έχουν

Αφηρημένο

Ιστορικό

Τα microRNAs (miRNAs) έχουν θεωρηθεί ως κρίσιμος παράγοντας στην στόχευση ογκογονίδια ή ογκοκατασταλτικών γονιδίων στην ογκογένεση. Η γενετική προδιάθεση των οδών miRNAs σηματοδότησης που σχετίζονται με την ανάπτυξη της προφορικής πλακώδες καρκίνωμα (OSCC) παραμένει άλυτο. Αυτή η μελέτη εξέτασε τις συσχετίσεις των πολυμορφισμών με τέσσερις miRNAs με την ευαισθησία και την κλινικοπαθολογικών χαρακτηριστικά OSCC.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Ένα σύνολο 895 άρρενα άτομα, συμπεριλαμβανομένων 425 έλεγχοι και 470 άνδρες με καρκίνο του στόματος ασθενείς, επιλέχθηκαν. Πολυμεράσης αλυσίδα μήκους θραύσματος αντίδραση περιορισμού πολυμορφισμού (PCR-RFLP) και σε πραγματικό χρόνο PCR χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση miRNA146a, miRNA196, miRNA499 και miRNA149 γενετικούς πολυμορφισμούς μεταξύ της ομάδας ελέγχου και της ομάδας υπόθεση. Αυτή η μελέτη διαπίστωσε ότι μια σημαντική συσχέτιση της miRNA499 με CC γονότυπο, σε σύγκριση με τα άτομα με ΤΤ γονότυπο, είχαν υψηλότερο κίνδυνο (AOR = 4,52, 95% CI = 1,24 – 16,48) της OSCC. Επιπλέον, η επίδραση αυτών των τεσσάρων miRNAs πολυμορφισμό του γονιδίου για την ευαισθησία του betel καρύδι και την κατανάλωση προϊόντων καπνού που οδηγούν σε καρκίνο του στόματος, επίσης, αποκάλυψε. Βρήκαμε μια προστατευτική επίδραση μεταξύ της αναπτυξιακής κλινικό στάδιο (AOR = 0,58, 95% CI = 0,36 – 0,94) και την αύξηση του μεγέθους του όγκου (AOR = 0.47, 95% CI = 0,28 – 0,79) σε νεότερους ασθενείς (ηλικίας & lt? 60).

Συμπεράσματα

τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ο γενετικός πολυμορφισμός του miRNA499 συνδέεται με από του στόματος καρκινογένεση, και η αλληλεπίδραση του γενετικού πολυμορφισμού miRNAs και περιβαλλοντικών καρκινογόνων σχετίζεται επίσης με αυξημένο κίνδυνο καρκίνου του στόματος στην Ταϊβάν.

Παράθεση: Chu YH, Tzeng SL, Lin CW, Chien ΜΗ, Τσεν ΜΚ, Yang SF (2012) Επιπτώσεις των microRNA γονιδίων πολυμορφισμών με την ευαισθησία των Περιβαλλοντικών παραγόντων που οδηγούν σε καρκινογένεση στον καρκίνο του στόματος. PLoS ONE 7 (6): e39777. doi: 10.1371 /journal.pone.0039777

Επιμέλεια: Brock C. Christensen, Geisel της Ιατρικής Σχολής του Dartmouth, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 7 του Γενάρη του 2012? Αποδεκτές: 25 Μαΐου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 28, Ιουνίου του 2012

Copyright: © 2012 Chu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

MircoRNAs (miRNAs) είναι μικρά RNAs κομμάτι, το οποίο περιέχουν περίπου 20-22 νουκλεοτίδια, μπορούν να στοχεύσουν ειδικά τα mRNA και αρνητικά ρυθμίζουν μεταφραστική απόδοση και τη σταθερότητα τους [1]. Προηγούμενη ευρήματα έχουν δείξει ότι ένας miRNA θα μπορούσε να επηρεάσει την έκφραση διαφόρων γονιδίων-στόχων. Σύμφωνα με τη ρύθμιση διαφορετικών RNAs στόχου, miRNAs μπορούν να συμμετέχουν σε κυτταρικές διαδικασίες, συμπεριλαμβανομένων πολλαπλασιασμού, διαφοροποίησης και την επιβίωση [2]. Η αλλαγμένη έκφραση miRNA έχει παρατηρηθεί σε πολλές ασθένειες, ιδιαίτερα στον καρκίνο [3].

