Αφηρημένο

L-ασπαραγινάση έχει χαμηλή νλουταμινάσης αποτέλεσε βασικό θεραπευτικό μέσο για τη θεραπεία της οξείας λευχαιμίας lymphpoblastic (A.L.L). Στην παρούσα μελέτη, ένα εξωκυτταρικό L-ασπαραγινάση με χαμηλή δραστηριότητα γλουταμινάσης, που παράγεται από

Bacillus licheniformis

καθαρίστηκε έως ομοιογένειας. Η πρωτεΐνη βρέθηκε να είναι ένα ομοτετραμερές από 134,8 KDa με μονομερείς μέγεθος των 33,7 KDa και πολύ συγκεκριμένες για το φυσικό υπόστρωμα του

δηλ.

L-ασπαραγίνη. Η δραστικότητα της καθαρισμένης L-ασπαραγινάση ενισχυμένη παρουσία κατιόντων, συμπεριλαμβανομένων Na

+ και Κ

+, ενώ ήταν μέτρια αναστέλλεται παρουσία δισθενών κατιόντων και αντιδραστήρια αποκλεισμού ομάδα θειόλης. Το καθαρισμένο ένζυμο ήταν μέγιστα ενεργό στην περιοχή των ρΗ 6.0 στο 10.0 και θερμοκρασία 40 ° C και το ένζυμο ήταν σταθερό μέγιστο σε ρΗ 9.0 και -20 ° C. CD φάσματα της L-ασπαραγινάσης προέβλεψε το ένζυμο να αποτελείται από 63.05% α- έλικας και 3,29% β-φύλλων στη φυσική του μορφή με Τ

222 58 ° C. φασματοσκοπία φθορισμού έδειξε την πρωτεΐνη να είναι σταθερό ακόμη και παρουσία περισσότερων από 3 Μ GdHCl. Κινητικές παράμετροι Κ

m, V

max και k

γάτα του καθαρού ενζύμου βρέθηκαν ως 1,4 × 10

-5 Μ, 4.03 IU και 2,68 × 10

3 s

– 1, αντίστοιχα. Το καθαρισμένο L-ασπαραγινάση είχε κυτταροτοξική δραστικότητα έναντι διαφόρων καρκινικές κυτταρικές σειρές

δηλ.

Jurkat κλώνος Ε6-1, MCF-7 και Κ-562 με IC

50 0.22 IU, 0.78 IU και 0.153 IU αντίστοιχα . Ωστόσο, το ένζυμο δεν είχε καμία τοξική επίδραση στα ανθρώπινα ερυθροκύτταρα και κυτταρικές σειρές CHO, ως εκ τούτου θα πρέπει να θεωρούνται εν δυνάμει υποψήφιες για περαιτέρω φαρμακευτική χρήση ως αντικαρκινικό φάρμακο

Παράθεση:. Mahajan RV, Kumar V, Rajendran V, Saran S, Ghosh PC, Saxena RK (2014) Καθαρισμός και χαρακτηρισμός ενός Μυθιστόρημα και ισχυρή L-ασπαραγινάση Έχοντας χαμηλής νλουταμινάσης Δραστηριότητα από

Bacillus licheniformis: In Vitro

Αξιολόγηση των Αντι-καρκινικές ιδιότητες. PLoS ONE 9 (6): e99037. doi: 10.1371 /journal.pone.0099037

Επιμέλεια: Philip C. Trackman, Boston University Goldman School of Dental Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 24 του Φλεβάρη του 2014? Αποδεκτές: 9 Μαΐου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 6 Ιουνίου, 2014

Copyright: © 2014 Mahajan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Ο συγγραφέας Richi V. Mahajan χάρη Συμβούλιο Επιστημονικής και Βιομηχανικής Έρευνας (CSIR), Νέο Δελχί, για την υποστήριξη υποτροφίας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, η συλλογή και ανάλυση δεδομένων, τα έξοδα εξοπλισμού πειραματισμού και των χημικών ουσιών, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

η αδυναμία των λευχαιμικών κυττάρων να συνθέσουν τη δική τους L-ασπαραγίνη έχει καταστήσει το ένζυμο L-ασπαραγινάση ένα βασικό στοιχείο της χημειοθεραπείας για τη θεραπεία της οξείας λεμφοβλαστικής λευχαιμίας (ALL) [1] , [2]. Αυτό το ένζυμο υδρολύει L-ασπαραγίνη σε L-ασπαρτικό οξύ και αμμωνία σε αγγειακό σύστημα του αίματος, καθιστώντας τα λευχαιμικά κύτταρα στερούνται ουσιωδών εξωγενούς L-ασπαραγίνη, οδηγώντας σε αναστολή της πρωτεϊνοσύνθεσης και της απόπτωσης [3] – [5], ως εκ τούτου καθιστώντας το ένζυμο αυτό ένα ισχυρό αντι-καρκινικών παράγοντα.

Η τρέχουσα εμπορική προμήθεια της L-ασπαραγινάσης είναι κυρίως προέρχονται από

Ε. coli

και

Erwinia chrysanthemi

αλλά το φάρμακο από τις πηγές αυτές είναι έντονα ανοσογόνα, ως εκ τούτου εξουδετέρωση των θεραπευτικών αποτελεσμάτων και προκαλεί συμπτώματα σε περισσότερο από το 50% των περιπτώσεων καρκίνου [6]. Επίσης, πολλές μελέτες έχουν παρατηρήσει την αύξηση του αριθμού των ασθενών με κλινική αντοχή στο τρέχον φάρμακο αγορά [6] – [8]. Η εμπορική L-ασπαραγινάση βρέθηκε να έχει

in vitro

αντίσταση έναντι των κυττάρων από ασθενείς με υποτροπιάζον A.L.L [9]. Ένα άλλο πρόβλημα που συνδέεται με τις εμπορικές L-asparaginases είναι χαμηλή εξειδίκευση υποστρώματος της και δραστηριότητα υψηλής γλουταμινάσης, η οποία μπορεί να προκαλέσει δυσλειτουργία του ήπατος, παγκρεατίτιδα, λευκοπενία, νευρολογικές επιληπτικές κρίσεις και ανωμαλίες πήξης που οδηγεί σε ενδοκρανιακή αιμορραγία ή θρόμβωση [10]. Ως εκ τούτου, υπάρχει μια ανάγκη για νέες και ισχυρή L-asparaginases από GRAS (

γενικώς αναγνωρισμένα ως ασφαλή

) μικροοργανισμών που έχει βελτιωμένη σταθερότητα, μικρότερη δραστικότητα γλουταμινάσης με υψηλή συγγένεια υπόστρωμα, χαμηλή K

τιμή m και επαρκές ήμισυ -Life υπό φυσιολογικές συνθήκες, έτσι ώστε να μπορούν να ξεπεράσουν το παραπάνω προκλήσεις που αντιμετωπίζει στο τρέχον σενάριο.

