Αφηρημένο

Αύξηση του μεταβολισμού αποτελεί προϋπόθεση για τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων. Για να κατανοήσουμε την εξάρτηση των κυττάρων του όγκου στο μεταβολισμό των λιπαρών οξέων, αξιολογήσαμε διάφορους κόμβους του μονοπατιού της σύνθεσης των λιπαρών οξέων. Χρησιμοποιώντας RNAi αποδείξαμε ότι η εξάντληση των λιπαρών οξέων μονοπάτι σύνθεσης ένζυμα SCD 1, FASN, ή ACC1 σε HCT116 κύτταρα καρκίνου κόλου αποτελέσματα σε κυτταροτοξικότητα η οποία είναι αναστρέψιμη με προσθήκη εξωγενούς λιπαρών οξέων. Αυτό εξαρτάται από φαινότυπος είναι πιο έντονο όταν SCD 1 είναι εξαντλημένο. Χρησιμοποιήσαμε αυτό το λιπαρό οξύ στρατηγική διάσωσης για να χαρακτηρίσει διάφορους αναστολείς μικρού μορίου της σύνθεσης λιπαρών οξέων, συμπεριλαμβανομένου του προσδιορισμού των TOFA ως ένας ισχυρός αναστολέας της SCD 1, που αντιπροσωπεύει μια προηγουμένως undescribed δραστικότητα για αυτή την ένωση. αναστολείς FASN αναφοράς και ACC δείχνουν κυτταροτοξικότητα που είναι λιγότερο έντονη από εκείνη των TOFA, και προφίλ διάσωσης λιπαρών οξέων συμφωνεί με την προτεινόμενη τους στόχους του ενζύμου. Δύο αναστολείς αναφορά SCD1 δείχνουν χαμηλή νανομοριακή κυτταροτοξικότητα που αντισταθμίζεται από τουλάχιστον δύο τάξεις μεγέθους από εξωγενείς ελαϊκό. Ένας από αυτούς τους αναστολείς επιβραδύνει την ανάπτυξη των όγκων HCT116 ξενομοσχεύματος. Τα δεδομένα μας περιγράψει μια αποτελεσματική στρατηγική για την υποβολή ερωτήσεων σε μηχανισμό δραστικότητα και οδός-κόμβο-εξειδίκευση των αναστολέων της σύνθεσης των λιπαρών οξέων, τη δημιουργία μια σαφή σχέση μεταξύ της σύνθεσης των λιπαρών οξέων και την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων, και το σημείο προς SCD 1 ως βασικό στόχο σε αυτό το μονοπάτι.

Παράθεση: Mason P, Liang Β, Li L, Fremgen Τ, Murphy Ε, Quinn A, et al. (2012) SCD 1 Αναστολή προκαλεί θάνατο των καρκινικών κυττάρων με τη μείωση μονο-ακόρεστα λιπαρά οξέα. PLoS ONE 7 (3): e33823. doi: 10.1371 /journal.pone.0033823

Επιμέλεια: Irina V. Λεμπέντεβα, Enzo Life Sciences, Inc., Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 13, Οκτώβρη 2011? Αποδεκτές: 17 Φεβρουαρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 22 Μαρτίου 2012

Copyright: © 2012 Mason et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς είναι υπάλληλοι της Genzyme Corporation. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Το λιπαρό οξύ περιεχόμενο των κυττάρων στο σώμα προέρχεται από τη διατροφή και από

de novo

σύνθεσης. Ταχέως-πολλαπλασιαζόμενα καρκινικά κύτταρα συχνά έχουν ένα ισχυρό πρόγραμμα σύνθεσης λιπαρού οξέος συνοδεύεται από υψηλού επιπέδου έκφραση των γονιδίων που σχετίζονται όπως λιπαρών οξέων συνθάσης [1]. Λόγω της σχετικής αφθονίας της στα καρκινικά κύτταρα, λιπαρά οξέα συνθάσης έχει επιδιωχθεί ως στόχο ογκολογία [2]. Ωστόσο, δεν είναι σαφές αν λιπαρών οξέων συνθάσης αντιπροσωπεύει το περιοριστικό του ρυθμού συστατικό στην οδό σύνθεσης λιπαρών οξέων.

μακράς αλύσου λιπαρά οξέα είναι ζωτικής σημασίας για την απαίτηση ταχεία σύνθεση μεμβράνης σε έντονα αναπτυσσόμενα κύτταρα και παίζουν βασικούς ρόλους σε διάφορα συστήματα σηματοδότησης [3]. Επιπλέον, μία κατάλληλη ισορροπία αλυσίδας μήκη και βαθμός κορεσμού είναι κρίσιμη για τη διατήρηση της ρευστότητας της μεμβράνης και καμπυλότητα [4]. Έχει αναφερθεί ότι η αναστολή διαφόρων σταδίων στην οδό σύνθεσης λιπαρών οξέων προκαλεί την αναστολή της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων, είτε λόγω της ανεπάρκειας σε κατάντη λιπαρά οξέα

per se

, είτε λόγω συσσώρευση τοξικών ενδιάμεσων οδού όπως μηλονυλο-ΟοΑ, ή και τα δύο. [5]

Χρησιμοποιώντας έναν συνδυασμό siRNA και αναστολέων μικρών μορίων, σε συνδυασμό με μια στρατηγική «λιπαρό οξύ συμπληρώσεως», έχουμε εντοπίσει στεαροϋλ-ΟοΑ 1 ως ένα ένζυμο στο λιπώδη οξύ οδό σύνθεσης που είναι απαραίτητη για τη βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων. Η στρατηγική «συμπληρώσεως» επιτρέπεται χαρακτηρισμός των δύο SCD 1, καθώς και την εξειδίκευση των διαφόρων αναστολέων σύνθεσης λιπαρού οξέος, και διευκρινίζει το μηχανισμό με τον οποίο η αναστολή της SCD 1. περιορίζει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων. Τα δεδομένα μας σκιαγραφήσει μια σαφή σχέση μεταξύ της σύνθεσης των λιπαρών οξέων και την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων.

