Αφηρημένο

Τα ενδοθηλιακά (Ε-) και αιμοπεταλίων (Α-) σελεκτίνη προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων στο αγγειακό ενδοθήλιο είναι ένα κεντρικό βήμα σχηματισμού αιματογενής μετάσταση. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η ανεπάρκεια σελεκτίνης μειώνει σημαντικά το σχηματισμό μετάστασης

in vivo

. Έχουμε επιλέξει ένα Ε- και Ρ

S

electin ειδικές

D

NA

Μια

ptamer (SDA) μέσω SELEX (

S

ystematic

Ε

volution του

L

igands από

EX

εκθετικού εμπλουτισμού) με

K

δ αξίας περίπου 100 nm και την ικανότητα να αναστέλλουν την αλληλεπίδραση μεταξύ σελεκτίνη και συνδέτες του. Χρησιμοποιεί ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου (ΗΤ29) και λευχαιμία (EOL-1) θα μπορούσε να αποδείξει μια αντι-συγκολλητική δράση για SDA

in vitro

. Κάτω από φυσιολογικές συνθήκες διατμητικής τάσης σε μια δοκιμασία προσκόλλησης στρωτή ροή, SDA ανέστειλε δυναμική προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων με ακινητοποιημένο Ε- ή Ρ-σελεκτίνης. Η σταθερότητα του SDA για περισσότερο από δύο ώρες αφέθηκε η εφαρμογή της σε δοκιμασίες προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου σε μέσο κυτταρικής καλλιέργειας. Όταν πρόσφυση των ΗΤ29 κυττάρων σε ΤΝΡα-διεγερμένα Ε-σελεκτίνης που παρουσιάζει ανθρώπινο πνευμονικό μικροαγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα αναλύθηκε, η αναστολή μέσω SDA θα μπορούσε να αποδειχθεί επίσης. Εν κατακλείδι, SDA είναι ένας πιθανός νέος θεραπευτικός παράγοντας που ανταγωνίζεται σελεκτίνης-προσκόλληση κατά την διάρκεια σχηματισμού μετάστασης σε ανθρώπινες κακοήθειες

Παράθεση:. Faryammanesh R, Lange Τ, Magbanua Ε, Haas S, Meyer C, D Wicklein, et al. (2014) SDA, το DNA απταμερές Παρεμποδίζουν Ε- και Ρ-σελεκτίνη προσκόλληση του Καρκίνου και Λευχαιμίας, του πρώτου και καίριο βήμα στην ενδοθηλίου μετανάστευση κατά τη διάρκεια Μετάσταση Σχηματισμός. PLoS ONE 9 (4): e93173. doi: 10.1371 /journal.pone.0093173

Επιμέλεια: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 9 Γενάρη, 2014? Αποδεκτές: 3 Μάρτη του 2014? Δημοσιεύθηκε: 3 Απριλίου, 2014

Copyright: © 2014 Faryammanesh et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Forschungs- und Wissenschaftsstiftung Αμβούργο στην Forschungsverbund «κυτταρική επιφάνεια στόχευσης». Χορήγηση της FAZIT-STIFTUNG να R.F. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Το απταμερές έχει δίπλωμα ευρεσιτεχνίας που εκκρεμούν?. ονομάσει «DNA-Aptamere, πεθαίνουν Ε- und P-Selektine spezifisch binden», αριθμός 2013112212485800DE. Δεν υπάρχουν περαιτέρω διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Παρά τις προόδους στη μοριακή ιατρική, η θεραπεία της μεταστατικής νόσου παραμένει ένα άλυτο πρόβλημα , έτσι η θνησιμότητα του καρκίνου εξακολουθεί να είναι υψηλός. Το 2013, περίπου 1.600.000 περιστατικά καρκίνου και 580.000 θάνατοι από καρκίνο έχουν καταχωρηθεί και μόνο στις Ηνωμένες Πολιτείες [1]. Αυτό το υψηλό ποσοστό θνησιμότητας οφείλεται κυρίως στο γεγονός ότι ο καρκίνος κάνει μετάσταση δεν μπορεί να αντιμετωπίζεται θεραπευτικά. Έτσι, περισσότερο από το 90% των θυμάτων καρκίνο πεθαίνουν λόγω της μεταστατικής εξάπλωσης των κακοήθων [2] κύτταρα. Ως εκ τούτου, η πρόοδος στη θεραπεία του καρκίνου εξαρτάται ουσιαστικά από τη θεραπευτική χειραγώγηση της μεταστατικής διαδικασίας.

Κατά haematogeneous καρκινικά κύτταρα σχηματισμού μετάστασης πρέπει να τηρούν και μεταναστεύσουν το ενδοθήλιο στη θέση-στόχο του μέλλοντος μετάστασης. Με τον τρόπο αυτό, θα μιμούνται τη συμπεριφορά των φυσιολογικών λευκοκυττάρων καθώς χρησιμοποιούν το σελεκτίνης μεσολάβηση μεταναστευτικά μονοπάτι των λευκοκυττάρων στην φλεγμονή [3], [4]. Οι εξαρτάται από το ασβέστιο σελεκτίνες που αποτελείται από έναν τομέα λεκτίνης, η οποία είναι υπεύθυνη για την δέσμευση συνδέτη, έναν τομέα επιδερμικού αυξητικού παράγοντα που μοιάζει και ένα ευέλικτο αριθμό συναίνεσης επαναλαμβανόμενων μονάδων [5], [6]. Τα καρκινικά κύτταρα προσκολλώνται στο ενδοθήλιο από την αλληλεπίδραση με τα ενδοθηλιακά (Ε-) και αιμοπεταλίων (Ρ-) σελεκτίνες [3], [4], μετά μετανάστευση εντός του υποκείμενου ιστού και επακόλουθο πολλαπλασιασμό (Σχήμα 1). Σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος παγκρεατικού αδενοκαρκινώματος ανθρώπινης, η απουσία Ε- και Ρ-σελεκτινών οδήγησε σε μείωση κατά 85% της περιτοναϊκής καρκινωμάτωσης [7]. Μια παρόμοια μείωση της μετάστασης παρατηρήθηκε σε μια ηωσινοφιλική και χρόνιας μυελογενούς μοντέλο ξενομοσχεύματος [8] και ένα ορθοκολικό καρκίνωμα μοντέλο απουσία και των δύο σελεκτινών [4]. Έτσι, ο αποκλεισμός του μηχανισμού προσκόλλησης σελεκτίνης μεσολάβηση σε αιματογενή καθώς και σε ενδοπεριτοναϊκή μετάσταση είναι κλινικής σημασίας και μπορεί να είναι ένας πιθανός θεραπευτικός προσέγγιση έναντι παθοφυσιολογικά γεγονότα (Σχήμα 1). Μέχρι στιγμής, μονοκλωνικά αντισώματα, glycomimetic ανταγωνιστές [9], και διαφόρων τροποποιημένων απταμερή [10] – [12] έχουν δοκιμαστεί ως σελεκτίνης αναστολείς σε προ-κλινικές δοκιμές

