Αφηρημένο

αντίσταση χημειοθεραπεία είναι η κύρια αιτία για την αποτυχία της θεραπείας του καρκίνου των ωοθηκών. Ένας μηχανισμός πίσω χημειο-αντίσταση περιλαμβάνει την προς τα πάνω ρύθμιση της αντίστασης σε πολλαπλά φάρμακα (MDR) γονίδια (ABC μεταφορείς) που μεταφέρουν αποτελεσματικά (εκροή) φάρμακα έξω από τα κύτταρα του όγκου. Ως ένα κοινό σύμπτωμα σε στάδιο III /IV ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών, ασκίτης σχετίζεται με την εξέλιξη του καρκίνου. Ωστόσο, εάν η αντίσταση σε πολλά φάρμακα μονάδες ασκίτη σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών περιμένει διευκρίνιση. Εδώ, έχουμε αποδείξει ότι όταν καλλιεργούνται με ασκίτη που προέρχονται από ποντίκια που φέρουν καρκίνο των ωοθηκών, ένα ποντικού κυτταρική σειρά καρκίνου των ωοθηκών έγινε λιγότερο ευαίσθητες σε πακλιταξέλη, μια πρώτη γραμμή χημειοθεραπευτικό παράγοντα για ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών. Επιπλέον, η επώαση των καρκινικών κυττάρων ποντικού ωοθηκών

in vitro

με ασκίτη οδηγεί λειτουργία εκροής σε αυτά τα κύτταρα. Λειτουργικές μελέτες δείχνουν ασκίτη καθοδηγείται εκροής είναι να κατασταλεί με ειδικούς αναστολείς του ενός από τους δύο μεταφορείς ABC [πολυφαρμακευτική σχετική πρωτεΐνη (MRP 1)? Καρκίνος του μαστού σχετική πρωτεΐνη (BCRP)]. Για να καταδειχθεί η σημασία των ευρημάτων μας σε ασθενείς του καρκίνου των ωοθηκών, μελετήσαμε σχετική εκροή σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών που λαμβάνονται από είτε ασκίτη ασθενή ή από πρωτογενή όγκο. Αθανατοποιημένες κυτταρικές γραμμές αναπτύχθηκαν από ανθρώπινο ασκίτη εμφανίζουν αυξημένη ευαισθησία σε αναστολείς εκρέει (MRP1, BCRP) σε σύγκριση με μια κυτταρική γραμμή που προέρχεται από ένα πρωτογενή καρκίνο των ωοθηκών, προτείνοντας τη σύνδεση μεταξύ ασκίτη και λειτουργία εκροής στον ανθρώπινο καρκίνο των ωοθηκών. Εκροής σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών ασκίτη προερχόμενα συνδέεται με αυξημένη έκφραση του ABC μεταφορέων σε σύγκριση με εκείνη στην πρωτοβάθμια προέρχονται από όγκους ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Συλλογικά, τα ευρήματά μας προσδιορίσει μια νέα δραστηριότητα για ασκίτη στην προώθηση της αντίστασης του καρκίνου των ωοθηκών σε πολλά φάρμακα

Παράθεση:. Μο L, Pospichalova V, Huang Ζ, Murphy SK, Payne S, Wang F, et al. (2015) Ασκίτης αυξάνει την έκφραση /Λειτουργία σε πολλαπλά Αντίστασης Πρωτεΐνες σε ωοθηκών καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 10 (7): e0131579. doi: 10.1371 /journal.pone.0131579

Επιμέλεια: Ιρίνα Β Λεμπέντεβα, το Πανεπιστήμιο Columbia, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 5 Δεκέμβρη του 2014? Αποδεκτές: 3 Ιουνίου, 2015? Δημοσιεύθηκε: 6 Ιουλίου, 2015

Copyright: © 2015 Μο et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα δεδομένα είναι περιέχεται μέσα στο χαρτί

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από CZ.1.07 /02.03.00 /30.0009, το Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο (VP) (https://ec.europa.eu/esf/home.jsp ), W81XWH-11-1-0469, Υπουργείο άμυνας καρκίνου των ωοθηκών Βραβείο Έρευνας Πρόγραμμα (SKM) (https://cdmrp.army.mil/ocrp/), Gail Πάρκινς καρκίνου των ωοθηκών Ταμείο Έρευνας (SKM) (http: //www.ovarianawareness.org), εσωτερική Αποθεματικό Κεφάλαιο του Τμήματος Παθολογίας, Duke University Medical Center (SVP). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Λειτουργικά debulking όγκου γίνεται κυρίως σε Ι /ΙΙ ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών σταδίου. Αυτή η χειρουργική διαδικασία για προχωρημένο στάδιο της νόσου (III έως IV) δεν είναι πάντα εφικτό, ιδιαίτερα σε γυναίκες των οποίων η νόσος είναι εκτεταμένη [1]. Ως εκ τούτου, η χημειοθεραπεία είναι το κύριο εργαλείο για την παρεμπόδιση της διάδοσης των καρκινικών κυττάρων όταν οι κλινικοί γιατροί τη θεραπεία ασθενών σε προχωρημένα στάδια του καρκίνου. Σε σύγκριση με τα φυσιολογικά κύτταρα, ενεργά πολλαπλασιαζόμενα καρκινικά κύτταρα είναι πιο ευαίσθητα σε μία ποικιλία κυτταροτοξικών φαρμάκων που στοχεύουν διαφορετικές κυτταρικές διαδικασίες, συμπεριλαμβανομένων των παραγόντων αλκυλίωσης DNA, αντιμεταβολίτες, παράγοντες παρεμβολής και μιτωτικούς αναστολείς [2].

χημειοθεραπεία πρώτης γραμμής για καρκίνο των ωοθηκών έχει παραμείνει αμετάβλητη κατά την τελευταία δεκαετία, με την θεραπευτική σκελετό που αποτελείται από ένα αντικαρκινικό μέσο πλατίνας (γενικά καρβοπλατίνης) και μίας ταξάνης (γενικά paclitaxel) [3]. Οι χημειοθεραπείες δεύτερης γραμμής θεωρούνται όταν οι ασθενείς δεν ανταποκρίνονται στη πρώτης γραμμής φάρμακα. Ένας αριθμός αντινεοπλασματικών παραγόντων έχουν καταδείξει επαρκή βιολογική δραστικότητα πρέπει να θεωρηθούν ορθολογικές επιλογές δεύτερης γραμμής, όπως δοξορουβικίνη, ετοποσίδη, γεμσιταβίνη, ιφοσφαμίδη, ή κυκλοφωσφαμίδη [4].

