Αφηρημένο

καρκίνο του πνεύμονα Μικρά-κυττάρων (SCLC) είναι μία από τις πιο επιθετικές μορφές καρκίνου, αλλά οι μοριακοί μηχανισμοί που διέπουν καταστροφικές κλινική έκβαση του παραμένουν ασαφείς. Σε αυτή τη μελέτη, ερευνήσαμε αν microRNA (miRNA) προφίλ έκφρασης μπορεί να προβλέψει τις κλινικές εκβάσεις των SCLC ασθενών. Συνολικά 82 ασθενείς με περιορισμένη SCLC, οι οποίοι υποβλήθηκαν σε θεραπεία με χειρουργική εκτομή και επικουρική χημειοθεραπεία, είχαν εγγραφεί στη μελέτη αυτή. Κατ ‘αρχάς, εμείς που ρωτήθηκαν την έκφραση των 924 miRNAs από 42 SCLC ασθενείς να ανακαλύψουν την επιβίωση-σχετικών miRNAs και την ανάπτυξη προγνωστικών μοντέλων, τα οποία στη συνέχεια επικυρώνονται σε μια ανεξάρτητη ομάδα των 40 περιπτώσεων χρησιμοποιώντας ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου. Βρήκαμε ότι το miR-150 /miR-886-3p υπογραφή συσχετίστηκε σημαντικά με τη συνολική επιβίωση (OS) του SCLC ασθενών (p = 0.02) στο σύνολο εκπαίδευσης, και τα δύο επίπεδα έκφρασης των miRNAs ήταν πολύ χαμηλότερα στα δείγματα SCLC από φυσιολογικά δείγματα πνεύμονα. Η υπογραφή miRNA αποδείχθηκε επίσης να είναι ένας σημαντικός παράγοντας πρόβλεψης της επιβίωσης στο σύνολο επικύρωσης. Οι ασθενείς με υψηλού κινδύνου miRNA υπογραφές είχαν κακή συνολική επιβίωση (p = 0,005) και η επιβίωση χωρίς εξέλιξη (p = 0,017) σε σύγκριση με εκείνους με τα αποτελέσματα χαμηλού κινδύνου. Τα ευρήματα αυτά διατηρούνται στατιστική σημαντικότητα μετά την προσαρμογή για την ηλικία, το φύλο και την κατάσταση καπνίσματος (HR: 0,26, 95%: CI 0,10 – 0,69, p = 0,007), η οποία πρότεινε μπορεί να είναι ένας ανεξάρτητος προγνωστικός δείκτης επιβίωσης. Εν ολίγοις, έχουμε αναπτύξει ένα προγνωστικό miR-150 /miR-886-3p υπογραφή και επικυρωμένη έκφρασης σε ένα ανεξάρτητο σύνολο δεδομένων της χειρουργήσιμη SCLC. Αυτά τα προκαταρκτικά αποτελέσματα έδειξαν ότι miRNAs μπορούν να χρησιμεύσουν ως πολλά υποσχόμενη μοριακών δεικτών πρόγνωσης και νέων θεραπευτικών στόχων για SCLC

Παράθεση:. Bi Ν, Cao J, Τραγούδι Υ, Shen J, Liu W, Fan J, et al. (2014) Μια microRNA Υπογραφή Προβλέπει επιβίωσης σε πρώιμα στάδια Μικρά-κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα αντιμετωπίζεται με χειρουργική επέμβαση και επικουρική χημειοθεραπεία. PLoS ONE 9 (3): e91388. doi: 10.1371 /journal.pone.0091388

Επιμέλεια: Bernard Μαρί, IPMC, CNRS UMR 7275 UNS, Γαλλία

Ελήφθη: 26 του Νοέμβρη, 2013? Αποδεκτές: 10η Φεβρουαρίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 17 Μάρτη του 2014

Copyright: © 2014 Bi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το 973 Εθνικό Key Θεμελιωδών Ερευνητικό Πρόγραμμα της Κίνας (2009CB521801, 2010CB912800) και το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81021061, 81071830). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα παραμένει η κύρια αιτία θανάτου στον κόσμο, και μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (SCLC) αντιπροσωπεύει το 15-25% των περιπτώσεων [1]. Κλινικά, SCLC διακρίνεται από μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) με ταχεία ανάπτυξη του όγκου και την πρώιμη έναρξη των μεταστάσεων. Σε αντίθεση με τις περισσότερες δυτικές χώρες, SCLC ποσοστά εξακολουθούν να αυξάνονται στην Κίνα, όπου ο επιπολασμός του καπνίσματος εξακολουθεί να αυξάνεται. Παρά το γεγονός ότι SCLC θεωρείται υψηλής απόκρισης σε χημειοθεραπεία και την ακτινοθεραπεία, η υποτροπή συμβαίνει συχνά μέσα σε δύο χρόνια και η συνολική επιβίωση (OS) πέραν των πέντε ετών είναι περίπου 3% -8%. Για τη βελτίωση των κλινικών αποτελεσμάτων, έχουν νέα φάρμακα έχουν αναπτυχθεί, αλλά αποθαρρύνει ότι η επιβίωση για τις δύο εντοπισμένες και προηγμένες SCLC έχει σταθεροποιηθεί τα τελευταία 20 χρόνια.

