Αφηρημένο

Αρκετές μελέτες έχουν επιφέρει αυξανόμενες ενδείξεις για να υποστηρίζουν την υπόθεση ότι miRNAs να διαδραματίσει κεντρικό ρόλο σε πολλές διεργασίες καρκινογένεσης, καθώς και στην ανάπτυξη των κυττάρων, την απόπτωση, τη διαφοροποίηση και την μετάσταση. Σε αυτή τη μελέτη, ερευνήσαμε τον πιθανό ρόλο του miR-31 σε καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC) επιθετικότητα και τους υποκείμενους μηχανισμούς της. Βρήκαμε ότι miR-31 αυξήθηκαν σε κύτταρα CRC προέρχονταν από μεταστατικές εστίες και ανθρώπινα πρωτογενή ιστούς CRC με μεταστάσεις στους λεμφαδένες. Επιπλέον, η έκφραση υψηλού επιπέδου του miR-31 συσχετίστηκε με μια πιο επιθετική και η κακή προγνωστική φαινότυπο των ασθενών με CRC (

σ

& lt? 0,05). Η σταθερή υπερέκφραση του miR-31 σε κύτταρα CRC ήταν επαρκείς για να προάγουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την εισβολή και τη μετανάστευση

in vitro

. Διευκόλυνε την ανάπτυξη του όγκου και των μεταστάσεων

in vivo

πάρα πολύ. Περαιτέρω μελέτες έδειξαν ότι το miR-31 μπορεί να συνδεθεί άμεσα με την 3 ‘αμετάφραστη περιοχή (3’UTR) της SATB2 mRNA και ακολούθως καταστέλλουν τόσο το mRNA και πρωτεΐνης εκφράσεις SATB2. Η έκτοπη έκφραση του SATB2 με παροδικά επιμολυσμένα με τον φορέα pCAG-SATB2 κωδικοποιεί ολόκληρη την αλληλουχία κωδικοποίησης SATB2 μπορούσε να αντιστρέψει τις επιδράσεις της miR-31 επί CRC ογκογένεση και την εξέλιξη. Επιπλέον, έκτοπη υπερέκφραση του miR-31 σε κύτταρα CRC επάγεται επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ). Τα αποτελέσματα μας δείχνει ότι το πάνω ρύθμιση του miR-31 έπαιξε σημαντικό ρόλο στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων CRC, εισβολή, και μετάσταση

in vitro

και

in vivo

μέσω της άμεσης κατασταλτική SATB2, γεγονός που υποδηλώνει μια πιθανή εφαρμογή του miR-31 στην πρόβλεψη πρόγνωση και θεραπευτική εφαρμογή στο CRC

Παράθεση:. Γιανγκ MH, Yu J, Τσεν Ν, Wang ΧΥ, Liu ΧΥ, Wang S, et al. (2013) Αυξημένα microRNA-31 Έκφραση Ρυθμίζει καρκίνο του παχέος εντέρου Εξέλιξη από την καταστολή του γονιδίου στόχου SATB2. PLoS ONE 8 (12): e85353. doi: 10.1371 /journal.pone.0085353

Επιμέλεια: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 2, Αυγ 2013? Αποδεκτές: 25 Νοεμ 2013? Δημοσιεύθηκε: 30 Δεκ 2013

Copyright: © 2013 Yang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 81000953, 81172242, 81071735), Μεγάλα έργα του Εθνικού Ιδρύματος Φυσικών Επιστημών της Κίνας ((αριθ. 81090422), μέλος του Προγράμματος κλειδιά του Εθνικού Ιδρύματος Φυσικών Επιστημών της Κίνας (U1201226), εθνικό πρόγραμμα βασικής έρευνας της Κίνας (973 Προγράμματος, Νο 2010CB529402), Key Πρόγραμμα του Εθνικού Ιδρύματος Φυσικών Επιστημών της Guangdong, Κίνα (2010B031500012) και το εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Guangdong, Κίνα (10451051501004710). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης , συλλογή και ανάλυση δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Όλοι οι συγγραφείς έχουν διαβάσει το χαρτί και ενέκρινε την υποβολή του στο PLoS ONE Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα..

Εισαγωγή

Ο ορθοκολικός καρκίνος (CRC) είναι μία από τις πιο κοινούς καρκίνους στον κόσμο. Αν και έχουν διάφορα είδη θεραπειών έχουν αναπτυχθεί πρόσφατα για τους ασθενείς με CRC, κακή πρόγνωση συνεχίζει να είναι σε ασθενείς με προχωρημένο CRC [1]. Οι περισσότερες CRC θάνατοι έχουν συσχετιστεί με εισβολή και μετάσταση όγκων. Έτσι, η κατανόηση των υποκείμενων μοριακών μηχανισμών της CRC μετάσταση είναι κρίσιμης σημασίας για την ανάπτυξη θεραπευτικών στρατηγικών για ασθενείς με προχωρημένο CRC.

microRNAs (miRNAs) αποτελούν μια πλούσια τάξη εξαιρετικά διατηρημένη, σύντομο, ρυθμιστικές (περίπου 22 nt) μη-κωδικοποίησης RNA που εκφράζονται ευρέως στους ζώντες οργανισμούς. Συνδέονται με την 3’UTR του mRNA, προκαλώντας είτε mRNA αποικοδόμηση μόριο ή μεταφραστικά αναστολή [2]. miRNAs έχουν διαφορετικές λειτουργίες, συμπεριλαμβανομένης της ρύθμισης της κυτταρικής διαφοροποίησης, πολλαπλασιασμού και απόπτωσης [3,4]. Ως εκ τούτου, αρκετές μελέτες έχουν αναφέρει τον κεντρικό ρόλο των miRNAs στις πολλαπλές διαδικασίες της καρκινογένεσης, συμπεριλαμβανομένης της μετάστασης [3,5,6]. Επιπλέον, οι αναλύσεις έδειξαν χαρακτηριστικές υπογραφές miRNA σε συγκεκριμένους καρκίνους του ανθρώπου [7-9] έκφρασης.