Chemo-αντίσταση, η οποία χαρακτηρίζεται από μια μειωμένη ικανότητα της χημειοθεραπείας να αναστέλλει την ανάπτυξη του όγκου πάροδο του χρόνου, είναι η πιο κοινή αιτία για διακοπή της θεραπείας χημειοθεραπεία. Ωοθηκών υποτροπής του καρκίνου είναι ένα άμεσο αποτέλεσμα της χημειο-αντίστασης, που εμφανίζονται σε περισσότερους από το 80% των ασθενών υψηλού βαθμού ορώδες ωοθηκικό καρκίνο [3, 5]. Οι μηχανισμοί πίσω από χημειο-αντίσταση περιλαμβάνουν: 1) προς τα πάνω ρύθμιση της αντίστασης σε πολλαπλά φάρμακα (MDR) γονιδίων που μεταφέρουν αποτελεσματικά φάρμακα έξω από το κύτταρο? 2) μεταβολή των ενζύμων που μεταβολίζουν φάρμακα, όπως εκείνες στην οικογένεια της γλουταθειόνης δ-τρανσφεράσης (GST)? 3) διαφυγή από την απόπτωση και αυξημένη επιδιόρθωση του DNA λόγω μεταλλαγμένα γονίδια καταστολέα όγκου [p53, ο καρκίνος του μαστού 1/2 μεταλλαγμένα γονίδια (BRCA1 /2), και αταξία τηλαγγειεκτασία (ΑΤΜ)] [2]? και 4) απομείωση μιτωτικής ατράκτου οδοφράγματος που οδηγεί σε αντίσταση σε αναστολείς μικροσωληνίσκων [6].

Μια μεγάλη οικογένεια του 50 διαφορετικές ΑΤΡ-σύνδεσης κασέτας (ABC) πρωτεΐνες (ABC μεταφορείς) έχουν τεκμηριωθεί ότι εκρέει κυτταροτοξικά μόρια, μειώνοντας την ενδοκυτταρική συγκέντρωση φαρμάκου [7, 8]. Μεταξύ των μεταφορείς ABC που σχετίζονται με χημειο-αντίσταση του καρκίνου των ωοθηκών, η

MDR1

γονίδιο, το οποίο κωδικοποιεί P-γλυκοπρωτεΐνης (P-gp? MDR1, ABCB1), είναι η πιο συχνά μελετηθεί ο μηχανισμός. Άλλες κοινές μεταφορείς ABC περιλαμβάνουν: την MDR-1 πρωτεΐνης που συνδέεται (MRP1, ABCC1) και την πρωτεΐνη αντοχής στον καρκίνο του μαστού (BCRP, ABCG2) [2]. Βραχυπρόθεσμες επώαση των ωοθηκών καρκινικά κύτταρα με χημειοθεραπευτικές αγωγές (π.χ. δοξορουβικίνη, σισπλατίνη και πακλιταξέλη) σε κλινικές συγκεντρώσεις τους [9] αυξάνει τα επίπεδα έκφρασης MDR1. Αξίζει να σημειωθεί ότι, επαναλαμβανόμενες καρκίνων των ωοθηκών εμφανίζουν αυξημένη σημαντικά MDR1 σε σύγκριση με πρωτογενείς καρκίνους των ωοθηκών, με τις επαναλαμβανόμενες ασθενείς που λαμβάνουν πλατίνα ταξάνη θεραπεία ως πρότυπο φροντίδας μετά τη διάγνωση του πρωτοπαθούς καρκίνου τους [10]. Παρόμοια με MDR1, MRP1 ανιχνεύεται σε πρωτογενείς όγκους των ωοθηκών ανεπεξέργαστων σε διάφορα επίπεδα [11] και βρέθηκε ρυθμίζεται αυξητικά μετά από μια σταδιακή ανάπτυξη αντίστασης σισπλατίνη σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών

in vitro

[12]. BCRP επάγεται σε κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών από μακροχρόνια επώαση με τοποτεκάνη και προσδίδει αντοχή στην τοποτεκάνη και μιτοξανθρόνη [13, 14].

ασκίτη είναι ένα κοινό σύμπτωμα σε στάδιο III /IV ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών και συσχετίζεται με μια φτωχή πρόγνωση [15]. Κακοήθεις ασκίτη είναι γνωστό στην προστασία της ανθρώπινης ωοθήκης καρκινικά κύτταρα από TRAIL επαγόμενη απόπτωση οδηγεί σε μια συντομότερη ελεύθερη νόσου επιβίωση των ασθενών [16, 17]. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά για τη σχέση μεταξύ της παρουσίας ασκίτη και χημειο-αντίσταση στον καρκίνο των ωοθηκών. Σε αυτή τη μελέτη, θα διερευνήσει τον τρόπο με ασκίτη επηρεάζει ωοθηκών καρκινικά κύτταρα στις απαντήσεις τους στο paclitaxel και docetaxel, οδηγώντας φάρμακα ταξάνη που χρησιμοποιούνται από τους κλινικούς ιατρούς στην αντιμετώπιση του καρκίνου των ωοθηκών [3].