SCLC πιστεύεται ότι φέρουν μια ποικιλία μοριακών διαταραχών που είναι αρκετά διαφορετική από NSCLC. Για παράδειγμα, ΤΡ53 μεταλλάξεων, Rb αδρανοποίηση και ενίσχυση του c-Myc είναι κοινά σε SCLC σύγκριση με NSCLC [2], [3]. Αντίθετα, οι υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) μεταλλάξεις, μεταλλάξεις K-ras και Ρ16 αδρανοποίηση βρίσκονται συχνά σε NSCLC, αλλά όχι σε SCLC [2] – [4]. Ωστόσο, οι υποκείμενοι μηχανισμοί με τους οποίους SCLC εξελίσσεται ταχύτατα μένει να καθοριστεί, και η αναγνώριση αυτών των μηχανισμών θα μπορούσε να προωθήσει την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών παραγόντων και τη βελτίωση της διαχείρισης της αυτό το δύσκολο ασθένεια.

Τα microRNAs (miRNAs) είναι ένα κατηγορία μη κωδικεύουσας RNAs που έχουν μήκος περίπου 22 νουκλεοτίδια και είναι μετα-μεταγραφικό ρυθμιστές της γονιδιακής έκφρασης. Λόγω του θεμελιώδους ρόλου τους στην ανάπτυξη και διαφοροποίηση, συμμετοχή σε βιολογικούς μηχανισμούς που διέπουν την ογκογένεση και την εξέλιξη, καθώς και χαμηλή πολυπλοκότητα, τη σταθερότητα και την εύκολη ανίχνευση, miRNAs αντιπροσωπεύουν μια πολλά υποσχόμενη κατηγορία των ιστών και του αίματος που βασίζονται σε βιοδείκτες του καρκίνου.

Ένας αριθμός ερευνητών έχει καταδείξει ότι η έκφραση παρεκκλίνουσα miRNA είναι στενά συνδεδεμένη με την ανάπτυξη και την πρόοδο πολλών μορφών καρκίνου, συμπεριφέρονται ως καταστολείς όγκων ή ογκογονίδια [5] – [10]. Πρόσφατα δεδομένα από πολλές μελέτες υποστηρίζουν σθεναρά τις δυνατότητες των microRNAs ως βιοδείκτες για NSCLC [11] – [17]. Επιπλέον, αλλαγμένη έκφραση microRNA συνδέεται επίσης με την εξέλιξη του όγκου και της επιβίωσης σε ασθενείς με καρκίνο NSCLC. Ένα παγκόσμιο πρότυπο έκφρασης των miRNAs αξιολογήθηκε με τη χρήση μικροσυστοιχιών ανάλυση με βάση έχει καθιερωθεί, και έχουν πολλά «υπογραφές miRNA» NSCLC έχουν προταθεί για βελτιωμένη μοριακή σταδιοποίηση και την ταξινόμηση των NSCLC [18] – [21]. Ωστόσο, η κλινική σημασία των miRNAs σε SCLC δεν έχει εδραιωθεί.

Για να διερευνήσουν το ρόλο της ανώμαλης προφίλ έκφρασης των miRNAs σε SCLC, εμείς που ρωτήθηκαν πρώτα 924 γνωστά miRNAs σε δείγματα φορμόλη σταθερό εμπεδωθεί με παραφίνη (FFPE) από 42 ασθενείς και προσδιόρισε μια υπογραφή διπλής miRNA να προβλέψουμε το κλινικό αποτέλεσμα του SCLC ασθενών πρώιμο στάδιο που έλαβαν θεραπεία με χειρουργική εκτομή ακολουθούμενη από επικουρική χημειοθεραπεία. Αυτή η ένωση περαιτέρω επικυρωθεί με την ανάλυση των 40 επιπλέον δείγματα ασθενών ποσοτικής αλυσιδωτής αντίδρασης αντίστροφης μεταγραφάσης πολυμεράσης (qRT-PCR), και η προγνωστική αξία της υπογραφής φαίνεται να είναι ανεξάρτητη από την ηλικία, το φύλο και την κατάσταση καπνίσματος σε πολυπαραγοντική ανάλυση παλινδρόμησης κατά Cox.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Αυτή η αναδρομική μελέτη εγκρίθηκε από το Διοικητικό συμβούλιο Institutional Review του Αντικαρκινικού Νοσοκομείου και του Ινστιτούτου της κινεζικής Ακαδημίας Ιατρικών Επιστημών και του Πεκίνου Ένωσης Ιατρικό Κολέγιο. Όλα τα αρχεία των ασθενών που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη έγιναν ανώνυμα και de-εντοπίστηκαν πριν από την ανάλυση.

