Αφηρημένο

Περιγράφουμε εδώ δύο νέα ενδογενή παραλλαγές του ανθρώπινου ενδοπλασματικό δίκτυο (ER) SEL1LA υποδοχέα φορτίου, ορίζεται p38 και Ρ28. Βιοχημικές και παρεμβολή RNA μελέτες σε ογκογόνα και μη ογκογόνα κύτταρα δείχνουν ότι η ρ38 και ρ28 είναι Ν-τερματικό, ER-αγκύρωση και πιο σταθερό σε σχέση με την κανονική διαμεμβρανική SEL1LA. Ρ38 εκφράζεται και εκκρίνεται ιδιοσυστατικά, με αύξηση μετά ER στρες, στη γραμμή μυελώματος KMS11 και στον καρκίνο του μαστού MCF7 γραμμές και SKBR3, αλλά όχι στο μη ογκογόνο γραμμή ΜΟΡ10Α επιθηλιακών μαστού. P28 ανιχνεύεται μόνο στο πτωχά διαφοροποιημένη κυτταρική γραμμή SKBR3, όπου εκκρίνεται μετά ER στρες. Σταθερά με την παρουσία του ρ38 και Ρ28 σε μέσο καλλιέργειας, μορφολογικές μελέτες των κυττάρων SKBR3 και KMS11 ανιχνεύουν Ν-τερματικό SEL1L ανοσοσήμανση στα εκκριτικά /αποικοδομητικά διαμερισμάτων και εξωκυτταρικά κυκλοφορήσει κυστίδια μεμβράνης. Τα ευρήματά μας δείχνουν ότι οι δύο νέες παραλλαγές SEL1L ασχολούνται με ενδοσωματιακής διακίνηση και έκκριση μέσω κυστίδια, τα οποία θα μπορούσαν να συμβάλουν στην ανακούφιση του ER στρες σε ογκογόνα κύτταρα. Ρ38 και Ρ28 θα μπορούσε, επομένως, να είναι σχετικές ως διαγνωστικοί δείκτες ή /και θεραπευτικοί στόχοι στον καρκίνο

Παράθεση:. Cattaneo Μ, Lotti LV, Μαρτίνο S, Alessio M, Conti Α, Bachi A, et al. (2011) Η έκκριση της Μυθιστόρημα SEL1L ενδογενής Παραλλαγές προωθείται από ER στρες /UPR μέσω ενδοσώματα και Σπιτάκι κυστίδια σε ανθρώπινα κύτταρα του καρκίνου. PLoS ONE 6 (2): e17206. doi: 10.1371 /journal.pone.0017206

Επιμέλεια: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 26 του Οκτώβρη του 2010? Αποδεκτές: 22 Ιανουαρίου του 2011? Δημοσιεύθηκε: 17 Φεβ 2011

Copyright: © 2011 Cattaneo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από MIUR-FIRB nRBIP064CRT Ministero Università e Ricerca (MIUR), και MAPLOMBARDIA, Grant 7/193 ar 3 έως IB, MIUR 60% επιχορηγήσεις από το Πανεπιστήμιο La Sapienza να LVL, MIUR 60% επιχορηγήσεις 2008-2010 από το G . d’Annunzio Πανεπιστήμιο για RMC, και με επιχορήγηση το 2009 από την Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) για να RMC. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Πολλαπλές ομοιοστατικοί μηχανισμοί που ελέγχουν την αναδίπλωση των πρωτεϊνών και του συνέρχεσθαι και την προώθηση της διάθεσης των ελαττωματικών πρωτεϊνών λειτουργούν σε διακριτά κυτταρικά διαμερίσματα για να παρέχουν προστασία από ενδογενή proteotoxic άγχος [1] – [4]. Το ενδοπλασμικό δίκτυο (ER) είναι η περιοχή αναδίπλωση και συναρμολόγηση για κάτοικος δομικές πρωτεΐνες και ένζυμα, καθώς και για τις πρωτεΐνες εκκρίσεως και πλάσματος μεμβράνης [5]. Αυτή η αξιοσημείωτη φόρτος εργασίας διοικείται από αναδίπλωση πρωτεϊνών αποτελεσματική και υψηλής πιστότητας και misfold-διόρθωση των συστημάτων, με βάση την ΑΤΡ-εξαρτώμενη συνοδούς και δισουλφιδικές ισομεράσες, παράλληλα με τους μηχανισμούς ελέγχου της ποιότητας που επιτρέπουν Golgi διέλευση μόνο σε σωστά αναδιπλωμένες πρωτεΐνες [6]. Επιπλέον, η κάθαρση της παρεκκλινουσών πρωτεϊνών συγκρατείται στο ER προκαλείται μέσω της οδού ER σχετίζεται με αποικοδόμηση (ERAD) [7], μια διαδικασία πολλών σταδίων η οποία απαιτεί την αναγνώριση των ελαττωματικών πρωτεϊνών, retro-μετατόπιση προς την κυτοσολική πλευρά της μεμβράνης ER, ουβικιτινίωση και αποικοδόμηση από το πρωτεάσωμα 26S [8].

Παρόλα αυτά, η κυτταρική ικανότητα πρωτεϊνικής αναδίπλωσης και η οδός ERAD μπορεί να επηρεαστεί και /ή υπερφορτωμένα με μία ποικιλία παθολογικών καταστάσεων που διαταράσσουν την ομοιοστασία της ενέργειας και του ασβεστίου, αύξηση εκκριτική πρωτεϊνική σύνθεση ή /και παρεμβαίνει με τον σχηματισμό γλυκοζυλίωση πρωτεϊνών και δισουλφιδικού δεσμού [6], [9]. Σε τέτοιες περιπτώσεις η ενδοαυλική συσσώρευση ξεδιπλωμένη /λανθασμένα διπλωμένες πρωτεΐνες καθορίζει ER στρες, η οποία με τη σειρά της ενεργοποιεί μία σύνθετη αλληλουχία από μονοπάτια σηματοδότησης επιβίωσης, που συλλογικά ονομάζονται ξεδιπλωμένη απόκριση πρωτεΐνης (UPR). Αυτό αποσκοπεί στην ελάφρυνση του ER στρες με την εξασθένηση του ρυθμού της πρωτεϊνικής σύνθεσης και up-ρύθμιση των πρωτεϊνών πτυσσόμενα ένζυμα, τα μηχανήματα ERAD και την εκκριτική ικανότητα [6], [10], [11]. Αν ομοιόσταση δεν μπορεί να αποκατασταθεί, UPR-ενεργοποιημένα μηχανήματα μπορούν να προκαλέσουν προγράμματα θάνατο /γήρανση [12].