Ως εκ τούτου, η παρούσα μελέτη έχει ως στόχο να καθαρίσει L-ασπαραγινάση από

Bacillus licheniformis

RAM-8 (έδαφος Απομονώστε), η οποία έχει επιβεβαιωθεί ότι είναι ένα μυθιστόρημα L-ασπαραγινάση και έχει αξιολογηθεί για βιοφυσικών και βιοχημικών χαρακτηριστικών του και των δυνατοτήτων του ως αντικαρκινικός παράγοντας έναντι διαφόρων ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών.

Υλικά και Μέθοδοι

δήλωση Ηθική:

Τα δείγματα αίματος στην τρέχουσα εργασία ελήφθησαν από Rotary αίματος Λευκά, το Νέο Δελχί ως δώρο και τα δείγματα αίματος είναι εμπορικά διαθέσιμα στο Ρόταρυ Τράπεζα αίματος για ερευνητικούς σκοπούς. Ηθικά έγκριση της επιτροπής δεν είναι απαραίτητη για την απόκτηση ανθρώπινο αίμα για ερευνητικούς σκοπούς. Έχουμε τη χρήση του ανθρώπινου αίματος για σκοπούς έρευνας λαμβάνεται από το Ρόταρυ Τράπεζα Αίματος και δημοσίευσε ο ίδιος στο παρελθόν [11].

2.1 Χημικά

Χημικές ουσίες που χρησιμοποιούνται για τον καθαρισμό του ενζύμου (χρωματογραφικές μήτρες) και τον χαρακτηρισμό αγοράστηκαν από την Sigma Aldrich. αντιδραστήριο Nessler του αγοράστηκε από την Fluka (Buchs, Switzerland). L-ασπαραγίνη αγοράστηκε από Spectrochem (Ινδία). Όλα τα χημικά που χρησιμοποιούνται για την παραγωγή ήταν αναλυτικής ποιότητας και αγοράσθηκαν από Hi-Media (Ινδία). Χημικές ουσίες και δείκτες που χρησιμοποιούνται στη μητρική και SDS PAGE ελήφθησαν από την BioRad.

2.2 L-ασπαραγινάση

Παραγωγή

παραγωγή L-ασπαραγινάση από

Bacillus licheniformis

RAM-8 (απομόνωση του εδάφους ? προσδιορίζονται βάσει των 16 s RNA και ανάλυση 500 bp? Midi-εργαστήρια, USA) διεξήχθη σε βελτιστοποιημένο τροποποιημένο μέσο Czapek Dox [12]: Na

2HPO

4, 6 g /L? KH

2 ΡΟ

4, 2 g /L? NaCl, 0,5 g /L? L-ασπαραγίνη, 20 g /L? γλυκερόλη, 2 g /L? MgSO

4.7H

20, 0,2 g /L? CaCl

2,2Η

2O, 0.005 g /L. Οι φιάλες που περιέχουν μέσο παραγωγής (50 ml σε φιάλη των 250 ml) εμβολιάστηκαν με 2% εμβόλιο (ν /ν) (O.D. 2.0). Η επώαση πραγματοποιήθηκε στους 37 ° C στις 200 rpm για 24 ώρες. Η παραγωγή του ενζύμου ήταν εξωκυτταρική και η δραστικότητα του ενζύμου προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το διήθημα καλλιέργειας. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν και υπολογίστηκαν οι μέσες τιμές με τυπικές αποκλίσεις (SD).

2.3 Δοκιμασία Ενζύμου

Δοκιμασία ενζύμου διεξήχθη σύμφωνα με την διαδικασία που δίνεται από nesslerization Shirfrin

et al

. [13], με τη χρήση 189 mM L-ασπαραγίνης ως υπόστρωμα ή αναφέρεται διαφορετικά, σε ρυθμιστικό διάλυμα 50 mM Tris-HCl (ρΗ 8.6) και την ανάγνωση της απορρόφησης στα 436 nm. διαλύματος θειικού αμμωνίου χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή της πρότυπης καμπύλης. Μία Διεθνής Μονάδα (IU) δραστικότητας ασπαραγινάσης ορίζεται ως η ποσότητα του ενζύμου που απαιτείται για να απελευθερώσει έναν μmole αμμωνίας ανά ml ανά λεπτό σε ρΗ 8.6 στους 37 ° C.

2.4 Enzyme Καθαρισμός

2.4.1 υπερδιήθησης.

Ο ζωμός κύτταρο ελεύθερη ζύμωσης υποβλήθηκε σε υπερδιήθηση με κασέτα μεμβράνης των 30 kDa για να αφαιρέσετε τις χαμηλότερες πρωτεΐνες και να συγκεντρώσει την επιθυμητή πρωτεΐνη. Παρακράτημα και διαπερνούν συλλέγονται μετά την υπερδιήθηση αναλύθηκαν για δραστηριότητα L-ασπαραγινάση και συγκέντρωση πρωτεΐνης με τη μέθοδο Bradford [14]. Καθίζηση

2.4.2 ακετόνη.