Ασθενείς και δείγματα

αναδρομικά μελετηθεί φορμόλη σταθερό εμπεδωθεί με παραφίνη (FFPE) δείγματα από ασθενείς οι οποίοι διαγνώστηκαν με χειρουργήσιμο περιορισμένη SCLC και υποβλήθηκε σε χειρουργική επέμβαση ακολουθούμενη από επικουρική χημειοθεραπεία (σχήματα με βάση την πλατίνα, όπως η σισπλατίνη /ετοποσίδη και η καρβοπλατίνη /ετοποσίδη) στο Νοσοκομείο του Καρκίνου και του Ινστιτούτου της κινεζικής Ακαδημίας Ιατρικών Επιστημών (Πεκίνο, Κίνα) μεταξύ του Ιανουαρίου 2000 και του Δεκεμβρίου 2005. Όλοι οι ασθενείς ήταν σε μια κατάσταση απόδοσης κατά ECOG 0-1, και οι ασθενείς με καρκίνωμα /μεγάλων κυττάρων μικτών μικρών κυττάρων ή σε συνδυασμό μικροκυτταρικό καρκίνωμα αποκλείστηκαν. Συνολικά, 82 SCLC δείγματα ασθενών αναλύθηκαν, μεταξύ των οποίων 42 δείγματα χρησιμοποιήθηκαν ως επιλογής που να προσδιορίσει miRNAs που σχετίζονται με την επιβίωση με χρήση μικροσυστοιχιών miRNA. Τα επιλεγμένα miRNAs στη συνέχεια επικυρώνονται τα υπόλοιπα 40 ασθενείς που χρησιμοποιούν PCR πραγματικού χρόνου. Αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η & amp? Ε) τμήματα όλων των δειγμάτων εξετάστηκαν από έναν παθολόγο για να επιβεβαιωθεί η διάγνωση. Τρεις φυσιολογικό πνευμονικό ιστό (NL) δείγματα ελήφθησαν από μακροσκοπικά αμέτοχος περιοχές 2-3 εκατοστά μακριά από καλοήθη οζίδια των ασθενών που υποβλήθηκαν σε χειρουργική εκτομή. Όλα τα NL ιστών ιστοπαθολογικά αξιολογήθηκαν και ήταν μορφολογικώς φυσιολογικά.

RNA

εκχύλιση

χαμηλού μοριακού βάρους RNA απομονώθηκε από ολικό RNA, το οποίο εκχυλίστηκε με TRIZOL, χρησιμοποιώντας ένα κατακρήμνιση διαλύματος PEG μέθοδο [22]. Εν συντομία, για να ληφθεί χαμηλού βάρους RNA μοριακού, ολικό RNA καταβυθίστηκε με ίσες ποσότητες διαλύματος PEG, και το υπερκείμενο καταβυθίστηκε με χρήση ισοπροπανόλης. Όλα τα RNA εκχυλίσματα αξιολογήθηκαν και δεν έδειξε σημάδια αποικοδόμησης RNA.

miRNA ανάλυση μικροσυστοιχιών

ανάλυση μικροσυστοιχιών εκτελέστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23]. Εν συντομία, το RNA σημάνθηκε χρησιμοποιώντας την μέθοδο επισήμανσης λιγάση Τ4 RNA. Η υβριδοποίηση εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας ένα πάνελ προσαρμοσμένη microRNA μικροσυστοιχιών (CapitalBio, Beijing, Κίνα), η οποία περιελάμβανε ανιχνευτές εις τριπλούν για 924 ώριμο ανθρώπινο και αλληλουχίες ποντικού miRNA και οκτώ βραχέα ολιγονουκλεοτίδια που κατείχε ομολογία προς οποιαδήποτε γνωστή αλληλουχία RNA ως εξωτερικών ελέγχων. Οι υβριδοποιήθηκαν συστοιχίες σαρώθηκαν με ένα LuxScan 10Κ-ένα σαρωτή λέιζερ συνεστιακή, και οι εικόνες που λαμβάνονται στη συνέχεια αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό LuxScan 3.0 (CapitalBio, Beijing, Κίνα) [6]. Για την επεξεργασία των δεδομένων, εξετάστηκε μόνο τα δεδομένα για τα ανθρώπινα miRNAs (546 924). Πρώτον, τα ακατέργαστα δεδομένα υποβλήθηκαν προ-επεξεργασία για να φιλτράρει τα miRNAs με μέγιστες εντάσεις λιγότερο από 300 για να μειωθεί μεροληψία στην βαθμίδα κανονικοποίησης. Μετά από διήθηση, 456 (83,5%) από 546 miRNAs συμπεριλήφθηκαν για περαιτέρω ανάλυση. Στη συνέχεια, οι μέσες τιμές των επαναληπτικών σημεία για κάθε miRNA έχουν αφαιρεθεί το υπόβαθρο, και τα σήματα ομαλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το μεσαίο εργαλείο κέντρο για τα γονίδια με Cluster 3,0 λογισμικού.