Αποτελέσματα

Τα καρκινικά κύτταρα είναι ευαίσθητα σε απώλεια της SCD1 λειτουργίας

Για να εξεταστεί η επίδραση της διακοπής του τη σύνθεση λιπαρών οξέων στη βιωσιμότητα καρκινικών κυττάρων, χρησιμοποιήσαμε πισίνες siRNA να καταστρέφουν τρία κόμβους στο μονοπάτι για τη σύνθεση των λιπαρών οξέων μακράς αλυσίδας (Εικόνα 1Α). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Β, εξάντληση του ακετυλ-ΟοΑ καρβοξυλάση (ACC1), συνθάσης λιπαρού οξέος (FASN), ή στεαροϋλ-ΟοΑ (SCD1) οδηγεί σε μειωμένη βιωσιμότητα (ή κυτταρικό μεταβολισμό) (όπως μετράται με κυτταρικά επίπεδα ΑΤΡ χρησιμοποιώντας κύτταρον ο τίτλος Glo) σε HCT116 κύτταρα καρκίνου κόλου, κατά 30%, 30%, και 70%, αντίστοιχα, έναντι ενός μη-στόχευσης ελέγχου siRNA, η οποία ορίζεται ως 100% βιωσιμότητα σε κάθε περίπτωση, το mRNA knockdown προσδιορίστηκε με πραγματικού χρόνου RT -PCR να είναι περίπου 80% (δεν φαίνεται). Σκεφθήκαμε ότι εάν τα αυτό κυτταροτοξικότητα είναι πραγματικά γονίδιο-συνδεδεμένο και on-στόχου, και εάν η διακοπή των αποτελεσμάτων μονοπάτι σύνθεσης λιπαρού οξέος σε μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων λόγω της ανεπάρκειας σε κατάντη λιπαρά οξέα σε αντίθεση με συσσώρευση των τοξικών ενδιάμεσων μονοπατιού, τότε κυτταροτοξικότητα που προκαλείται με εξάντληση των διαφόρων κόμβων οδού θα πρέπει να είναι δυνάμενο να αποδεσμευθεί, ή να προληφθούν, με την προσθήκη εξωγενών λιπαρών οξέων κατάντη αυτού του κόμβου. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Β, εξάντληση ACC1 και εξάντληση FASN είναι δυνάμενο να αποδεσμευθεί από παλμιτικό, στεατικό, και ελαϊκό, τα οποία είναι όλα προς τα κάτω τόσο ACC1 και FASN. εξάντληση SCD1 δεν είναι δυνάμενο να αποδεσμευθεί με παλμιτικό ή στεατικό (που είναι ανάντη της SCD1), αλλά εξάντληση SCD1 σημαντικά διασωθεί από ελαϊκό (το οποίο είναι καθοδικά της SCD1). Μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων που προκαλείται από την εξάντληση των δύο βασικών γονιδίων των μη συνδεδεμένων μηχανισμού, PSMD14 και RNA πολυμεράση II (ροΙ II) δεν διασώζεται από οποιαδήποτε από τις θεραπείες λιπαρών οξέων. Αυτό υποδηλώνει ότι η μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων που προκαλείται από θεραπεία με αυτά τα siRNA είναι πραγματικά οφείλεται στην εξάντληση του γονιδίου στόχου, και ότι προκαλείται από μια ανεπάρκεια στη σύνθεση των λιπαρών οξέων, σε αντίθεση με μια συγκέντρωση των τοξικών ενδιάμεσων μονοπατιού στην κανονική κατάσταση καλλιέργεια .

Ένα

de novo

σύνθεση της μονο-ακόρεστα λιπαρά οξέα. Β καρκίνος κόλου HCT116 κύτταρα (ATCC) καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 (Cambrex) που περιέχει 2% FBS επιστρώθηκαν σε πυκνότητα 4000 κυττάρων ανά φρεάτιο σε 100 μέσα ενημέρωσης ul σε πλάκες 96-φρεατίων μορφομετατράπηκαν με πισίνες siRNA (Dharmacon, 50 ηΜ) στόχευσης τρεις κόμβοι λιπαρού οξέος-σύνθεση οδού, ή δύο άσχετα γονίδια επιβίωσης, χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen). 16 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 25 μΜ λιπαρά οξέα (Sigma, 100 × αποθέματα διαλύθηκε σε 10% MeOH /0.9% BSA /PBS) όπως υποδεικνύεται, και η βιωσιμότητα προσδιορίσθηκε 72 ώρες μετά την επιμόλυνση (Cell Titer Glo, Promega). Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως επί τοις εκατό βιωσιμότητα συναρτήσει κύτταρα επιμολυσμένα με ένα μη-στόχευσης ελέγχου siRNA (ορίζεται 100% βιωσιμότητα) κατεργάζεται με τον ίδιο λιπαρό οξύ. C DU145 καρκίνου του προστάτη, κύτταρα καρκίνου κόλου HCT116 κύτταρα, και ΜΙΑ PaCa2 παγκρεατικό καρκίνο κύτταρα (ATCC) καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 που περιείχε 2% FBS υποβλήθηκαν σε αγωγή με μονή siRNAs που στοχεύουν SCD1 ή PSMD14 (Dharmacon, 25 ηΜ), που ακολουθείται 16 ώρες αργότερα από θεραπεία με ελαϊκό όπως υποδεικνύεται. Η βιωσιμότητα προσδιορίσθηκε 72 ώρες μετά την επιμόλυνση. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως επί τοις εκατό βιωσιμότητα συναρτήσει κύτταρα επιμολυσμένα με ένα μη-στόχευσης ελέγχου siRNA (ορίζεται 100% βιωσιμότητα) κατεργάζεται με τον ίδιο λιπαρό οξύ. D HCT116 του κόλου καρκινικά κύτταρα επιστρώθηκαν σε πυκνότητα 1000 κυττάρων ανά φρεάτιο σε 25 media ul σε πλάκες 384-φρεατίων υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αναστολείς μικρού μορίου του ACC1 (CP640186, Pfizer), FASN (# 10V, Merck), ή SCD1 (# 7Ν, Abbott), σε μέσα που περιέχουν λιπαρά οξέα, όπως αναφέρεται, 72 ώρες πριν από την βιωσιμότητα προσδιορισμού. Inibitors συντέθηκαν σε Genzyme (Waltham, ΜΑ).