Ψύξη ακετόνης (-20 ° C) ήταν προστίθεται στο ζωμό συμπυκνώθηκαν με συνεχή ανάδευση στους 4 ° C σε συγκέντρωση βαθμίδα 20 έως 80%, για τις πρωτεΐνες να καθιζάνει. Τα κλάσματα που δείχνουν μέγιστη δραστικότητα φυγοκεντρήθηκαν ξηράνθηκε και διαλύθηκε σε ελάχιστη ποσότητα 50 mM Tris HCl (ρΗ 8,6) και υποβλήθηκε σε διαπίδυση έναντι του ίδιου ρυθμιστικού αέρα για να ληφθεί η συμπυκνωμένη πρωτεΐνη.

2.4.3 DEAE χρωματογραφία κυτταρίνης.

Το συμπυκνωμένο ένζυμο εφαρμόστηκε σε στήλη διαιθυλαμινοαιθυλο κυτταρίνης (DEAE κυτταρίνη) (4 × 60 cm) εξισορροπημένη με 50 mM Tris-HCL (ρΗ 8.6). Η στήλη πλύθηκε με 2 όγκους ρυθμιστικού εκκίνησης και η πρωτεΐνη εκλούστηκε με γραμμική βαθμίδωση χλωριούχου νατρίου (0-0.5 Μ) παρασκευάστηκε σε φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα ρΗ 7.4 με ρυθμό 60 ml ανά ώρα. Τα κλάσματα που δείχνουν δραστικότητα L-ασπαραγινάση συνενώθηκαν σε διαπίδυση έναντι 50 mM Tris-HCl (ρΗ 8.6) και συμπυκνώθηκε με πάγκου πρωτεΐνη συγκεντρωτή στους 4 ° C.

2.4.4 Gel διήθηση.

το συμπυκνωμένο διάλυμα ενζύμου προστέθηκε στην κορυφή της στήλης Sephadex G-100 (4 Χ 60) cm εξισορροπημένη με 50 mM Tris-HCl (ρΗ 8.6) και εκλούστηκε με το ίδιο ρυθμιστικό σε ρυθμό ροής 0,5 ml ανά λεπτό. Τα κλάσματα που δείχνουν δραστικότητα L-ασπαραγινάση συνενώθηκαν και υποβλήθηκαν σε διαπίδυση έναντι του ίδιου ρυθμιστικού και λυοφιλοποιήθηκε με πάγκο κορυφή λυοφιλοποιητή. Η ομοιογένεια της πρωτεΐνης ελέγχθηκε με SDS και αυτοφυή PAGE.

2.5 Χαρακτηρισμός καθαρισμένα L-ασπαραγινάση

2.5.1 Προσδιορισμός του μοριακού βάρους.

Το καθαρισμένο L- ασπαραγινάση εφαρμόσθηκε σε Sephacryl ™ S-200 στήλη υψηλής ανάλυσης (Pharmacia, 16/60), εξισορροπημένη με 50 mM Tris-HCl (ρΗ 8,6) και εκλούεται σε ταχύτητα ροής 0,5 ml ανά λεπτό [15]. Οι τυποποιημένες πρωτεϊνών σημειωτών μοριακού εφαρμόστηκαν στη στήλη και ο όγκος έκλουσης (V

ε) εκάστης πρωτεΐνης δείκτη και κενό όγκο (V

ιε) η στήλη καταγράφηκαν. Η μοριακή μάζα της πρωτεΐνης προσδιορίστηκε σε ένα γράφημα ημι-log με γραφική παράσταση V

E /V

o στο X-άξονα και λογάριθμο του μοριακού βάρους στον άξονα-Υ.

2.5.2 Επίδραση του ρΗ και της θερμοκρασίας επί της δραστικότητας και της σταθερότητας του ενζύμου.

Η δραστηριότητα της L-ασπαραγινάσης αξιολογήθηκε σε διαφορετικές τιμές ρΗ και θερμοκρασίας. Βέλτιστο ρΗ για την ενεργότητα L-ασπαραγινάση προσδιορίστηκε σε ένα εύρος ρΗ από 4 έως 10. Για μελέτες σταθερότητας ρΗ, τα παρασκευάσματα ενζύμων επωάστηκαν σε ρΗ 4-10 για 24 ώρες σε 4 ° C και η υπολειμματική δράση προσδιορίστηκε υπό συνθήκες δοκιμασίας ( ρΗ 8,6, 50 mM). Η βέλτιστη περιοχή θερμοκρασίας για δραστικότητα ενζύμου προσδιορίστηκε διεξάγοντας τη δοκιμασία ενζύμου σε διαφορετικές θερμοκρασίες που κυμαίνονται από 25 έως 65 ° C. Επίσης, η θερμική σταθερότητα του ενζύμου προσδιορίστηκε με επώαση του λυοφιλισμένου ενζύμου σε διαφορετικές θερμοκρασίες

δηλαδή

-20 ° C, 4 ° C, 10 ° C, 30 ° C και 60 ° C για 30 ημέρες.

ειδικότητα

2.5.3 Υπόστρωμα.

δραστηριότητες Enzyme αξιολογήθηκαν με διαφορετικά αμίδια ως υποστρώματα,

δηλ.

L-ασπαραγίνη, D-ασπαραγίνη, L-γλουταμίνη, D-γλουταμίνη, L -ασπαρτικό οξύ, D-ασπαρτικό οξύ, L-γλουταμινικό οξύ, L-ορνιθίνη και ουρία, σε συγκεντρώσεις 10 mM, αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα παρουσιάστηκαν στους όρους του ποσοστού σχετικής δραστηριότητας.

2.5.4 Επίδραση των διαφόρων μεταλλικών ιόντων, τα συστατικά του ορού και αναστολέων στην ενζυμική δραστηριότητα.

Επίδραση των διαφόρων ανόργανων ιόντων στη δραστικότητα του ενζύμου προσδιορίστηκε με προ-επώαση του ενζύμου με διαφορετικά άλατα σε συγκέντρωση 100 mM για 6 ώρες στους 4 ° C. Επίσης, η επίδραση του ορού, συστατικά ορού και αναστολέων (σουλφυδρυλ και σερίνη) προσδιορίστηκε με επώαση του ενζύμου σε συγκέντρωση τελεστή 10 mM για 6 ώρες στους 4 ° C. Τα αποτελέσματα παρουσιάστηκαν στους όρους του ποσοστού σχετικής δραστηριότητας.