Οι αναλογίες κινδύνου (HR) από μονοπαραγοντική ανάλυση παλινδρόμησης Cox , μια τυποποιημένη μέθοδος στην βιοστατιστικής για την εξέταση των δεδομένων επιβίωσης που ελαχιστοποιεί την προκατάληψη, αφαιρώντας απλώς λογοκρισία ασθενείς, χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιορίσουν ποια miRNAs συσχετίστηκαν με το λειτουργικό σύστημα των ασθενών [21]. Χρησιμοποιήσαμε ένα Ρ-τιμή 0,1 ως αποκοπή για επιλογή γονιδίου. Μια βαθμολόγηση κινδύνου για την πρόγνωση επιβίωσης υπογραφή miRNA υπολογίστηκε σύμφωνα με ένα συνδυασμό του επιπέδου έκφρασης του miRNA με το συντελεστή παλινδρόμησης που προέρχεται από μονοπαραγοντική ανάλυση παλινδρόμησης Cox [21], [24], [25]. Μια σύγκριση τάξη με τη μη παραμετρική Mann-Whitney U πραγματοποιήθηκε επίσης να προσδιορίσει με διαφορετικό τρόπο εκφράζεται miRNAs μεταξύ των 42 SCLC δείγματα και τα τρία NL δείγματα.

Όλα τα ανεπεξέργαστα δεδομένα που αποτέθηκαν σε ένα συμβατό βάση δεδομένων MIAME (ArrayExpress , GEO:. GSM678225 – GSM678266)

miRNA ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR

cDNA παρασκευάστηκε από 100 ng ολικού RNA με ειδικούς εκκινητές για miR-886-3p, miR-150 ή U6 ως εσωτερικού ελέγχου. Για την ανίχνευση του ώριμου miRNAs, ποσοτική miRNA RT-PCR εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το στέλεχος-θηλειά μέθοδος qRT-PCR [26]. Τα ολιγονουκλεοτίδια που χρησιμοποιήθηκαν περιελάμβαναν την κοινή ανάστροφο εκκινητή miRNA, GTGCAGGGTCCGAGGT? miR-150, TCTCCCAACCCTTGTACCAGTG? miR-150 RT αστάρι, GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCACTGG? miR-150 πρόσθιο εκκινητή, GTCTCCCAACCCTTGTACCA? miR-886-3p, CGCGGGTGCTTACTGACCCTT? miR-886-3p RT αστάρι, GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAGGGT? miR-886-3p πρόσθιο εκκινητή, CACGCGGGTGCTTACTGAC? U6 πρόσθιο εκκινητή, CTCGCTTCGGCAGCACA? και U6 αντίστροφο εκκινητή, AACGCTTCACGAATTTGCGT. qRT-PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας έναν ΑΒΙ Prizm 7300 Sequence Detection System με LightCycler DNA κύριο SYBR Green Ι μείγμα (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το επίπεδο των miRNAs προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την 2

-ΔΔCt μέθοδο με SDS 1.3 λογισμικό, κανονικοποιημένη στο επίπεδο του εσωτερικού ελέγχου, U6 και χαράσσονται για ενδο-κυτταρική σύγκρισης.

τελικά σημεία

Το κύριο καταληκτικό σημείο της μελέτης αυτής ήταν OS. Δευτερεύοντα καταληκτικά σημεία περιελάμβαναν επιβίωση χωρίς εξέλιξη (PFS), τοπικό-περιφερειακό έλεγχο (ΚΓΠ), και μακρινή μετάσταση επιβίωση χωρίς (ΒΔΜ). OS υπολογίστηκε από την ημερομηνία της διάγνωσης μέχρι θανάτου από οποιαδήποτε αιτία ή την τελευταία γνωστή ημερομηνία κατά την οποία ο ασθενής να ήταν ζωντανός. PFS ορίστηκε ως η διάρκεια από την ημερομηνία της διάγνωσης μέχρι την ημερομηνία της αποτυχίας είτε στο θώρακα ή σε απομακρυσμένες περιοχές, την ημερομηνία θανάτου από οποιαδήποτε αιτία, ή την ημερομηνία της τελευταίας παρακολούθηση των ασθενών.

LRC υπολογίστηκε από την ημερομηνία της διάγνωσης στον πρώτο τοπικό-περιφερειακό (θώρακα) υποτροπή, και ΒΔΜ υπολογίζεται από την ημερομηνία της διάγνωσης με το πρώτο μακρινό μετάσταση, την ημερομηνία θανάτου από οποιαδήποτε αιτία, ή την ημερομηνία της τελευταίας παρακολούθησης ασθενούς -up.

Η στατιστική ανάλυση

Τα κλινικά χαρακτηριστικά των διαφορετικών ομάδων συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας t-test του ανεξάρτητου μαθητή, χ

2 δοκιμή, ή την ακριβή δοκιμασία του Fisher. Η συσχέτιση μεταξύ των δεδομένων μικροσυστοιχιών και τα δεδομένα qRT-PCR αναλύθηκε με τη συσχέτιση Spearman. OS, PFS, LRC και ΒΔΜ εκτιμήθηκαν με τη μέθοδο Kaplan-Meier και δοκιμασία log-rank. HRs υπολογίστηκαν με ανάλυση Cox παλινδρόμησης. Ένα πολυπαραγοντικό μοντέλο παλινδρόμησης κατά Cox χρησιμοποιήθηκε για να ελεγχθεί εάν η υπογραφή miRNA ήταν ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας κατά την προσαρμογή για την ηλικία, το φύλο και την κατάσταση καπνίσματος. Όλες οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το πακέτο λογισμικού SPSS (έκδοση 11.5, SPSS Inc., Chicago, IL). Ένα διπλής όψης p-τιμή μικρότερη από 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