Η

Για να εξετάσει το πεδίο εφαρμογής της συμμετοχής της SCD 1 στην επιβίωση των καρκινικών κυττάρων, διάφορες καρκινικές κυτταρικές σειρές υποβλήθηκαν σε θεραπεία SCD 1 ή PSMD14 RNAi, και στις δύο περιπτώσεις, χρησιμοποιώντας ένα μόνο siRNA. Η βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων του προστάτη DU145, τα καρκινικά κύτταρα HCT116 του κόλου, και ΜΙΑ PaCa2 παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα είναι μειωμένη (σε σχέση με ένα μάρτυρα μη στόχευση siRNA) με εξάντληση και των δύο γονιδίων, όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Γ. Σε όλες τις περιπτώσεις, SCD1-εξάντληση μεσολάβηση κυτταροτοξικότητας είναι αποδεσμευθούν από τη συμπλήρωση των μέσων μαζικής ενημέρωσης με ελαϊκό, ενώ σε όλες τις περιπτώσεις εξάντλησης PSMD14 δεν είναι. Αυτό υποδηλώνει ότι μία ποικιλία καρκινικών κυττάρων εξαρτάται από

σύνθεση του μονο-ακόρεστα λιπαρά οξέα

για τη βιωσιμότητα των κυττάρων, και ότι SCD 1 είναι ένα κρίσιμο κόμβο στο μονοπάτι που μπορεί να είναι ένας κατάλληλος θεραπευτικός στόχος.

Η οδός σύνθεσης λιπαρού οξέος έχει μελετηθεί στο πλαίσιο τόσο της μεταβολικής νόσου [6] και του καρκίνου [7]. Συνεπώς, μια ποικιλία αναστολέων σύνθεσης λιπαρού οξέος είναι διαθέσιμες. Ξεκινήσαμε να χρησιμοποιήσουν τη στρατηγική λιπαρών οξέων διάσωσης με αρκετές τέτοιες ενώσεις, ως μέσο τόσο τον έλεγχο της υπόθεσης ότι τα λιπαρά σύνθεση οξύ, και δράσης SCD 1 ειδικότερα, είναι απαραίτητο για τη βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων, καθώς επίσης και με στόχο την καλύτερη κατανόηση οι ίδιοι οι εντός και εκτός μηχανισμό δραστηριότητες της σύνθεσης λιπαρών οξέων αναστολέων. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 1D, αναστολείς αναφοράς για ACC1 (Pfizer # CP640186 [8]), FASN (Merck # 10V [9]), και SCD 1 (Abbott # 7Ν [10]) όλα τα προφίλ κυτταροτοξικότητας και διάσωσης οθόνη συνεπής με την θέση μονοπάτι του στόχου. Τοξικότητα που οφείλεται στη ACC1 και FASN αναστολή διασωθεί από παλμιτικό, στεατικό, και ελαϊκό, ενώ η τοξικότητα που οφείλεται στην αναστολή της SCD 1 διασώζεται μόνο με ελαϊκό. Αξίζει επίσης να σημειωθεί ότι η ισχύς αυτών των αναστολέων αντανακλά την παρατήρηση με siRNA. Παρά το γεγονός ότι οι αναστολείς αναφοράς είναι συγκρίσιμη ισχύ σε βιοχημικούς προσδιορισμούς για τους αντίστοιχους στόχους τους, ACC1 και αναστολή FASN δώσει μια μέτρια μείωση της βιωσιμότητας, ενώ ο φαινότυπος με αναστολή της SCD 1. είναι πιο έντονη, γεγονός που υποδηλώνει την SCD 1 είναι μια ιδιαίτερα πολύτιμη, ίσως rate- περιορίζοντας κόμβος σε αυτό το μονοπάτι. Αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν επίσης ότι οι αναστολείς αναφοράς είναι απαλλαγμένες από την κυρίαρχη (μη δυνάμενο να αποδεσμευθεί) τοξικότητα off-μηχανισμός σε αυτό το κυτταρικό σύστημα. Τα κορεσμένα λιπαρά οξέα μακράς αλυσίδας που χρησιμοποιείται στο σενάριο διάσωσης μόνα τους παράγουν μια μέτρια μείωση της βιωσιμότητας στις συγκεντρώσεις που χρησιμοποιούνται. Είναι αξιοσημείωτο ότι αυτά τα κορεσμένα λιπαρά οξέα είναι συνεργιστική με τον αναστολέα SCD 1 (Σχήμα 1 D). Αυτό υποδηλώνει ότι, ενώ το μεγαλύτερο μέρος των επιπτώσεων βιωσιμότητας φαίνεται κατά την αναστολή της SCD 1 είναι λόγω της εξάντλησης των μονο-ακόρεστων λιπαρών οξέων, αναστολή της SCD 1 επίσης μειώνει την ικανότητα των κυττάρων να αμβλύνουν τις επιπτώσεις των μη φυσικών, εξωγενών κορεσμένα λιπαρά οξέα, ενδεχομένως δι «αποτοξίνωσης» να ελαϊκό ή παλμιτελαϊκό.

Αναστολέας δραστηριότητα διευκρίνιση με συμπληρωματικότητα

Δοκιμάσαμε τρεις εμπορικές ευρέως χρησιμοποιούμενο ιστορική αναστολείς της οδού σύνθεσης λιπαρών οξέων με τη χρήση της στρατηγικής «διάσωσης λιπαρό οξύ». Η κερουλενίνη και C75 είναι FASN αναστολείς [11], [12], και TOFA είναι ένας αναστολέας ACC1 [13]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, κερουλενίνη και C75 αμφότερα αναστέλλουν HCT116 βιωσιμότητα των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου, όπως αναμένεται. Ωστόσο, κανένα από αυτούς τους αναστολείς ανταποκρίνεται σε παλμιτικό, στεατικό, ή ελαϊκό, υποδηλώνοντας ότι και οι δύο από αυτούς τους αναστολείς έχουν κυρίαρχη, μη-μηχανισμός που βασίζεται κυτταροτοξικότητα σε αυτό το σύστημα των κυττάρων, και ότι η μείωση στην βιωσιμότητα των κυττάρων οδηγείται από αυτές τις ενώσεις είναι άσχετη με αναστολή λιπαρού οξέος σύνθεση.