Είναι όλο και πιο προφανές ότι η UPR έχει ένα σημαντικό ρόλο στον καρκίνο, όπου απαιτείται για τη διατήρηση της κακοήθη φαινότυπο και να αναπτύξουν αντίσταση στη χημειοθεραπεία [13]. Στην πραγματικότητα, τα καρκινικά κύτταρα πρέπει να προσαρμοστούν σε θρεπτικά συστατικά πείνα και υποξία, οι οποίες επηρεάζουν την κατάσταση κυτταρική οξειδωτική και τη διαθεσιμότητα της ενέργειας από την υδρόλυση του ΑΤΡ. Αυτό αναμένεται να θέσει σε κίνδυνο αναδίπλωσης των πρωτεϊνών των ικανοτήτων τους, προδιαθέτουν για ER στρες [14] – [16]. Ως εκ τούτου, up-ρύθμιση των ERAD-UPR οδών μπορεί να συμβάλει ουσιαστικά στις πολύπλοκες κυτταρικές προσαρμογές που απαιτούνται για την πρόοδο του καρκίνου [17], [18]. Από αυτή την άποψη, είναι γνωστό ότι πολλές ER-κάτοικος πρωτεΐνες απορυθμισμένη, μετα-μεταφραστικά τροποποιημένα, ασυνήθιστα εκκρινόμενη και /ή κυτταρικής επιφάνειας εκ νέου εντοπισμένη σε διάφορους τύπους καρκίνου [13], [19] – [21].

Η πολύπλευρη γονίδιο ERAD

SEL1L

(SEL-1 καταστολέα των lin-12,

C.elegans

-όπως) κωδικοποιεί για τουλάχιστον τρεις διαφορετικές ισομορφές της πρωτεΐνης,

δηλαδή

, η κανονική ER-κάτοικος SEL1LA, ένας υποδοχέας φορτίου που συσχετίζει με την Ε3 ουβικιτίνης-πρωτεΐνης λιγάση HRD1 [22] – [25], και το μικρότερο, πρόσφατα κλωνοποιήθηκε SEL1LB και -C, που στερούνται το ο-τερματικό SEL1LA membrane- εκτείνονται περιοχή για εισαγωγή εντός του ER [26]. Αρκετές αναφορές έχουν δείξει ότι η έκφραση SEL1L πρωτεΐνης μεταβάλλεται σε ανθρώπινους όγκους σε σχέση με συμφωνημένα φυσιολογικούς ιστούς, γεγονός που υποδηλώνει τη συμμετοχή στην εξέλιξη του καρκίνου [27] – [32].

Αναφέρουμε εδώ την ταυτοποίηση, τον χαρακτηρισμό και την υποκυτταρική εντοπισμοί των δύο μυθιστόρημα αγκύρωση ενδογενή παραλλαγές SEL1L, p38 και Ρ28, σπούδασε στις κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού SKBR3 και MCF7, η πολλαπλή γραμμή μυελώματος KMS11 και οι μη ογκογόνων γραμμές ΜΟΡ10Α (μαστού) και 293FT (νεφρού εμβρύου). Βρήκαμε ότι:

i

p38 και Ρ28 κωδικοποιούνται από το 5 ‘άκρο του

SEL1L

γονίδιο?.

ii

. ρ38 ρυθμίζεται προς τα πάνω και ιδιοσυστατικά εκκρίνονται στα καρκινικά κύτταρα, διαφορετικά από την μη-ογκογόνα γραμμή ΜΟΡ10Α? .

iii

ρ28 εκφράζεται μόνο σε φτωχά διαφοροποιημένα γραμμή SKBR3 του καρκίνου του μαστού? .

iv

ER στρες /UPR ενισχύσει σημαντικά την έκκριση της p38 στα καρκινικά κύτταρα?

ν

. Ν-τερματική SEL1L είναι παρούσα σε εκκριτικά και αποικοδομητική διαμερίσματα κυττάρων SKBR3 και KMS11, και σε κυστίδια απελευθερώνονται στον εξωκυτταρικό χώρο. Συνολικά, η βιοχημική και μορφολογικά στοιχεία υποστηρίζουν την άποψη ότι SEL1L ρ38 και ρ28 εμπλέκονται σε μονοπάτια που συνδέουν ER στρες /UPR να ενδοσωματιακή εμπορίας ανθρώπων και για την απέκκριση μέσω εξωκυττάρια-ρίξει κυστίδια. Επιπλέον, η έκφραση της p38 και Ρ28 και την απελευθέρωσή τους στο μέσο καλλιέργειας υπερεκφράζεται σε ογκογόνα σχετικά με μη ογκογόνα κύτταρα, προτείνοντας λειτουργίες σχετίζονται με τον καρκίνο.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές, τον πολιτισμό συνθήκες, επιμολύνσεις

Ανθρώπινο πολλαπλό μυέλωμα KMS11, του καρκίνου του μαστού MCF7, SKBR3, MDAMB453, λέμφωμα Namalwa, τον καρκίνο του τραχήλου HeLa και γλοιοβλαστώματος G144, τα κύτταρα G166 και G179 διατηρήθηκαν σε RPMI που περιέχει 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (EuroClone, Celbio, Pero, Ιταλία). έμβρυο 293 Ανθρώπινα κύτταρα νεφρού FT καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ που περιέχει 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (EuroClone, Celbio, Pero, Ιταλία). Μη ογκογόνα κύτταρα μαστού ΜΟΡ10Α [33] διατηρήθηκαν σε ΜΕΒΜ (Lonza, Treviglio, Ιταλία), συμπληρωμένο με EGF, 20 ng /ml? bFGF, 20 ng /ml? ινσουλίνη, 10 μg /ml? και υδροκορτιζόνη, 0,5 μg /ml. Μη ογκογονικά ανθρώπινα εμβρυϊκά εγκεφαλικά κύτταρα CB660, που λαμβάνεται από τον καθηγητή Austin Smith (Cambridge, UK), διατηρήθηκαν σε ανθρώπινα νευρικά μέσο βλαστοκυττάρων σε λαμινίνη-επικαλυμμένα πιάτα. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με τα υποδεικνυόμενα πλασμίδια και siRNAs με Lipofectamine 2000 (Invitrogen, S.Giuliano M.se, Ιταλία) και συλλέχθηκαν μετά τον υποδεικνυόμενο χρόνο. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DTT (2 mM) για 3 ώρες, MG132 (10 μΜ) για 3 ή 22 ώρες, κυκλοεξιμίδη (200 μg /ml) για 3, 6, 18 ώρες, όπως υποδεικνύεται.