2.5.5 Κινητικές παράμετροι.

Το

V

max,

K

m

,

k

γάτα, και

k

cat /

K

m

προσδιορίστηκαν στους 25 ° C με τη χρήση L-ασπαραγίνη ως υπόστρωμα σε συγκεντρώσεις που κυμαίνονται από 2 έως 20 mm με σταθερή συγκέντρωση ενζύμου 1 mg /ml. Το αρχικό ρυθμό ανακύκλωσης στα δέκα διαφορετικές συγκεντρώσεις υποστρώματος υπολογίστηκε, και ο τύπος της αναστολής και των παραμέτρων Michaelis-Menten καθορίστηκαν από Lineaweaver-Burk γραφικές παραστάσεις χρησιμοποιώντας την εξίσωση που προέρχεται από την ανάλυση γραμμικής παλινδρόμησης-της καμπύλης. Η

k

αξία γάτα υπολογίστηκε με την εφαρμογή της εξίσωσης

k

cat =

V

max /[E], όπου [Ε ] είναι η συγκέντρωση του ενζύμου στη δοκιμασία. k

γάτα και οι σταθερές εξειδίκευσης (k

cat /K

m) υπολογίσθηκαν με βάση ένα ενεργό θέση ανά 33,7 kD υπομονάδα όπως περιγράφεται από Kumar

κ.ά.

. [16].

2.5.6 Εγκύκλιος διχρωϊσμού.

CD φάσματα καταγράφηκαν σε JASCO J-815 φασματοπολαριμέτρου (JASCO Corporation, Hachioji-shi, Tokyo, Japan) χρησιμοποιώντας ένα κυλινδρικό κύτταρο χαλαζία του μήκους διαδρομής 1 mm και 1 cm, αντίστοιχα, για πολύ και κοντινού περιοχή UV. Αλλαγές στο δευτερογενή και τριτογενή δομή της πρωτεΐνης παρακολουθήθηκαν στη μακριά και κοντά -UV περιοχή μεταξύ 190 έως 260 nm και 260 – 320 nm, αντίστοιχα. Τρεις διαδοχικές σαρώσεις φάσματος κατά μέσο όρο και διορθώθηκαν με αφαίρεση αντίστοιχων κενά και υποβλήθηκαν σε μείωση του θορύβου. Το ξεδίπλωμα πρότυπο μετάβαση καθαρισμένου L-ασπαραγινάση παρακολουθήθηκε με πολύ υν φασματοσκοπία CD, όπου οι αλλαγές στην ένταση του σήματος στα 222 nm παρίστανται γραφικώς έναντι των συνάρτηση της θερμοκρασίας.

2.5.7 φθορισμού φασματοσκοπία.

μετρήσεις φθορισμού διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας Eclipse Cary Varian UV-Vis φασματοφθορισμόμετρο (Varian, Inc. Hansen Way, Palo Alto, CA, USA) που συνδέεται με ένα ελεγκτή θερμοκρασίας Peltier. Ένα μήκος κύματος διέγερσης 280 nm με διέγερση σχισμή 5 nm και σχισμή εκπομπής 5 nm χρησιμοποιήθηκε και ο φθορισμός καταγράφηκε από 300 nm έως 400 nm. Ξεδιπλώνοντας πρότυπο και η σταθερότητα της πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με τη χρήση 0-6 Μ γουανιδίνης HCl (GdHCl) όπως περιγράφεται από Bansal

et al.

, [17]. Η ένταση φθορισμού καταγράφεται ως συνάρτηση του μήκους κύματος με χρήση F

400 nm ως τη βασική γραμμή.

2.5.8 Ν-τελική αλληλούχιση της L-ασπαραγινάσης.

Για να επιβεβαιωθεί η ταυτότητα της πρωτεΐνης, τα δείγματα πρωτεΐνης που αντιστοιχεί σε μία μοριακή μάζα 33,7 kDa σε SDS-PAGE κηλιδώθηκαν επί μεμβράνης πολυβινυλικής διφθοριούχο (PVDF) (Sigma-Aldrich, USA) και υποβλήθηκε σε προσδιορισμό αλληλουχίας Ν-τερματικού αμινοξέος χρησιμοποιώντας αυτοματοποιημένο πρωτεΐνη sequencer PPSQ31A (Shimadzu, Ιαπωνία).

Εφαρμογή

2.6 Anti-όγκου της L-ασπαραγινάσης από

Bacillus licheniformis

Η

2.6.1 κύτταρα και συνθήκες καλλιέργειας κυττάρων.

Οι αντικαρκινικές ιδιότητες της καθαρισμένης L-ασπαραγινάση αξιολογήθηκαν σε διαφορετικές ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές γραμμές

δηλ.

Jurkat κλώνος Ε6-1, MCF-7 και Κ-562 (που προμηθεύονται από NCCS, Pune). Τα κύτταρα Jurkat και Κ-562 αναπτύχθηκαν όπως εναιώρημα σε RPMI-1640 και MCF-7 αναπτύχθηκαν σε μέσο ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% θερμοαπενεργοποιημένο FBS (Sigma), πενικιλλίνη (100 μg /ml) και στρεπτομυκίνη (100 μg /ml ). Τα κύτταρα διατηρούνται κάτω από μια πλήρως υγροποιημένη ατμόσφαιρα 95% αέρα του δωματίου και 5% CO

2 στους 37 ° C.

Μέτρησης

2.6.2 Η βιωσιμότητα των κυττάρων.