μεταστατική εξάπλωση των καρκίνων συμβαίνει μέσω μιας διαδοχικής διεργασίας. ότι αρχίζει με την εισβολή των πρωτογενών κυττάρων όγκου. Μετά τη διέλευση της βασικής μεμβράνης και μεταναστεύουν μέσω του παρακείμενου συνδετικού ιστού, ορισμένα καρκινικά κύτταρα intravasate σε μικροαγγείων του όγκου και κυκλοφορούν με την ροή του αίματος σε απομακρυσμένα όργανα. Στο μέλλον μεταστατική θέση, αυτά τα κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων (CTC) επιβραδύνθηκε από την κυκλοφορία του αίματος και να συμμορφώνονται με αγγειακό ενδοθήλιο. Αυτό το στάδιο αποφασιστικά κινείται από αλληλεπιδράσεις μεταξύ των ενδοθηλιακών σελεκτίνες και ορισμένων συνδετήρων υδατάνθρακα όπως σιαλυλιωμένη δομές Lewis παρουσιάζονται στην επιφάνεια του κυττάρου όγκου. Η προσκόλληση είναι ένα προαπαιτούμενο για την εξαγγείωση και την επακόλουθη αποίκιση του μεταστατικού ιστού. Σελεκτίνης δεσμευτικό απταμερή τα οποία μειώνουν την αλληλεπίδραση μεταξύ συνδετήρων σελεκτίνης και ενδοθηλιακών σελεκτίνες θα ήταν επομένως μία πολλά υποσχόμενη νέα αντι-μεταστατικό θεραπευτικό.

Η

Τα απταμερή είναι DNA ή RNA ολιγονουκλεοτίδια με καθορισμένες τρισδιάστατες δομές που εμφανίζουν υψηλή συγγένεια και εξειδίκευση για στοχευόμενα μόρια. Σε σχέση με τα χαρακτηριστικά τους σύνδεσης, είναι συγκρίσιμα με τα αντισώματα. Τα πλεονεκτήματα της απταμερών πάνω αντισωμάτων είναι (i) απλά και οικονομικά σύνθεση τους, (ii) τη δυνατότητα για μακροχρόνια αποθήκευση τους σε θερμοκρασία δωματίου και έτσι (iii) τη σταθερότητα τους κατά τη μεταφορά, (iv) των διαφορετικών δυνατοτήτων σύζευξης με άλλες αντιδραστήρια και (v) την έλλειψη ανοσογονικότητας [12]. Τα απταμερή επιλέγονται με

in vitro

διαδικασία που ονομάζεται

S

ystematic

E

volution του

L

igands από

EX

εκθετικού εμπλουτισμού (

SELEX

) με ενίσχυση DNA ή RNA ολιγονουκλεοτίδια με βάση την συγγένειά τους για ένα μόριο στόχο [13] – [15]. Η ποικιλομορφία των ολιγονουκλεοτιδίων επιτρέπει την επιλογή απταμερών για σχεδόν οποιοδήποτε μόριο-στόχο. Έτσι, απταμερή είναι ένα κατάλληλο εργαλείο για ιατρική χρήση στη διάγνωση και τη θεραπεία.

Αρχίσαμε να επιλέξετε απταμερή DNA με σκοπό την ιατρική εφαρμογή τους στην αναστολή της μετάστασης όγκων. Πετύχαμε στην επιλογή μιας απταμερές με υψηλή συγγένεια για Ε- και Ρ-σελεκτίνης και δοκιμαστεί η δέσμευση με μόρια-στόχους της μέσω δοκιμασίες κατακράτησης φίλτρο (FRA). Για να αξιολογηθεί η ικανότητα του απταμερούς να μπλοκάρουν την αλληλεπίδραση του καρκίνου και λευχαιμίας κυττάρων με σελεκτίνες, χρησιμοποιήσαμε δοκιμασίες στρωτής ροής κάτω από φυσιολογικές συνθήκες διατμητικής τάσης, που απασχολούν την ανθρώπινη ορθοκολικού καρκίνου κυτταρική γραμμή ΗΤ29, ανθρώπινη χρόνια ηωσινοφιλική κυτταρική λευχαιμία γραμμή EOL-1, και πρωτογενή ανθρώπινα πνευμονική μικροαγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα (HPMECs). Τα επιλεγμένα απταμερή DNA ανέστειλαν την αλληλεπίδραση των καρκινικών κυττάρων με το ενδοθήλιο με το φράξιμο σελεκτίνη προσκόλλησης τους. Έτσι, οι επιλεγμένες απταμερή παρέχει μια ελκυστική εναλλακτική λύση στις υπάρχουσες συγκρίσιμα αντιδραστηρίων.

Υλικά και Μέθοδοι

Ολιγονουκλεοτίδια

Η αρχική βιβλιοθήκη DNA που χρησιμοποιείται για SELEX αγοράστηκε από Metabion. Αποτελούνταν από μια τυχαιοποιημένη περιοχή 50 νουκλεοτιδίων πλαισιώνεται από σταθερές περιοχές στο 5′- καθώς και 3′-άκρο (21 ή 20 νουκλεοτίδια, αντιστοίχως) για να επιτρέψει για την ενίσχυση PCR. Περαιτέρω ολιγονουκλεοτίδια αγοράσθηκαν από την Invitrogen.