Αρκετοί ερευνητές ανέφεραν ότι miR-31 πάνω ρυθμισμένα σε CRC [10-12] και πλακώδες καρκίνωμα της γλώσσας [13], αλλά κάτω ρυθμισμένη στον καρκίνο του μαστού [14], γαστρικού καρκίνου [15], κακόηθες μεσοθηλίωμα [16] και τον καρκίνο του παγκρέατος [17] χρησιμοποιώντας qRT-PCR. Όμως, η κλινική προγνωστική σημασία, τη λειτουργία και ρυθμιστική δραστηριότητα των miR-31 στο CRC δεν έχουν ακόμα πλήρως κατανοηθεί. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε την αδιαμφισβήτητη ρόλος του miR-31 στο CRC και διαπίστωσε ότι η αυξητική ρύθμιση του miR-31 συνδέθηκε με τις επιθετικές φαινοτύπους του CRC και την κακή πρόγνωση σε ασθενείς. Περαιτέρω έρευνες αποκάλυψαν ότι η υπερ-έκφραση του miR-31 σε CRC οδήγησε να αυξήσει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και την κινητικότητα του

in vitro

και

in vivo

. Η παρούσα μελέτη καθορίζει ένα θετικό ρόλο του miR-31 στην καρκινογένεση, εισβολή, και της μετανάστευσης, μέσω της καταστολής της έκφρασης SATB2 στο CRC.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

Η χρήση ιστών για την παρούσα μελέτη έχει εγκριθεί από την επιτροπή δεοντολογίας του Nanfang Νοσοκομείο, Νότια Ιατρικό Πανεπιστήμιο. Όλοι οι ασθενείς υπέγραψαν την ενημερωμένη συγκατάθεση πριν από τη χρήση αυτών των κλινικών υλικών για ερευνητικούς σκοπούς. Η μελέτη αυτή πραγματοποιήθηκε σε αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις στον Οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας των πειραμάτων σε ζώα του Ιατρικού Πανεπιστημίου της Νότιας (Αριθμός Άδειας: SYXK2011-0074). Όλες οι χειρουργικές επεμβάσεις έγινε υπό αναισθησία πεντοβαρβιτάλης νατρίου, και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία.

προετοιμασίας ιστών και καλλιέργεια κυττάρων

Φρέσκα και φορμόλη σταθερό, παραφίνη-ενσωματωμένες, δείγματα ιστού ορθοκολικού όγκου ήταν που λαμβάνονται από ασθενείς με διάγνωση πρωτογενούς CRC και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε εκλεκτική χειρουργική επέμβαση στο Nanfang Νοσοκομείο, Νότια Ιατρικό Πανεπιστήμιο (Guangzhou, Κίνα). Η χρήση ιστών για την παρούσα μελέτη έχει εγκριθεί από την επιτροπή δεοντολογίας του Nanfang Νοσοκομείο, Νότια Ιατρικό Πανεπιστήμιο. Συνολικά 31 περιπτώσεις νέων ιστών CRC έγιναν προσφάτως καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C μέχρι την περαιτέρω χρήση. Και 143 περιπτώσεις αρχειοθετούνται δείγματα ιστών CRC συλλέχθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν στην κλινικοπαθολογοανατομικές και προγνωστική έρευνα του miR-31. Κανένας ασθενής δεν έλαβε καμία προεγχειρητική χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία. Ένα ολοκληρωμένο σύνολο κλινικοπαθολογοανατομικών στοιχεία διαθέτει, όπως η ηλικία, το φύλο, το μέγεθος του πρωτοπαθούς όγκου, η διαφοροποίηση του όγκου, το στάδιο Τ, μετάσταση στους λεμφαδένες και απομακρυσμένες μετάσταση. Πλήρης παρακολούθηση, που κυμαίνονται 1-96 μήνες, ήταν διαθέσιμο για την ομάδα των 143 ασθενών, και η μέση επιβίωση ήταν 56 μήνες.

Τα ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά κύτταρα 293Τ και τα ανθρώπινα CRC κυτταρικές σειρές DLD-1 , HCT116, SW480, SW620, Lovo ελήφθησαν από μια τράπεζα κυττάρων στην κινεζική Ακαδημία Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα). Σε προηγούμενες μελέτες, έχουμε περιγράψει μια υποκλώνου που ονομάζεται M5 με αυξημένη μεταστατική ικανότητες στο ήπαρ. Έχουμε περιγράψει επίσης ένα υποκλώνος ονομάζεται SCP 51 με υψηλή μεταστατική ικανότητες στο ήπαρ και λεμφαδένα. Αυτές οι υποκλώνοι απομονώθηκαν με

in vivo

επιλογή των κυττάρων SW480 μέσω μιας διαδικασίας που περιγράφεται σε προηγούμενες μελέτες [18-20]. Όλες οι κυτταρικές σειρές CRC καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 (Gibco, Gaithersburg, MD, USA) με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (HyClone, Logan, USA) και 100 U /ml πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (Gibco). Αυτά διατηρήθηκαν σε υγροποιημένο θάλαμο με 5% CO

2 στους 37 ° C. 293Τ διατηρήθηκε σε τροποποιημένο μέσο Dulbecco Eagle (ϋΜΕΜ) συμπληρωμένο με 10% FBS.