Η αντι-πολλαπλασιαστική δράση της L-ασπαραγινάσης μετρήθηκε με την χρωματομετρική δοκιμασία η οποία μετρά την μείωση του κίτρινου 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλ τετραζόλιο (ΜΤΤ) με μιτοχονδριακή αφυδρογονάση ηλεκτρικού σε ένα αδιάλυτο, έγχρωμο ( σκούρο μωβ) φορμαζάνης προϊόν το οποίο διαλύεται σε οργανικό διαλύτη και μετρήθηκε φασματοφωτομετρικά. Εν συντομία, τα κύτταρα απλώθηκαν σε μια πυκνότητα κυττάρων 1 χ 10

4 κύτταρα /φρεάτιο σε επίπεδου πυθμένα πρότυπο μικροπλακίδια 96 φρεατίων. Το καθαρισμένο ί-asparginase (100 IU /mg) αραιώθηκε σειριακά σε ατελές μέσο και προστέθηκαν σε κυτταρικές καλλιέργειες σε μία τελική συγκέντρωση από 0.75-25 μg /ml. Μετά από επώαση για 24 ώρες, 20 μΐ ΜΤΤ σε μια συγκέντρωση 5 mg /ml σε φωσφορικό ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα (PBS, ρΗ 7.4) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Μετά από 4 ώρες επώασης οι πλάκες φυγοκεντρήθηκαν στις 2000 rpm για 10 λεπτά, μετά την οποία οι πλάκες ταχέως αναστρέφεται με μια σταθερή κίνηση για να απομακρυνθεί το μέσο καλλιέργειας. Για τη διαλυτοποίηση των φορμαζάνη ιζήματα με την προσθήκη 150 μΐ 1:01 μίγμα αιθανόλης και DMSO προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και οι πλάκες επωάστηκαν περαιτέρω για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Η απορρόφηση προσδιορίστηκε στη συνέχεια με φασματοφωτομετρικό αναγνώστη μικροπλάκας Tecan άπειρη 200 pro, σε δοκιμαστικό μήκος κύματος 550 nm και μήκος κύματος αναφοράς 620 nm.

2.6.3

In vitro

δοκιμή αιμόλυσης.

το καθαρισμένο L-ασπαραγινάση δοκιμάστηκε για την in vitro αιμόλυση με επώαση των αυξανόμενων συγκεντρώσεων του ενζύμου (6,25 μg έως 100 μg) με ηπαρινισμένο ανθρώπινο ολικό αίμα (που λαμβάνεται από Rotary Τράπεζα αίματος, Νέο Δελχί) σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών ( ρΗ 7.2) για 24 ώρες όπως περιγράφεται από τον Lubran [18]. Η αντίδραση τερματίστηκε με την προσθήκη 2,5% γλουταραλδεΰδη μετά από 24 ώρες επώασης και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε. Το υπερκείμενο διαβάστε στα 540 nm έναντι αρνητικού ελέγχου δηλαδή δείγμα χωρίς ένζυμο. Η προετοιμασία του ανθρώπινου αίματος σε διπλά αποσταγμένο νερό αντιμετωπίζεται ως θετικός μάρτυρας.

Αποτελέσματα

3.1 Καθαρισμός της L-ασπαραγινάση και Μοριακής Μάζας Προσδιορισμός

Η σταδιακή καθαρισμό του L- ασπαραγινάση από

Bacillus licheniformis

RAM-8 έχει παρουσιάζονται στον πίνακα 1 και στο Σχήμα 1a. Η σειρά των σταδίων χρωματογραφίας ήταν πολύ αποτελεσματικές και έδωσε συνολική κάθαρση του 33-φορές. Το τελικό περιεχόμενο πρωτεΐνης της καθαρισμένης L-ασπαραγινάση ήταν 15,25 mg, με την απόδοση του 32,95%. Η ειδική δραστικότητα του ενζύμου ήταν καθαρίστηκε 697,09 IU /mg πρωτεΐνης. Η πρωτεΐνη βρέθηκε να έχει μοριακό μέγεθος των 134,8 kDa (Σχήμα 1β), όπως προσδιορίζεται μέσω χρωματογραφίας διήθησης πηκτής και μονομερή μέγεθος 33,7 kDa επιβεβαιώθηκε με SDS-PAGE. Η θεωρητική ΙΕΡ του ενζύμου υπολογίστηκε σε 5,48.

Η

3.2 Επίδραση του pH και της θερμοκρασίας στην δραστικότητα και σταθερότητα της L-ασπαραγινάσης

Καθαρίστηκε L-ασπαραγινάση από

Bacillus licheniformis

RAM-8 ήταν δραστικό πάνω από ευρύ φάσμα ρΗ 6-11 με μέγιστη δραστικότητα σε ρΗ 9 (Σχήμα 2α). Είναι προφανές από το Σχήμα 2γ ότι το καθαρισμένο ένζυμο ήταν ενεργό στην περιοχή θερμοκρασίας από 30-50 ° C και έδειξε μία απότομη αξιοπρεπή στη δραστηριότητα άνω των 60 ° C. Επίσης, το ένζυμο ήταν σταθερό σε μέγιστο εύρος ρΗ 7,0 έως 9,0 επί διάστημα 24 ωρών (Σχήμα 2β). Η καλύτερη θερμοκρασία για το ένζυμο αποθήκευση βρέθηκε να είναι -20 ° C όπου ήταν ακόμη σταθερό μετά από 30 ημέρες διατήρησης (Σχήμα 2δ).

100% δραστηριότητα αντιστοιχεί σε 140 U ενζύμου. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν SD τριών πειραμάτων.

Η

3.3 Επίδραση των Μεταλλοϊόντων, Ορός Εξαρτήματα και Αναστολείς στην L ασπαραγινάση-Δραστηριότητα

Είναι φανερό από το Σχήμα 3α που ενζυμική δραστηριότητα ενισχύεται σημαντικά με την παρουσία του πλέον τα μονοσθενή κατιόντα και ήταν μέγιστη σε παρουσία Na

+, Κ

+ και Mg

++. Εντούτοις, τα άλλα δισθενή κατιόντα είχαν δυσμενή επίδραση επί της δραστικότητας του ενζύμου. Το ένζυμο διατήρησε περισσότερο από 80% δραστικότητα παρουσία αναστολέων πρωτεάσης σερίνης δηλαδή. PMSF & amp? ΡΒΑ ως εκ τούτου δείχνει ότι δεν είναι μια υδρολάση σερίνη. Υπήρξε μείωση 60% στην δραστικότητα της L-ασπαραγινάσης από

Bacillus licheniformis

RAM-8 παρουσία αναστολέων σουλφυδρυλίου. Επίσης, παράγοντες διαστάσεως ουρία και EDTA ανέστειλαν την δραστικότητα κατά 70% (σχήμα 3β).