Κατασκευάσματα

Tagged TPD52 ισομορφή 1 κατασκευάσματα δημιουργήθηκαν με κλωνοποίηση του πλήρους μήκους TPD52 ισομορφή 1 κωδικοποιητική αλληλουχία, συντήκονται με ένα myc ή GFP ετικέτα στο άκρο 3 ‘, σε pCDNA3.1myc-HYS (-) Α ή φορείς peGFPN3 , αντίστοιχα (Invitrogen, S. Giuliano M.se, Ιταλία). Οι Μγο-tagged

SEL1LB

κατασκευάσματα που περιγράφηκε προηγουμένως [26].

RT-PCR

Ολικό RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας το διάλυμα αντιδραστηρίου TRI (Applied Biosystems, Monza Ιταλία) . RNA μεταγράφηκε αντίστροφα με SuperScript II TM ανάστροφης μεταγραφάσης (Invitrogen, S. Giuliano M.se, Ιταλία) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ημι-ποσοτική PCR ενισχύσεις πραγματοποιήθηκαν με 2 μΙ προϊόντος RT ανά αντίδραση και 0,15 μονάδες Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogen, S. Giuliano M.se, Ιταλία), χρησιμοποιώντας ένα όργανο Mastercycler (Eppendorf, Μιλάνο, Ιταλία). Οι συνθήκες PCR για όλα τα πειράματα που περιγράφονται εδώ ήσαν: μετουσίωση στους 95 ° C για 3 λεπτά, ακολουθούμενη από 22 κύκλους στους 95 ° C για 30 δευτερόλεπτα, στη συνέχεια στους 60 ° C για 72 δευτερόλεπτα. Οι ακόλουθοι ειδικοί εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν:

SEL1LA

: νόημα: 5′-ctcgctaacaggaggctcagtagtac-3 ‘? αντίθετης φοράς: 5’-gccactggcatgcatctgagc-3 ‘

HRD

1: νόημα: 5′-ggccagggcaatgttccgc-3′? αντίθετης φοράς: 5′-gtccattgcctggagctcc-3 ‘

ΣΣΕ

: νόημα:. 5′-tgcagcaggacatcaagttc-3′? αντίθετης φοράς: 5′-cgctggtcaaagtcttctcc-3 ‘

ATF6

: νόημα: 5′-ctgatggctgttcaatacac-3′? αντίθετης φοράς: 5′-aatgactcagggatggtgct-3 ‘

CHOP

: νόημα: 5′-gatggcagctgagtcattgc-3′? αντίθετης φοράς: 5′-atgcttggtgcagattcacc-3 ‘

XBP-1

: νόημα: 5′-ccttgtagttgagaaccagg-3? αντίθετης φοράς: 5′-ggggcttggtatatatgtgg-3 ‘

GADD45β

: νόημα: 5′-ggaagagctcgtggcgtgcg-3′? αντίθετης φοράς: 5′-gtctcgggcctcggtggtgc-3 ‘

SEL1LB

: νόημα: 5′-ccggccccgagaggaggatgcgggtc-3′? αντίθετης φοράς: 5′-ggggaaacatagataccatg-3 ‘

SEL1LC

: νόημα: 5′-ccggccccgagaggaggatgcgggtc-3′? αντίθετης φοράς: 5′-ggggcaatcagccaaactaatca-3 ‘

HPRT

: νόημα: 5′-aattatggacaggactgaacgtc-3′ αντι-νόημα: 5′-cgtggggtccttttcaccagcaag-3 ‘

κηλίδωση Western, ανοσοκαθίζηση, η ανάλυση των υπερκειμένων καλλιέργειας, Ν-γλυκοσιδάση F και πέψη ενδογλυκοσιδάση η

Μονοκλωνικό SEL1L αντίσωμα που εγείρεται έναντι του Ν-τερματικού πεπτιδίου της ανθρώπινης SEL1L [34]. Συγγένεια-καθαρισμένο πολυκλωνικό αντίσωμα με το SEL1L Ν-άκρο παρασχέθηκε ευγενώς από τον Dr. H.L. Ploegh [35]. πολύκλωνα C-τερματικό αντίσωμα SEL1L συγγένειας καθαρισμένο εγέρθηκε έναντι Μια βακτηριακά-εκφρασμένο ανασυνδυασμένο θραύσμα που κωδικοποιεί τα αμινοξέα 575-738 της ανθρώπινης SEL1L (Primm, Μιλάνο, Ιταλία). Τα μονοκλωνικά αντισώματα αντι-βινκουλίνης και αντι-myc αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, Μιλάνο, Ιταλία). Πολυκλωνικά αντι-TPD52 παρασχέθηκε ευγενώς από τον καθηγητή J. Byrne (Πανεπιστήμιο του Σίδνεϊ, Sydney, NSW, Αυστραλία). Τα κύτταρα λύθηκαν σε 10 mM Tris-HCl (ρΗ 7,4), 150 mM NaCl, 1% ΝΡ40, που περιέχει αναστολείς πρωτεάσης (Pierce, Celbio, Pero, Ιταλία). Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν με τη δοκιμασία Bradford? δείγματα αναλύθηκαν επί πηκτωμάτων SDS-πολυακρυλαμιδίου, κηλιδώθηκαν πάνω σε μεμβράνες PVDF, ανιχνεύθηκαν με ειδικά αντισώματα και αναπτύχθηκε με ECL (Genespin, Μιλάνο, Ιταλία). Για ανοσοκαθίζηση κυτταρολύματα προ-καθαριστεί και επωάστηκαν με αντισώματα ακινητοποιούνται σε πρωτεΐνη G-sepharose (Invitrogen S. Giuliano M.se, Ιταλία). Τα ανοσοϊζήματα πλύθηκαν δύο φορές με 10 mM Tris-HCl ρΗ 7,4, 150 mM NaCl, 0,25% ΝΡ40, μία φορά με 5 mM Tris-HCl, και εκλούεται με ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος πριν από την ηλεκτροφόρηση πηκτώματος. Για την ανάλυση των υπερκειμένων τα κύτταρα πλύθηκαν και επωάστηκαν με ΟΡΤΙΜΕΜ (Invitrogen, S. Giuliano M.se, Ιταλία) για 16 ώρες. Τα υπερκείμενα ανακτήθηκαν, φυγοκεντρήθηκαν, καταβυθίστηκε με 10% TCA, αιωρούνται εκ νέου με 1 Μ Tris-HCl ρΗ 7,4 και διαχωρίστηκαν σε πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου SDS. Όλα τα στυπώματα Western διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το X-BLOT τμήμα (www.isenet.it).