Βιοτινυλίωση της Ε-σελεκτίνης και ακινητοποίηση επί Στρεπταβιδίνη-Dynabeads επικαλυμμένων (Target σφαιρίδια)

Για την αντίδραση βιοτινυλίωσης, 50 μg ανασυνδυασμένου ανθρώπινου Ε-σελεκτίνης /IgG-Fc -chimeras (rh Ε-σελεκτίνη? Κ &? D Systems) επωάστηκαν με τριπλή γραμμομοριακή περίσσεια σουλφο-ΝΗδ-ΕΟ-βιοτίνη (Thermo Scientific) όπως περιγράφεται λεπτομερώς στο εγχειρίδιο του κατασκευαστή. Τέλος, το βιοτινυλιωμένο rh Ε-σελεκτίνης ακινητοποιήθηκε επί μαγνητικών σφαιριδίων 5 mg επικαλυμμένα με στρεπταβιδίνη (Dynabeads? Τεχνολογίες ζωής) και αιωρούνται σε ρυθμιστικό διάλυμα επιλογής (3 mM MgCl

2 σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS), ρΗ 7,5) που περιλαμβάνει 1 mg αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) /mL, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16].

Βιοτίνη Ακινητοποίηση επί στρεπταβιδίνη-Dynabeads επικαλυμμένων (χάντρες προ-επιλογή)

επικαλυμμένα με στρεπταβιδίνη μαγνητικά σφαιρίδια (5 mg) πλύθηκαν πέντε φορές με 500 μL ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης (1 mg BSA /ml PBS), επαναιωρήθηκαν σε 500 μL PBS που περιείχε 0,9 mM βιοτίνη, και επωάστηκαν για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Οι βιοτίνης-στρεπταβιδίνης-επικαλυμμένα μαγνητικά σφαιρίδια πλύθηκαν πέντε φορές με ρυθμιστικό διάλυμα έκπλυσης 500 μι, επαναιωρήθηκε σε 1.5 mL PBS συμπεριλαμβανομένων 1.25 mg BSA /ml και εν συνεχεία χρησιμοποιήθηκαν για προ-επιλογή.

In vitro

επιλογή σελεκτίνης απταμερή DNA

για

in vitro

επιλογή E-σελεκτίνης ειδικό DNA απταμερών, χρησιμοποιήσαμε τη διαδικασία SELEX (Σχήμα 2) περιλαμβάνει ένα βήμα προ-επιλογής για να αφαιρέσετε στρεπταβιδίνη -σύνδεση DNA. Για προ-επιλογής, 250 pmol της βιβλιοθήκης ssDNA (5′-GCCTGTTGTGAGCCTCCTAAC- (Ν)

50-CATGCTTATTCTTGTCTCCC-3 ‘) επωάστηκαν με 30 nmol χάντρες προεπιλογής για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Στρεπταβιδίνη-δέσμευσης DNA απομακρύνθηκε μέσω μαγνητικού διαχωρισμού. Ο πρώτος γύρος επιλογής άρχισε με επώαση του προ-επιλεγμένη βιβλιοθήκη DNA με σφαιρίδια στόχου 50 pmol για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά την απομάκρυνση του μη συνδεδεμένου DNA με πλύση με 200 μλ ρυθμιστικού επιλογής, συνδεδεμένο DNA εκλούστηκε σε 55 μΐ νερό με θέρμανση του μίγματος στους 80 ° C για 3 λεπτά. Εκλούεται DNA ενισχύθηκε μέσω PCR χρησιμοποιώντας 1 μΜ 5′-βιοτινυλιωμένου αντίστροφο εκκινητή (5’-GGGAGACAAGAATAAGCATG-3 ‘), 1 μΜ εμπρόσθιο εναρκτήρα (5′-GCCTGTTGTGfAGCCTCCTAAC-3’), 1.5 mM MgCl

2, 200 μΜ dNTPs σε 1 × PCR ρυθμιστικό διάλυμα Β και 0.05 U FIREPol DNA πολυμεράσης ανά μL (τα δύο τελευταία αγοράστηκε από Solis Βίοϋγηβ). Διαχωρισμός των απταμερών μονόκλωνου DNA από δίκλωνα προϊόντα PCR έγινε με επικαλυμμένα με στρεπταβιδίνη μαγνητικά σφαιρίδια. Ως εκ τούτου, τα προϊόντα PCR αραιώθηκαν 1:02 σε 2 χ Β &? W ρυθμιστικού (1 mM EDTA, 2 Μ NaCl σε 10 mM Tris-HCl, ρΗ 7,5), προστέθηκαν σε επικαλυμμένα με στρεπταβιδίνη μαγνητικά σφαιρίδια και στη συνέχεια πλένεται δύο φορές με 1 × B & amp ? W ρυθμιστικό. Μετά από επώαση για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου απομακρύνθηκαν τα υπερκείμενα και τα σφαιρίδια επανα-εναιωρήθηκαν σε 150 mM NaOH μετά από επώαση για άλλα 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα συνδυασμένα υπερκείμενα, που περιέχουν το μονόκλωνο DNA, εξουδετερώθηκαν χρησιμοποιώντας 100 mM HCl και χρησιμοποιούνται σαν πισίνα ξεκίνημα για έναν επόμενο γύρο επιλογής. Μετά από επώαση του DNA μονών κλώνων με στόχο χάντρες των ποσών των βημάτων πλύσης τέθηκαν από γύρο σε γύρο αυξανόμενη αυστηρότητα.

DNA επωάστηκε με ακινητοποιημένη rh Ε-σελεκτίνη σε μαγνητικά σφαιρίδια (σφαιρίδια στόχο). Μετά από έκπλυση και την απομάκρυνση αδέσμευτου DNA, δεσμεύεται στόχου DNA εκλούστηκε και ενισχύθηκε μέσω PCR. Το δίκλωνο προϊόν PCR διαχωρίζεται σε μονές DNA κλώνου και το επόμενο βήμα SELEX άρχισε μετά από αυτή την αναγέννηση. Η ταυτοποίηση των απταμερών μέσω κλωνοποίησης και προσδιορισμού αλληλουχίας της εμπλουτισμένης δεξαμενής ssDNA διεξήχθη μετά από αρκετούς γύρους SELEX (10-20 γύρους).

Η

Κλωνοποίηση

Απομόνωση των επιλεγμένων απταμερών επιτεύχθηκε με μοριακό TA-κλωνοποίηση. Ως εκ τούτου, ο φορέας pUC19-Τ (pCR2.1-ΤΟΡΟ? Invitrogen) περιορίστηκε με XcmI (Thermo Scientific) για τη δημιουργία 3 ‘προεξοχές θυμιδίνης [17], [18]. Τα απταμερή ενισχύθηκαν μέσω PCR χρησιμοποιώντας πολυμεράση DNA FIREPol παράγουν προεξοχές 5 ‘αδενοσίνης και συνδέθηκε με τον φορέα χρησιμοποιώντας Τ4 DNA λιγάση (Thermo Scientific). DNA από 50 προκυπτόντων κλώνων απομονώθηκε και αλληλουχήθηκε (GATC-Biotech).