100% δραστηριότητα αντιστοιχεί σε 140 U ενζύμου. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν SD τριών πειραμάτων.

Η

Ωστόσο καθαρίστηκε δραστικότητα L-ασπαραγινάση ήταν εύρωστη σε φυσιολογικό ρΗ και θερμοκρασία, αλλά η δραστικότητα του ενζύμου μειώθηκε κατά περίπου 40%, όταν το καθαρισμένο ί-ασπαραγινάση επωάστηκε με ανθρώπινο ορού και τα συστατικά του, αντιστοίχως κάτω από το

in vitro

συνθήκες για 48 ώρες, όπου σε λεπτομερή αξιολόγηση που λήφθηκε ότι γαλακτικό, τα οξαλικά και πυροσταφυλικό εκτίθενται περισσότερο από 70% αναστολή (Σχήμα 3γ).

3.4 Υπόστρωμα εξειδίκευση

Το καθαρισμένο L-ασπαραγινάση έδειξαν υψηλή ειδικότητα έναντι φυσικό υπόστρωμα δηλαδή L-ασπαραγίνη της. Ωστόσο, λιγότερο από το 10% και το% δραστικότητα έναντι 1 D-ασπαραγίνη και L-γλουταμίνη, αντίστοιχα παρατηρήθηκε (Εικόνα 3d). Κανένα άλλο υπόστρωμα βρέθηκε να αλληλεπιδρά με το ένζυμο στην καθαρή του μορφή.

3.5 Kinetic Παράμετροι

Το οικόπεδο Lineweaver Burk στο Σχήμα 4 συνάγει ότι K

m και V

max καθαρισμένου L-ασπαραγινάση από

Bacillus licheniformis

RAM 8 χρησιμοποιώντας L-ασπαραγίνη ως υπόστρωμα ήταν 1.4 × 10

-5 Μ και 4.03 IU, αντίστοιχα και ο αριθμός του κύκλου εργασιών (Κ

cat) του ενζύμου ήταν αποφασισμένη να είναι 2,68 × 10

3 s

-1. (Κ

cat /K

m) του ενζύμου βρέθηκε να είναι 1.503 × 10

6 M

-1δ

-1.

K

m = 1.4 × 10

-5 MV

max = 4.03 IU /μg.

Η

3.6 Εγκύκλιος Διχρωισμού

CD φάσμα καθαρίζεται L-ασπαραγινάση έδωσε αρνητική elipticities σε 208 και 222 nm (Σχήμα 5α). Η ανάλυση k2D της στιγμής φάσμα UV CD από 240 έως 200 nm προβλεπόμενη ΑΡΗΑ έλικα να είναι 63,05% και βήτα φύλλα να είναι 3,29% και Τ

m πρωτεΐνης βρέθηκε να είναι 58 ° C, η οποία αναφέρει τον λόγο για απότομη αξιοπρεπή στη δραστικότητα όταν ενζύμου ελέγχθηκε πάνω από 60 ° C (Σχήμα 5β). Το εγγύς υν φάσματα CD της πρωτεΐνης έδωσε αρνητική elipticities στην περιοχή από 260 να 290 όπως παρουσιάζεται στο Σχήμα 5γ.

γ). Κοντά υν CD φάσματα καθαρίστηκε L-ασπαραγινάση 1,0 mg /ml σε 0,1 Μ Tris HCL (ρΗ 8.4).

Η

3.7 Φασματοσκοπία Φθορισμού

Η καθαρισμένη πρωτεΐνη L-ασπαραγινάση έδειξε μέγιστη φθορισμού στα 323 nm στη φυσική του μορφή σε απουσία GdHCl, ωστόσο, μια μετατόπιση προς 352 nm παρατηρήθηκε όταν 6Μ GdnCl προστέθηκε δηλώνοντας έτσι της πλήρους αναδίπλωση όπως παρουσιάζεται στο Σχήμα 6. ένας υψηλότερος φθορισμός παρατηρήθηκε στην πρωτεΐνη σε εκτυλίχθηκε του ψυχρή κατάσταση

nm (μήκος κύματος διέγερσης: 292 nm).. και ξεδίπλωμα μεταβάσεις της L-ασπαραγινάσης σε 0 Μ, 3 Μ και 6 Μ γουανιδίνη HCl

Η

3,8 Ν-τερματική Αλληλούχιση της L-ασπαραγινάσης

Τα δείγματα πρωτεΐνης που αντιστοιχεί σε μοριακή μάζα 33,7 kDa σε SDS-PAGE κηλιδώθηκαν επί μεμβράνης πολυβινυλικής διφθοριούχο (PVDF) (Sigma-Aldrich, USA) και υποβλήθηκαν σε Ν-τερματικό αμινο προσδιορισμός οξύ ακολουθία χρησιμοποιώντας ένα αυτοματοποιημένο PPSQ21A αλληλουχίας πρωτεϊνών (Shimadzu, Ιαπωνία). Η αλληλουχία των πρώτων υπολειμμάτων Ν-τερματικού αμινοξέος 15 βρέθηκε να είναι DNKKVEAATGGTQAG οποία έδειξε μια ευρεία διακύμανση με τη γνωστή και αναφερόμενη ακολουθία πρωτεΐνης της L-ασπαραγινάσης.