Για την πέψη με

N

α-γλυκοσιδάσης F (PNGase F) ή ενδογλυκοσιδάση Η (ενδο Η), κυτταρολύματα μετουσιώθηκαν με θέρμανση στους 95 ° C σε 0,05% SDS, 0,1% μερκαπτοαιθανόλη για 10 λεπτά και στη συνέχεια επωάστηκαν στους 37 ° C για 1 ώρα με ή χωρίς PNGase F ή ενδο η (New England Biolabs, Celbio, Pero, Ιταλία) , σύμφωνα με τις ενδείξεις του προμηθευτή.

ανοσοφθορισμού μικροσκοπία

κύτταρα SKBR3, αναπτύχθηκαν σε καλυπτρίδες, ακατέργαστα ή κατεργασμένα με DTT, όπως περιγράφεται παραπάνω, μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη σε PBS για 30 λεπτά, πλύθηκαν σε 0.1 Μ γλυκίνη για 20 λεπτά, και διαπερατά σε 0.1% Triton Χ-100 για επιπλέον 5 λεπτά. Για να διερευνηθούν οι υποκυτταρικούς εντοπισμούς του SEL1L, τα κύτταρα επωάστηκαν με το Ν-τερματικό αντι-SEL1L μονοκλωνικό αντίσωμα [34] και με πολυκλωνικά αντισώματα έναντι του Καλρετικουλίνης δείκτη ER (Affinity Bioreagents, Breda, The Netherlands) και το Golgi δείκτη Giantin (Covance , Princeton, NJ, USA). Οι πυρήνες βάφτηκαν με 4,6-διαμιδο-2-φαινυλινδόλιο (ϋΑΡΙ, Sigma-Aldrich, Μιλάνο, Ιταλία). Πρωτογενή αντισώματα οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας αντι-ποντικού IgG (Cappel Research Products) ή Texas Red-συζευγμένη με IgG αίγας αντι-κουνελιού (Jackson Immunoresearch Laboratories) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Apotome Axio Παρατηρητής Ζ1 ανεστραμμένο μικροσκόπιο (Zeiss, Oberkochen, Γερμανία), εξοπλισμένο με μία AxioCam MRM Rev.3 σε 40Χ μεγέθυνση. Συνεντόπισης σημάτων φθορισμού αναλύθηκε με AxioVision 4.6.3 λογισμικό. Η ανάλυση εικόνας πραγματοποιήθηκε με χρήση Adobe Photoshop.

Cryoimmunoelectron μικροσκοπία

Cells επεξεργασία για μικροσκοπία cryoimmunoelectron αναπτύχθηκαν όπως παραπάνω και σταθεροποιήθηκαν σε 2% παραφορμαλδεΰδη, 0,2% γλουταραλδεΰδη σε φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα 0,1 Μ, ρΗ 7,4, για 2 ώρες στους 25 ° C. Τα κύτταρα αποξέσθηκαν από τα καλυπτρίδες, φυγοκεντρείται, ενσωματωμένα μέσα σε 10% ζελατίνη (Sigma-Aldrich) σε 0.1 Μ PBS, ρΗ 7.4 και στερεοποιείται επί πάγου. Μετά την έγχυση σε 2,3 Μ σακχαρόζης όλη τη νύκτα στους 4 ° C, μπλοκ κυττάρων τοποθετείται σε πείρους αλουμινίου και καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο. Υπέρλεπτων κατεψυγμένες τομές (60 nm) κόπηκαν στους -120 ° C χρησιμοποιώντας ένα cryoultramicrotome Ultracut EM FC6 (Leica Microsystems, Βιέννη, Αυστρία), που συλλέγονται με 1% μεθυλοκυτταρίνη σε 1.15 Μ σακχαρόζη και μονής ή διπλής ανοσοεπισημάνθηκαν με πρωτογενή αντισώματα. Τα δεσμευμένα αντισώματα κατέστησαν ορατά χρησιμοποιώντας κατσικίσια αντι-ποντικού συζευγμένο με 5- ή 15-nm κολλοειδούς χρυσού (British BioCell International, Cardiff, UK) ή με πρωτεΐνη-Α συζευγμένο με 10-nm κολλοειδούς χρυσού (παρέχεται από G.Posthuma και J. Slot , Ουτρέχτη, Ολλανδία). Ανοσοσήμανση εκτελέστηκε με τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα: μονοκλωνικά αντι-SEL1L Ν-άκρο [34], πολυκλωνικά αντι-SEL1L Ν-άκρο [35], πολυκλωνικά άκρο αντι SEL1L-C, πολυκλωνικά αντι-Καλρετικουλίνης (Affinity Bioreagents), αντι-CD63 μονοκλωνικά H5C6, που αναπτύχθηκε από τον JT Αύγουστο και Ι.Ε.Κ. Hildreth, που λαμβάνεται από το Αναπτυξιακών Μελετών Hybridoma Bank αναπτύχθηκε υπό την αιγίδα του NICHD και συντηρείται από το Πανεπιστήμιο της Αϊόβα, Τμήμα Βιολογίας (Iowa City, IA 52242), και μονοκλωνικά αντι-c-Myc (Sigma-Aldrich) για

SEL1LBmyc

επιμολυσμένα 293 κύτταρα FT [26]. Μονά και διπλά ανοσοσήμανση διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23], [36]. Κρυοτομές αναλύθηκαν με τη Philips CM10 ηλεκτρονικό μικροσκόπιο.

Off-gel πρωτεΐνες κλασματοποίηση

ημι-υγρή ισοηλεκτρική εστίαση κλασματοποίηση φάση διεξήχθη σε 3100 συσκευή Off-Gel (Agilent Technologies, Cernusco, IT ) χρησιμοποιώντας ένα 24 cm λωρίδα με ακινητοποιημένα πήγματα βαθμίδωσης ρΗ στην περιοχή 4-7. Σύνολο δειγμάτων κυτταρικής λύσης (360 μΙ, που αντιστοιχεί σε 1.300 μg των πρωτεϊνών) αναμίχθηκαν με 3240 μΙ ρυθμιστικού ισοηλεκτρική εστίαση (Agilent Technologies) και φορτώνεται στην συσκευή. Πρωτεΐνη κλασματοποίηση εκτελέστηκε επί 26 ώρες με μέγιστο 8,000 Volt για ένα σύνολο 60.000 V /ώρες, σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα προκύπτοντα υγρά κλάσματα (150 μl) με 0,25 περιοχή ρΗ συλλέχθηκαν και υποπολλαπλάσια των πρωτεϊνών επιλυθεί περαιτέρω σε ποσοστό 10% ακρυλαμιδίου SDS-PAGE για στύπωμα Western σχολαστικά.