Φίλτρο κατακράτησης Δοκιμασία

Φίλτρο δοκιμασίες κατακράτησης (FRA) χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί σταθερές διάστασης των αλληλεπιδράσεων απταμερούς σελεκτίνης. Ως εκ τούτου, το DNA ραδιενεργά σημασμένα με [& lt? $ & Gt? \\ Raster = «Rg1» & lt? $ & Gt? –

32Ρ] αδενοσίνη-5′-triphosphte (Hartmann Analytic) χρησιμοποιώντας κινάση Τ4 πολυνουκλεοτιδίου (Thermo Scientific) και καθαρίστηκε μέσω πήγματος εκχύλιση που ακολουθείται από καθίζηση με ισοπροπανόλη. Για τις δοκιμασίες πρόσδεσης, σταθερές ποσότητες ραδιενεργού DNA (& lt? 1 ηΜ) επωάστηκε με αυξανόμενες ποσότητες των αντίστοιχων πρωτεϊνών (0-1 μΜ) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου σε ρυθμιστικό διάλυμα επιλογής. Στη συνέχεια σύμπλοκα πρωτεΐνης-απταμερές διηθήθηκαν (Πολλαπλή Ι Dot-BlotSystem, Whatman) μέσω ενός προ-εξισορροπηθεί (15 λεπτά σε 0.4 Μ ΚΟΗ) μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (Whatman) για 5 λεπτά σε απιονισμένο νερό σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια πλένονται εντός ρυθμιστικού επιλογής. Μετά από διήθηση, η μεμβράνη νιτροκυτταρίνης ξηράνθηκαν και εκτέθηκαν για 3 ώρες σε ένα κόσκινο απεικόνισης φωσφόρου (Bio-Rad). Για τον ποσοτικό προσδιορισμό χρησιμοποιήσαμε το ένα site-specific μοντέλο δέσμευσης (Quantity One software)

Nuclease-αντίσταση σταθερότητα

DNA απταμερές ραδιενεργά σημασμένη με. [-

32Ρ] adenosine- 5′-triphosphte όπως περιγράφεται παραπάνω και επωάζονται με 100 μι πλήρους μέσου εις 37 ° C. Μετά από καθορισμένη χρονικά σημεία (0 έως 720 λεπτά), 10 μL από κάθε δείγμα καταψύχονται σε υγρό άζωτο και στη συνέχεια αναλύθηκαν μέσω ηλεκτροφόρησης σε πήκτωμα μετουσίωσης 10%.

Γραμμές Κυττάρων και συνθήκες καλλιέργειας

Το ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρική γραμμή ΗΤ29 (που αγοράστηκε από την Ευρωπαϊκή Συλλογή Καλλιεργειών κυττάρων) και η ανθρώπινη χρόνια ηωσινοφιλική κυτταρική λευχαιμία γραμμή EOL-1 (από DSMZ) διατηρήθηκαν σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 2 mM L-γλουταμίνη, 10% ορό εμβρύου μόσχου (FCS ), 100 μg πενικιλλίνης /ml και 100 μg στρεπτομυκίνη /ml (τελευταία αντιδραστήρια αγοράστηκαν από την ΡΑΑ) στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2. Για όλες τις δοκιμασίες, τα κύτταρα ΗΤ29 καλλιεργήθηκαν μέχρι 80% συρροή? κύτταρα EOL-1 αναπτύχθηκαν σε εναιώρημα. Πρωτογενή ανθρώπινα πνευμονικών μικροαγγειακών ενδοθηλιακών κυττάρων (HPMECs) ελήφθησαν από Promocell, καλλιεργημένα σε ενδοθηλιακά MV μέσο κυτταρικής ανάπτυξης συμπληρωμένο με το αντίστοιχο μείγμα συμπλήρωμα, όπως προβλέπεται από τον προμηθευτή, και 100 μg πενικιλλίνης /ml και 100 μg στρεπτομυκίνης /κ.εκ. HPMECs ήταν υπο-καλλιεργηθούν χρησιμοποιώντας ένα ειδικό κιτ Αποσύνδεση (Promocell) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Όλα τα πειράματα με πρωτογενή κύτταρα έγιναν κατά τη διάρκεια των πρώτων έξι περάσματα.

Αναστολή Δυναμική Tumor Η κυτταρική συγκόλληση σε Ακινητοποιημένη Ανθρώπινα Ε- και Ρ-σελεκτίνης

Αναλύσαμε απταμερούς μεσολάβηση αναστολή της σελεκτίνης αλληλεπίδραση υπό συνθήκες στρωτής ροής που αντιπροσωπεύει τα ενδοθηλιακά διατμητική τάση που βρέθηκαν σε μετα-τριχοειδή φλεβίδια του μεταστατικού όργανα, όπως πνεύμονες [19]. Για το σκοπό αυτό, Rh Ε- και rh Ρ-σελεκτίνης ακινητοποιήθηκαν επί IBIDI microslides κέρασμα VI (IBIDI) σε τελική συγκέντρωση 0,02 mg /ml, αραιωμένη σε DPBS συμπεριλαμβανομένων Ca

+ και Mg2

2+ ( DPBS

+? PAA) επί 30 λεπτά στους 37 ° C. Παράλληλα ως μάρτυρας, θάλαμοι επικαλύφθηκαν παρομοίως με 0.02 mg /mL IgG-Fc (R &? D Systems). Τα πλακίδια πλύθηκαν με 50 μί DPBS και επωάστηκαν με ή χωρίς απταμερές (0,15 mg απταμερούς /mL DPBS

+) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. τριχοειδή IBIDI microslides πλύθηκαν και πάλι με 50 μL ϋΡΒδ

+ και στη συνέχεια διαποτίζονται με 1 × 10

5 ΗΤ29 καρκινικά κύτταρα ανά mL σε ένα ρυθμό γραμμικής ροής 8,5 mL /h [19]. Κολλητική γεγονότα καταγράφηκαν και στη συνέχεια αναλύθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [4], [20], [21].