Ένα κόλου HCT116 καρκινικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με μικρού μορίου αναστολείς FASN C75 και κερουλενίνη (Sigma), ή τον αναστολέα ACC TOFA (Sigma), σε μέσα που περιέχουν λιπαρά οξέα, όπως αναφέρεται, 72 ώρες πριν από τη βιωσιμότητα αποφασιστικότητα. κύτταρα HCT116 Β υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ελαϊκό σε διάφορους χρόνους σε σχέση με τον χρόνο προσθήκης TOFA. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε 72 ώρες μετά την αγωγή TOFA. κύτταρα HCT116 C υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ενώσεις σε μέσα που στερούνται ή που περιέχουν ελαϊκό, που ακολουθείται από προσδιορισμό της βιωσιμότητας μετά από 72 ώρες. D καρκίνος κόλου HCT116 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πυκνότητα 1 × 10

6 κύτταρα ανά 1 ml μέσου ανά φρεάτιο σε πλάκες 12-φρεατίων προ-επεξεργασμένο με TOFA για μία ώρα, ακολουθούμενη από 13C-Παλμιτική ή 13C-στεατικό ή 13C -οξικό (Sigma) θεραπεία για τέσσερις ώρες. Επισημασμένα λιπαρά οξέα και εστέρες εκχυλίζονται, σαπωνοποιούνται, και αναλύθηκαν με LC /MS /MS χρησιμοποιώντας είτε ένα διπλό τριπλό φασματόμετρο μάζας ΑΡΙ 5000 ή ΑΡΙ 4000 (ΑΒ Sciex, Forster City, CA) ενωτικό με ένα Agilent 1100 σύστημα HPLC (Agilent, Σάντα Claire, CA). διαχωρισμός LC πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Xbridge φαινυλ στήλη 2,1 × 100 mm (Waters, Milford, ΜΑ). Κινητή φάση Α αποτελείτο από 5 mM μυρμηκικού αμμωνίου σε απιονισμένο νερό. Κινητή φάση Β αποτελούνταν από 5 mM μυρμηκικό αμμώνιο σε μεθανόλη. Το ρυθμιστικό φόρτωσης δείγματος αποτελείτο από 30% ρυθμιστικό διάλυμα Α και 70% ρυθμιστικό διάλυμα Β Μία γραμμική κλίση χρησιμοποιήθηκε για τον διαχωρισμό (70% έως 100% Β σε 5 λεπτά). Τα δείγματα ιονισμένο με ESI στον τρόπο λειτουργίας αρνητικού ιόντος και ο χρόνος παραμονής για την MRM ήταν 75 ms.

Η

Σε αυτή τη δοκιμασία, η τοξικότητα TOFA διασώζεται αποτελεσματικά από ελαϊκό, αλλά όχι από παλμιτικό ή στεατικό (Εικόνα 2Α), αντίθετα με την προσδοκία για ένα συγκεκριμένο αναστολέα της ACC1. Αυτό το πρότυπο λιπαρών οξέων διάσωσης είναι συνεπής με TOFA αναστολή της SCD1. Εναλλακτικά, TOFA γνώμονα κυτταροτοξικότητα θα μπορούσε να είναι εντελώς εκτός στόχου (unrescuable με παλμιτικό ή στεατικό), και TOFA θα μπορούσε, κατ ‘αρχήν, σωματικά αλληλεπιδρούν με ελαϊκό στο μέσο καλλιέργειας έτσι ώστε ελαϊκό εμποδίζει απλά TOFA από την είσοδο στα κύτταρα. Για να ελεγχθεί αυτή η πιθανότητα, προσθέσαμε ελαϊκό σε διάφορους χρόνους σε σχέση με τον χρόνο προσθήκης TOFA, και μετρήθηκαν βιωσιμότητα σε όλες τις περιπτώσεις σε 72 ώρες μετά την κατεργασία TOFA. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Β, ελαϊκό προσθήκη μέχρι και 8 ώρες μετά την προσθήκη TOFA αποδίδει ένα βαθμό «διάσωσης» που δεν μπορεί να διακριθεί από την περίπτωση όπου ελαϊκό προστίθεται πριν από την προσθήκη TOFA. Σε αυτήν την περίπτωση, TOFA έχει ώρα να διαπερνούν το κύτταρο και αναστέλλουν το στόχο, πριν από την εισαγωγή του ελαϊκού. Αυτό έρχεται σε αντίθεση με το ελαϊκό απλά πρόληψη TOFA από την είσοδο στα κύτταρα. Όταν ελαϊκό προστίθεται 24 ώρες μετά προσθήκη TOFA, η αντιστροφή φαινότυπος είναι σημαντικά μειωμένη. Ως εκ τούτου, μεταξύ 8 και 24 ώρες μετά τη θεραπεία TOFA, τα κύτταρα πάει παρελθόν ένα «σημείο χωρίς επιστροφή», και να σταματήσει να ανταποκρίνεται σε ελαϊκό όταν προσδιορίστηκε για τη βιωσιμότητα σε 72 ώρες.

Επιπλέον θεωρήσαμε ότι το ελαϊκό μπορεί να είναι μια επιπόλαιο «κυτταροτοξικότητα-διάσωσης-agent.» Για να δοκιμάσει αυτή τη δυνατότητα, θα δοκιμαστεί μια ποικιλία κυτταροτοξικών ενώσεων στη δοκιμασία ελαϊκού-διάσωσης. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Γ μιας ποικιλίας αναστολείς διαφόρων μηχανισμών που δοκιμάστηκαν (συμπεριλαμβανομένων C75 και κερουλενίνη), μόνο TOFA καθοδηγείται κυτταροτοξικότητα είναι δυνάμενο να αποδεσμευθεί από ελαϊκό. Αυτό έρχεται σε αντίθεση με ελαϊκό ενεργεί ως γενική «διάσωσης-agent.»