απομόνωση RNA και ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου

Ολικό RNA εκχυλίστηκε με το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA ). cDNA συνετέθη με το κιτ αντιδραστηρίου PrimeScript RT (Promega, Madison, WI, USA). Μια ποσοτική stem-loop RT-PCR διεξήχθη για την ανίχνευση της έκφρασης του ώριμου miR-31 με την ABI TaqMan

® κιτ δοκιμασίας microRNA (Applied Biosystems, Foster City, USA) και το γονίδιο-ειδικούς εκκινητές (Applied Biosystems, Foster City , USA) χρησιμοποιώντας ένα σύστημα πραγματικού χρόνου PCR ΑΒΙ 7500. Η δοκιμασία διεξήχθη εις τριπλούν για την κάθε περίπτωση να επιτρέψουν την εκτίμηση της τεχνικής μεταβλητότητας.

in situ υβριδοποίηση και η αξιολόγηση της χρώσης του miR-31

in situ υβριδισμός (ISH) πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Exiqon, Vedbaek, Denmark). ενσωματωμένες σε παραφίνη τομές (πάχους 4 μm) αποπαραφινοποιήθηκαν με ξυλόλιο και επανυδατώθηκαν με αραιό αιθανόλης βαθμού αντιδραστηρίου. Τα πλακίδια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με πρωτεϊνάση Κ στους 37 ° C για 20 λεπτά. Στη συνέχεια, προϋβριδοποιήθηκαν σε ένα διάλυμα υβριδισμού στους 50 ° C για 2 ώρες. Στη συνέχεια, 40 πΜ ενός κλειδωμένου οξύ-τροποποιημένο, 5 ‘διγοξιγενίνη νουκλεϊκού (DIG) -σημασμένου ολιγονουκλεοτιδικό ανιχνευτή της HSA-miR-31 ή ένα ανιχνευτή κωδικοποιημένο ελέγχου (Exiqon) προστέθηκε στο διάλυμα υβριδισμού και υβριδοποιήθηκε σε θερμοκρασία 50 ° C όλη τη νύκτα. Εφαρμόστηκε μια αλκαλική φωσφατάση συζευγμένη αντι-DIG αντίσωμα (Roche, Mannheim, Germany). Αφού πλύθηκαν σε χρώση διάλυμα, οι τομές επωάστηκαν σε /ΒΟΙΡ διάλυμα ανάπτυξης ΝΒΤ (Roche) στους 37 ° C για 15 έως 30 λεπτά. Στη συνέχεια, βάφτηκαν αντίθετα με nuclear fast κόκκινο.

Για να αξιολογηθεί κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών, οι ISH τομές ιστού εξετάστηκαν και βαθμολογήθηκαν χωριστά από δύο τύφλωσε παθολόγους. Η χρώση για miR-31 εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας μια σχετικά απλή και αναπαραγώγιμη μέθοδος βαθμολόγησης [21,22]. Σε μια κλίμακα από το 0 έως 3, η ένταση της χρώσης βαθμολογήθηκε ως εξής: αρνητικό (όχι χρώση, 0), αδύναμο (ανοιχτό μπλε, 1), μέσο (μπλε, 2), ή ισχυρά (σκούρο μπλε, 3). Η έκταση της χρώσης ορίζεται ως το ποσοστό των θετικών περιοχών χρώση των καρκινικών κυττάρων ή κανονικά επιθηλιακά κύτταρα του κόλου σε σχέση με ολόκληρη την περιοχή του όγκου ή ολόκληρο το τμήμα για τα φυσιολογικά δείγματα. Η έκταση της χρώσης βαθμολογήθηκε σε μια κλίμακα από το 0 έως 4 ως εξής: 0, 0%? 1, 1-25%? 2, 26-50%? 3, 51-75%? και 4, 76-100%. Το άθροισμα των βαθμολογιών έντασης χρώσης και χρώση-έκταση χρησιμοποιήθηκε ως το τελικό σκορ χρώση για miR-31 (0-7). Για τη στατιστική ανάλυση, η τελική βαθμολογία χρώση ≥ 3 θεωρήθηκε υψηλό.

Vector προετοιμασία

επιλέχθηκε

Ένα 184-bp θραύσμα DNA που αντιστοιχεί σε προ-miR-31, και η πλευρική αλληλουχία ενισχύθηκε και κλωνοποιήθηκε εντός φορέα λεντοϊού pLVTHM (https://www.addgene.org/Didier_Trono) για να δημιουργηθεί PLV-miR-31 φορέα έκφρασης. pLVTHM λεντοϊού φορέας κωδικοποιεί ενισχυμένη πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (EGFP) που έχει βελτιστοποιηθεί για λαμπρότερο φθορισμό και μεγαλύτερη έκφραση σε κύτταρα θηλαστικών. Η περιγραφόμενη προηγουμένως φορέα pCAG-SATB2 [19] χρησιμοποιήθηκε για να ρυθμίζουν την έκφραση SATB2.

Το πλήρους μήκους 3’UTR του SATB2 (2711bp) κλωνοποιήθηκε και στη συνέχεια εισάγεται καθοδικά του γονιδίου αναφοράς λουσιφεράσης pGL3 του ελέγχου (Promega, Madison, WI, USA). Αυτό έγινε για να δημιουργήσει pGL3-SATB2-3’UTR. Δύο υποθετικές miR-31 θέσεις πρόσδεσης στο 3’UTR της SATB2 ήταν κατευθυνόμενη σε θέση και να μεταλλαχθεί, αντίστοιχα χρησιμοποιώντας GeneTailor ιστοσελίδας-Directed Mutagenesis System (Invitrogen). Όλα τα πλασμίδια επιβεβαιώθηκε με ανάλυση αλληλουχίας. Όλες οι αλληλουχίες εκκινητών για αλληλουχίες ανίχνευσης και miRNA παρέχονται στον Πίνακα S1.

Lentivirus παραγωγή και μόλυνση

Τα σωματίδια του ιού συλλέχθηκαν 48 ώρες μετά την PLV-miR-31 επιμόλυνση με το πλασμίδιο του φακέλου pMD2.G και του φορέα συσκευασίας psPAX2 σε κύτταρα 293Τ χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο λιποφεκταμίνης 2000 (Invitrogen ). κύτταρα CRC μολύνθηκαν με τους ανασυνδυασμένους μονάδες φακοϊό μεταγωγής συν 8 mg /ml Polybrene (Sigma, St Louis, Missouri, USA) και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε ανάλυση FACS για την έκφραση GFP για να αποκτήσουν τα κύτταρα CRC με σταθερή υπερέκφραση του miR-31. Το άδειο φορέα λεντοϊού pLVTHM χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος (miR-con).