Αναστολή Δυναμική όγκου κυττάρων Προσκόλληση σε Ανθρώπινα Πνευμονική Ενδοθήλιο

Για να προσδιοριστεί η ανασταλτική δυναμικό της απταμερές μας την διάτμηση ανθεκτική προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων προς την ανθρώπινη πνευμονική ενδοθήλιο, IBIDI microslides θεραπεία VI επικαλύφθηκαν με συρρέουσες μονοστοιβάδες HPMEC, η οποία παρέμεινε χωρίς θεραπεία ή διεγέρθηκαν με ανασυνδυασμένη ανθρώπινη (rh) ΤΝΡα (Peprotech) για 4 ώρες πριν από τη δοκιμασία προσκόλλησης ροή (10 ng /mL). Τα διεγερμένα HPMECs επωάστηκαν με 0.15 mg απταμερές /mL μέσου για 30 λεπτά στους 37 ° C και στη συνέχεια διαποτίζονται με 1 × 10

5 ΗΤ29 καρκινικών κυττάρων ανά mL όπως περιγράφεται ανωτέρω (έλεγχος χωρίς απταμερούς).

Στατιστικά

Για όλες τις στατιστικές αναλύσεις Graphpad Prism 6 (La Jolla California, USA) χρησιμοποιήθηκε. Οι τιμές δίνονται ως μέση ± τυπική απόκλιση. Το One site-specific μοντέλο δέσμευσης (Graphpad Prism 6) χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό των σταθερών διάστασης. Η δίπλευρη unpaired t-test χρησιμοποιήθηκε για συγκρίσεις μεταξύ των δύο ομάδων. Σημαντικές διαφορές μεταξύ των δύο μέσων με p & lt? Είναι 0.05 σημειώνονται με *, πολύ σημαντικές διαφορές (p & lt? 0,01) με ** και εξαιρετικά σημαντικές διαφορές (p & lt? 0.001) με ***

Αποτελέσματα

επιλογή και χαρακτηρισμό μιας Ε- και Ρ-σελεκτίνης ειδικού DNA απταμερές

Με σκοπό την επιλογή απταμερών DNA που αναστέλλουν την αλληλεπίδραση μεταξύ της ανθρώπινης Ε-σελεκτίνες και τους συνδέτες τους παρουσιάζονται σε καρκινικά κύτταρα, πραγματοποιήσαμε SELEX χρησιμοποιώντας παράγεται με ανασυνδυασμό ανθρώπινη πρωτεΐνη σύντηξης Ε-σελεκτίνης ως μόριο-στόχο. Μετά από 17 γύρους επιλογής, της δεξαμενής εμπλουτισμένου ϋΝΑ έδειξε περίπου 20% σύνδεση προς rh Ε-σελεκτίνη σε σύγκριση με την αρχική πισίνα DNA (Εικόνα 3Α), που περιλαμβάνει ένα σταθερά διάστασης (

K

δ) του 170 ± 65 nM. Αναλύσεις αλληλουχίας των 50 μονά ολιγονουκλεοτίδια προερχόμενα από αυτή την ομάδα δεν απεκάλυψε ομοιότητες αλληλουχίας μεταξύ αυτών των ολιγονουκλεοτιδίων. Ωστόσο, ερευνά πολλά από αυτά τα μόρια από προσδιορισμούς συγκράτησης του φίλτρου, εντοπίσαμε του δεξιού Ε-σελεκτίνης ειδικό DNA SDA απταμερούς (5′-GCCTGTTGTGAGCCTCCTAACGATTTGGATTTGGGGTGGAGGGTATGGTTTGTGCTGGCGTTCTCATTTCCCATGCTTATTCTTGTCTCCC-3′) με ένα

K

d αξία των 98 ± 16 ηΜ (Σχήμα 3Β).

DNA ραδιοσημάνθηκε, επωάστηκαν με αυξανόμενες ποσότητες των πρωτεϊνών και διηθείται μέσω μιας μεμβράνης νιτροκυτταρίνης. Κλάσματα του δεσμευμένου DNA που εντοπίστηκαν μέσω αυτοραδιογραφίας και ποσοτικά. (Α) Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη Ε-σελεκτίνη επωάζονται με πισίνα DNA μετά από ένα (▴) και 17 γύρους (•) SELEX. (Β) Το απταμερές SDA επωάζονται με rh Ε-σελεκτίνη (•,

K

d ≈ 87 ηΜ), rh Ρ-σελεκτίνη (▪,

K

d ≈ 84 ηΜ), ή στρεπταβιδίνη (▴) ως έλεγχο. Ένας μάρτυρας DNA έκανε ούτε συνδέονται με την ανθρώπινη Ε- (▾) ούτε η P-σελεκτίνη (♦)

Η

Λόγω ομοιοτήτων αλληλουχίας μεταξύ των Ε- και Ρ-σελεκτίνες [6], [22] -. [ ,,,0],24], ελέγξαμε την συγγένεια του SDA για ανασυνδυασμένης ανθρώπινης Ε-σελεκτίνης /IgG-Fc-χίμαιρες (rh Ρ-σελεκτίνη? Κ &? D Systems). Με αυτόν τον τρόπο SDA, αρχικά επιλεγεί για ανθρώπινη Ε-σελεκτίνη, έδειξε επίσης αξιοσημείωτη συγγένεια για την ανθρώπινη Ρ-σελεκτίνη (

K

d = 95 ± 18 ηΜ), αλλά δεν είναι καθόλου σε στρεπταβιδίνη. Τέλος, το DNA ελέγχου (5′-GCCTGTTGTGAGCCTCCTAACGAGGAGTGGGCTAAAGGTATGTTGTGGGTTTGGTTCCATGCTTATTCTTGTCTCCC-3 ‘), η οποία διέφερε από SDA στην τυχαιοποιημένη περιοχή, έκανε ούτε δεσμεύονται σε RH Ε- ούτε rh Ρ-σελεκτίνη (Σχήμα 3Β).

Όλες οι προσπάθειες για την ελαχιστοποίηση ο 91 νουκλεοτιδίων μακρύ απταμερές απέτυχε παρά εφαρμόζοντας Mfold [25], [26] με τη βοήθεια δευτερογενούς προβλέψεις δομής για την πρόβλεψη βραχύτερες αλληλουχίες. Παρακολουθήσαμε την σταθερότητα του SDA σε πλήρη μέσο. Ακόμη και αν θα μπορούσε να παρατηρηθεί μια αργή αποικοδόμηση, μετά από 12 ώρες περισσότερο από το 25% πλήρους μήκους απταμερές θα μπορούσε ακόμη να ανιχνευθεί σε απουσία σελεκτίνες (Σχήμα 4).