Για να ελεγχθεί η υπόθεση ότι το «προφίλ διάσωσης λιπαρών οξέων» TOFA αντανακλά πραγματικά TOFA αναστολή της SCD 1, παρακολουθήσαμε τη μετατροπή σταθερών ισοτόπων-επισημασμένο λιπαρά οξέα με LC /MS /MS για προφίλ λιπαρών οξέων ροής απουσία ή παρουσία TOFA. Εξετάσαμε την SCD1 μεσολάβηση αποκορεσμό του 13C-παλμιτικό ή 13C-στεατικό να παλμιτελαϊκό ή ελαϊκό, αντίστοιχα, και η επιμήκυνση του 13C-παλμιτικό να στεατικό μετά από 1 ώρα έκθεσης TOFA. Επιπλέον, για τη μέτρηση της αναστολής ACC1, θα παρακολουθείται η ενσωμάτωση 13C-οξικό σε παλμιτικό. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Δ, TOFA αναστέλλει τόσο SCD1 μεσολάβηση συμβάντων αποκορεσμού σε μια ισχύ συγκρίσιμη με κύτταρο-βιωσιμότητας EC50 της, και συγκρίσιμη με την ισχύ της για ACC1. Αντίθετα, οι σημαντικά υψηλότερα επίπεδα TOFA που απαιτούνται για την πραγματοποίηση της (μη SCD1 με γνώμονα) την επιμήκυνση του παλμιτικού να στεατικό. Ως εκ τούτου, με βάση το προφίλ διάσωση λιπαρών οξέων και την άμεση μέτρηση της αναστολής SCD 1 σε ζωντανά κύτταρα, TOFA αναστέλλει SCD 1, η οποία είναι μια προηγουμένως undescribed δραστηριότητα για TOFA.

Στην περίπτωση των δύο TOFA και αναστολέα SCD 1 # 7Ν (Σχήματα 1D και 2Α), εξωγενείς παλμιτικό αυξάνει την επίδραση της αναστολής του SCD1. Πέρα από το γεγονός ότι σε αυτή τη ρύθμιση δοκιμασία παλμιτικό δείχνει κάποια εγγενή αναστολή κυτταρικής βιωσιμότητας, παλμιτικό επίσης αριστερά μετατοπίζει την EC50 για TOFA και # 7Ν, γεγονός που υποδηλώνει ότι ο συνδυασμός των αφύσικα αυξημένη παλμιτικό, και την αδυναμία για την επεξεργασία σε ελαϊκό, ενισχύει την αναστολή της βιωσιμότητας των καρκινικών κυττάρων.

ίχνη αναστολή κυτταρικής βιωσιμότητας του καρκίνου με αναστολέα της δραστικότητας και SCD 1 αντιπροσωπεύει τη μόνη ουσιαστική διαδρομή αποκορεσμού

Για να δοκιμαστεί η πίστη και η συσχέτιση των μελετών βιωσιμότητας λιπαρών οξέων-διάσωσης μας και την κυτταρική SCD1-αναστολή LC δοκιμασία /MS /MS, εξετάσαμε τρία μόρια αναστολέα SCD 1: TOFA, Abbott # 7Ν, και η Abbott # 28γ [14]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, # 7N είναι αρκετές φορές πιο ισχυρή από ό, τι TOFA, και περισσότερο ελαϊκό-δυνάμενο να αποδεσμευθεί, στη δοκιμασία κύτταρο-βιωσιμότητας, και παρομοίως είναι περισσότερο ισχυρή από ό, τι TOFA στην άμεση δοκιμασία κυτταρικής αναστολής SCD1. Ομοίως, # 28c είναι ουσιαστικά πιο ισχυρό από # 7Ν στην δοκιμασία αναστολής άμεση κυτταρική SCD1, και επίσης στην δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας, ενώ διατηρεί πλήρως ελαϊκό-rescuability.

HCT116 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία και αναλύθηκαν για την κυτταρική βιωσιμότητα ή κυτταρική αναστολή SCD 1 (LC /MS /MS), όπως περιγράφεται παραπάνω. Β HCT116 υποβλήθηκαν σε αγωγή με DMSO ή αναστολέα SCD 1 # 28c υπό την παρουσία διαφόρων λιπαρών οξέων (25 μΜ) (Biomol, # 2803) για 72 ώρες, και αναλύθηκαν για τη βιωσιμότητα των κυττάρων. Τα δεδομένα εμφανίζονται ως ένα συνεχές χάρτη θερμότητας από το πράσινο (ζωντανά κύτταρα) σε κόκκινο (νεκρά κύτταρα). κύτταρα HCT116 C υποβλήθηκαν σε επεξεργασία επί 36 ώρες με διάφορες δόσεις αναστολέων SCD 1 όπως υποδεικνύεται. Τα κύτταρα λύθηκαν σε χρωστική φόρτωσης LDS (Invitrogen) και αναλύθηκε με στύπωση western για διάσπαση PARP (Cell Signaling). Σταυροσπορίνη, ένας αναστολέας κινάσης ευρέος φάσματος, συμπεριλήφθηκε ως θετικός έλεγχος για διάσπαση PARP. κύτταρα HCT116 D υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως στο C, υπό την παρουσία ή απουσία εξωγενούς ελαϊκό, ακολουθούμενη από ανάλυση της διάσπασης PARP.

Η

Θεωρήσαμε ότι άλλα μη-κορεσμό γεγονότα μπορεί να είναι διαθέσιμα για την υποστήριξη βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων, μέσω δεσατουρασών πλην της SCD 1, αν τα κύτταρα δοθεί επαρκής παροχή κορεσμένου υποστρώματος. Για να διερευνηθεί αυτή η πιθανότητα, καθώς και για να χαρακτηριστεί περαιτέρω η ειδικότητα του # 28γ αναστολέα SCD 1 εξετάσαμε ένα πάνελ των λιπαρών οξέων διαφόρων μηκών αλύσου και καταστάσεις κορεσμού για την ικανότητά τους να «συμπληρώνει» (αποτρέπουν το αποτέλεσμα του) SCD1-inhibitor- μεσολάβηση μείωση της βιωσιμότητας. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Β, ενώ δεν είναι όλα τα ακόρεστα λιπαρά οξέα συμπληρώνονται, όλων των «συμπληρώνει» λιπαρά οξέα δεν περιέχουν τουλάχιστον ένα ακόρεστο δεσμό. Από την άλλη πλευρά, όλα τα κορεσμένα λιπαρά οξέα απέτυχαν να συμπληρώσουν, γεγονός που υποδηλώνει ότι ακορεστότητα είναι απολύτως απαραίτητη για συμπληρωματικότητα, και δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν οι εναλλακτικοί δραστηριότητες δεσατουράσης.