επιμόλυνση ολιγονουκλεοτιδίων

miR-31 μιμείται και αναστολείς αντίστροφης φοράς που περιέχουν 2′-OMe (

O

μεθυλο) τροποποιήσεις συντέθηκαν από GenePharma (Σαγκάη, Κίνα). διαμόλυνση ολιγονουκλεοτιδίου διεξήχθη με αντιδραστήριο Lipofectamine 2000 (Invitrogen).

λουσιφεράσης δημοσιογράφος δοκιμασία

Με την παρουσία του είτε miR-31 ή miR-con, το κατασκεύασμα λουσιφεράσης της πυγολαμπίδας ήταν συν-επιμολυσμένα με έλεγχο

Renilla

φορέα λουσιφεράσης pRL- CMV (Promega) σε κύτταρα SW480. Μια διπλή δοκιμασία λουσιφεράσης (Promega) πραγματοποιήθηκε 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν ανεξάρτητα.

Προσδιορισμός πολλαπλασιασμού κυττάρων και του κυτταρικού κύκλου ανάλυση

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων στα 2 χ 10

3 ανά φρεάτιο. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας Καταμέτρηση κυττάρων Kit-8 (CCK-8, Dojindo, Rockville, ΗΠΑ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου, τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων σε 5 × 10

5 ανά φρεάτιο. Η κατανομή κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε με ιωδιούχο προπίδιο (Sigma-Aldrich) χρώση και κυτταρομετρία ροής [23].

Colony δοκιμασία σχηματισμού

Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων σε 2 × 10

2 ανά φρεάτιο και διατηρήθηκαν σε RPMI1640 που περιείχε 10% FBS για 2 εβδομάδες. Μετά από 2 εβδομάδες, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS, σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη και χρωματίστηκαν με 0.5% κρυσταλλικό ιώδες. Ο αριθμός των αποικιών μετρήθηκε υπό μικροσκόπιο [24].

επούλωση των πληγών και την εισβολή δοκιμασίες

μετανάστευση κυττάρων αξιολογήθηκε με μέτρηση της κίνησης των κυττάρων σε ένα ξύνεται, ακυτταρικό περιοχή που δημιουργείται από ένα σωλήνα σιφωνίου 200 μL, και η εξάπλωση του κλεισίματος τραύματος παρατηρήθηκε μετά από 0 και 48 ώρες, αντίστοιχα. ελήφθησαν φωτογραφίες για να αξιολογήσει το επίπεδο της μετανάστευσης σε κάθε ομάδα των επιμολυσμένων κυττάρων. Η μετανάστευση ποσοτικοποιήθηκε με απαρίθμηση του συνολικού αριθμού των κυττάρων που μετανάστευσαν προς το αρχικό πεδίο πληγή. Για την ανίχνευση εισβολής, χρησιμοποιήθηκαν θάλαμοι matrigel επικαλυμμένα (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) που περιέχει 8 μm πόρους. Τα κύτταρα σπάρθηκαν εντός των άνω θαλάμων (επικαλυμμένα με Matrigel) στα 2 × 10

5 συγκέντρωση σε μέσο χωρίς ορό. Το κατώτερο τμήμα του transwell γέμισε με μέσο καλλιέργειας που περιέχει 10% FBS ως χημειο-προσελκυστικό. Αφού οι θάλαμοι επωάστηκαν στους 37 ° C για 48 ώρες, μη εισέβαλαν κύτταρα στο πάνω μέρος του transwell αποξέονται με ένα βαμβάκι. Επιτυχώς μετατοπίζεται κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 10% φορμαλίνη. Στη συνέχεια, βάφτηκαν με 0.1% κρυσταλλικό ιώδες επί 30 λεπτά και μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο φωτός.

In vivo

λειτουργίες προσδιορισμοί

Balb /C-ηυ /ηυ αθυμικοί γυμνά ποντίκια (ηλικίας 4-6 εβδομάδων) αγοράστηκαν από το Κέντρο Εργαστήριο ζώων του Ιατρικού Πανεπιστημίου της Νότιας. Οι ποντικοί στεγάστηκαν κάτω από συνθήκες χωρίς παθογόνα σε 12 ώρες σκοτάδι /κύκλο φωτός και

κατά βούληση

πρόσβαση σε τροφή και φιλτραρισμένο νερό. Ζώων που χρησιμοποιούνται για πειραματικούς έλαβαν ανθρώπινη φροντίδα. Για τη δοκιμασία ανάπτυξης όγκου, συνολικά 2 × 10

6 κύτταρα SW480 με σταθερή υπερέκφραση miR-31, ή κύτταρα ελέγχου, εγχύθηκαν υποδορίως σε πλευρό των ποντικών αριστερά και δεξιά (η = 6 ανά ομάδα). Στη συνέχεια, ο φθορισμός που εκπέμπεται από τα κύτταρα συλλέχθηκε και εικόνες αναλύθηκαν μέσω ενός συστήματος απεικόνισης GFP σε ολόκληρο το σώμα (Lighttools, Encinitas, CA) που θα μπορούσαν να απεικονίσει την ανάπτυξη του όγκου σε πραγματικό χρόνο. Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε με τη χρήση ψηφιακών παχύμετρο κάθε τρεις ημέρες. Μετά από 30 ημέρες παρακολούθησης, τα ποντίκια θυσιάστηκαν με αυχενική εξάρθρωση και οι όγκοι ανατμήθηκαν. Ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε ως εξής:. Όγκος = (D × d

2) /2, όπου D σήμαινε την μεγαλύτερη διάμετρο και δ σήμαινε τη μικρότερη διάμετρο

Για την ίδρυση μεταστατικό μοντέλο, τυφλό έντερο ποντικού εξωτερικεύεται με λαπαροτομία υπό αναισθησία πεντοβαρβιτάλης νατρίου (6mg /100g σωματικού βάρους). Τα υποδόρια όγκοι κύβους σε 1 mm