Αναγνώριση των πρωτεϊνών με φασματομετρία μάζας MALDI-TOF ανάλυση (MS)

Συγκροτήματα ενδιαφέροντος από SDS-PAGE αποκόπηκαν από πηκτώματα, μειωμένη, αλκυλιωμένα και χωνεύεται επί μία νύκτα με θρυψίνη βοδιού (Roche, Μιλάνο, Ιταλία), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [37]. Ένα μΐ (1 μl) κλάσματα του υπερκειμένου χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση μάζας χρησιμοποιώντας την τεχνική ξηραίνεται σταγονιδίων και α-κυανο-4-υδροξυκινναμωμικού οξέως ως μήτρα. Τα φάσματα μάζης ελήφθησαν σε ένα φασματόμετρο μάζας MALDI-TOF Voyager-DE STR (Applied Biosystem, Foster City, CA). Εναλλακτικά, όξινο και βασικό εκχύλιση πεπτιδίου από τεμάχια γέλης μετά τρυπτική πέψη διεξήχθη και τα προκύπτοντα μίγματα πεπτιδίων υποβάλλεται σε ένα μόνο βήμα αφαλάτωσης /συγκέντρωση πριν από την ανάλυση MS υπεράνω Zip-TipC18 (Millipore Corporation, Bedford, ΜΑ, USA). Φάσματα εσωτερικά διαμορφώνεται με τη χρήση των προϊόντων θρυψίνη αυτόλυση και επεξεργασία μέσω του λογισμικού Explorer δεδομένων. Πρωτεΐνες προσδιορίζεται με σαφήνεια από την αναζήτηση μιας συνολικής μη πλεονασματική βάση δεδομένων πρωτεΐνης του National Center for Biotechnology Information (NCBI, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) και η βάση δεδομένων πρωτεϊνική ακολουθία Φασματομετρίας Μάζας (MSDB, http: //msdn.microsoft.com/en-us/library/ms187112.aspx), επιλεγμένη από προεπιλογή χρησιμοποιώντας στο σπίτι τα προγράμματα λογισμικού ProFound v4.10.5 και μασκότ v1.9.00, αντίστοιχα [38], [39]. Μία αποτυχημένη διάσπαση ανά πεπτίδιο επιτρέπεται, και μια αρχική μάζα ανοχή 50 ppm χρησιμοποιήθηκε σε όλες τις αναζητήσεις.

Αποτελέσματα

Μυθιστόρημα ER-αγκύρωση SEL1L παραλλαγές

Ένα μονοκλωνικό αντίσωμα εγείρεται έναντι του Ν-άκρου της πρωτεΐνης SEL1L [34] χρησιμοποιήθηκε για την διαλογή ενός πίνακα ολόκληρων κυτταρολυμάτων από πέντε ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές, συμπεριλαμβανομένων των MCF7 και SKBR3 (καρκίνος του μαστού), KMS11 (Ig-K εκκρίνει το πολλαπλό μυέλωμα), 293FT ( νεφρό εμβρύου) και το μη ογκογόνο επιθηλιακών κυττάρων του μαστού γραμμή ΜΟΡ10Α. Εκτός από το γνωστό 95 KDa SEL1LA πρωτεΐνη, δύο προσθετικό συγκροτήματα, που ορίζεται ως ρ38 και ρ28, έγιναν ορατά σε περίπου 38 KDa και 28 KDa (Σχήμα 1Α). Ενώ Ρ28 ανιχνεύθηκε αποκλειστικά στη γραμμή SKBR3, ρ38 εκφράζεται έντονα, σε επίπεδα υψηλότερα από SEL1LA, σε όλες τις καρκινικές κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν, με χαμηλότερα επίπεδα σε ΜΟΡ10Α, όπου η έκφραση SEL1LA (πρωτεΐνης και RNA) ήταν επίσης χαμηλότερη (Σχήμα 1 Α- ΣΙ). Ένα πολυκλωνικό αντίσωμα που εγείρεται έναντι του SEL1L C-τελικό άκρο, η οποία περικλείει την SEL1LA ουρά άγκυρα για εισαγωγή εντός της μεμβράνης ER, ανίχνευσε την πρωτεΐνη 95 KDa SEL1LA, αλλά όχι p38 και Ρ28, μολονότι μια πρόσθετη ζώνη αποδείχθηκε στα περίπου 55 kDa, η οποία θα μπορούσε υποδεικνύουν την καρβοξυ-τερματικό θραύσμα που προκύπτει από τη διάσπαση της φυσικής πρωτεΐνης (Εικόνα S1A). Αξίζει να σημειωθεί ότι η παραλλαγή ρ38 εκφράστηκε έντονα και σε άλλα δοκιμάστηκαν καρκινικές κυτταρικές σειρές, συμπεριλαμβανομένων Namalwa (λέμφωμα), MDAMB453 (καρκίνος του μαστού), HeLa (καρκίνος του τραχήλου της μήτρας), και G144, G166, G179 (γλοιοβλάστωμα), όλα εκ των οποίων είχε ως αποτέλεσμα αρνητικό για Ρ28 (Σχήμα S1B). Ανάλυση των προφίλ πρωτεΐνης SEL1L στο μη ογκογόνο ανθρώπινο εγκέφαλο κυτταρική γραμμή εμβρυϊκού CB660 σε σύγκριση με τις τρεις κυτταρικές γραμμές γλοιοβλαστώματος (Σχήμα S1B) παρείχε περαιτέρω

in vitro

απόδειξη ότι η ρ38 ήταν πράγματι εκφράζονται σε υψηλότερα επίπεδα σε καρκινικά κύτταρα.