Τα κλινικά χαρακτηριστικά των 82 SCLC ασθενείς παρατίθενται στον Πίνακα 1. Η μέση παρακολούθηση χρόνου ήταν 57,2 μήνες. Σαράντα τέσσερις ασθενείς είναι ακόμα ζωντανοί. Σαράντα δύο ασθενείς είχαν υποτροπή της νόσου, και ο διάμεσος χρόνος έως τη διάγνωση της υποτροπής ήταν 12,3 μήνες.

Η

Στο σύνολο εκπαίδευσης, εντοπίσαμε δύο miRNAs, miR-150 και miR-886-3p, ότι σχετίστηκαν με την κακή OS με χρήση του μοντέλου παλινδρόμησης αναλογικού κινδύνου Cox. Και οι δύο από αυτούς ήταν προστασίας (Πίνακας 2). Η σύγκριση μεταξύ των Κάτω Χωρών και της SCLC ιστούς επαλήθευσε επίσης ότι το miR-150 και miR-886-3p επίπεδα έκφρασης σε SCLC όγκοι ήταν πολύ χαμηλότερη από ό, τι στις Κάτω Χώρες δείγματα (Σχήμα 1).

Η

Στη συνέχεια, προέρχονται μια φόρμουλα για τον υπολογισμό της βαθμολογίας του κινδύνου για κάθε ασθενή από το επίπεδο έκφρασης των δύο miRNAs που σχετίζονται με το OS, σταθμίζονται με συντελεστές παλινδρόμησης Cox: βαθμολογία κινδύνου = (0.545 επιπέδου × έκφραση του miR-150) + (0.617 επιπέδου × έκφραση του miR -886-3p). Οι ασθενείς στο σύνολο εκπαίδευσης χωρίστηκαν σε ομάδες υψηλού κινδύνου ή χαμηλού κινδύνου, χρησιμοποιώντας τη μέση βαθμολογία κινδύνου υπογραφή miRNA ως αποκοπής. Οι ασθενείς με βαθμολογία υψηλότερο κίνδυνο αναμένεται να έχουν κακή OS. Σε σύγκριση με τους ασθενείς με χαμηλού κινδύνου miRNA υπογραφή, ασθενείς με υπογραφή υψηλού κινδύνου είχαν σημαντικά μικρότερη διάμεση OS (12,6 μήνες σε σύγκριση με το να μην επιτευχθεί, p = 0,02) (Εικ. 2Α). Ομοίως, οι ασθενείς στην ομάδα υψηλού κινδύνου είχε μικρότερη PFS και ώρες ΒΔΜ από εκείνες στην ομάδα χαμηλού κινδύνου (τα δύο p-τιμές ήταν 0,045) (Εικ. 2Β-C). Ωστόσο, ΚΓΠ ήταν παρόμοια μεταξύ των δύο ομάδων (p = 0,36) (Σχ. 2D).

Η

Για να επικυρώσετε τα δεδομένα έκφρασης υβριδοποίησης μικροσυστοιχιών, τα επίπεδα έκφρασης των δύο miRNAs που σχετίζονται με το OS ήταν ποσοτικά με τη χρήση qRT-PCR σε 10 SCLC ιστούς επιλέγονται τυχαία από το σύνολο εκπαίδευσης. Σημαντική συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ log 2-μετασχηματιστεί εντάσεις σήματος array και τις αξίες qRT-PCR Ct τόσο για miR-150 (r = 0,94, p & lt? 0.001) και miR-886-3p (r = 0,75, p = 0,01) (Εικ. 3).

(γ) τη σχέση μεταξύ της έκφρασης των U6 RNA από qRT-PCR και log 2-μετασχηματιστεί παγκόσμια μέση έκφραση πίνακα. (D) Έκφραση U6 RNA σε ανθρώπινο φυσιολογικό πνεύμονα (NL, η = 3) και καρκίνου του πνεύμονα μικρών κυττάρων (SCLC, n = 42), τα δείγματα με τη μέθοδο των μικροσυστοιχιών. Μουστάκια απεικονίζουν τις 10 και 90 εκατοστημόρια. p αξία υπολογίζεται από το Mann-Whitney U.

