοποιώντας ένα τεστ logrank έναντι κατάλληλου ελέγχου είχε συναχθεί σε ρ & lt? 0.05. * Υποδηλώνει p & lt? 0,05, ** σημαίνει ρ & lt? 0,01 και *** ρ & lt?. 0.001

Η

Ποντίκια ξενο-μεταμόσχευσις όγκους καλλικρεΐνη εκκρίνουν εμφανίζουν αλλαγές στην παθοφυσιολογία

Για να διευκρινιστεί η σχέση μεταξύ KLK την έκκριση και την επιβίωση, αρκετές μετρήσεις σχετίζονται με την ασθένεια συγκρίθηκαν σε όλες τις ομάδες κατά την νεκροψία (Πίνακας 3). Η επικρατέστερη τελικό σημείο ήταν κοιλιακή διάταση (82%) που προκύπτει από τη συσσώρευση ασκίτη, που ακολουθείται από αναπνευστικής δυσχέρειας (8%) που προκαλείται από πλευριτική συλλογή, αφυδάτωση και απώλεια βάρους (7%), και τελικά μειωμένη κινητικότητα (3%). Μερικά ζώα δεν μετρήθηκαν στις τελικού σημείου στατιστικά λόγω της απουσίας της νόσου κατά τη λήξη της μελέτης (Ν = 8), είτε επειδή πέθαναν από τη νόσο πριν από την endpointed (Ν = 6). Όγκου ιστολογία, διάδοση και εντοπίσεων των μεταστάσεων ήταν παρόμοια μεταξύ των ομάδων, με μια προτίμηση για το επίπλουν, περιτοναϊκή μεμβράνη, διάφραγμα, αναπαραγωγικά όργανα, το συκώτι και τα έντερα. Τόσο φορτίο του όγκου και ο ασκίτης όγκος καταγράφηκαν σε ζώα που έφτασε τελικό σημείο, και μη μηδενικές τιμές χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό της μέσης (Πίνακας 3). Μέσος όγκος ασκίτη δεν διέφερε μεταξύ των ομάδων με την αξιοσημείωτη εξαίρεση του ελέγχου διπλής οποία προχώρησε παρελθόν διάταση καταληκτικό σημείο τους πριν να θυσιαστούν λόγω του γρήγορου ρυθμού τους εξέλιξης της νόσου. Μια στατιστικά σημαντική χαμηλώσει συχνότητα εμφάνισης ασκίτη στη νεκροψία δεν παρατηρήθηκε στα ζώα των ομάδων KLK5 /10 (ρ & lt? 0,01) και KLK6 /10 (ρ & lt? 0,01) με μόνο ποσοστό εμφάνισης 37,5% σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου οι οποίες όλες αναπτύχθηκαν ασκίτη. Παραδόξως, η ομάδα KLK6 /10 είχαν επίσης κατά μέσο όρο υψηλότερο φορτίο του όγκου (p & lt? 0,01), πιθανώς λόγω της μεγαλύτερης ασκίτη επιβίωση ελεύθερη. Μεταξύ των ζώων που ανέπτυξαν ασκίτη στους κόλπους των ομάδων KLK5, KLK10, KLK5 /6, KLK5 /10, KLK6 /10, σημαντικά χαμηλότερη συχνότητα εμφάνισης των πολυκύτταρων ελεύθερης διακύμανσης αδρανών υλικών στα ασκίτη καταγράφηκε (Πίνακας 3). Τα συσσωματώματα που υπάρχουν στα ασκίτη ήταν συμπαγείς σφαίρες των κυττάρων του ομοιόμορφου μεγέθους (~ 1 mm

3) ορατό με γυμνό μάτι. Οι συγκεντρώσεις καλλικρεϊνης που μετρήθηκαν με ELISA στον ασκίτη έδειξαν επίπεδα KLK6 (Πίνακας 3) να είναι συγκρίσιμα με τα επίπεδα παρατηρήθηκαν σε ασκίτη ασθενή, ενώ τα επίπεδα τόσο της KLK10 και KLK5 ήταν αυξημένα σε σύγκριση με τα δείγματα των ασθενών, ειδικά στις ομάδες συνδυασμού.

Ο χρόνος επιβίωσης της κάθε ομάδας ποντικών μπορεί να διαιρεθεί σε μια περίοδο πριν από την έναρξη των συμπτωμάτων, που ακολουθείται από μια συμπτωματική περίοδο, η οποία κορυφώνεται στο τέλος της μελέτης. Η μεταβλητότητα μεταξύ των ομάδων είναι ήδη παρούσα κατά την εξέταση η εμφάνιση των συμπτωμάτων (Πίνακας 3), υποδεικνύοντας καλλικρεϊνες μπορεί να επηρεάσει την εξέλιξη της νόσου νωρίς. Για να ακολουθήσει την εξέλιξη πρώιμο στάδιο της νόσου, τα επίπεδα στο πλάσμα καλλικρεΐνης μετρήθηκαν με ELISA σε κάθε εβδομαδιαία ζώο και κατά τη νεκροψία, για να χρησιμεύσει ως υποκατάστατος δείκτης της επιβάρυνσης του όγκου. Καλλικρεϊνες ήταν ανιχνεύσιμα στο πλάσμα πολύ πριν από την εμφάνιση των πρώτων συμπτωμάτων σε όλα τα ποντίκια, υποδεικνύοντας ότι οι ασυμπτωματικοί ασθένεια ίχνος είναι ανιχνεύσιμη με μέτρηση κυκλοφορούντων καλλικρεΐνες.