Υλικά και Μέθοδοι

τηλέφωνα γραμμή και αντιδραστήρια

ID8, ένα επιθηλιακό ποντίκι κυτταρική σειρά καρκίνου των ωοθηκών [18], ήταν ένα είδος δώρο από τον Δρ Kathy Roby στο Πανεπιστήμιο του Κάνσας Ιατρικό Κέντρο. Mycoplasma διαλογή μόλυνση χρησιμοποιώντας υβριδισμό νουκλεϊκού οξέος Gen-Probe διεξήχθη με την Cell Culture Facility Duke Ινστιτούτο Καρκίνου τον Απρίλιο του 2010. κύτταρα ID8 διατηρήθηκαν σε DMEM (υψηλή γλυκόζη, Gibco-Life Technologies [Gibco]? Carlsbad, CA) που περιέχει 4% ορό εμβρύου βόειο ορό, πενικιλλίνη (100 μονάδες /ml) + στρεπτομυκίνη (100 μg /ml) (Invitrogen-Life Technologies [Invitrogen]? Carlsbad, CA). ΗΑ1 και ΗΑ2 αναπτύχθηκαν από SV40 Τ αντιγόνο αθανατοποίηση ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών που λαμβάνονται από ασκίτη [γραμμή ΗΑ1 προέρχεται από ασκίτη (6116) από την πρωτογενή χειρουργική ορώδες καρκίνωμα, χαμηλή διαφοροποίηση? ΗΑ2 γραμμή που προέρχεται από ασκίτη (OV 186), από την πρωτογενή χειρουργική επέμβαση ορώδες θηλώδες cystadenocarinoma]. κύτταρα TD αναπτύχθηκαν από SV40 αθανατοποίηση των ανθρώπινων ωοθηκών καρκινικά κύτταρα από την πρωτογενή χειρουργική επέμβαση υψηλού βαθμού ιστού ορώδες αδενοκαρκίνωμα (πρωτοβάθμια περιτοναϊκή καρκίνωμα) (6114)]. Αυτές οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε ϋΜΕΜ (υψηλή γλυκόζη, Gibco) που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου και 1Χ πενικιλλίνη στρεπτομυκίνη. De-εντοπίστηκαν δείγματα όγκων και ασκίτη που χρησιμοποιούνται για να δημιουργήσουν τα αθανατοποιημένες κυτταρικές σειρές συλλέχθηκαν, ακόλουθη διάταξη δότη των γραπτή συγκατάθεση, από τον όγκο Δούκα Γυναικολογικής Ογκολογίας Τράπεζα (Pro00013710) και χρησιμοποιήθηκαν για αυτή τη μελέτη σύμφωνα με το πρωτόκολλο Δούκα IRB Pro00027325. Η πακλιταξέλη (T7191) και docetaxel (01.885) αγοράσθηκαν από την Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ. Ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές των ωοθηκών διατηρήθηκαν για μέγιστο χρονικό διάστημα δύο περάσματα πριν από την ανάλυση.

Ποντικού ασκίτη προετοιμασία

Αυτή η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις στον Οδηγό για την Φροντίδα και Χρήση των Εργαστηριακών ζώων του Εθνικού Ινστιτούτου Υγείας. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από τα θεσμικά Animal Care & amp? Χρησιμοποιήστε επιτροπή στο Πανεπιστήμιο Duke (αριθμός πρωτοκόλλου: A295-12-11). Όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία. Χρησιμοποιήθηκαν? Γυναίκα ηλικίας 6-8 εβδομάδων C57BL /6 ποντίκια (Raleigh, NC Charles River). κύτταρα ID8 (1-10×10

6) ενέθηκαν στο περιτόναιο ποντικού. Μετά τη συσσώρευση ασκίτη, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία. Περιτοναϊκό υγρό συλλέχθηκε και φυγοκεντρήθηκε δύο φορές στα 500 χ g για 5 λεπτά για να διαχωριστούν τα κυτταρικά και μη κυτταρικά κλάσματα. Ακυτταρικά κλάσματα από πολλαπλές ποντίκια συγκεντρώθηκαν και διηθήθηκαν μέσω 0.22 μm αποστειρωμένων φίλτρων. Οι συνθήκες επεξεργασίας ασκίτης 50% ομαλοποιήθηκαν σε κανονικές συνθήκες καλλιέργειας σε σχέση με FBS, γλυκόζη και συγκεντρώσεις αντιβιοτικού.

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής με πράσινο εκροής ID Dye

Οι λειτουργίες των πρωτεϊνών αντοχής σε πολλαπλά φάρμακα MDR1 , MRP και BCRP αναλύθηκαν με eFluxx-ID Πράσινο πολυφαρμακευτική αντίσταση Assay Kit (ENZ-51029-K100, Enzo Lifesciences, Farmingdale, ΝΥ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, εναιωρήματα απλού κυττάρου συλλέχθηκαν με τρυψίνη μετρήθηκαν, ίσοι αριθμοί κυττάρων (500,000 /κατάστασης) επαναιωρήθηκαν σε πλήρες μέσο που περιέχει specificinhibitors ή συνδυασμούς τους (ή DMSO ως έλεγχος αραιωτικού) andincubated για 10 λεπτά στους 37 ° C. Πηγές /τελικές συγκεντρώσεις των αναστολέων είναι ως ακολούθως: Verapamil (αναστολέας MDR1? Sigma V4629? 40 μΜ)? ΜΚ-571 (αναστολέας MRP1? Sigma M7571? 100 μΜ)? Νοβοβιοκίνη (αναστολέας BCRP? Sigma N1628? 200 μm). Πράσινο χρώμα στη συνέχεια προστέθηκε και επωάστηκε στους 37 ° C για 40 λεπτά. Τα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά σε PBS πριν την απόκτηση δεδομένων FACS χρησιμοποιώντας ένα όργανο γκουάβα Easycyte Plus (Millipore, Billerica, ΜΑ), 7-AAD χρησιμοποιήθηκε για να αποκλείσει τα νεκρά κύτταρα από την ανάλυση. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με τη χρήση του λογισμικού FlowJo_V10 (Ashland, OR)

Υπολογισμός της σε πολλαπλά παράγοντα αντιστασιακή δράση

Η δραστηριότητα συντελεστή αντίστασης σε πολλαπλά φάρμακα (MAF) για κάθε μεταφορέα, ήταν υπολογίζονται με τους ακόλουθους τύπους:. Όπου F είναι ο γεωμετρικός μέσος της έντασης φθορισμού (GMFI), F

0 – χωρίς αναστολέα, F

MDR1 – με αναστολέα MDR1, F

MRP – με αναστολέα MRP, F

BCRP – με αναστολέα BCRP

Rhodamine 123 κατακράτηση δοκιμασία

λειτουργία αποβολής του φαρμάκου προσδιορίστηκε σε μη επεξεργασμένα και ασκίτη επεξεργασμένα κύτταρα ID8 με ροδαμίνη 123 προσδιορισμούς συγκράτησης [18]. κύτταρα ID8 λαμβάνονται από φυσιολογικά καλλιέργεια, από 7 ήμερη καλλιέργεια ασκίτη προεπεξεργασίας ή από ασκίτες

in vivo

σπάρθηκαν στα 40.000 κύτταρα ανά φρεάτιο σε τρυβλία 6 φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα. Αυτά τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με ροδαμίνη 123 για 30 λεπτά. Κύτταρα από κάθε συνθήκη στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS και επωάστηκαν με κανονικό μέσο για 2,5 ώρες. Φθορισμού φωτογραφίες τραβήχτηκαν σε μια διέγερση λ = 485 nm και εκπομπή λ = 530 nm χρησιμοποιώντας BioTek Cytation3 Imager (Winooski, VT) σε 0 λεπτά (μετά την αφαίρεση βαφής και το πλυστικό PBS) και σε 2.5 ώρες ώρες μετά την ροδαμίνη 123 αφαίρεση. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις ανεξάρτητα φορές