3 κύβους και εμφυτεύεται στην μεσεντέριο στο τυφλό έντερο άκρο των ποντικών. Στη συνέχεια, το έντερο επεστράφη στην κοιλιακή κοιλότητα και έκλεισε με χειρουργικές γάζες. μαξιλάρια θέρμανσης χρησιμοποιήθηκαν για να βοηθήσει μετεγχειρητικής αποκατάστασης για ποντίκια μετά από ξενομοσχεύματα την εμφύτευση. την κατάσταση της υγείας των ζώων παρακολουθήθηκε μετά την επέμβαση καθημερινά, συμπεριλαμβανομένης της φυσικής τους δραστηριότητας, ενυδάτωση, το φαγητό και τις συνήθειες κατανάλωσης οινοπνεύματος και βάδιση. Το σωματικό βάρος του ελέγχου και SW480 /miR-31 ποντίκια καταγράφηκε επίσης κάθε τρεις ημέρες. Τα τελικά σημεία ευθανασίας είχε προγραμματιστεί για το τέλος του πειράματος και ως μέσο για να ξαναζήσουμε τον πόνο ή δυσφορία. Ένα ολοκληρωμένο κριτήριο για την ανάγκη να ευθανασία πραγματοποιήθηκε στη μελέτη μας, συμπεριλαμβανομένης της φυσικής έλλειμμα, ασθένεια, αγωνία, την ακινησία, την απώλεια βάρους και το μέγιστο μέγεθος του όγκου. Όταν εμφανίστηκε εμφανής σωματική του ελλείμματος, όπως ξηρά ή θαμπά μάτια, κολλώδες τους βλεννογόνους, καμπούρα, τη μείωση βάδιση, αγνόησε παρατηρητή, δύσπνοια ή καχεξία, ποντίκια θεωρούνται ότι πληρούν τα κριτήρια της ευθανασίας και θυσιάστηκαν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία και την αγωνία. Στο τέλος του πειράματος (8 εβδομάδες), οι ακόμα ζωντανός ποντικοί θυσιάστηκαν με αυχενική εξάρθρωση. Τα όργανα αφαιρέθηκαν και σταθεροποιήθηκαν με 10% ουδέτερη ρυθμισμένη φορμαλίνη. Ακολούθως, αποκτήθηκαν και χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη-ηωσίνη (Η &? Ε) διαδοχικές τομές ιστών για την παρατήρηση των μεταστατικών οζιδίων των οργάνων κάτω από μικροσκόπιο. Όλες οι πειραματικές διαδικασίες πραγματοποιήθηκαν σε αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις στον Οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας των πειραμάτων σε ζώα του Ιατρικού Πανεπιστημίου της Νότιας. Όλα ελήφθησαν τα αναγκαία μέτρα για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία και την αγωνία στα ποντίκια.

κηλίδος Western ανάλυση

προϊόντα λύσης πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE γέλη 10% και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF (Amersham Pharmacia Biotech, NJ, USA). Η μεμβράνη ανιχνεύθηκε με τα ακόλουθα αντισώματα: anti-SATB2 (Abcam, Cambridge, UK), αντι-Ε-καδερίνης (Cell Signaling Technology, Inc), αντι-Ν-καντερίνης (Cell Signaling Technology), αντι-βιμεντίνης (κυτταρική σηματοδότηση Τεχνολογίας), και αντι-β-κατενίνης (Cell Signaling Technology). Τέλος, η μεμβράνη ανιχνεύτηκε με HRP (ραφανιδική υπεροξειδάση) -επισημασμένο ποντικού κατσίκας-IgG (Santa Cruz Biotechnology, USA) και ανιχνεύθηκαν με χημειοφωταύγεια. Ένας πολυκλωνικός αντι-β-ακτίνης αντίσωμα (Santa Cruz Biotechnology) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος πρωτεΐνη-φόρτωσης. Η ένταση των θραυσμάτων πρωτεΐνης ποσοτικοποιήθηκε με την ποσότητα Ένα λογισμικό (4.5.0 βασικό, Bio-Rad).

ανοσοϊστοχημεία (IHC)

Τα κομμάτια ιστού κόπηκαν σε τομές πάχους 4 μm και υποβάλλονται σε επεξεργασία για IHC σύμφωνα με μία προηγουμένως περιγραφείσα πρωτόκολλο [19].

Η στατιστική ανάλυση

Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του στατιστικού πακέτου λογισμικού SPSS 16.0. Σε τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα, τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως προς τις μέσες ± SEM. Οι διαφορές μεταξύ των μεταβλητών αξιολογήθηκαν από τα ακόλουθα τρία στατιστικά τεστ: χ

2 τεστ, το ακριβές τεστ του Fisher, ή One-way ANOVA. Για τους ασθενείς με διαφορετικά επίπεδα miR-31 έκφραση, καμπύλες επιβίωσης χαράχθηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Kaplan-Meier και συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας το τεστ log-rank. πολυπαραγοντική ανάλυση επιβίωσης πραγματοποιήθηκε σε όλες τις παραμέτρους που βρέθηκαν να είναι σημαντική στην μονοπαραγοντική ανάλυση με τη χρήση του μοντέλου παλινδρόμησης Cox. Ένα

σ

τιμή μικρότερη από 0,05 θεωρήθηκε ως στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

miR-31 ήταν πάνω ρυθμισμένα σε μεταστατικά κύτταρα CRC και ανθρώπινα πρωτογενή ιστούς CRC με λεμφαδένων μεταστάσεις

Εξετάσαμε πρώτα miR-31 έκφρασης από ένα στέλεχος-βρόχος ποσοτικής RT-PCR σε ένα πάνελ κυτταρικών γραμμών CRC και 31 ζεύγη CRC και γειτονικών μη-νεοπλαστικούς ιστούς βλεννογόνου. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι miR-31 ήταν αξιοσημείωτα τα πάνω ρυθμισμένη σε ιστούς CRC σε σύγκριση με παρακείμενες μη νεοπλασματικά φυσιολογικούς ιστούς (

σ

= 0,0004, Σχήμα 1Α). Παρατηρήθηκε ότι η αυξητική ρύθμιση του miR-31 σε δείγματα όγκων συσχετίστηκε με μετάσταση λεμφαδένων σε σημαντικό βαθμό (