3.8 Αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση της L-ασπαραγινάσης

Η αντι-πολλαπλασιαστική δραστικότητα της L-ασπαραγινάσης παρακολουθήθηκε έναντι τριών διαφορετικών καρκινικών κυτταρικών γραμμών ανθρώπινου δηλαδή. κλώνος Jurkat Ε6-1, MCF-7 και Κ-562. Το IC

50 καθαρισμένης L-ασπαραγινάση από

Bacillus licheniformis

RAM-8 βρέθηκε να άκρως αποτελεσματική έναντι των λευχαιμικών κυτταρικών σειρών δηλαδή. Jurkat κλώνου Ε6-1 κυτταρικές γραμμές και κυτταρικές γραμμές Κ-562 με IC

50 0,22 IU και 0.15 IU, αντίστοιχα (Σχήμα 7). Ο καρκίνος του μαστού κυτταρική σειρά MCF-7 έδειξε επίσης μια καθυστερημένη ανάπτυξη κατά τις αυξανόμενες συγκεντρώσεις και έδειξε ένα IC

50 0.78 IU.

Η

3.9

In vitro

αιμόλυση δοκιμής για Εξετάζοντας το Drug Τοξικότητα

ο L-ασπαραγινάση επωάστηκαν με το ηπαρινοποιημένο αίμα δεν έδειξε καμία επίδραση ακόμη και σε συγκέντρωση 100 μg /ml (Σχήμα 8). Επίσης, το φάρμακο δεν είχε την ανασταλτική επίδραση στην ωοθήκη δοκιμή κυτταρική σειρά κινέζικου χάμστερ (CHO), ως εκ τούτου το φάρμακο μπορεί να θεωρηθεί ασφαλές για τα περαιτέρω

in vivo

αξιολογήσεις

Α:. Αρνητικός ελέγχου (χωρίς L-ασπαραγινάση)? Β: θετικός έλεγχος (με διπλά απεσταγμένο νερό)? C: 100 μg /ml? D: 50 μg /ml? Ε: 25 μg /ml? F: 12,5 μg /ml? G:. 6.25 μg /ml L-ασπαραγινάση

Η

Συζήτηση

Καθαρισμός της L-ασπαραγινάσης από

Bacillus licheniformis

RAM-8 επιτεύχθηκε με τη χρήση υπερ- διήθηση, το 80% κατακρήμνιση ακετόνη, χρωματογραφία ϋΕΑΕ κυτταρίνη και διήθηση Sephadex G-100 γέλη, αντίστοιχα. L-ασπαραγινάση από

Bacillus licheniformis

RAM-8 καθαρίστηκε μέχρι φαινόμενη ομοιογένεια με τη φορές καθαρισμό του 30,17 και απόδοση 32,95%, όπου η ειδική δραστικότητα του ενζύμου αυξήθηκε από 23,10 IU /mg έως 697,09 IU /mg. Πρωτεΐνη είχε μοριακό βάρος 134,8 kDa αλλά μονομερείς μέγεθος του 33,7 kDa, ως εκ τούτου θα μπορούσε να είναι μια πιθανή ομοτετραμερές. Αυτά τα ευρήματα είναι σύμφωνα με προηγούμενες εκθέσεις δηλώνοντας ότι βακτηριακές L-ασπαραγινάση είναι ένα ομοτετραμερές [19] – [21]. Η θεωρητική ΙΕΡ του ενζύμου υπολογίστηκε σε 5,48, κοντά σε εκείνη της L-ασπαραγινάσης του

E. coli

(IEF 5), αλλά διαφορετικό από εκείνο των

Erwinia

(IEF 8.7) [16], [22]. Καθαρίστηκε L-ασπαραγινάση από

Bacillus licheniformis

RAM-8 ήταν λειτουργικά σταθερός και ενεργός επί μεγάλο εύρος ρΗ και θερμοκρασίας, και έδειξε την βέλτιστη δραστικότητα κάτω από φυσιολογικές συνθήκες. Ως εκ τούτου, αυτή η L-ασπαραγινάση ήταν πιο ισχυρή σε σύγκριση με L-ασπαραγινάση από

E. coli

και

Erwinia

[16], [22] – [23]. Πιο μονοσθενή κατιόντα, Mg

++ και σάκχαρα ορού ενίσχυσε την δραστικότητα του ενζύμου, ενώ ενζυμική δραστηριότητα μειώθηκε στην παρουσία άλλων δισθενή κατιόντα και οργανικά οξέα ορού. Από την άποψη αυτή, το ένζυμο ήταν παρόμοια με

Erwinia

L-ασπαραγινάση [24]. Η ανασταλτική δράση των δισθενών κατιόντων όπως Ca

++ και οργανικά οξέα ορού μπορούν να ξεπεραστούν με την παγίδευση του ενζύμου σε λιποσώματα τα οποία μπορεί να καλύψει την ανασταλτική δράση. Το ένζυμο παγίδευση μπορεί περαιτέρω να παρατείνει την ημίσεια ζωή στο πλάσμα και επίσης να μειώσει την ανοσογονικότητα, ενισχύοντας περαιτέρω τη θεραπευτική αποτελεσματικότητα σε σύγκριση με ελεύθερο ένζυμο [25]. Δραστηριότητα της L-ασπαραγινάσης μειώθηκε σημαντικά κατά 60% σε παρουσία αναστολέων σουλφυδρυλίου, η οποία μπορεί να οφείλεται στην παρουσία των ελεύθερων ομάδων -SH στις ενεργές θέσεις του ενζύμου [26]. Το ένζυμο βρέθηκε να είναι πολύ ειδικό για το φυσικό υπόστρωμα L-ασπαραγίνη της, με δραστικότητα γλουταμινάσης λιγότερο από 1%. Ωστόσο, η

Ε. coli

L-ασπαραγινάση συσχετίζεται με σημαντική δραστηριότητα νλουταμινάσης [2]. Έχει αναφερθεί ότι οι καταστροφικές επιπτώσεις που ανακύπτουν όταν η γλουταμίνη έχει εξαντληθεί κάτω από τα κρίσιμα επίπεδα, μειώνοντας τη σύνθεση αρκετών σημαντικών πρωτεϊνών