Α. Ανάλυση κηλίδας Western: Τα προϊόντα λύσης (50 ug) από διαφορετικές κυτταρικές σειρές, συμπεριλαμβανομένων 293FT (νεφρού εμβρύου), ΜΟΡ10Α (μη ογκογόνα μαστού), MCF7, SKBR3 (καρκίνος του μαστού) και KMS11 (πολλαπλό μυέλωμα), αναλύθηκαν με SDS-PAGE ( 10%) και ανιχνεύθηκαν με μονοκλωνικό να SEL1L Ν-άκρο. Βινκουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Εκτός από SEL1LA (95 kDa), το Ν-τερματικό αντίσωμα SEL1L αναγνωρίζονται δύο μικρότερα κωδικοποιημένες προϊόντων, σε περίπου 38 και 28 kDa (p38 ορισθεί και Ρ28). P38 ήταν πιο άφθονη από SEL1LA και τα δύο ήταν επάνω διαμορφωμένου στις καρκινικές κυτταρικές γραμμές σε σχέση με ΜΟΡ10Α. P28 ήταν ανιχνεύσιμο μόνο σε SKBR3. Συγκροτήματα παραπάνω ρ38, πιθανώς αντιστοιχεί σε ανώριμα προδρόμους ή μετα-μεταφραστικά τροποποιημένα προϊόντα, ενίοτε παρατηρήθηκαν στις εξετασθείσες κυτταρικές γραμμές. Η κηλίδα είναι αντιπροσωπευτικά τεσσάρων ανεξάρτητων πειραμάτων. Β RT-PCR ανάλυση: RNAs από KMS11, ΜΟΡ10Α και κυττάρων SKBR3 αναλύθηκαν με RT-PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές ειδικούς για

SEL1LA

. Σήματα εμφανίζονται ελήφθησαν με 27 κύκλους για

SEL1LA

.

HPRT

χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας φόρτωσης.

SEL1LA

ήταν επάνω διαμορφωμένου στις καρκινικές κυτταρικές γραμμές σε σχέση με το μη ογκογόνα γραμμή ΜΟΡ10Α. Η εικόνα είναι αντιπροσωπευτική τριών διαφορετικών δοκιμασίες που βασίζονται σε ανεξάρτητες θεραπείες. Γ

Intra /μεταξύ

-molecular δεσμούς δισουλφιδίου ανάλυση της p38. κυτταρολύματα 293FT αναλύθηκαν με SDS-PAGE (10%) υπό αναγωγικές (R) και μη-αναγωγικές συνθήκες (NR) και στυπώθηκαν με μονοκλωνικό αντι-SEL1L Ν-άκρο. P38 μετανάστευσε σαν μία δυάδα υπό μη αναγωγικές συνθήκες (οι λωρίδες συγκρίνοντας μετανάστευση ρ38 κάτω από αναγωγικές και μη αναγωγικές συνθήκες είναι από την ίδια γέλη). Δ Down-διαμόρφωσης των SEL1LA, Ρ28 και της p38 από SEL1L μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA): Αριστερός πίνακας: κύτταρα SKBR3 (3 × 10

5) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με μπερδεμένο siRNA ή siRNA ειδικά για SEL1L (siRNA SEL1L) για 48 ώρες, που ακολουθείται από μια δεύτερη θεραπεία siRNA για περαιτέρω 48 ώρες. Σίγαση αποτελεσματικότητα επιβεβαιώθηκε με κηλίδα Western. SEL1LA, τα επίπεδα Ρ28 και της πρωτεΐνης ρ38 μειώθηκε κοντά στο 55%, 30% και 16% αντίστοιχα σε σύγκριση με κύτταρα κατεργασμένα με μπερδεμένο siRNA. Βινκουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Δεξιό πλαίσιο: 293FT κύτταρα (6 × 10

5) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με μπερδεμένο siRNA ή siRNA-SEL1L για 48 ώρες. επίπεδα SEL1LA και πρωτεΐνη ρ38 μειώθηκε κοντά στο 45% και 23% αντίστοιχα σε σύγκριση με κύτταρα κατεργασμένα με μπερδεμένο siRNA. Βινκουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Τα ιστογράμματα δείχνουν τιμές κανονικοποιούνται σε σχέση με τα σήματα οικοκυρική και εκφράζονται ως φορές διαφοροποίησης σε σχέση με τους μάρτυρες, πυκνομετρική ανάλυση προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα απεικόνισης Scion. (Www.scioncorp.com). Τα δεδομένα είναι οι μέσοι όροι από τρία ανεξάρτητα πειράματα, ± SD? έλεγχος τ χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η στατιστική σημαντικότητα *

σ

& lt? 0.1? **

σ

& lt? 0,05. Ε Ανάλυση ρ38 και SEL1LA σταθερότητα: 293 κύτταρα FT (6 × 10

5) υποβλήθηκαν σε θεραπεία για 3, 6 και 18 ώρες με κυκλοεξιμίδιο (CHX, 200 μg /ml). Δείγματα των προϊόντων λύσης (50 μg) αναλύθηκαν με SDS-PAGE (10%) και ανιχνεύθηκαν με μονοκλωνικό αντι-SEL1L και αντι-βινκουλίνης αντισώματα. Σε αντίθεση με SEL1LA, η οποία μειώθηκε σταδιακά κατά τη διάρκεια του κυκλοεξιμιδίου έκθεσης έως περίπου 90%, τα επίπεδα της p38 δεν μεταβλήθηκε σημαντικά. Το ιστόγραμμα παρουσιάζει τις πυκνομετρικές ποσοτικούς προσδιορισμούς που λαμβάνονται μέσω του προγράμματος απεικόνισης Scion (www.scioncorp.com). Τιμές κανονικοποιούνται σε σχέση με τα σήματα καθαριότητας και εκφράζονται ως φορές διαφοροποίηση σε σχέση με μη επεξεργασμένα δείγματα. Τα δεδομένα είναι μέσοι όροι δύο ανεξάρτητων πειραμάτων, ± SD.