Εξετάσαμε TOFA, # 7Ν και # 28c για επαγωγή ο καταρράκτης απόπτωση. κύτταρα HCT116 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με την ένωση δόσεις ισοδύναμες με, ή δέκα φορές παραπάνω, cytotoxocity IC50 τους. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3C, και οι τρεις αναστολείς σύνθεσης λιπαρού οξέος επάγουν διάσπαση PARP με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, υποδεικνύοντας ότι η διακοπή του λιπαρού οξέος σύνθεση στα κύτταρα αυτά προκαλεί απόπτωση. Η επαγωγή της διάσπασης της ΡΑΚΡ συσχετίζεται με το κυτταρικό θάνατο από το ότι είναι αναστρέψιμη με εξωγενή ελαϊκό (Σχήμα 3D). διάσπαση PARP είναι ένας δείκτης της απόπτωσης [15].

αναστολή της SCD 1. επιβραδύνει την ανάπτυξη του όγκου και δεν είναι καθολικά τοξικό

Ο αντίκτυπος της εξάντλησης SCD 1 σε διάφορες κυτταρικές σειρές καρκίνου εγείρει την πιθανότητα ότι η αναστολή της SCD 1 θα να είναι καθολικά τοξικά. Δοκιμάσαμε την κυτταρική σειρά καρκίνου των ωοθηκών SKOV3 για ευαισθησία σε έναν αναστολέα SCD 1 αναφοράς. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α, ο αναστολέας της SCD 1 έχει περιορισμένη επίδραση στη βιωσιμότητα του κυττάρου SKOV3 έναντι HCT116, παρά το γεγονός ότι συγκρίσιμα ανασταλτική επίδραση στην κυτταρική μετατροπή στεατικού να ελαϊκού (δράσης SCD 1). Θεωρήσαμε ότι SKOV3 μπορεί να είναι γενικά επηρεάζεται από διάφορους τοξικούς παράγοντες. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 4Β, SKOV3 και HCT116 είναι συγκριτικά ευαίσθητα σε μία ποικιλία μηχανιστικά-διακριτές τοξικές ενώσεις, όπως διμεθυλσφιγγοσίνη και η δαουνορουβικίνη, ενώ στην περίπτωση των αναστολέων SCD 1, SKOV3 είναι αρκετά ευαίσθητη σε σχέση με HCT116. Αυτό υποδηλώνει ότι SKOV3 έχει κάποια συγκεκριμένη έλλειψη ευαισθησίας σε αναστολή λιπαρού οξέος-σύνθεση, και ότι η αναστολή της SCD 1 δεν θα είναι καθολικά τοξικά.

Ένα HCT116 ή κύτταρα SKOV3 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία και αναλύθηκαν για τη βιωσιμότητα των κυττάρων ή η αναστολή κυτταρικής SCD1 (LC /MS /MS), όπως περιγράφεται παραπάνω. Β HCT116 ή SKOV3 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία και αναλύθηκαν για τη βιωσιμότητα των κυττάρων. Πίνακας εκφράζει την αναλογία των SKOV3 EC50 έναντι HCT116 EC50. C, D Γυμνοί ποντικοί που φέρουν πέρασμα πέντε 200 mm3 όγκων HCT116 (ανακαλλιεργήθηκαν ως θραύσματα τροκάρ) (η = 10 ανά ομάδα) έλαβαν δόση από του στόματος καθετηριασμό δύο φορές την ημέρα με 160 mg /kg # 28γ για 20 ημέρες ή με ενδοφλέβια CPT11 σε τρεις διαδοχικές ημέρες ξεκινώντας όταν οι όγκοι έφθασαν 200 mm3. Η ανάπτυξη του όγκου (Γ) και το σωματικό βάρος (D) παρακολουθήθηκαν και σχεδιάστηκαν ως μέση τιμή +/- τυπική απόκλιση.

Η

αναστολέα SCD 1 # 28c περιγράφηκε πρόσφατα από την Abbott [14] ως ένα ισχυρό, orally- διαθέσιμο αναστολέα SCD 1 με ευνοϊκές φαρμακοκινητικές ιδιότητες. Ως εκ τούτου, το μόριο αυτό παρέχει ένα εργαλείο για

in vivo

SCD 1 επικύρωσης στόχο για τον καρκίνο. Εμείς αγωγή ποντικούς που φέρουν όγκους 200 mm3 HCT116 δύο φορές την ημέρα με # 28c από του στόματος καθετηριασμό (έναντι IV CPT11 επί μια βελτιστοποιημένη δοσολογικό σχήμα) για 20 ημέρες και παρακολουθείται η ανάπτυξη του όγκου και το σωματικό βάρος. Όπως και στην Εικόνα 4C, # 28c έδειξε μέτρια καθυστέρηση ανάπτυξης των όγκων HCT116. Ενώ ο αναστολέας της SCD 1 μείωσαν τη ελαϊκού περιεχομένου εκτομή όγκων (δεν φαίνεται), ουσιαστική ελαϊκό παρέμεινε στον ιστό του όγκου, αυξάνοντας την πιθανότητα ότι τα διαιτητικά ελαϊκό μπορεί να είναι περιοριστική για την αποτελεσματικότητα του αναστολέα SCD 1. Η θεραπεία με τον αναστολέα SCD 1 συνοδευόταν από την απώλεια βάρους που πλησιάζει το 20%, ή μείωση από 20 g έως περίπου 16 g, επί δοσολογία ημέρα 10 (ημέρα μελέτης 26) (Εικόνα 4D), που ανακτήθηκε μετά τη διακοπή της χορήγησης της δόσης (ημέρα μελέτης 36). Δεν είναι σαφές αν αυτή η απώλεια βάρους είναι on-μηχανισμό αυτού του αναστολέα (όπως θα ήταν αναμενόμενο από έναν αναστολέα της σύνθεσης των λιπιδίων), ή άσχετο με την αναστολή της SCD 1.