πραγματικού χρόνου ποσοτική RT-PCR

Το ολικό RNA από κύτταρα εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας κιτ Qiagen RNeasy Micro σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. (Qiagen? Valencia, CA) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με RNase-free DNase να απομακρυνθούν τυχόν υπολείμματα γονιδιωματικό DNA. Μονόκλωνο cDNA που συντέθηκαν με επώαση ολικού RNA (1 μg) με RNase H-αντίστροφης μεταγραφάσης (500 U), ολίγο- (dT) 12-18 εκκινητή (100 ηΜ), dNTPs (1 mM), και RNase αναστολέα ( 40 U) στους 42 ° C για 1 ώρα σε ένα τελικό όγκο 20 μΙ. Απομαγνητοφώνηση First Strand cDNA Synthesis Kit αγοράστηκε από την Roche Applied Science (Indianapolis, IN). Q-PCR εκκινητών για ποντίκι

Abcc1

,

Abcb1a

,

Abcb1b

και

β-ακτίνης

αγοράστηκαν από ΟηΟεηε (Rockville, MD). Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου πραγματοποιήθηκε για να συγκρίνουν τα επίπεδα έκφρασης του κάθε συνολικού δείγματος RNA. Real-time PCR στο QPCR Σύστημα Mx3005P (Stratagene, La Jolla, CA) πραγματοποιήθηκε με την παρουσία 12,5 μλ VeriQuest Fast SYBR Green qPCR κύριο μίγμα (2χ) (USB, Cleveland, ΟΗ) και 2 cDNA μΙ, και Η

2O προστέθηκε σε ένα τελικό όγκο 25μλ. Real-time PCR πραγματοποιήθηκε με ένα αρχικό στάδιο αποδιάταξης 5 λεπτών στους 95 ° C, που ακολουθείται από 40 κύκλους των 3 s στους 95 ° C, 30 s σε θερμοκρασία ανόπτησης στους 60 ° C. Τα προϊόντα της PCR παρακολουθείται σε πραγματικό χρόνο με μέτρηση της αύξησης του φθορισμού που προκαλείται από την πρόσδεση του SYBR Green Ι Dye. Σημασία αναλύθηκε χρησιμοποιώντας το πακέτο λογισμικού MxPro QPCR Software (Stratagene, La Jolla, CA).

Western Blots

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας τρυψίνη-ΕϋΤΑ και πλύθηκαν με PBS. Τα συλλεγμένα κύτταρα επωάστηκαν σε συνολικό ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (50 mM Tris ρΗ 7.5, 1% SDS) συν πρωτεάσης και φωσφατάσης αναστολέα κοκτέιλ (Halt, Thermo Scientific). Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίσθηκαν με δοκιμασία BCA. Ισοδύναμες ποσότητες πρωτεΐνης υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση πηκτής SDS-πολυακρυλαμιδίου (PAGE) και ανοσοστυπώθηκαν. Οι κηλίδες επωάστηκαν με τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα, ακολουθούμενη από τις κατάλληλες είδος IRDye-συζευγμένο δευτερεύον αντίσωμα (Life Technologies, Carlsbad, CA): MDR1 (BIOSs? Cat # 1468R)? MRP1 (Biorbyt Cat # ORB76148)? BCRP (Biorbyt Cat # ORB10178)? βήτα ακτίνης (Sigma Cat # SAB5500001). MDR1, MRP1, πρωτεΐνες BCRP ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας Odyssey σύστημα υπέρυθρης απεικόνισης (LI-COR, Lincoln, NE). Οι ζώνες πρωτεΐνης ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Image J (ΝΙΗ, Bethesda, MD), και η σχετική αναλογία της πρωτεΐνης του ενδιαφέροντος για τον έλεγχο φόρτωσης βήτα ακτίνης υπολογίστηκε.

δοκιμασίες πολλαπλασιασμού

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 2.5×10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες 96-φρεατίων και αφέθηκαν να αναπτυχθούν όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά με ϋΜΕΜ χωρίς ορό. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με διαφορετικές συγκεντρώσεις paclitaxel ή docetaxel αραιωμένο σε 200 μΙ ϋΜΕΜ για 24 ώρες. Οι ασκίτες κατεργασμένα κύτταρα ή κύτταρα ID8 ID8 που συλλέγονται από ασκίτες έλαβαν τις θεραπείες αραιωμένο σε 200 μΙ 50% υπερκείμενο ασκίτη. Σε 18 ώρες, 0,5 μθί [

3Η] -θυμιδίνης (Perkin-Elmer, Waltham, ΜΑ) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο. Μετά από 8 ώρες, το μέσο απομακρύνθηκε και τα κύτταρα διαχωρίστηκαν σε 10Χ θρυψίνη-ΕϋΤΑ και συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας μία microharvester 12 καναλιών (Skatron Instruments, Νορβηγία). Τα δείγματα μετρήθηκαν σε έναν υγρό φασματοφωτόμετρο σπινθηρισμού. Όλες οι συνθήκες ήταν εις τετραπλούν, και κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον δύο φορές.

7-AAD χρώση

ID8 κύτταρα από διαφορετικούς προ-θεραπείες σπάρθηκαν στα 4×10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο και αφέθηκαν να αναπτυχθούν όλη τη νύκτα σε πλάκες 6 φρεατίων. Πλύθηκαν μια φορά με DMEM ελεύθερο ορού. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με διαφορετικές συγκεντρώσεις paclitaxel ή docetaxel αραιωμένο σε 2 ml ϋΜΕΜ για 4 ημέρες. αντιμετωπίζονται ασκίτη κύτταρα ID8 ή κύτταρα ID8 συλλέγονται από ασκίτη έλαβαν τις θεραπείες διαλυμένο σε 2 ml υπερκείμενου ασκίτη 50%. Στο τέλος των θεραπειών, τα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση και χρωματίστηκαν με 7-AAD (BD Biosciences) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή που ακολουθείται από ανάλυση σε ένα όργανο γκουάβα Easycyte Plus (Millipore) και αναλύθηκαν με λογισμικό FlowJo_V10.