Η

Στη συνέχεια, χρησιμοποιήσαμε τον ίδιο τύπο βαθμολόγηση κινδύνου που λαμβάνονται από την εκπαίδευση που για τον υπολογισμό της βαθμολογίας του κινδύνου υπογραφή miRNA για 40 ασθενείς στην ομάδα ελέγχου, για τις οποίες τα επίπεδα miRNA σε δείγματα FFPE προσδιορίστηκαν με qRT-PCR. Και πάλι, η υψηλού κινδύνου υπογραφή miRNA σκοράρει ασθενείς παρουσίασαν μικρότερη επιβίωση από ό, τι στην ομάδα χαμηλού κινδύνου (διάμεση OS 18,9 μήνες σε σύγκριση με το να μην επιτευχθεί, p = 0,005) (Εικ. 4Α). PFS, ΒΔΜ, και LRC ήταν επίσης σημαντικά μικρότερη σε υψηλό από ό, τι η στην ομάδα χαμηλού κινδύνου (PFS p = 0,017, ΒΔΜ p = 0,019 και LRC p = 0,031, σχ. 4Β, 4Γ και 4Δ). Η πολυπαραγοντική ανάλυση Cox-παλινδρόμησης έγινε για να αξιολογήσει περαιτέρω κατά πόσον η διπλή-miRNA υπογραφή είναι ένας ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας που σχετίζεται με την επιβίωση σε αυτό το σύνολο δοκιμών. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η υπογραφή miRNA παρέμενε ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας για OS (HR: 0,26, 95%: CI 0,10 – 0,69, p = 0,007), PFS (HR: 0,36, 95%: CI 0,15 – 0,86, p = 0,02) , ΒΔΜ (HR: 0,34, 95%: CI 0,13 – 0,86, p = 0,02), και LRC (HR: 0,26, 95%: CI 0,07 – 0,99, p = 0,05) μετά από προσαρμογή για την ηλικία, το φύλο και την κατάσταση καπνίσματος (Πίνακας 3).

η

Συζήτηση

σε αυτή τη μελέτη, θα ξεκινήσει μια άσκηση φάση ανακάλυψη για τον εντοπισμό βασικών miRNAs με τοπογραφικά την έκφραση της 924 γνωστά miRNAs σε FFPE δείγματα από 42 SCLC περιπτώσεις. Ανακαλύψαμε ότι μια διπλή-miRNA υπογραφή, miR-150 και miR-886-3p, συνδέθηκε με το OS και PFS. Τα ευρήματα αυτά επιβεβαιώθηκαν στη συνέχεια σε μια ανεξάρτητη ομάδα των 40 SCLC ασθενείς που χρησιμοποιούν τη μέθοδο qRT-PCR, και η αντιστοιχία μεταξύ αυτών των δύο πλατφόρμες ήταν υψηλό.

Εφαρμόζοντας μια βέλτιστη μέθοδος κανονικοποίησης είναι ιδιαίτερα σημαντικό για miRNA προφίλ για την ελαχιστοποίηση των τεχνικών παραλλαγές και να πάρει ουσιαστικές βιολογικές αλλαγές. Ωστόσο, δεν υπάρχει καμία μέθοδος κανονικοποίησης συναίνεση και συστάσεις προς το παρόν είτε για μικροσυστοιχιών ή qRT-PCR μεθόδους από την άποψη των miRNA προφίλ. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε μια παγκόσμια μέθοδος κανονικοποίησης στο σετ εκπαίδευσης, η οποία θεωρείται πιο κατάλληλο για μεγάλης κλίμακας miRNA-προφίλ σύνολα δεδομένων [27]. Στο σύνολο δοκιμών, χρησιμοποιήσαμε U6 RNA για την ομαλοποίηση των δεδομένων, διότι είναι η πιο συχνά αναφερόμενη γονίδιο αναφοράς για μελέτες έκφρασης miRNA στον καρκίνο του πνεύμονα στη βιβλιογραφία [21], [28] – [30]. Εμείς συσχετίζονται επίσης τις εκφράσεις των δύο miRNAs σε qRT-PCR με εκφράσεις πίνακα, και επιβεβαίωσε ότι διαφορετικές μέθοδοι miRNA-προφίλ δεν επηρέασε τα αποτελέσματα του miR-150 και miR-886-3p εκφράσεις (Σχήμα 3Α-Β). Επιπλέον, ο συσχετισμός της έκφρασης U6 επί qRT-PCR με παγκόσμια μέση έκφραση συστοιχία παρατηρήθηκε (r = 0,71, ρ & lt? 0,001? Εικ. 3C). U6 RNA έδειξε απόλυτη φορές αλλάζει κάτω από 1,2-φορές και δεν είχε σημαντικές διαφορές μεταξύ των δειγμάτων NL και μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (ρ = 0.96, Εικ. 3D).