Ραδιοσημασμένη SDA επωάστηκε με πλήρες μέσο και αναλύθηκαν μέσω πολυακρυλαμιδίου ηλεκτροφόρηση πηκτής. Μετά από μία ώρα περισσότερο από το ήμισυ του SDA ήταν ακόμη διαθέσιμο (μικρό κουτί).

Η

DNA απταμερή Αναστολή κυτταρικής προσκόλλησης σε ακινητοποιημένο ανασυνδυασμένο Ανθρωπίνων Σελεκτίνες υπό φυσιολογικές Shear Stress

Θα διερευνηθεί κατά πόσον η SDA ήταν σε θέση να επηρεάσει την πρόσφυση των κυττάρων που παρουσιάζουν όγκου συνδετήρα σελεκτίνης να Ε- και Ρ-σελεκτινών υπό φυσιολογικές συνθήκες διατμητικής τάσης. Ως εκ τούτου, rh-σελεκτίνες ακινητοποιήθηκαν σε μια μικρο-θαλάμου στρωτής ροής και τα τριχοειδή αγγεία διαχύθηκαν είτε με κύτταρα ΗΤ29 σε περίπτωση ανθρώπινης Ε-σελεκτίνης ή με κύτταρα EOL-1 στην περίπτωση του ανθρώπου Ρ-σελεκτίνης. Κολλητική γεγονότα καταγράφηκαν. Εν τη απουσία του SDA, τα κύτταρα ΗΤ29 προσκολλάται επί θαλάμους Ε-σελεκτίνη-επικαλύπτονται με 11.89 ± 4,9 συμβάματα ανά λεπτό (Σχήμα 5Α). Για να εξεταστεί το ανασταλτικό αποτέλεσμα SDA, θαλάμων Ε-σελεκτίνη επικαλυμμένα προ-επωάστηκαν με SDA. Στη συνέχεια, αυτή η τριχοειδής εγχύθηκε με κύτταρα ΗΤ29 και ο αριθμός των προσκολλημένων κυττάρων ΗΤ29 μειώθηκε σημαντικά σε 7,67 ± 3,9 συμβάντα ανά λεπτό που αντιστοιχεί σε μείωση κατά 35%. Όταν χρησιμοποιήθηκε DNA έλεγχο, πρόσφυση ΗΤ29 κυττάρων δεν ήταν απομειωμένες (11,22 ± 5,3 γεγονότα /min). Ως κατάλληλη αρνητικός έλεγχος IgG-Fc χωρίς συνεργάτη σύντηξης ακινητοποιήθηκε σε ένα μικρο-θαλάμου για τον αποκλεισμό μη ειδική σύνδεση. Αυτό είχε ως αποτέλεσμα μόνο σπάνια δεσμευτικές εκδηλώσεις (0,78 ± 0,8 εκδήλωση /min,

P

& lt? 0.001

vs

E-σελεκτίνη.)

Ακινητοποιημένη RH Ε- (Α. ) ή RH Ρ- (Β) σελεκτίνη (0,2 μΜ έκαστο), καθώς και διεγείρονται HPMECs (C) επωάστηκαν με 5 μΜ του SDA ή τον έλεγχο DNA. καρκινικά κύτταρα συνδέτη σελεκτίνης παρουσιάζοντας διαχύθηκαν επί ακινητοποιημένων πρωτεϊνών ή παρουσίαση της Ε-σελεκτίνης HPMECs (ταχύτητα ροής 8 mL /h) και τα κύτταρα διατηρούν μετρήθηκαν. SDA μείωσε την προσκόλληση σε αντίστοιχα κύτταρα (n = 6 του συνολικού 2 διαφορετικά πειράματα,

P

-τιμές ισχύουν για τις σελεκτίνες). IgG-Fc ελέγχου δεν έδειξε καμία επίδραση πρόσφυσης. Όλα

P τιμές

υπολογίστηκαν με μη επεξεργασμένα σελεκτίνες ως πρότυπο

(* P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01, *** P & lt? 0.001).

Η

για να εξεταστεί αν SDA αναστέλλει επίσης EOL-1 κυτταρική προσκόλληση στην ανθρώπινη Ρ-σελεκτίνη, έχουμε ακινητοποιημένο ανθρώπινο Ρ-σελεκτίνης στην επιφάνεια του θαλάμου. Στην δοκιμασία στρωτή ροή, ανεπηρέαστη EOL-1 προσκόλλησης κυττάρου για την ανθρώπινη Ρ-σελεκτίνη είχε ως αποτέλεσμα 10,42 ± 3,7 συμβάματα ανά λεπτό (Σχήμα 5Β). Αυτή η τιμή μειώθηκε στο 60% με 6,54 ± 2,2 συμβάντα ανά λεπτό παρουσία του SDA (

P

& lt?. 0.05

vs

P-σελεκτίνη). Μετά την επώαση με DNA έλεγχο, ροή συγκόλληση των κυττάρων EOL-1 προς Ρ-σελεκτίνη παρέμεινε αμετάβλητη με 13,00 ± 3,7 συμβάντα ανά λεπτό (

P

& lt?. 0.01

vs

SDA).

SDA Αναστέλλει ΗΤ29 ροής πρόσφυση σε εξαναγκασμένη Ανθρωπίνων Πνευμονική μικροαγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα

Μετά αποδεικνύοντας ότι SDA ήταν σε θέση να μειώσει την προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων στο ανθρώπινο Ε- και Ρ-σελεκτίνη-επικαλυμμένες επιφάνειες κάτω από την πίεση ροή στρωτή, μπορούμε επόμενη διερεύνησαν την επίδραση του SDA στις αλληλεπιδράσεις κυττάρου-κυττάρου. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιήθηκαν δύο ανθρώπινες κυτταρικές σειρές: ανθρώπινη πνευμονική μικροαγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα (HPMECs) και κύτταρα ΗΤ29. Μη-διεγερμένη HPMECs δεν παρουσιάζουν Ε-σελεκτίνη στην επιφάνειά τους. Κατά TNFα-διέγερση, HPMECs παράγουν Ε-σελεκτίνη και να το παρουσιάσει στην κυτταρική τους επιφάνεια που επιτρέπει την αλληλεπίδραση με ΗΤ29 που φέρουν το E-σελεκτίνης συνδετήρες ΣΕΛ