Η στατιστική ανάλυση

οπτικοποίηση γράφων, μετασχηματισμό δεδομένων και στατιστική ανάλυση (δίπλευρη unpaired t-test ή διπλής κατεύθυνσης – ANOVA) πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση Prism (έκδοση 5.0, GraphPad Software) και το Microsoft Office Excel (έκδοση 2010, η Microsoft ).

Αποτελέσματα

ασκίτη αυξάνει ID8 αντίσταση των κυττάρων χημειοθεραπεία

Εξετάσαμε την επίδραση του ασκίτη στην αντίσταση των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών με πακλιταξέλη, μια πρώτη γραμμή χημειοθεραπευτικό παράγοντα. Σύγκριση πραγματοποιήθηκε μεταξύ 1) κυττάρων ID8 αναπτύχθηκαν σε κανονικό μέσο καλλιέργειας, 2) κύτταρα ID8 πρόσφατα απομονωμένα από υγρό ασκίτη σε ένα συγγενικό μοντέλο, και 3) κύτταρα ID8 θεραπεία για 7 ημέρες

in vitro

με υπερκείμενο ασκίτη που προέρχονται από ID8 φέρουν ποντικούς. δοσολογία Χημειοθεραπεία βελτιστοποιήθηκε για μια σειρά για την επίτευξη 0 έως 95% αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης, όπως μετράται από [

3Η] -θυμιδίνης. Τόσο τα κύτταρα ID8 θεραπεία για 7 ημέρες με ασκίτη υπερκείμενο και τα κύτταρα ID8 προσφάτως απομονωθέντα από υγρό ασκίτη ήταν πιο ανθεκτικά στο paclitaxel από κύτταρα ID8 καλλιεργήθηκαν σε κανονικό μέσο, ​​όπως μετράται από [

3Η] -θυμιδίνης δοκιμασία ενσωμάτωσης (Εικόνα 1Α). Για να αξιολογηθεί η υπόθεση ότι ασκίτη drives ωοθηκών κύτταρο χημειο-αντίσταση, μελετήσαμε την επόμενη την απόκριση των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών (+/- θεραπεία ασκίτη) σε ένα άλλο χημειοθεραπευτικό αντιδραστήριο στην οικογένεια ταξανίου (docetaxel). Αξίζει να σημειωθεί ότι, τα κύτταρα ID8 θεραπεία για 7 ημέρες με υπερκείμενο ασκίτη, καθώς και κύτταρα ID8 προσφάτως απομονωθέντα από υγρό ασκίτη ήταν σημαντικά πιο ανθεκτικά στη docetaxel από τα κύτταρα ID8 από την κανονική καλλιέργεια (Σχήμα 1Β).

ποντικού ωοθηκών καρκινικά κύτταρα ( ID8) από τρεις διαφορετικές πηγές μελετήθηκαν: 1) ID8 κύτταρα από κανονικό μέσο καλλιέργειας (Medium), 2) κύτταρα ID8 πρόσφατα απομονωμένα από υγρό ασκίτη σε ένα συνγονιδιακό μοντέλο (

In vivo

κύτταρα), και 3) ID8 κύτταρα κατεργασμένα για 7 ημέρες

in vitro

με υπερκείμενο ασκίτη (ασκίτης αγωγή 7 ημερών). Κάθε ένα από αυτά κυτταρικών πληθυσμών εκτέθηκε σε paclitaxel (Α) ή docetaxel (Β) στο υποδεικνυόμενο συγκέντρωση για 24 ώρες και [

3Η] -θυμιδίνης προσδιορίστηκε. Τρία ανεξάρτητα πειράματα και ένα αντιπροσωπευτικό αποτέλεσμα δείχνεται. μπαρ σφάλμα αντιπροσωπεύει SD της τετραπλούν σε κάθε κατάσταση. * Υποδηλώνει p & lt? 0,05, *** p & lt? 0.001, διπλής κατεύθυνσης ANOVA. κύτταρα Α ID8 προεπεξεργασία με ακυτταρικό ασκίτη για 7 ημέρες (ασκίτης αγωγή 7 ημερών) ή απομονώνονται από ασκίτη (

in vivo

κύτταρα) έχουν αυξημένη αντοχή σε πακλιταξέλη συγκριτικά με κύτταρα ID8 από κανονικό μέσο. κύτταρα Β ID8 προεπεξεργασία με ακυτταρικό ασκίτη για 7 ημέρες (ασκίτης αγωγή 7 ημερών) έχουν αυξημένη αντοχή σε docetaxel σε 2 και 4 ηΜ σε σύγκριση με κύτταρα από φυσιολογικό ID8 καλλιέργεια. ID8 κύτταρα που απομονώθηκαν από ασκίτη (

in vivo

κύτταρα) έχουν αυξημένη αντοχή σε docetaxel σε σύγκριση με τα κύτταρα ID8 από το κανονικό μέσο (Medium). CD. πρόσληψη 7-AAD μετρήθηκε με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Οι τοις εκατό 7-AAD θετικά κύτταρα από τρία ανεξάρτητα πειράματα παρουσιάζεται για την πακλιταξέλη (C) και κύτταρα κατεργασμένα docetaxel (D). Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν SD. * Υποδηλώνει p & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01, *** p & lt? 0.001, διπλής κατεύθυνσης ANOVA. κύτταρα ID8 προ-επεξεργασμένο με ακυτταρικό ασκίτη για 7 ημέρες (ασκίτης αγωγή 7 ημερών) είναι πιο ανθεκτικά σε επαγόμενη από χημειοθεραπεία κυτταρικό θάνατο (

i

.

e

., εμφανίζουν λιγότερες 7-AAD + κύτταρα ) από τα κύτταρα ID8 από την κανονική πολιτισμό.

η

Τα παραπάνω στοιχεία δείχνουν ότι ασκίτη αυξήσεις των ωοθηκών χημειο-αντίσταση των καρκινικών κυττάρων, όπως αξιολογήθηκε με τη χρήση [

3Η] δοκιμασία -θυμιδίνης, η οποία είναι ένα μέτρο του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Εμείς δίπλα επιδιώξαμε να προσδιορίσουμε αν ασκίτη προστατεύει ωοθηκών καρκινικά κύτταρα από προκαλούμενη από χημειοθεραπεία κυτταρικό θάνατο εκτελώντας χρώση 7-AAD. Όπως φαίνεται στο Σχ 1C και 1D, τα κύτταρα ID8 θεραπεία για 7 ημέρες με ελεύθερο κυττάρων ασκίτη προστατεύθηκαν από δύο paclitaxel- και docetaxel- κυτταρικό θάνατο που επάγεται, παρέχοντας περαιτέρω απόδειξη ότι ασκίτη υπερκείμενο προάγει τον καρκίνο των ωοθηκών χημειο-αντίσταση.