Σήμερα, υπάρχουν μόνο δύο δημοσιευμένες μελέτες που εξετάζουν την έκφραση miRNA στην ανθρώπινα SCLC δειγμάτων [31], [32]. Lee et al. διερευνήθηκε η έκφραση ενός πάνελ επτά miRNAs (miR-21, miR-29b, miR-34a /b /c, miR-155, και αφήστε-7α) σε 31 SCLC όγκους [31]. Ανέφεραν ότι η έκφραση αυτών των επτά miRNAs ήταν άσχετη με τα κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών SCLC και δεν ήταν προγνωστικό σε όρους OS ή PFS, ούτε ήταν το επίπεδο έκφρασης προγνωστική της ανταπόκρισης στη θεραπεία. Αυτά τα δεδομένα ήταν συνεπή με τα ευρήματα μας. Ranade και οι συνεργάτες του αξιολόγησαν την έκφραση των 880 επικυρωθεί ανθρώπινη ώριμη miRNAs με επιπλέον 473 επικυρωμένη ανθρώπινη προ-miRNAs σε 34, δείγματα SCLC όγκου φορμόλη σταθερό εμπεδωθεί με παραφίνη και διαπίστωσε ότι miR-92a-2 * συσχετίστηκε ανεξάρτητα με την επιβίωση. Αν και αυτή η μελέτη έδειξε για πρώτη φορά ότι miRNAs μπορεί να είναι προγνωστικός για SCLC, περιελάμβανε περιπτώσεις και με τα δύο περιορισμένο στάδιο (12,1%) και εκτεταμένη στάδιο (87,9%) του καρκίνου κατά τη διάγνωση, και ασθενείς με εκτεταμένη στάδιο της νόσου έχουν καρκίνους που θεωρούνται πιο ετερογενής. Επιπλέον, σε αυτή τη μελέτη, οι ιστοί του όγκου συλλέχθηκαν όχι μόνο από πρωτογενείς όγκους, αλλά και από λεμφαδένες και απομακρυσμένες μεταστάσεις, οι οποίες θα συγχύσει τα αποτελέσματα της αξιολόγησης επειδή η έκφραση miRNA θεωρείται ότι είναι ειδικό ιστό. Επιπλέον, μόνο οι μισοί από τους ασθενείς στην μελέτη αυτή έλαβαν ακτινοβολία κατά τη διάρκεια της θεραπείας πρώτης γραμμής. Αυτό είναι σημαντικό επειδή η ακτινοβολία μπορεί να επηρεάσει σημαντικά την επιβίωση τόσο περιορισμένο στάδιο [33] και εκτεταμένη σταδίου SCLC [34]. Μέχρι σήμερα, η μελέτη μας είναι η πρώτη που δείχνει ότι σε ασθενείς με SCLC πρώιμο στάδιο αντιμετωπίζεται με χειρουργική επέμβαση και επικουρική χημειοθεραπεία, ένα miR-150 /miR-886-3p υπογραφή προβλέπει OS και PFS τόσο την κατάρτιση και τη δοκιμή σύνολα. Αυτή η συσχέτιση ήταν ανεξάρτητη από την ηλικία, το φύλο και την κατάσταση καπνίσματος. Τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι η miR-150 /miR-886-3p υπογραφή θα μπορούσε να είναι ένας καλός υποψήφιος ως μοριακό προγνωστικό δείκτη και, ενδεχομένως, θα βοηθήσει τους γιατρούς να προσδιορίσουν τους ασθενείς υψηλού κινδύνου που μπορούν να επωφεληθούν από την πιο εκτεταμένη συμπληρωματική θεραπεία.

Βρήκαμε επίσης ότι τόσο το miR-150 και miR-886-3p αρνητικά που συνδέονται με το OS. Συγκρίνοντας τα επίπεδα των miRNAs μεταξύ NL και SCLC ιστούς επαλήθευσε επίσης ότι το miR-150 και miR-886-3p επίπεδα έκφρασης σε μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα ήταν πολύ χαμηλότερες από ό, τι στο NL δείγματα. Λόγω του μικρού μεγέθους του δείγματος NL, ήμασταν σε θέση να προσδιορίσει ένα μοτίβο επίμονα μικρών σ τιμές. Ωστόσο, αυτά τα δεδομένα με συνέπεια προτείνει ότι miR-150 και miR-886-3p θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως σημαντικό καταστολείς όγκων στην ανάπτυξη και την πρόοδο του SCLC και μπορεί να λειτουργήσει με δυναμικό αντικαρκινικές στόχους. προηγούμενη πειραματική μελέτη μας έδειξε μία νέα miR-886-3p μεσολάβηση μηχανισμός βασίζεται η παρεκκλίνουσα έκφραση του σε πόλο-όπως κινάση 1 (PLK1) και μετασχηματιστικό παράγοντα ανάπτυξης βητα 1 (TGF-β1) σε SCLC [23]. Οι 3 ‘αμετάφραστες περιοχές του PLK1 και ΤΟΡ-β1 περιέχουν εξαιρετικά διατηρημένη miR-886-3p δεσμευτική μοτίβα, και άμεσες αλληλεπιδράσεις με miR-886 ρυθμίζει προς τα κάτω την ενδογενή PLK1 και ΤΟΡ-β1 επίπεδα πρωτεΐνης. Δείξαμε επίσης ότι miR-886-3p υπερέκφραση ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και εισβολή σε SCLC κύτταρα, καθώς και την καταστολή της ανάπτυξης και της μετάστασης του SCLC ξενομοσχευμάτων σε γυμνούς ποντικούς. Τέλος, αποκάλυψε ότι ο μηχανισμός πίσω από την κάτω-ρυθμιζόμενη έκφραση του miR-886-3p σε SCLC επιτεύχθηκε με τη μεσολάβηση DNA υπερμεθυλίωση προαγωγέα της. Συνολικά, αυτά τα ευρήματα δημιουργία ενός miR-886-3p-PLK1 /TGF-β1 Nexus ως νέο ρυθμιστή και πολλά υποσχόμενο θεραπευτικό στόχο για SCLC.