X και ΣΕΛ

Α. Κατ ‘αρχάς, μη διεγερμένη HPMECs καλύφθηκαν σε ένα μικρο-θαλάμου. Η προσκόλληση των κυττάρων ΗΤ29 συνδέτη παρουσιάζοντας σελεκτίνης προσδιορίστηκε ότι είναι 1,50 ± 1,3 κύτταρα ανά λεπτό (-Κ TNFa). Μετά την παραγωγή της Ε-σελεκτίνης επάγεται με αγωγή με ΤΝΡα RH για 4 ώρες πριν από τα πειράματα προσκόλλησης ροής, ο αριθμός των κυττάρων ΗΤ29 ακολουθώντας HPMECs αυξήθηκε σε 23,17 ± 12,7 συμβάματα ανά λεπτό (+ rh TNFa,

P

& lt? 0,01

vs

διεγείρονται HPMEC).. Για να διερευνηθεί η επίδραση του SDA σε αυτή την αλληλεπίδραση κυττάρου-κυττάρου, rh ΤΝΡα-διεγερμένα HPMECs επωάστηκαν είτε με SDA ή DNA ελέγχου. Η ακόλουθη δοκιμασία στρωτή ροή με κύτταρα ΗΤ29 έδειξε ότι η SDA μειωθεί ΗΤ29 πρόσφυση στην παρουσίαση της Ε-σελεκτίνης HPMECs σημαντικά στο 45% (10,50 ± 2,1 γεγονότα /min,

P

& lt?. 0.05

vs

διεγείρεται HPMECs). Σε αντίθεση, ο έλεγχος του DNA δεν έδειξε καμία σημαντική επίδραση (19,67 ± 7,7 γεγονότα /min,

P

& lt? 0,05

vs SDA

?. Σχήμα 5C).

Συζήτηση

σχηματισμό μετάσταση είναι η κύρια κλινική εμπόδιο στη θεραπεία του καρκίνου [2]. Ένας αυξανόμενος αριθμός μελετών αποκάλυψε ένα κρίσιμο ρόλο των Ε- και Ρ-σελεκτίνες κατά τη διάρκεια της μεταστατικής [4], [27], [28]. Κατά συνέπεια, σελεκτίνες αναδυθεί ως υποσχόμενους στόχους να παρεμβαίνει με το σχηματισμό μεταστάσεων. Για το σκοπό αυτό, απταμερή μπορούσε να είναι επωφελής εργαλεία. Τα απταμερή είναι ικανά να συνδέουν μόριο στόχο τους με υψηλή εξειδίκευση και συγγένεια και μπορεί να αναστείλει τη λειτουργία ενός μορίου στόχου. Σε αντίθεση με τα αντισώματα, αυτά τα ολιγονουκλεοτίδια επιδεικνύουν σταθερότητα θερμοκρασίας καθώς και απλή και ανέξοδη σύνθεση μαζί με μη επιπλεγμένη χειρισμό. Ειδικά απταμερή DNA θα μπορούσε να είναι περισσότερο ισχύει τότε RNA απταμερών σχετικά μεγαλύτερη ημίσεια ζωή τους στον ορό. Η θεραπευτική αξία των απταμερών έχει αποδειχθεί από προηγούμενες μελέτες [12].

Πραγματοποιήσαμε μια

in vitro

επιλογή για απταμερή DNA δεσμευτική για την Ε-σελεκτίνη και προσδιόρισε ένα απταμερές, που ονομάζεται

S

electin

D

NA

A

ptamer (SDA) το οποίο περιλαμβάνει υψηλές συνάφειες για τα δύο, ανθρώπινης Ε- όσο και για την ανθρώπινη Ρ-σελεκτίνη. Για SDA μια σταθερά διαστάσεως περίπου 100 nm προσδιορίστηκε, η οποία τεκμηριώνει την υψηλή συγγένεια της bimolecular αλληλεπίδρασης μεταξύ του απταμερούς και του σελεκτίνη.

Λόγω ομοιοτήτων αλληλουχίας αμινοξέων μεταξύ Ε- και Ρ-σελεκτίνης και το ίδιο συγγένεια για SLE

X και ΣΕΛ

Α, αντίστοιχα [6], [22], [23], [29], η συγκρίσιμη συγγένεια του SDA τόσο σελεκτίνες δεν αποτελεί έκπληξη.

Η in vitro δοκιμασίες σύνδεσης

έδειξαν σχεδόν παρόμοια συγγένεια του SDA για ανασυνδυασμένη ανθρώπινη Ρ- και Ε-σελεκτίνη. Δοκιμασίες με ανασυνδυασμένη σελεκτίνες ποντικού έδειξε ότι SDA διατηρούνται συγγένεια για σελεκτίνης ποντικού καθώς και τα οποία δεν ήταν επίσης απροσδόκητη οφείλεται στην αναλογία αλληλουχία μεταξύ ανθρώπου και ποντικού σελεκτίνες (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Δεν αποδεικνύουν την πιθανή συγγένεια δέσμευσης του SDA για L-σελεκτίνη, λόγω έλλειψης σημασίας της στη διαδικασία της μετάστασης. Επιπλέον L-σελεκτίνης αλληλεπιδρά με άλλα προσδέματα από Ε- ή Ρ-σελεκτίνης.

Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, νουκλεϊκά οξέα, γενικά, και του RNA, ειδικότερα, δεν είναι αξιοσημείωτα σταθερός στον ορό, εξαιτίας της παρουσίας των διαφόρων νουκλεασών [12] . Να αναλύσει τη βιωσιμότητα του απταμερούς του, πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία σταθερότητας με ραδιενεργά σημασμένο SDA. Το απταμερές κατέληξε να είναι σταθερό σε μεγάλο βαθμό σε πλήρες μέσο για αρκετές ώρες. Μετά από μία ώρα θα μπορούσαν να ανιχνευθούν περίπου 80% πλήρους μήκους SDA. Επιπλέον, είναι γνωστό ότι τα απταμερή με μάζα περίπου 40 kDa ή μεγαλύτερο παραμένουν στην κυκλοφορία για εκτεταμένες χρονικές περιόδους [30]. Έτσι θα περιμέναμε μια παρόμοια συμπεριφορά για σελεκτίνη απταμερές μας με μάζα 30 kDa, η οποία αποτελεί προϋπόθεση για οποιαδήποτε

in situ

ή ακόμα και

in vivo

εφαρμογές στις επόμενες έρευνες. Η υπόθεση αυτή και το απέδειξε τη σταθερότητα του SDA είναι ενθαρρυντικά χαρακτηριστικά για τη μελλοντική επιτυχή

in vivo

μελέτες.