Η

Όταν αναλύθηκαν σε 293FT κύτταρα με SDS-PAGE και ανοσοστύπωμα υπό αναγωγικές συνθήκες, μετανάστευσε ρ38 ως μονομερές, ενώ φάνηκε ως δυάδα υπό μη -μείωση συνθήκες (σχήμα 1 C). Ετσι, ενώ πολλές πρωτεΐνες που περιέχουν ενδομοριακούς δισουλφιδικούς δεσμούς μεταναστεύουν ταχύτερα υπό μη αναγωγικές συνθήκες, λόγω της πιο συμπαγή φυσική δομή [40], ρ38 μεταναστεύει ταχύτερα σε μειωμένη σε σχέση με οξειδωμένη κατάσταση, φαινόμενο που υποδηλώνει ότι η πιο αργά μεταναστεύει μορφή θα μπορούσε να εμπλακεί σε διαμοριακών δισουλφιδικών δεσμών [41] – [43]. Το σήμα Ρ28 εμφανίστηκε ως μία μονή ζώνη κάτω και από αναγωγικές και μη-αναγωγικές συνθήκες (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Για να διασφαλιστεί ότι η p38 και Ρ28 ήταν

καλόπιστους

ενδογενούς

SEL1L

που κωδικοποιείται πρωτεΐνες, SKBR3 και 293FT κύτταρα επιμολύνθηκαν με siRNAs που στοχεύουν στην SEL1L Ν-άκρο. Τα επίπεδα των τριών σημάτων SEL1L ήταν σημαντικά χαμηλότερα στα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με

SEL1L

έναντι ομελέτα siRNAs, με μειώσεις 55% και 45% για SEL1LA και του 16% και 23% για την p38 σε SKBR3 και 293FT κύτταρα αντίστοιχα, και από 30% για ρ28 σε SKBR3 (Εικόνα 1D). Σε 293FT κύτταρα, αναστολή της πρωτεϊνικής σύνθεσης από κυκλοεξιμίδιο για 3 και 6 ώρες, χρόνος παράθυρα που δεν οδήγησε σε κυτταρικό θάνατο, μείωσε το επίπεδο SEL1LA κατά περίπου 50%, αλλά δεν είχε σχεδόν καμία επίδραση στην ρ38 (Σχήμα 1 Ε). Σε 18 ώρες, κυκλοεξιμίδιο προκάλεσε θάνατο των κυττάρων, η ταυτόχρονη στη δραστική μείωση των SEL1LA (περίπου 90%), αλλά δεν αλλάζει το επίπεδο ρ38. Αυτό υποδεικνύει ότι η ρ38 είναι πιο σταθερές από SEL1LA, η οποία μπορεί να ευθύνεται για τη μέτρια εξάντληση ρ38 από siRNAs στο SEL1L Ν-άκρο.

Συνολικά, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η ρ38 και ρ28 είναι SEL1L παραλλαγές πρωτεΐνης που κωδικοποιείται από το 5 ‘άκρο του

SEL1L

γονίδιο. Ενώ ρ38 είχε ως αποτέλεσμα εκφράζεται σε όλες τις εξετασθείσες κυτταρικές γραμμές, με υψηλότερα επίπεδα στις σειρές καρκίνου, Ρ28 ανιχνεύθηκε μόνο σε πτωχά διαφοροποιημένο μεταστατικό γραμμή καρκίνου του μαστού SKBR3 [44].

Οι παραλλαγές ρ38 και ρ28 εμφανίζει ιδιότητες εκκριτική

Για να διερευνήσει τη συμπεριφορά και την έκκριση της ρ38 και ρ28 σε κύτταρα κάτω ER στρες /UPR, αναλύσαμε με SDS-PAGE και κυττάρων ανοσοαποτύπωση λύματα και υπερκείμενα καλλιέργειας των ΜΟΡ10Α, SKBR3 και τα κύτταρα KMS11 υπό κανονικές συνθήκες και μετά τη θεραπεία με DTT, η οποία προκαλεί εσφαλμένη αναδίπλωση πρωτεΐνης, μειώνοντας δισουλφιδικούς δεσμούς [45] (Σχήμα 2Α-C). Σε όλες τις δοκιμασμένες κύτταρα DTT ενεργοποίησε ER στρες /UPR, η οποία αξιολογείται από

XBP-1

μάτισμα σε συνδυασμό με

ΣΣΕ

,

ATF6

και

CHOP

up -modulation, και ενίσχυσε

SEL1LA

έκφραση mRNA (Σχήμα 2Α1, C1? Σχήμα S2A-C), ενώ το επίπεδο της πρωτεΐνης SEL1LA δεν αύξησε σημαντικά (Σχήμα 2Α-ο, C2). P38, αλλά δεν SEL1LA, ήταν εύκολα ανιχνεύσιμη σε SKBR3 και KMS11 υπερκείμενα, αυξάνοντας κοντά σε τρεις και πέντε φορές, αντίστοιχα, μετά DTT (Σχήμα 2Β-C). Καμία ένδειξη ρ38 ανιχνεύθηκε σε υπερκείμενα ΜΟΡ10Α, τόσο υπό κανονικές όσο και DTT-ακραίες συνθήκες (Σχήμα 2Α). Ρ28 βρέθηκε αποκλειστικά μετά την κατεργασία DTT και μόνο στο υπερκείμενο της κυτταρικής γραμμής SKBR3, η οποία εκφράζει την παραλλαγή αυτή (Σχήμα 2Β).

A. Η ανάλυση στυπώματος Western των μη επεξεργασμένων και DTT-επεξεργασμένα κύτταρα ΜΟΡ10Α: κύτταρα ΜΟΡ10Α εκτέθηκαν σε DTT (2 mM) για 3 ώρες και διαδοχικά διατηρήθηκε για 24 ώρες σε OptiMEM. Η εκκρινόμενη πρωτεΐνη (50 μg) που εξάγεται από το μέσο καλλιέργειας με καθίζηση TCA, και δείγματα των προϊόντων λύσης κυττάρου (50μg) διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE (10%) και στυπώθηκαν με μονοκλωνικά αντι-SEL1L και αντι-βινκουλίνης αντισώματα. P38 δεν ήταν ανιχνεύσιμη στο μέσο καλλιέργειας, τόσο κατά την παρουσία και απουσία του DTT. Εκτός από την ρ38, κύτταρα ΜΟΡ10Α έδειξε μια υψηλότερη ζώνη, πιθανώς αντιστοιχεί σε ένα ανώριμο πρόδρομο ή μετα-μεταφραστικά τροποποιημένου προϊόντος. Η εικόνα είναι αντιπροσωπευτική της δύο ανεξάρτητα πειράματα. Α1. RT-PCR ανάλυση των μη επεξεργασμένων και DTT-επεξεργασμένα κύτταρα ΜΟΡ10Α: RNA εκχυλίστηκε από τα δείγματα που περιγράφονται στο πλαίσιο Α και αναλύθηκαν με RT-PCR για την UPR απόκριση. Το ιστόγραμμα δείχνει έκφραση ομαλοποιημένων τιμών σε σχέση με τα σήματα οικοκυρική και εκφράζεται ως διαφοροποίηση φορές σε σχέση με τα μη επεξεργασμένα δείγματα? πυκνομετρική ανάλυση έγινε με το πρόγραμμα απεικόνισης Scion. UPR ενεργοποίηση κατά την αγωγή DTT υποδεικνύεται από up-διαμόρφωση των