ασκίτης οδηγεί εκροής σε κύτταρα ID8

επόμενο διερευνήθηκε λειτουργία εκροής σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών ασκίτη επεξεργασμένα χρησιμοποιώντας δύο προσδιορισμούς εκροής φαρμάκου (εκροής ID πράσινη χρωστική και ροδαμίνη 123) [18]. Η εκροή ID πράσινα μέτρα δοκιμασία ένταση φθορισμού μετά από επώαση των κυττάρων με φθορίζουσα χρωστική. Το σχήμα 2Α παρουσιάζει μειωμένη ένταση φθορισμού στα δύο ασκίτη προ-επεξεργασμένα κύτταρα και τα κύτταρα ID8 ID8 απομονώνονται από ασκίτη (συγγενή μοντέλο ποντικού) σε σύγκριση με ένταση φθορισμού σε μη επεξεργασμένα κύτταρα. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ασκίτη προωθεί τη λειτουργία εκροής σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Είμαστε δίπλα μετριέται διατήρηση της ροδαμίνης 123 βαφής στα κύτταρα ID8 (θεραπεία +/- ασκίτης). Όπως φαίνεται στο σχήμα 2Β και 2Γ, 2.5Η μετά την απομάκρυνση ροδαμίνη, μη κατεργασμένα κύτταρα ID8 είχαν διατηρήσει βαφής. Σε αντίθεση, σημαντικά μειωμένα επίπεδα χρωστικής ανιχνεύθηκαν σε κύτταρα ID8 ασκίτη-προεπωασμένο, υποστηρίζοντας το συμπέρασμα ότι καρκινικά κύτταρα ασκίτη επεξεργασμένα εμφανίζουν αυξημένη εκροή. Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ο ασκίτης οδηγεί μηχανισμών του καρκίνου των ωοθηκών εκροής.

(Α). λειτουργία εκροής μετρήθηκε με δοκιμασία Πράσινη βαφή εκροής ID. ID8 κύτταρα που απομονώνονται από την κανονική καλλιέργεια, που λαμβάνεται μετά την επεξεργασία του ασκίτη 7 ημέρας, ή να απομονωθούν από ασκίτη (

in vivo

κύτταρα) επωάστηκαν με εκροής ID Πράσινο βαφή για 40 λεπτά, επιτρέποντας στα κύτταρα να πρόσληψη και εκρέει αυτή βαφή. κύτταρα ID8 προ-επεξεργασμένο με ασκίτη διατηρείται λιγότερο βαφή σε σύγκριση με κύτταρα από φυσιολογικό ID8 καλλιέργεια, υποδηλώνοντας μία αυξημένη λειτουργία εκροής. (ΣΙ). λειτουργία εκροής μετρήθηκε με ροδαμίνη 123 δοκιμασίας. κύτταρα ID8 λαμβάνονται από φυσιολογικά καλλιέργεια, από 7 ήμερη καλλιέργεια ασκίτη προεπεξεργασίας ή από ασκίτες

in vivo

επωάστηκαν με ροδαμίνη 123 για 30 λεπτά. Στη συνέχεια τα κύτταρα από κάθε συνθήκη πλύθηκαν με PBS και επωάστηκαν με κανονικό μέσο για 2,5 ώρες. Φθορισμού φωτογραφίες τραβήχτηκαν σε 0 λεπτά (μετά την αφαίρεση βαφής και το πλυστικό PBS) και σε 2.5 ώρες ώρες μετά την ροδαμίνη 123 αφαίρεση. Ποσοτικοποίηση της έντασης φθορισμού (μείον το υπόβαθρο) σε κάθε ομάδα παρουσιάζεται στο (C). Τρία ανεξάρτητα πειράματα και ένα αντιπροσωπευτικό αποτέλεσμα δείχνεται. μπαρ σφάλμα αντιπροσωπεύει SD της έντασης φθορισμού μέτρηση κάθε κελί σε κάθε εικόνα. * Υποδηλώνει p & lt?. 0.05, έλεγχος τ

Η

θεραπεία ασκίτη αυξάνει την έκφραση των μεταφορέων αντίστασης που σχετίζονται με πολυανθεκτικά

Μελετήσαμε την έκφραση των τριών γονιδίων μεταφορέα ABC (MDR1, MRP1 και BCRP) που εμπλέκονται συχνά σε καρκίνο χημειο-αντίσταση. Πραγματοποιήσαμε ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR (Q-PCR) επί RNA που συλλέγονται από κύτταρα ID8 και τα κύτταρα ID8 προ-επεξεργασία με ασκίτη. Τα ανεπεξέργαστα κύτταρα ID8 εκφράζεται τόσο MRP1 και BCRP mRNA (Σχήμα 3Α). Μετά τη θεραπεία με ασκίτη

in vitro

για 7 ημέρες, τα κύτταρα ID8 εμφάνισαν σημαντικά αυξημένη έκφραση του MDR1a (118- φορές), MDR1b (75 φορές), και BCRP (17 φορές) (σχήμα 3Α και 3Β) .