Στην Ταϊβάν, ο καρκίνος του στόματος είναι η τέταρτη πιο κοινή μορφή καρκίνου μεταξύ των ανδρών. Μια γρήγορη αύξηση της συχνότητας εμφάνισης του καρκίνου του στόματος σημειώθηκαν κατά τα τελευταία χρόνια και ακαθάριστο ποσοστό θνησιμότητας του καρκίνου του στόματος ήταν 10,1 ανά 100.000 το 2007 και κατατάσσεται ως η έκτη αιτία θανάτου από καρκίνο [4]. Στη διάρκεια των τελευταίων ετών, η επίπτωση του καρκίνου του στόματος ήταν ιδιαίτερα υψηλό στη Νότια Ασία. Το φαινόμενο αυτό εμφανίζεται κυρίως σε πληθυσμούς συνηθίσει να το μάσημα του arec (του bétel) παξιμάδι [5]. Επιδημιολογικές μελέτες έχουν επίσης προτείνει ότι η ευαισθησία του καρκίνου του στόματος διαμεσολαβείται από δύο καρκινογόνες ουσίες στο περιβάλλον (συμπεριλαμβανομένης της κατανάλωσης αλκοόλ, η κατανάλωση καπνού και betel καρύδι μάσημα) και γενετικοί παράγοντες [6]. Όλο και περισσότερα στοιχεία δείχνουν ότι οι miRNAs συνδέονται με το κεφάλι και το λαιμό /καρκίνο του στόματος [7], και αρκετές miRNAs έχουν δειχθεί ότι είναι άναρχη σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου [8]. Η σχέση αυτή έχει επίσης προσδιοριστεί στην εργαστηριακή έρευνα [9].

πολυμορφισμού ενός νουκλεοτιδίου (SNP) είναι μία παραλλαγή στην ακολουθία του DNA η οποία συμβαίνει όταν τα νουκλεοτίδια (Α, Τ, C ή G) αλλαγή σε τουλάχιστον 1 % ενός συγκεκριμένου πληθυσμού. Μερικές επιδημιολογικές στοιχεία δείχνουν ότι οι miRNA γενετικές παραλλαγές που συνδέονται με την εξέλιξη σε καρκίνο του στόματος [10], [11]. Ενώ miRNAs έχουν λάβει σημαντική προσοχή τα τελευταία χρόνια, SNPs σε miRNA και προ-miRNA ακολουθίες έχουν ανακαλυφθεί να συνδεθεί με υποψήφια γονίδια τους [12]. Στη βάση δεδομένων dbSNP, έχουν πάνω από 400 miRNAs SNPs έχουν τεκμηριωθεί. Για την απόκτηση επαρκούς ισχύος για την αξιολόγηση των δυνατοτήτων σύνδεσης, ερευνήσαμε miRNA146a (rs2910164), miRNA149 (rs2292832), miRNA196 (rs11614913), και miRNA499 (rs3746444), εκείνους με μικρές συχνότητες αλληλόμορφο ≥5% και βρίσκονται στις περιοχές pre-miRNA στην κινεζική πληθυσμούς [13], [14]. Σε μια άλλη άποψη, αυτά τα τέσσερα miRNA SNPs έχουν αναφερθεί ως σημαντικοί για ογκογένεση λόγω στόχευση τους σε διάφορα σημαντικά γονίδια [15]. Ως εκ τούτου, αυτά τα τέσσερα SNPs miRNA επιλέχθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Θεωρήσαμε επίσης ένα μοναδικό φαινόμενο στη Νότια Ασία, όπου οι περισσότεροι τον καρκίνο του στόματος άτομα έχουν betel καρύδι μάσημα συνήθεια. Συνδυάσαμε τα αποτελέσματα κλινικής κατάστασης και των εργαστηριακών να καθορίσουν τη σχέση μεταξύ αυτών των SNPs και την ευαισθησία του καρκίνου του στόματος.

Αποτελέσματα

Η στατιστική ανάλυση των δημογραφικών χαρακτηριστικών παρουσιάζεται στον Πίνακα 1. Δεν υπήρξαν σημαντικές διαφορές στις διανομές του betel-quid μάσημα (

σ

& lt? 0.001), η κατανάλωση αλκοόλ (

σ

& lt? 0.001), και η χρήση του καπνού (

σ

& lt? 0.001 ) μεταξύ υγιών ατόμων ελέγχου και ασθενείς OSCC. Επειδή αυτές οι διαφορές μεταξύ των δύο ομάδων μπορεί να είναι η σύγχυση, εμείς προσαρμόζονται αυτά τα χαρακτηριστικά σε περαιτέρω στατιστική ανάλυση.

Η

Η κατανομή των miRNA SNP γονοτύπων περιγράφονται στον Πίνακα 2. Σε υγιείς μας ελέγχους, πολυμορφισμοί miRNA (rs2910164 , rs11614913 και rs3746444) ήταν σύμφωνα με την ισορροπία Hardy-Weinberg, εκτός από το rs2292832 (

σ

& lt? 0.001). Χρησιμοποιήσαμε μοντέλο λογιστικής παλινδρόμησης για την εκτίμηση των προσαρμοσμένοι λόγοι πιθανοτήτων (AORs). Μετά την προσαρμογή ηλικία, την κατάσταση, η κατανάλωση αλκοόλ και betel καρύδι συνήθειες μάσημα κάπνισμα, βρήκαμε ότι miRNA499 CC γονότυπους εμφάνισαν σημαντικά (

σ

& lt? 0,05) μεγαλύτερους κινδύνους 4.52- (95% CI = 1,24 – 16,48) της έχοντας OSCC σε σύγκριση με τον αντίστοιχο άγριου τύπου (WT) ομοζυγώτες. Ωστόσο, δεν υπήρχε σημαντικά υψηλότερη από του στόματος κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου για τα άτομα με την miRNA146a, miRNA149 και πολυμορφικό γονίδιο miRNA196 σε σύγκριση με εκείνους με το γονίδιο WT.