σ

= 0,0045, Σχήμα 1Β). Σε ασθενείς με μεταστάσεις στους λεμφαδένες, η σχετική μέση έκφραση του miR-31 ήταν πάνω από 7,82 φορές υψηλότερη από ότι σε ασθενείς χωρίς μεταστάσεις (61.54 ± 16.68

vs

.7.87 ± 2,47). Επιπλέον, miR-31 ήταν χαμηλή σε SW480 και DLD-1 κύτταρα, τα οποία προέρχονται από πρωτογενείς όγκους, ενώ ήταν σχετικά υψηλή σε SW620, Lovo, M5 και SCP51 κύτταρα, τα οποία προέρχονται από μεταστατικές εστίες (Σχήμα 1C), ειδικά σε M5 και κυτταρικές σειρές SCP51, τα οποία έχουν υψηλού μεταστατικού δυναμικού μεταξύ των κυτταρικών σειρών CRC. Η ένωση αυτή έδειξε ότι το miR-31 θα μπορούσε κάλλιστα να έχει κεντρικό ρόλο στην CRC μετάσταση.

(Α) Τα επίπεδα έκφρασης του ώριμου miR-31 σε ζεύγη CRC και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών. (Β) Η έκφραση του miR-31 σε ιστούς CRC με ή χωρίς μεταστάσεις σε σχέση με ταιριάζει-φυσιολογικούς ιστούς. nmCRC δηλώνει CRC ιστούς χωρίς μεταστάσεις? mCRC δηλώνει CRC ιστούς με μεταστάσεις στους λεμφαδένες. (Γ) έκφραση του miR-31 σε κυτταρικές σειρές CRC και υποκλώνους. miRNA αφθονία ομαλοποιήθηκε με U6 RNA. (Δ) Η ανάλυση έκφρασης του miR-31 στην κανονική του παχέος βλεννογόνο και τους ιστούς CRC από

στο

situ υβριδισμού

. (Α) αρνητική έκφραση του miR-31 στην κανονική του παχέος βλεννογόνο? (Β) Η χαμηλή έκφραση του miR-31 σε ιστούς CRC? (C, d) Υψηλή έκφραση του miR-31 σε ιστούς CRC? (Ε) αρνητικός μάρτυρας? (Στ) ανάλυση Kaplan-Meier για την επιβίωση των ασθενών με CRC σύμφωνα με miR-31 έκφρασης. Σύνδεση Rank = 6.682,

σ

= 0,010.

Η

Η υπερέκφραση του miR-31 συνδέθηκε με μια επιθετική φαινότυπο και κακή πρόγνωση των ασθενών με CRC

Για να διερευνήσουν περαιτέρω το κλινικοπαθολογοανατομικών και προγνωστική σημασία του miR-31 επίπεδα, μετρήσαμε miR-31 έκφρασης σε μια μεγάλη ομάδα 143 αρχειοθετούνται παραφίνη-ενσωματωμένες CRC και φυσιολογικούς ιστούς του παχέος εντέρου χρησιμοποιώντας ISH. Παρατηρήσαμε ότι 75/143 (52.45%) CRCs είχαν έκφραση υψηλού επιπέδου miR-31, ενώ 11/55 (20%) των φυσιολογικών ιστών του βλεννογόνου είχε έκφραση υψηλού επιπέδου του miR-31 (

σ

& lt? 0.001). Η ανάλυση συσχέτισης μεταξύ κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά και miR-31 επίπεδο έδειξαν έκφραση υψηλού επιπέδου του miR-31 συσχετίστηκε σημαντικά με την T-στάδιο (

σ

= 0,045), μετάσταση λεμφαδένα (

p

= 0.001), και μακρινή μετάσταση (

σ

= 0.026) σε ασθενείς με CRC, ωστόσο, δεν σχετίζονται με την ηλικία, το φύλο, θέση του όγκου, το μέγεθος του όγκου, και το βαθμό διαφοροποίησης του όγκου (

p

& gt?. 0.05, Πίνακας 1)

Χαρακτηριστικά

n

miR-31 έκφρασης

Η χαμηλή (%)

υψηλή (%)

P

αξία

Φύλο Male8739 (44.83) 48 (55.17) 0.416 Female5629 (51.79) 27 (48.21) Ηλικία (χρόνια) & lt? 506,535 (53.85) 30 (46.15) 0.169 ≥507833 (42.31) 45 (57.69) Tumor ιστοσελίδα εγγύς colon4220 (47.62) 22 (52.38) 0.369 Περιφερική colon3721 (56.76) 16 (43.24) Rectum6427 (42.19) 37 (57.81) το μέγεθος του όγκου (εκατοστά σε διάμετρο) & lt? 54519 (42.22) 26 (57.78) 0.387 ≥59849 (50.00 ) 49 (50.00), η διαφοροποίηση του όγκου Good136 (46.15) 7 (53,85) 0,979 Moderate10450 (48.08) 54 (51.92) Poor2612 (46.15) 14 (53.85) T-stage1-22316 (69.57) 7 (30.43) 0.045 38.740 (45.98) 47 (54,02) 43.312 (36.37) 21 (63,63) Ν-stage05938 (64.41) 21 (35.59) 0.001 1 έως 28430 (35.71) 54 (64,29) Distant metastasis09451 (54.26) 43 (45.74) 0.026 14.917 (34.69) 32 (65.31) Πίνακας 1. συσχέτιση μεταξύ των κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά και την έκφραση του miR-31.

CSV Λήψη CSV

για να αξιολογηθεί η προγνωστική αξία του miR-31 για CRCs, αναλύσαμε τη συσχέτιση μεταξύ miR-31 έκφρασης και της διάρκειας επιβίωσης με τη χρήση Kaplan -Meier ανάλυση με τη δοκιμασία log-rank. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι η έκφραση υψηλού επιπέδου του miR-31 συσχετίστηκε με σύντομο χρόνο επιβίωσης των ασθενών με CRC (51,85 ± 3,78

vs

.76.64 ± 4,30,

σ

= 0,010, σχήμα 1Δ ). Επιπλέον, πολυπαραγοντική ανάλυση παλινδρόμησης Cox έδειξε ότι η έκφραση υψηλού επιπέδου του miR-31 είναι ένας ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας για την κακή επιβίωση των ασθενών με CRC (Πίνακας 2).