Ολικό RNA συλλέχθηκε από κύτταρα ID8 σε κανονική καλλιέργεια, καθώς και από κύτταρα ID8 προεπεξεργασία με ασκίτη για 7 ημέρες. Τα επίπεδα έκφρασης των υποδεικνυόμενων γονιδίων (σε σχέση με βήτα ακτίνης) προσδιορίσθηκαν με πραγματικού χρόνου PCR (Α). Πτυχές αυξήσεις στην γονιδιακή έκφραση (ασκίτης κατεργασμένων κυττάρων ID8 πάνω φυσιολογικά κύτταρα ID8) δείχνονται στο B. Τρεις ανεξάρτητα πειράματα και μπαρ σφάλματος αντιπροσωπεύει SD. * Υποδηλώνει p & lt? 0,05 και *** ρ & lt?. 0.001, έλεγχος τ

Η

Αναστολείς των μεταφορέων αντίστασης που σχετίζονται με πολλαπλά φάρμακα μειώνουν την αποτελεσματικότητα εκροής σε ασκίτη που σχετίζεται με τον καρκίνο των ωοθηκών κύτταρα

Μετά αποδεικνύοντας ρυθμίζεται αυξητικά MDR σχετίζονται μεταφορείς ABC σε ασκίτη ωοθηκών καρκινικά κύτταρα θεραπευθεί, εμείς δίπλα προσπάθησαν να προσδιορίσουν εάν ειδικοί αναστολείς αυτών των μεταφορέων αποτροπή εκροής σε αυτά τα κύτταρα. Μελετήσαμε τρία αναστολείς μεταφορέα MDR: βεραπαμίλη (αναστολέας MDR1), ΜΚ-571 (/αναστολέα MRP1 2), και Νοβοβιοκίνη (αναστολέας BCRP). Πρώτον, ο αναστολέας αξιολογήθηκε αποτελέσματα επί της λειτουργίας εκροής σε κύτταρα ID8 καλλιεργήθηκαν σε κανονικό μέσο. Οι αναστολείς προστέθηκαν σε κύτταρα για 10 λεπτά πριν από την προσθήκη εκροής ID πράσινη χρωστική. Όπως φαίνεται στο Σχ 4Α και 4Β, μόνο η MRP1 αναστολέα αυξημένη ένταση φθορισμού των ID εκροής θερμοκηπίου επισημασμένα κύτταρα ID8. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι χωρίς θεραπεία ID8 καρκίνο των ωοθηκών κύτταρα υποστηρίζουν MRP1 εξαρτώμενη εκροή, αλλά όχι MDR1 ή BCRP εξαρτώμενη εκροή. Στη συνέχεια μελετήσαμε επιδράσεις αυτών των αναστολέων στη λειτουργία εκροής σε αμφότερα τα κατεργασμένα κύτταρα ασκίτη ID8 και σε κύτταρα ID8 απομονωθούν άμεσα από ασκίτη (

in vivo

κύτταρα). MDR1 αναστολέας δεν αύξησε φθορισμό σε κύτταρα ID8 προ-επωάστηκαν με ασκίτη για 7 ημέρες

in vitro

. Ωστόσο, MDR1 αναστολέας έκανε αύξηση του φθορισμού στα κύτταρα που απομονώνονται από ID8 ασκίτη

in vivo

(Σχήμα 4Α και 4Β). Η προσθήκη είτε αναστολέα MRP1 ή αναστολέα BCRP αυξήθηκε σημαντικά φθορισμού (MAF) και στα δύο κύτταρα ID8 ασκίτη επεξεργασμένα και σε κύτταρα ασκίτη (

in vivo

) (Εικόνα 4Β). Έχουμε, επίσης, έδειξε ότι οι συνδυασμοί αυτών των αναστολέων δεν αυξηθεί η ένταση φθορισμού της εκροής ID κυττάρων πράσινο-επισημασμένο ID8 ή ασκίτη-επεξεργασμένα κύτταρα κατά τη διάρκεια της έντασης φθορισμού που λαμβάνονται με ενιαίο αναστολείς, γεγονός που υποδηλώνει ότι η δραστηριότητα αυτών των μεμονωμένων μεταφορέων δεν αντισταθμίστηκε από άλλους μεταφορείς ( τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ασκίτη προωθεί MRP1 και BCRP εξαρτώμενη εκροή σε ID8 καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών.

(Α). ID8 κύτταρα από κανονικό καλλιέργεια, καλλιέργεια ασκίτη προ-επεξεργασία, ή ασκίτης (

in vivo

κύτταρα) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς αναστολείς που στοχεύουν MDR1, MRP1 ή BCRP για 10 λεπτά και στη συνέχεια επωάστηκαν με εκροής ID πράσινη χρωστική για 30 min. ένταση φθορισμού της κάθε κατάσταση μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής. Η πολυφαρμακευτική δραστηριότητα συντελεστή αντίστασης (MAF) υπολογίστηκε για κάθε δείγμα, και η μέση MAF (+/- SD από δείγματα εις τριπλούν) παρουσιάζεται για κάθε κατάσταση σε τιμές Β MAF πέσει κάτω φόντο επισημαίνονται με γκρι περίγραμμα. Στατιστικά σημαντικές αυξήσεις σε MAF μεταξύ ασκίτη επεξεργασμένου και

in vivo

ασκίτη κύτταρα (σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα) υποδεικνύονται. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα. * Υποδηλώνει ρ & lt?. 0,05, t-test του Student

Η

Ανθρώπινο ωοθηκών καρκινικά κύτταρα που λαμβάνονται από ασκίτη, αλλά δεν προέρχονται από όγκους καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών, εμφανίζουν λειτουργία εκροής

Στη συνέχεια, επιδιώξαμε να επεκτείνει τα ευρήματά μας στα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Μελετήσαμε αθανατοποιημένα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών που προέρχεται από ασκίτη ασθενή (ΗΑ1, ΗΑ2 κύτταρα) ή από την πρωτογενή θέση όγκου (TD κύτταρα). Χρησιμοποιώντας την εκροή ID πράσινο δοκιμασία, δείξαμε ότι ΗΑ1 και ΗΑ2 κύτταρα παρουσίασαν υψηλότερες εκροής από τα κύτταρα TD (Σχήμα 5Α και 5Β), υποστηρίζοντας τη διαπίστωσή μας ότι ο ασκίτης οδηγεί την λειτουργία εκροής των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών. Κηλίδωση Western Διεξήχθη να διερευνηθεί εκροή έκφραση πρωτεΐνης σε αυτά που προέρχονται από όγκους και ασκίτη προερχόμενα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Όπως φαίνεται στο Σχ 5C, η έκφραση του MDR1, MRP1 και BCRP ήταν σημαντικά υψηλότερη σε καρκινικές κυτταρικές σειρές ασκίτη προερχόμενο (ΗΑ1, ΗΑ2) από ό, τι σε ένα πρωτογενές κύτταρο γραμμή που προέρχεται από όγκο (TD). Για να προσδιοριστεί ποιες πρωτεΐνες εκροής ήταν λειτουργικά σε αυτά τα κύτταρα, ερευνήσαμε την επόμενη επιδράσεις των αναστολέων MDR σε εκροής σε όγκο που προέρχεται και ασκίτη προερχόμενα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. MRP1 και αναστολείς BCRP, αλλά όχι ένας αναστολέας MDR1, κατέστειλε εκροή βαφής σε ΗΑ1 και ΗΑ2 κύτταρα σημαντικά. Σε αντίθεση, οι αναστολείς της MDR1, MRP1 και BCRP δεν είχε επίδραση κατακράτηση χρώματος σε κύτταρα TD (Σχ 5D και 5Ε). Δείξαμε ότι οι συνδυασμοί αυτών των αναστολέων δεν αύξησε την ένταση φθορισμού των κυττάρων TD (τα δεδομένα δεν φαίνονται), γεγονός που υποδηλώνει ότι η δραστηριότητα των μεμονωμένων μεταφορέων δεν αντισταθμίστηκε από άλλους μεταφορείς. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ασκίτη προερχόμενα ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών, αλλά όχι πρωτογενή κύτταρα που προέρχονται από όγκους, υποστηρίζουν ABC μεταφορέα εξαρτώμενη εκροή.