δηλαδή

. λευκωματίνη, ινσουλίνη, ινωδογόνο και η πρωτεΐνη-C [10], [25]. Κάτω δραστηριότητα νλουταμινάσης ενισχύει επίσης την εξάντληση L-ασπαραγίνη [25]. Το καθαρισμένο ένζυμο έχει K

m αξίας 1,4 × 10

-5 Μ το οποίο είναι χαμηλότερο από το L-ασπαραγινάση του

Erwinia

(3.0 × 10

-3 Μ) [27] και

Ε. coli

(3.5 × 10

-3 Μ) [28] και κατά συνέπεια μια καλύτερη συγγένεια υπόστρωμα, αν και χαμηλότερα K

αξία m του 7,4 × 10

-6 Μ λήφθηκε σε περίπτωση L- ασπαραγινάση από

Vibrio succinogenes

[28]. CD φάσμα της καθαρισμένης L-ασπαραγινάση παρουσίασαν αρνητικές elipticities στα 208 και 222 nm, οι οποίες είναι χαρακτηριστικές των φασμάτων που ελήφθησαν για μικτούς τύπους άλφα /βήτα των πρωτεϊνών [29]. Το εγγύς υν φάσματα CD της πρωτεΐνης έδωσε αρνητική elipticities στην περιοχή από 260 έως 290 το οποίο μπορεί να αποδοθεί στην παρουσία των αρωματικών πλευρικές αλυσίδες αμινοξέων από φαινυλαλανίνη, τυροσίνη και τρυπτοφάνη και δίνοντας τα φάσματα CD η οποία είναι χαρακτηριστική για τη μητρική συμπαγή αναδιπλωμένη πρωτεΐνη δομή [29]. Υπήρξε μια σταδιακή μετάβαση από 323 nm έως 352 nm λ

em στην αύξηση της συγκέντρωσης του GdHCl από 1 έως 6 Μ, ωστόσο μετατόπιση ήταν προεξέχον μόνο όταν η συγκέντρωση του GdHCl αυξήθηκαν περισσότερο από 3 Μ Παρόμοιες έχει αναφερθεί σε περίπτωση υπερθερμοφιλικά ασπαραγινάσης που παράγεται από το μεταλλαγμένο

Pyroccocus furiosus

από Bansal,

et al

το 2011 [17]. Η αλληλουχία των πρώτων 15 Ν-τερματικών αμινοξέων έδειξε μια ευρεία διακύμανση με τη γνωστή και αναφερόμενη ακολουθία πρωτεΐνης της L-ασπαραγινάση, ωστόσο, η διατηρημένη αλληλουχία του ATGGT καταγράφηκε [16] έτσι, ως εκ τούτου αυτή η πρωτεΐνη L-ασπαραγινάση είναι νέο, το οποίο θα μπορούσε αποδίδουν στην ισχυρή ιδιότητες και χαμηλή δραστηριότητα νλουταμινάσης. Τα καθαρισμένα L-ασπαραγινάση από

Bacillus licheniformis

RAM-8 βρέθηκε να είναι ιδιαίτερα αποτελεσματικό κατά των καρκινικών κυτταρικών γραμμών, Jurkat κλώνος Ε6-1, MCF-7 και Κ-562 όπου IC

50 καταγράφηκε σε το φάσμα των λιγότερο από 1 IU /ml. Ωστόσο, η εμπορική L-ασπαραγινάση από

Erwinia

έχει αναφερθεί ότι έχει IC

50 από 7,5 έως 10,0 IU /ml και εκείνη του

E. coli

έχει IC

50 1,0 IU /ml για τις παρόμοιες κυτταρικές γραμμές [30]. Σε αυτό αφορά αυτό, η L-ασπαραγινάση μπορεί να θεωρηθεί ως πιο ισχυρό και αποτελεσματικό όπλο στη χημειοθεραπεία των όγκων σε σύγκριση με τις παρούσες εμπορικά παρασκευάσματα. Επίσης αυτή L-ασπαραγινάση ήταν μη τοξικό έναντι κανονικής CHO κυτταρική γραμμή και τα ανθρώπινα ερυθροκύτταρα. Περίπου το 15-20% των ασθενών που έλαβαν θεραπεία με

Ε. coli

προερχόμενο ασπαραγινάση αναπτύξουν υπερευαισθησία και την τοξικότητα στο φάρμακο [31], ως εκ τούτου αυτή η L-ασπαραγινάση θα μπορούσε ενδεχομένως να είναι μια καλύτερη υποψήφια κάτω από φυσιολογικές συνθήκες.

Συμπεράσματα

L-ασπαραγινάση από

Bacillus licheniformis

RAM-8 καθαρίστηκε έως φαινόμενη ομοιογένεια και βρέθηκε να είναι ένα ομοτετραμερές που έχει μοριακό μέγεθος των 134,8 kDa. Αυτό L-ασπαραγινάση είναι δραστική και σταθερή κατά μεγάλο εύρος θερμοκρασίας και ρΗ και ειδικά για το φυσικό υπόστρωμα του

δηλ.

L-ασπαραγίνη. Βιοφυσικό χαρακτηρισμό κατέληξε στο συμπέρασμα ότι είναι στιβαρή δομή της α /β μεικτή πρωτεΐνη. Η Ν-τερματική αλληλουχία αυτής της πρωτεΐνης δεν ταιριάζει με τη γνωστή και αναφερόμενη ακολουθία L-ασπαραγινάση, ως εκ τούτου πρωτεΐνη είναι ένα νέο. Αυτό L-ασπαραγινάση έδειξε αντικαρκινική δράση έναντι Jurkat κλώνου Ε6-1, Κ-562 και κυτταρικές σειρές MCF-7 και μη-τοξική δράση κατά του ηπαρινισμένο αίμα ή CHO δοκιμή κυτταρικής γραμμής.

Ευχαριστίες

Συγγραφείς ευχαριστήσω τον Δρ TP Singh Τμήμα Βιοφυσικής, AIIMS για υποδομές στήριξης αλληλουχίας Ν-τερματικό. Συγγραφείς ευχαριστήσω Ρόταρυ Τράπεζα Αίματος, το Νέο Δελχί για την παροχή ανθρώπινου αίματος για ερευνητικούς σκοπούς ως δώρο.