Όπως SDA είναι σε θέση να αναστέλλουν την προσκόλληση σε Ε- καθώς και Ρ-σελεκτίνη, έχουμε υπέθεσαν ότι αυτό το απταμερές παρεμβαίνει με τους τομείς λεκτίνης των σελεκτινών, όπως αυτές είναι υπεύθυνες για την πρόσδεση υδατάνθρακα [31]. Χρήση δυναμικών δοκιμασίες προσκόλλησης ροής, αποδείξαμε ότι πρώτα SDA ανέστειλε την αλληλεπίδραση μεταξύ Ε-σελεκτίνης και συνδετήρα σελεκτίνης που παρουσιάζουν ΗΤ29 κύτταρα καθώς και την αλληλεπίδραση μεταξύ Ρ-σελεκτίνης και τα κύτταρα σελεκτίνης EOL-1 σε πλήρες μέσο υπό διάτμηση συνθήκες στρες. Ακολούθως, ελέγξαμε το ανασταλτικό αποτέλεσμα του SDA στην αλληλεπίδραση της Ε-σελεκτίνης που παρουσιάζουν HPMECs και σελεκτίνης δεσμευτικό κύτταρα ΗΤ29. Αυτή η δοκιμασία μιμείται τη φυσική διαδικασία προσκόλλησης αρκετά καλά, δεδομένου ότι τρέχει κάτω από φυσιολογικές συνθήκες διατμητικής τάσης και μετρήσαμε μια σημαντική μείωση για την προσκόλληση ΗΤ29 διαμεσολαβείται από SDA από 45%. Το γεγονός αυτό επαληθεύεται την ανασταλτική αποτελεσματικότητα αυτού του απταμερούς και επικυρωθεί η σταθερότητα του σε πλήρη μέσο και στη συνέχεια την ικανότητά του για

in vivo

μελέτες.

Για το καλύτερο της γνώσης μας, μόνο ένα θειο-τροποποιημένο DNA απταμερούς (ESTA-1) έχει περιγραφεί σε ικανό συνδέσεως και αποκλεισμού Ε-σελεκτίνη αποτελεσματικά [32]. Αυτό, ωστόσο, δεν έδειξε δεσμευτικός στα χέρια μας σε δοκιμασίες κατακράτησης φίλτρο κάθε στόχο. Επιπλέον, δύο τροποποιημένα RNA απταμερών PF377 [33] και ARC5690 [30] υπάρχει αυτό το δέσιμο και μπλοκ Ρ-σελεκτίνη. Αυτά ή άλλα απταμερών με οποιαδήποτε τροποποίηση εντός τμήμα τους σακχάρου είναι σχετικά ακριβά στην παραγωγή και επομένως λιγότερο κατάλληλη για μεγάλες θεραπείες ώρα. Επιπλέον, η 2′-φθορο τροποποιημένου RNA απταμερές PF377 περιορίζεται για κάθε

in vivo

εφαρμογή, δεδομένου ότι μπορεί να αντιμετωπιστεί μόνο με συνθετικά PBS παραλείποντας οποιαδήποτε νουκλεάσες [33], [34]. Η αστάθεια αυτή του ορού αναφέρονται και τα περισσότερα άλλα απταμερή RNA είναι ο κύριος λόγος για την αποτυχία τους σε προχωρημένες σπουδές.

Σε σύγκριση με τις ήδη υπάρχουσες τροποποιημένα απταμερή, έχουμε επιλέξει ένα σταθερό μη-τροποποιημένο DNA απταμερές με ανασταλτική ικανότητα για σελεκτίνης-συνδετήρα αλληλεπιδράσεις μεταξύ αγγειακό ενδοθήλιο και καρκινικά κύτταρα με μείωση της αρχικής και στάδιο περιοριστικό της ταχύτητας κατά τη διάρκεια του ενδοθηλίου μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων.

Εκτός ολιγονουκλεοτιδικές ανταγωνιστές, αναστολείς στόχευση εναλλακτική σελεκτίνης παρουσιάζονται από μια τάξη ουσία που ονομάζεται glycomimetics. Αυτά είναι τροποποιημένοι ολιγοσακχαρίτες οι οποίες μιμούνται τα φυσικά υδατάνθρακες που περιλαμβάνουν την ικανότητα να δεσμεύει τον μιμούνται συνδέτη υδατάνθρακα. Ένα glycomimetic που μπλοκάρει Ε-, Ρ-, και L-σελεκτίνη είναι GMI-1070 [9]. Το απταμερές SDA περιγράφεται εδώ αντιπροσωπεύει ένα νέο αναστολέα σελεκτίνης που μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε συνδυασμό με τις ήδη υπάρχουσες άλλους αναστολείς για την πρόληψη σχηματισμού μετάστασης.

Συμπεράσματα

Συνοπτικά, έχουμε επιλέξει ένα μη τροποποιημένο 91 νουκλεοτιδίων μακρύ DNA απταμερούς, SDA, το οποίο δείχνει υψηλή συνάφεια για την ανθρώπινη Ε- και Ρ-σελεκτίνης με το

K

d

τιμές περίπου 100 ηΜ. Η ικανότητά του να αναστέλλει την αλληλεπίδραση του ανθρώπινου καρκίνου και λευχαιμίας κυττάρων σε σελεκτίνες ακόμη και σε ένα θάλαμο ροής προσομοίωση της ροής του αίματος σε φυσιολογικό περιβάλλον αναδεικνύει SDA ως μια πολλά υποσχόμενη εργαλείο για περαιτέρω

σε

vivo

μελέτες. Η γενιά των ποντικών που φέρουν αντίστοιχο ανθρώπινο σελεκτίνες για όσους

στο

vivo

δοκιμασίες είναι ένα σημαντικό επόμενο βήμα και με την επιφύλαξη των σημερινών πειραμάτων.

Ευχαριστίες

ευχαριστώ Katrin Seelhorst για την προσεκτική ανάγνωση του χειρογράφου.