Α και Β αθανατοποιημένα ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου των ωοθηκών που προέρχεται από ασκίτη ασθενή (ΗΑ1 και ΗΑ2 κύτταρα ) ή πρωτογενή θέση όγκου (κύτταρα TD) επωάστηκαν με εκροής ID πράσινο χρώμα για 40 λεπτά. Η ένταση φθορισμού για κάθε κατάσταση μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής. Ιστόγραμμα κάθε κυτταρική σειρά καρκίνου που προέρχεται από ασκίτη ασθενή (ΗΑ1 ή ΗΑ2? Μπλε) επικαλύπτονται με ιστόγραμμα της κύριας γραμμής που προέρχεται από όγκο (TD? Κόκκινο)). B. μέση ένταση φθορισμού (MFI) υπολογίστηκε για κάθε γραμμή από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Πλάσια μείωση σε γεωμετρική μέση ένταση φθορισμού (GMFI) (σε σχέση με γραμμή που προέρχεται από όγκο) υπολογίστηκε για κάθε κυτταρική σειρά σε τρία ανεξάρτητα πειράματα. Τα αποτελέσματα αναφέρονται ως μέσος όρος φορές μείωση από τρεις ανεξάρτητες δοκιμές αγωγή (+/- SD). Γ Σύνολο κυτταρικά εκχυλίσματα ελήφθησαν από πρωτογενή όγκο προερχόμενο ανθρώπινη κυτταρική σειρά καρκίνου των ωοθηκών (TD) και από καθένα από τα δύο ασκίτη που προέρχεται ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών γραμμών ωοθηκών (ΗΑ1, ΗΑ2). Ισοδύναμες ποσότητες εκχυλίζεται πρωτεΐνες υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE και immunblotted με αντισώματα ειδικά για MDR1, MRP1, BCRP, ή βήτα ακτίνης, που ακολουθείται από τα κατάλληλα είδη IRdye-συζευγμένο δευτερεύον αντίσωμα. Οι ζώνες πρωτεΐνης ανιχνεύθηκαν με υπέρυθρη απεικόνιση Οδύσσεια. ζώνες πρωτεΐνης ποσοτικά με τη χρήση του λογισμικού J εικόνας (ΝΙΗ). Οι αναλογίες των ενδεικνυόμενη πρωτεΐνης σε βήτα ακτίνης δείχνεται. Δ και Ε που προέρχονται από ασκίτη και προέρχονται από όγκους ανθρώπινες κυτταρικές σειρές επωάστηκαν με ή χωρίς αναστολείς που στοχεύουν MDR1, MRP ή BCRP για 10 λεπτά και στη συνέχεια επωάστηκαν με εκροής ID Πράσινη χρωστική για 30 λεπτά. Τα δείγματα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Ιστογράμματα (+ αναστολέας vs – αναστολέα) επικαλύφθηκαν για κάθε γραμμή (D). Ε πολυφαρμακευτική δραστηριότητα συντελεστή αντίστασης (MAF) υπολογίστηκε για κάθε δείγμα, και η μέση MAF (+/- SD) από τρία ανεξάρτητα πειράματα για κάθε κατάσταση σε τιμές Ε MAF πέσει κάτω φόντο επισημαίνονται με γκρι χρώμα. Στατιστικά σημαντικές αυξήσεις σε MAF μεταξύ ασκίτη επεξεργασμένου και

in vivo

ασκίτη κύτταρα (σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα) υποδεικνύονται. * Υποδηλώνει p & lt? 0,05. ** Υποδεικνύει ρ & lt?. .01, T-test του Student

Η

Συζήτηση

Ο καρκίνος των ωοθηκών κύτταρα αποκτούν ανθεκτικότητα στη χημειοθεραπεία μετά από μικρής διάρκειας [7] ή μακροπρόθεσμα [12, 14] αγωγή με χημειοθεραπευτικά φάρμακα. Και οι δύο κακοήθη ασκίτη [15] και χημειο-αντίσταση [19] έχουν συσχετιστεί με μειωμένη επιβίωση των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών. Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε ότι ποντικού ωοθηκών καρκινικά κύτταρα (ID8) παρουσιάζουν αυξημένη ταξάνη χημειο-αντίσταση όταν εκτίθενται σε ασκίτη

in vitro

ή

in vivo

(σε σύγκριση με κύτταρα ID8 καλλιεργήθηκαν σε κανονικό μέσο ). Για τις γνώσεις μας, η δουλειά μας είναι η πρώτη που αποδεικνύει άμεσα επαγώγιμης χημειο-αντίσταση από το υπερκείμενο ασκίτη.

Μέχρι σήμερα, καμία μελέτη δεν έχει ερευνήσει τη σύνδεση μεταξύ της παρουσίας ασκίτη [15] και MDR μεταφορών [20-22 ], αν και το καθένα είναι ένας ανεξάρτητος παράγοντας κινδύνου για την πρόβλεψη των κακή πρόγνωση για τους ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών. Μελέτες έχουν χαρακτηρίσει το επίπεδο έκφρασης του μεταφορέα MDR σε πρωτογενή ή υποτροπιάζουσα ιστούς των ωοθηκών [10] ή MDR1 πολυμορφισμό και την πρόοδο του καρκίνου των ωοθηκών ή την επιβίωση [23]. Η μελέτη μας είναι νέα σε υποδηλώνοντας ότι ασκίτη είναι ικανό να οδηγεί την έκφραση και τη λειτουργία των μεταφορέων MDR.