Μεταβλητές

μονοπαραγοντική ανάλυση

πολυπαραγοντική ανάλυση

P

αξία

HR

95% διάστημα εμπιστοσύνης

P

αξία

HR

95% διάστημα εμπιστοσύνης

Gender0.516 0.826 0.464-1.471Age0.391 0.785 0.451-1.366Tumor site0.915 0,982 0.707-1.365Tumor size0.581 1.190 0.642-2.207Tumor differentiation0.074 1.648 0.953-2.850T-stage0.001 2,262 1.419-3.6060.032 1,695 1.045-2.750 Ν-stage0.041 1.563 0.846-2.7280.604 0,847 0.453-1.586M σταδίων & lt? 0.0014.338 2,441 έως 7,707 & lt? 0.0013.563 1.940-6.545miR-31 expression0.012 2.145 1.182-3.8900.048 1.877 1.007-3.488Table 2. η συνολική επιβίωση αναλύσεις με ανάλυση μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική COX παλινδρόμησης.

CSV Λήψη CSV

Exogenetic υπερ-έκφραση του miR-31 προωθείται CRC ανάπτυξη των κυττάρων, την εισβολή και τη μετανάστευση

in vitro

η

Για να διερευνήσουν τις δυνατότητες βιολογική λειτουργία του miR-31 στο CRC ογκογένεση και την εξέλιξη, SW480 και κύτταρα DLD-1 μολύνθηκαν με PLV-miR-31 ή PLV-con, αντίστοιχα. Αυτό έγινε για να δημιουργήσει δύο σταθερές κυτταρικές σειρές miR-31-υπερέκφραση και δύο εικονικές κυτταρικές σειρές (miR-con). Μια αυξημένη έκφραση του miR-31 κατά τη μόλυνση σε δύο κυτταρικές σειρές επιβεβαιώθηκε με πραγματικού χρόνου RT-PCR (Σχήμα 2Α). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Β-2D, η υπερ-έκφραση του miR-31 αυξημένο πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και την ικανότητά του να σχηματίζει αποικίες από ότι στα mock κύτταρα και άγριου τύπου μη-μολυσμένα κύτταρα (

ρ

& lt? 0.001 ). Κυτταρομετρία ροής και την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου αποκάλυψαν μια σημαντική μείωση στο ποσοστό των κυττάρων στη φάση G1 /Ο0 (

σ

= 0,004 σε SW480

, σ

= 0,008 σε DLD1) και αύξηση των S φάση των κυττάρων CRC που έλαβαν θεραπεία με miR-31 (

p = 0,002

στο SW480

, p = 0.001

στο DLD1, Σχήμα 2Ε).

(Α) σε πραγματικό χρόνο ανάλυση RT-PCR του miR-31 επίπεδο έκφρασης σε SW480 και κύτταρα DLD-1 μετά από έκτοπη υπερέκφραση του miR-31. (B, C) Επίδραση της miR-31 επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων μετρήθηκε με CCK-8 δοκιμασίας. (D) Σύγκριση αποικίας αποτέλεσμα σχηματισμό των κυτταρικών γραμμών CRC. (Ε) διανομή του κυτταρικού κύκλου των κυττάρων CRC μολυνθεί με miR-31 ανιχνεύθηκε με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. (F, G) Επίδραση της miR-31 έκτοπη υπερέκφραση σε κυτταρικές motilities και διεισδυτικότητα προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας την επούλωση των πληγών (F) και matrigel εισβολή (G) δοκιμασίες. Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± SD. Τα αποτελέσματα ήταν επαναλήψιμα σε τρία ανεξάρτητα πειράματα. *

σ

& lt? 0.05, **

σ

& lt?. 0.001

Η

Μετά την παρατήρηση του miR-31-μεσολάβηση αύξησης της χώρας την ανάπτυξη, την επίδραση των miR-31 για τα χωροκατακτητικά ικανότητα των κυττάρων CRC χαρακτηρίζεται από η επούλωση πληγών και Matrigel εισβολή δοκιμασίας. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι exogenetic έκφραση του miR-31 σε κύτταρα CRC προκάλεσε σημαντική αύξηση στην κυτταρική μετανάστευση χρησιμοποιώντας δοκιμασία επούλωση της πληγής (

σ

= 0,001 σε SW480

, σ

& lt? 0.001 σε DLD1, Σχήμα 2F). δοκιμασία εισβολή Matrigel απεικονίζεται επίσης ότι η υπερ-έκφραση του miR-31 αξιοσημείωτα επαγόμενη διηθητικότητα των κυττάρων CRC (

ρ

& lt? 0.001 σε αμφότερα SW480 και DLD1, Σχήμα 2G). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η υπερ-έκφραση του miR-31 ήταν αρκετή για να προωθήσει τόσο την κυτταρική μετανάστευση και πολλαπλασιασμό

in vitro

.

miR-31 διευκολύνεται CRC ανάπτυξη καρκινικών κυττάρων και τη μετάσταση

in vivo

Η

Από το miR-31 προάγει την ανάπτυξη, τη μετανάστευση και την εισβολή των κυττάρων CRC

in vitro

, θα μπει στον πειρασμό να καθοριστεί αν miR-31 θα μπορούσε να διευκολύνει την ανάπτυξη του όγκου και των μεταστάσεων

in vivo

. Για το σκοπό αυτό, SW480 κυττάρων με σταθερή υπερέκφραση miR-31 (SW480 /miR-31) και τα κύτταρα ελέγχου (SW480 /miR-con) υποδορίως εμβολιάσθηκαν σε γυμνούς ποντικούς. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, η ταχύτητα της ανάπτυξης του όγκου στην ομάδα SW480 /miR-31 ήταν σημαντική από εκείνη της ομάδας SW480 /miR-con (

ρ

& lt? 0,05, Σχήμα 3Α και 3Β). χρώση IHC έδειξε ότι οι όγκοι της ομάδας ελέγχου που εμφανίζεται πολύ χαμηλότερο δείκτη Ki-67 από εκείνη της ομάδας miR-31 υπερ-έκφραση (Σχήμα 3Β).