Η παρατήρηση του miR-150 ως καταστολέας των όγκων στο SCLC είναι συνεπής με παρόμοιες παρατηρήσεις σε παγκρεατικού καρκίνου [35], ο καρκίνος του ήπατος [36], ορθοκολικό καρκίνο [37], NSCLC [38], κακοήθες λέμφωμα [39] και την οξεία λευχαιμία [40]. Ωστόσο, η συμμετοχή της σε μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα δεν έχει αναφερθεί, και οι ακριβείς μοριακοί μηχανισμοί πίσω από αλλοιωμένη έκφραση της είναι ασαφείς. Jiang et al. Πρόσφατα διαπιστώθηκε ότι το miR-150 ωρίμανσης καταστέλλεται από MYC σε MLL-συνδέονται λευχαιμία. Επιπλέον, miR-150 αναφέρεται ότι είναι ένα προστατευτικό miRNA που στοχεύει άμεσα c-Myb και άλλους παράγοντες [36], [40]. miR-150 αλληλεπιδρά με την 3’UTR της c-Myb mRNA, και η υπερ-έκφραση του miR-150 ρυθμίζει προς τα κάτω τα επίπεδα πρωτεΐνης c-Myb [36]. Είναι ενδιαφέρον ότι, και τα δύο μέλη της οικογένειας MYC και το γονίδιο c-Myb είναι δύο πολύ γνωστές και κυρίαρχο πρωτο-ογκογονιδίων που βρίσκονται συχνά πρόκειται να ενισχυθεί ή να υπερ-εκφράζεται σε SCLC [41]. Στο σύνολό τους, αυτά τα πρόσφατα δημοσιευμένα στοιχεία, μαζί με τη δική μας, δείχνει ότι το miR-150 έχει ένα ογκοκατασταλτικό επίδραση στην μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα, διότι χαμηλά επίπεδα miR-150 έκφρασης συσχετίστηκε με κακή επιβίωση. Ωστόσο, οι συμπληρωματικές μελέτες που απαιτούνται για τη διαλεύκανση των μοριακών μηχανισμών τόσο της αιτίας και του αποτελέσματος των αλλοιωμένη έκφραση του miR-150 στην ανάπτυξη και εξέλιξη της SCLC.

Οι περιορισμοί αυτής της μελέτης περιλαμβάνουν σχετικά μικρό μέγεθος του δείγματος της, μια αναγκαιότητα επειδή μόνο ένα μικρό αριθμό ασθενών (λιγότερο από 5%) με πρώιμη περιφερική νόσο [42] είναι υποψήφιοι για χειρουργική επέμβαση. Περισσότερα από οκτακόσια SCLC ασθενείς έλαβαν θεραπεία με χημειοθεραπεία στο νοσοκομείο μας κατά την ίδια χρονική περίοδο. Ως αποτέλεσμα, βιοδείκτη αναλύσεις από SCLC ασθενείς ανέφεραν πολύ λιγότερο συχνά σε σχέση με NSCLC ασθενείς. Επιπλέον, λόγω αυτού του γεγονότος, οι διορθώσεις πολλαπλής δοκιμής δεν εφαρμόζονται στην παρούσα μελέτη επειδή αυτές οι διορθώσεις πρόληψη των σφαλμάτων τύπου Ι με το κόστος της αύξησης των σφαλμάτων τύπου II. Παρ ‘όλα αυτά, η συσχέτιση μεταξύ της υπογραφής miRNA και τα κλινικά αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν ανεξάρτητα σε ένα δεύτερο σετ ασθενή. Οι μελέτες μεγαλύτερης κλίμακας που απαιτούνται για να επιβεβαιώσουν τα ευρήματά μας. Ένας άλλος περιορισμός είναι η αναδρομική σχεδιασμό. Ωστόσο, όλες οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν σε ένα τυφλό τρόπο. Τέλος, η πιθανή αλληλεπίδραση μεταξύ miR-150 και miR-886-3p θα πρέπει να διερευνηθεί περαιτέρω για τη διαλεύκανση του μηχανισμού πίσω από το προγνωστικό ρόλο της υπογραφής dual-miRNA.

Εν κατακλείδι, τα προκαταρκτικά αποτελέσματα μας πρότεινε ότι το miR -150 /miR-886-3p υπογραφή θα μπορούσε να προβλέψει την εξέλιξη του καρκίνου και την επιβίωση σε ασθενείς με SCLC πρώιμο στάδιο και θα μπορούσε να είναι μια πολλά υποσχόμενη προγνωστικό βιοδείκτη και των πιθανών θεραπευτικών στόχων για SCLC ασθενείς.

Ευχαριστίες

Αυτή η μελέτη έγινε δεκτή για προφορική παρουσίαση στο 15ο Παγκόσμιο Συνέδριο για τον Καρκίνο του πνεύμονα, Σίδνεϊ, Αυστραλία 31 Οκτωβρίου 27 Οκτωβρίου 2013.