Συζήτηση

Τα καρκινικά κύτταρα είναι διακριτά από κακοήθη κύτταρα που βασίζεται εν μέρει σε μοναδική μεταβολική κατάσταση τους, ένα στοιχείο της οποίας είναι μια ασυνήθιστη απαίτηση για τη σύνθεση των λιπαρών οξέων [16]. Έτσι, το μονοπάτι της σύνθεσης λιπαρών οξέων υπήρξε ένας ελκυστικός στόχος καρκίνο για κάποιο χρονικό διάστημα, και τα πρωτογενή προσοχή έχει επικεντρωθεί επί της συνθετάσης λιπαρού οξέος, το οποίο σηματοδοτεί το σημείο της παραγωγής λιπαρών οξέων μακράς αλυσίδας [17]. Τα πειράματά μας και άλλοι [18] προτείνουν, εν τούτοις, ότι το στάδιο προσδιορισμού του ρυθμού στη σύνθεση του μονο-ακόρεστων λιπαρών οξέων είναι στο σημείο της απο-κορεσμού (με SCD1), και ότι SCD 1 αντιπροσωπεύει ένα ιδιαίτερα ευάλωτες κόμβος σε αυτό το μονοπάτι. Χρησιμοποιώντας και τα δύο siRNA και αναστολείς αναφοράς, έχουμε δείξει ότι η απώλεια των αποδόσεων δράσης SCD 1 προφέρεται βιωσιμότητα αναστολή διαφόρων καρκινικών κυττάρων

in vitro

. Το γεγονός ότι αυτή η αναστολή της βιωσιμότητας είναι αναστρέψιμη όταν ελαϊκό προστίθεται στο μέσο κυτταρικής καλλιέργειας υποστηρίζει ότι ο φαινότυπος είναι on-μηχανισμό, και αποδίδεται σε SCD 1-αναστολή με τη μεσολάβηση ανεπάρκεια ελαϊκό, σε αντίθεση με την συσσώρευση ενδοκυτταρικής παλμιτικού ή άλλων ανάντη οδού συστατικά. Προτείνουμε ότι αυτή η στρατηγική διάσωσης λιπαρών οξέων είναι ένα απλό, γενικά χρήσιμος μηχανισμός για τον χαρακτηρισμό της ειδικότητας αναστολέα σύνθεσης λιπαρών οξέων, όπως αποδεικνύεται από τον χαρακτηρισμό μας της ανασταλτικής δράσης SCD 1 του TOFA.

ανάπτυξη HCT116 όγκου καθυστερείται κατά κατεργασία με ένα ισχυρό, από του στόματος-διαθέσιμος αναστολέας αναφοράς SCD1. Ωστόσο, η καθυστέρηση της ανάπτυξης του όγκου είναι μέτρια, που υπάγονται σημαντικά μικρότερη από αυτή που παρατηρείται με CPT11, η οποία χρησίμευσε ως θετικός έλεγχος. Αξίζει να σημειωθεί, όμως, ότι μια βελτιστοποιημένη δοσολογικό σχήμα δεν ιδρύθηκε για τον αναστολέα SCD 1. καθυστέρηση ανάπτυξης όγκου συνοδευόταν από απώλεια βάρους, και μειωμένο σωματικό βάρος διατηρήθηκε καθ ‘όλη τη διάρκεια της χορήγησης. SCD1 αρχικά διερευνήθηκε ως στόχος για μεταβολικές διαταραχές, και δεν θα ήταν έκπληξη αν κάποιο τμήμα της παρατηρούμενης απώλειας βάρους οφειλόταν σε ευρεία αναστολή της

σύνθεση

λιπαρού οξέος μονο-ακόρεστα. Επιπροσθέτως, ενώ SCD1 knockout ποντίκια είναι βιώσιμα [19], τα ποντίκια έχουν πολλές ισομορφές SCD, η οποία μπορεί να είναι περιττή. Εάν η τοξικότητα (απώλεια βάρους) παρατηρήθηκε στην παρούσα μελέτη οφείλεται στην αναστολή της σύνθεσης λιπαρού οξέος, αυτό μπορεί να αποδοθεί στον αναστολέα SCD 1 στόχευσης SCD ισομορφές πολλαπλές ποντικού. Αυτό δεν έχει ελεγχθεί. Παρ ‘όλα αυτά, κατ’ αρχήν, αυτό θα διαφοροποιήσει το προφίλ τοξικότητας αναστολέα οδηγείται από την SCD 1. νοκ-άουτ γενετική. Εναλλακτικά, η απώλεια βάρους φαίνεται θα μπορούσε να είναι το καθαρό αποτέλεσμα της SCD 1-αναστολής με γνώμονα την μειωμένη παχυσαρκία και η αυξημένη ενεργειακή δαπάνη, συγκρίσιμη με εκείνη που παρατηρήθηκε στο νοκ-άουτ SCD 1 [19], [20].

Mono-ακόρεστα λιπαρά ωρίμανση και επεξεργασία οξύ, μετά από την παραγωγή από SCD1, είναι ένα πολύπλοκο δίκτυο που οδηγεί σε μια σειρά από διαφορετικά μήκη αλυσίδας, ο κορεσμός των κρατών, και υποκυτταρικές μοίρα διανομής. Μπορεί να είναι ότι ενώ SCD 1 αντιπροσωπεύει μία τελική, περιορισμού του ρυθμού «point-of-συστολής» στην οδό, μια προς τα κάτω στόχος ένζυμο, κατά μήκος ενός από μια ποικιλία από μονο-ακόρεστων λιπαρών οξέων επεξεργασίας υπο-μονοπάτια, μπορεί να αντιπροσωπεύει έναν κόμβο ότι απαιτείται ειδικά για τη βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων, και περιττό για την κανονική λειτουργία των κυττάρων. Μπορεί επίσης να είναι η περίπτωση ότι η αναστολή της SCD 1 θα μπορούσε να είναι παραγωγικοί σε ένα σενάριο συν-θεραπεία, σε χαμηλές δόσεις, σε συνδυασμό με ένα παραδοσιακό μέσο.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταροκαλλιέργεια

HCT116, DU145, και ΜΙΑ PaCa2 καρκινικά κύτταρα ελήφθησαν από την ATCC και διατηρήθηκαν σε RPMI1640 (Cambrex) συμπληρωμένο με Penn-strep (ATCC) και 5% FBS (Hyclone). Για τις δοκιμασίες, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI1640 που στερούνται Penn-strep και περιέχει 2% FBS σε πυκνότητα 4000 κυττάρων /100 μΙ /φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων για τη θεραπεία siRNA και προσδιορισμός της βιωσιμότητας, ή σε μια πυκνότητα 1000 κύτταρα /25 μΙ /φρεάτιο σε πλάκες 384 φρεατίων για την ένωση θεραπείας και προσδιορισμός της βιωσιμότητας, ή πυκνότητα 1 × 10

6 κύτταρα /1 ml /φρεάτιο σε πλάκες 12 φρεατίων για την ένωση θεραπείας και ανάλυση LC /MS /MS του επισημασμένου λιπαρών οξέων ροής . Όλα τα κύτταρα αναπτύχθηκαν ως μονοστιβάδα σε 95% αέρα /5% CO