(Α) Εξωτερικού εικόνες φθορισμού ολόκληρου του σώματος των SW480 /miR -31 και SW480 /miR-con ποντικούς και οι όγκοι (άνω) και οι εικόνες του υποδόριου όγκου ποντικών (κατώτερο) ελήφθησαν. Τα βέλη δείχνουν υποδόρια καρκίνους. (Β) Αντιπροσωπευτικές φωτογραφίες του Η &? Ε και ανοσοϊστοχημική χρώση για Ki-67 αντίσωμα πρωτογενούς καρκινικών ιστών (άνω) και η καμπύλη αύξησης του όγκου του όγκου (κατώτερο). Κάθε σημείο δεδομένων αντιπροσωπεύει το μέσο ± SD. (Γ) Οι εικόνες σε ολόκληρο το σώμα της μετάστασης σε ποντικούς. Ρ υποδηλώνει πρωτογενούς όγκου. Λευκή βέλη δείχνουν προς τα μεταστατικά οζίδια. (Ε) Η ιστολογική εικόνες των μεταστατικών οζιδίων σε όργανα. Ξενομοσχεύματος όγκων με miR-31-υπερέκφραση σχηματίζονται σημαντικά την εισβολή του τυφλού εντέρου τοιχώματος (α, β), σπορά μετάσταση του κόλου (γ), το τοίχωμα του στομάχου (δ), κοιλιακό τοίχωμα (ε) και του διαφράγματος (στ), και μετάσταση της λέμφου κόμβο (g), το ήπαρ (η) και του πνεύμονα (Ι). (Ε) Η συχνότητα της μετάστασης σε ποντίκια που εμφυτεύονται με SW480 /miR-31 ή miR-con κύτταρα. (F) Επιβίωση ανάλυση των SW480 /miR-31 και SW480 /miR-con ποντίκια.

Η

Για να μιμούνται την ανθρώπινη CRC και να αξιολογεί την

in vivo

επίδραση του miR-31 σε μετάσταση του CRC, SW480 /miR-31 και κύτταρα /miR-con SW480 ήταν orthotropically εμφυτεύθηκαν σε τυφλό άκρο των ατόμων. Μεταξύ 4 και 8 εβδομάδες μετά την εμφύτευση ξενομοσχευμάτων, 4/6 πειραματικά ποντίκια και 1/6 ποντίκια ελέγχου είχαν εμφανή σωματική έλλειμμα λόγω της αυξημένης επιβάρυνσης του όγκου. Δεδομένου ότι πληρούν το κριτήριο της μη βάναυσης τελικού σημείου, αυτά τα ποντίκια θυσιάστηκαν για να απαλύνει τον πόνο και την αγωνία. Τα υπόλοιπα ζωντανά ποντίκια θυσιάστηκαν στο τέλος του πειράματος (8 εβδομάδες). Τα αποτελέσματα του πειράματος σε ζώα έδειξαν ότι τα κύτταρα SW480 miR-31-υπερέκφραση παρουσίασαν δραματική μετάσταση στο ήπαρ και την περιτοναϊκή κοιλότητα, ενώ SW480 κύτταρα /miR-con προκαλείται μόνο αυξήσεις του όγκου χωρίς μετάσταση (Σχήμα 3C). Η &? Ε χρώση έδειξε σαφώς εισβολή στο εντερικό τοίχωμα και μετάσταση του στομάχου, του διαφράγματος, κοιλιακό τοίχωμα, το ήπαρ, λεμφαδένα, και πνεύμονα σε SW480 /miR-31cells ομάδες (

ρ

& lt? 0,05, Σχήμα 3D και 3Ε ). Επιπλέον, αποκαλύφθηκε ότι miR-31 υπερέκφραση οδήγησε σε μικρότερο συνολικό χρόνο επιβίωσης των ζώων (

ρ

& lt? 0,05, Σχήμα 3F)

Αναστολή της miR-31 μειώνεται. η ανάπτυξη, εισβολή, και τη μετανάστευση των κυττάρων CRC

in vitro

η

για να επιβεβαιώσετε τα αποτελέσματα του miR-31 για τη διαμόρφωση των κακοήθων φαινοτύπων των κυττάρων CRC, ερευνήσαμε επίσης την αλλαγή της επιθετικής φαινοτύπων κύτταρα CRC μετά από μειωμένη έκφραση του miR-31. miR-31-ειδικά επιμόλυνση αναστολέα χρησιμοποιήθηκε για να αναστείλει miR-31 έκφρασης στην M5 και SW620 κύτταρα, τα οποία είχαν υψηλή ενδογενή έκφραση του miR-31. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 4Α, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου, ένα σημαντικά βραδύτερο ρυθμό πολλαπλασιασμού παρατηρήθηκε σε miR-31 αναστολέα-επιμολυσμένα κύτταρα (

ρ

& lt? 0.001). Επιπλέον, Matrigel εισβολή και προσδιορισμούς επούλωση πληγών επιβεβαίωσε ότι η αναστολή της miR-31 έκφραση μείωσε την διεισδυτικότητα και τη μετανάστευση των M5 και SW620 κύτταρα, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (

ρ

& lt? 0,05, Σχήμα 4Β και 4C ).

(Α) Αναστολή της miR-31 ανέστειλε κυτταρικό πολλαπλασιασμό των Μ5 και SW620 κυττάρων με δοκιμασία CCK8. (B, C) Αναστολή της miR-31 μειώνεται κύτταρο διεισδυτικότητα και τη μετανάστευση, όπως καθορίζεται από θάλαμος matrigel εισβολή (Β) και επούλωσης τραυμάτων δοκιμασίες (C). Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± SD. Τα αποτελέσματα ήταν επαναλήψιμα σε τρία ανεξάρτητα πειράματα. *

σ

& lt? *

σ

& lt? β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.