ΣΣΕ

και

CHOP

και

XBP-1

μάτισμα, ταυτόχρονα

SEL1LA

αυξάνεται ( γκρίζα γραμμή). Οι αντίστοιχες εικόνες φαίνεται στο Σχήμα S2A. Τα δεδομένα είναι οι μέσοι όροι από δύο διαφορετικές δοκιμασίες βασίζονται σε ανεξάρτητες θεραπείες, ± SD. Η ανάλυση στυπώματος Western Β μη επεξεργασμένου και DTT-επεξεργασμένα κύτταρα SKBR3: Έκκριση ρ38 και Ρ28 αξιολογήθηκε σε μη επεξεργασμένα και DTT κατεργασμένα κύτταρα SKBR3. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε DTT (2 mM) για 3 ώρες ή δεν εκτίθενται διατηρήθηκαν για 24 ώρες σε OptiMEM. Η εκκρινόμενη πρωτεΐνη (50 μg) που εξάγεται από το μέσο καλλιέργειας με καθίζηση TCA, και δείγματα των προϊόντων λύσης κυττάρου (50μg) διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE (12%) και στυπώθηκαν με αντι-SEL1L και αντι-βινκουλίνης αντισώματα. ER στρες /UPR προώθησε έντονα την έκκριση της ρ38 και, σε μικρότερο βαθμό, Ρ28 στο μέσο καλλιέργειας. Η εικόνα είναι αντιπροσωπευτική πέντε ανεξάρτητα πειράματα. Η ανάλυση στυπώματος Western Γ κυττάρων KMS11 κατεργασία με DTT και MG132: KMS11 κύτταρα εκτέθηκαν σε DTT (2 mM) ή MG132 (10 μΜ) για 3 ώρες και διαδοχικά διατηρήθηκε για 24 ώρες σε OptiMEM. Η εκκρινόμενη πρωτεΐνη (30 μg), που εξάγεται από το μέσο καλλιέργειας με καθίζηση TCA, και δείγματα των προϊόντων λύσης κυττάρου (50μg) διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE (10%) και στυπώθηκαν με αντι-SEL1L και αντι-βινκουλίνης αντισώματα. Και οι δύο θεραπείες αισθητά επαγόμενη έκκριση ρ38 στο μέσο καλλιέργειας. Η εικόνα είναι αντιπροσωπευτική πέντε ανεξάρτητα πειράματα. C1. RT-PCR ανάλυση των κυττάρων KMS11 σε επεξεργασία με DTT και MG132: RNA εκχυλίστηκε από τα ίδια δείγματα που περιγράφονται στον πίνακα Γ και αναλύθηκαν με RT-PCR για την UPR απόκριση. Το ιστόγραμμα δείχνει την έκφραση τιμές κανονικοποιούνται σε σχέση με τα σήματα καθαριότητας και εκφράζονται ως φορές διαφοροποίηση σε σχέση με τα μη επεξεργασμένα δείγματα? πυκνομετρική ανάλυση προσδιορίστηκε από το πρόγραμμα απεικόνισης Scion. UPR ενεργοποίηση κατά την αγωγή DTT υποδεικνύεται από το up-ρύθμιση του

ATF6

,

ΣΣΕ

, και

CHOP

και

XBP-1

μάτισμα ( βλέπε σχήμα S2C), ταυτόχρονα την έκφραση του

SEL1LA

,

HRD1

και

GADD45β

αυξάνεται (γκρίζα γραμμή). Οι αντίστοιχες εικόνες φαίνεται στο Σχήμα S2C. επεξεργασία MG132 δεν ενεργοποιούν UPR ενεργοποίησης, όπως υποδεικνύεται από την απουσία του

ATF6

και

BIP

un-διαμόρφωση και η έλλειψη

XBP-1

μάτισμα (βλέπε Εικόνα S2C) ωστόσο,

CHOP

και

GADD45β

ήταν σημαντικά up-διαμορφωμένο και

SEL1LA

και

HRD1

κάτω-διαμορφωμένο (μαύρες μπάρες). Τα δεδομένα είναι μέσοι όροι τεσσάρων διαφορετικές δοκιμασίες βασίζονται σε ανεξάρτητες θεραπείες, ± SD. C2. έκφραση της πρωτεΐνης σε κύτταρα SEL1LA KMS11 σε επεξεργασία με DTT και MG132: Το ιστόγραμμα δείχνει τιμές έκφραση SEL1LA πρωτεΐνη που λαμβάνεται από τα δείγματα που περιγράφονται στο πλαίσιο C, κανονικοποιημένη σε σχέση με τα σήματα οικοκυρική και εκφράζονται ως φορές διαφοροποίηση σε σχέση με το μη επεξεργασμένο δείγμα? πυκνομετρική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα απεικόνισης Scion. MG132 καθορίζεται συσσώρευση της πρωτεΐνης SEL1LA έως 2 φορές σε σχέση με το επίπεδο ελέγχου (μαύρη γραμμή). Τα δεδομένα είναι οι μέσοι όροι των τεσσάρων ανεξάρτητων πειραμάτων, ± SD.

Η

MG132, η οποία καθορίζει ER στρες μέσω ERAD απόφραξη από την αναστολή του πρωτεασώματος [46], δοκιμάστηκε στη γραμμή μυελώματος KMS11, είναι γνωστό ότι το κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού είναι αρκετά ανθεκτικά σε τέτοια θεραπεία [47]. Ένα περίπου πενταπλάσια αύξηση του p38 στο μέσο KMS11 συνέβη μετά από τρεις ώρες MG132 έκθεσης, η ταυτόχρονη σε σημαντική αύξηση

CHOP

και

GADD45β

έκφρασης, ενδεικτικό της ER στρες /UPR ενεργοποίηση, ακόμα και αν σε περίπτωση απουσίας του

XBP-1

μάτισμα και

ΣΣΕ

και

ATF6

up-διαμόρφωση (Σχήμα 2C-C1? Σχήμα S2C). θεραπεία MG132 αύξησε επίσης το πρωτεϊνικό επίπεδο SEL1LA (Σχήμα 2C, C2), που είναι συμβατό με τα στοιχεία αποδείξεις ότι SEL1LA αποικοδομείται μέσω πρωτεασώματος [22].