2, και μία και μόνη παρτίδα των μη απολιπιδωμένο FBS χρησιμοποιήθηκε για όλα τα πειράματα

Λιπαρών Οξέων Παρασκευή

Λιπαρά οξέα (Sigma) διαλύθηκαν σε μεθανόλη σε μία συγκέντρωση 25 mM. 25 mM αποθέματα στη συνέχεια αραιώθηκαν δέκα φορές σε PBS (Cambrex) που περιέχει 0.9% BSA (A9576, Sigma). Αυτά τα 2.5 mM (100Χ) αποθέματα αναμειγνύονται καλά και επωάστηκαν σε υδατόλουτρο 37 μοιρών για μία ώρα πριν την καταμερισμού και κατάψυξη στους -20 βαθμούς. Ο πίνακας λιπαρό οξύ από την Biomol (# 2803) διαλύεται σε DMSO.

LC /MS /MS ανάλυση

Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν με τη χρήση ενός φασματογράφου μάζας τριπλού τετραπόλου API 5000 ή API 4000 ( AB /MDS Sciex, Concord, Καναδάς) και έναν Agilent 1100 HPLC αντλία (Agilent, Andover, ΜΑ). Στήλες ήταν Xbridge φαινυλ 2.1 x 100 mm (Waters, Milford, ΜΑ). Το ρυθμιστικό Α ήταν νερό με 5 mM μυρμηκικό αμμώνιο? ρυθμιστικό Β ήταν μεθανόλη 5 mM μυρμηκικό αμμώνιο? και ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης ήταν 30% ρυθμιστικό διάλυμα Α συν 70% ρυθμιστικό Β). Α 5-λεπτών βαθμίδα (70% έως 100% ρυθμιστικό Β, γραμμικό) χρησιμοποιήθηκε με το χρόνο κτήσης MRM 75 msec χρησιμοποιώντας αρνητικό τρόπο. Λιπαρά προσδιορισμοί σύνθεση οξύ εκφράστηκαν είτε ως προϊόν /(προϊόν + υπόστρωμα) (στην περίπτωση του στεατικού, παλμιτελαϊκό, ελαϊκό και σύνθεση), ή ως πρώτη προϊόν κανονικοποιημένη προς μη επισημασμένο λινελαϊκό οξύ (στην περίπτωση της σύνθεσης παλμιτικό).

siRNA επιμόλυνση

ON-Target-PLUS ή siRNAs απόθεμα siGENOME (ειδικά για το γονίδιο ή μη στόχευση των ελέγχων) αγοράστηκαν από Dharmacon, και επιμολυσμένα (50 nM (12,5 nM ανά κάθε μία από τις τέσσερις siRNAs) σε η περίπτωση του siRNA πισίνες (Smartpools), ή 25 ηΜ στην περίπτωση απλών siRNAs χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000. η SCD1 αλληλουχία ενιαίο siRNA ήταν:. 5′-GAACAGUGCUGCCCACCUC-3 ‘η αλληλουχία PSMD14 ενιαίο siRNA ήταν: 5’-GGCAUUAAUUCAUGGACUA-3 ». Δεκαέξι ώρες μετά την επιμόλυνση, 1/100

ου όγκου 100 × BSA-συμπλοκοποιημένο λιπαρό οξύ (παλμιτικό, στεατικό, ελαϊκό ή) (100Χ = 2.5 mM) ή έκδοχο μόνο προστέθηκε. Εβδομήντα δύο ώρες μετά την επιμόλυνση, 25 ul κυττάρων τίτλος Glo προστέθηκαν και οι πλάκες αναλύθηκαν για τη βιωσιμότητα των κυττάρων, σύμφωνα με τον κατασκευαστή (Promega) σύσταση. Όλες οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν εις διπλούν ή τριπλούν, σε πολλές περιπτώσεις με παρόμοια αποτελέσματα, και απεικονίζονται γραφικά ως η μέση τιμή ± SD από ένα ενιαίο αντιπροσωπευτικό πείραμα.

Μικρές-μόριο θεραπεία αναστολέα

C75, κερουλενίνη και TOFA αγοράστηκαν από τη Sigma. ACC αναστολέα CP640186 (Pfizer), FASN αναστολέα # 10V (Merck), και SCD 1 αναστολείς # 7Ν και # 28c (Abbott) συντέθηκαν σε Genzyme (Waltham, ΜΑ). Οι ενώσεις διαλύθηκαν σε DMSO και αποθηκεύτηκαν στους -20 βαθμούς. Στην περίπτωση των δύο BSA-συμπλοκοποιημένο λιπαρό οξύ (ή όχημα) και αναστολείς μικρού μορίου (ή DMSO), παράγοντες προ-αραιωμένο σε μέσο καλλιέργειας δοκιμασίας για 7 × τελική συγκέντρωση. 5 ul καθένας 7 × αποθέματα δύο κατάλληλων παραγόντων προστέθηκε σε 25 υΙ μέσου, για 35 ul τελικό όγκο. 72 έως 96 ώρες αργότερα, 7.3 ul κυττάρων τίτλος Glo προστέθηκε, και οι πλάκες αναλύθηκαν για τη βιωσιμότητα των κυττάρων. Όλες οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν εις διπλούν ή τριπλούν, σε πολλές περιπτώσεις με παρόμοια αποτελέσματα, και απεικονίζονται γραφικά ως η μέση τιμή ± SEM από ένα ενιαίο αντιπροσωπευτικό πείραμα.

HCT116 Ξενομοσχεύματος

Οι μελέτες σε ζώα (# GENZ100507- 20) διεξήχθησαν μετά την έγκριση της Genzyme Θεσμικών φροντίδα των ζώων και την Επιτροπή Χρήση (IACUC). όγκων HCT116 περάστηκαν ως θραύσματα τροκάρ στο

nu /nu

ποντίκια. Τα ζώα που έφεραν όγκους πέρασμα πέντε υπέστησαν αγωγή με # 28c (160 mg /kg δύο φορές ημερησίως από του στόματος χορήγηση για 20 ημέρες) ή CPT11 (άπαξ ημερησίως ενδοφλέβια χορήγηση για τρεις συνεχόμενες ημέρες), όταν οι όγκοι έφθασαν 200 mm3.