Η

Λαμβάνοντας υπόψη ότι οι παράγοντες κινδύνου, όπως η betel καρύδι μάσημα μπορεί να τροποποιήσει το γενετική ευαισθησία σε καρκίνο του στόματος, και οι διαδραστικές επιδράσεις μεταξύ περιβαλλοντικών παραγόντων κινδύνου και γενετικούς πολυμορφισμούς των miRNAs φαίνεται στον πίνακα 3, πίνακα S1 και S2 πίνακα. Άτομα με τουλάχιστον ένα αλληλόμορφο C του miRNA499 και betel καρύδι μάσημα συνήθεια είχαν αντίστοιχες υψηλότερο κίνδυνο 17.33- (95% CI = 9,63 – 31,17) έχουν καρκίνο του στόματος (Πίνακας 3). Άτομα με τουλάχιστον ένα αλληλόμορφο G της miRNA146a, το αλληλόμορφο C του miRNA149, ή το αλληλόμορφο C του miRNA196, και μια συνήθεια betel καρύδι μάσημα είχαν αντίστοιχες υψηλότερο κίνδυνο 9.93- (95% CI = 6,01 – 16,41), 8.67- ( 95% CI = 5,06 – 14,89), και 10.98- (95% CI = 6,21 – 19,39) έχουν καρκίνο του στόματος (Πίνακας S1). Ομοίως, η κατανάλωση καπνού είναι σημαντικά αυξημένα στην προφορική τον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου σε άτομα που πολυμορφικό για miRNA146a, miRNA149, miRNA196 και miRNA499 σύγκριση με τα άτομα με το γονίδιο WT αλλά χωρίς κάπνισμα (Πίνακας 3 και Πίνακας S2). Έχουμε αξιολογηθεί περαιτέρω το γονίδιο-περιβάλλοντος στατιστική αλληλεπίδραση μεταξύ πολυμορφισμών, το κάπνισμα και το ινδοκάρυδο miRNA λίρες για τον καρκίνο του στόματος (Πίνακας 3, Πίνακας S1 και S2 Πίνακας). Η στατιστική σημαντικότητα βρέθηκε για την αλληλεπίδραση μεταξύ όλων των πολυμορφισμών, το κάπνισμα και το ινδοκάρυδο miRNA λίρες για την ανάπτυξη καρκίνο του στόματος (p & lt? 0,05). Τα παραπάνω αποτελέσματα δείχνουν ότι οι πολυμορφισμοί του γονιδίου miRNAs έχουν ισχυρό αντίκτυπο στην ευαισθησία καρκίνο του στόματος στο betel καρύδι ή /και τους καταναλωτές το κάπνισμα.

Η

Για να διερευνήσει τις επιπτώσεις των πολυμορφικών γονότυπους των miRNAs στην κλινική κατάσταση του OSCC, εμείς ταξινομούνται περαιτέρω ασθενείς OSCC σε δύο υποομάδες: μία υποομάδα με τουλάχιστον ένα πολυμορφικό αλλήλιο, και το άλλο υποομάδα με ομόζυγο WT αλληλόμορφα. Δεδομένα της στατιστικής ανάλυσης έδειξαν ότι οι οποίοι έχουν πολυμορφικές γονίδιο miRNA499 είχε προστατευτική επίδραση της αύξησης του μεγέθους του όγκου (AOR = 0,46, 95% CI = 0,29 – 0,72) σε σύγκριση με τους ασθενείς με άγριου τύπου (Πίνακας 4). Ωστόσο, καμία σημαντική συσχέτιση μεταξύ miRNA416a, miRNA149 και πολυμορφισμοί γονιδίων miRNA196 και τα κλινικοπαθολογική συμμεταβλητές παρατηρήθηκαν (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον, σε σύγκριση με το γονότυπο WT (T /T), οι ασθενείς με τουλάχιστον ένα πολυμορφικό αλλήλιο C του miRNA499 έδειξαν ένα προστατευτικό αποτέλεσμα μεταξύ της ανάπτυξης κλινικό στάδιο (AOR = 0,58, 95% CI = 0,36 – 0,94) και την αύξηση του μεγέθους του όγκου ( AOR = 0.47, 95% CI = 0,28 – 0,79), σε νεότερους ασθενείς (age≤60), όπως φαίνεται στον πίνακα S3. Ωστόσο, δεν υπάρχει σημαντική συσχέτιση μεταξύ των πολυμορφισμών του γονιδίου miRNA499 και τις κλινικοπαθολογική συμμεταβλητές παρατηρήθηκαν σε ηλικιωμένους ασθενείς (ηλικίας & gt? 60). (Πίνακας S4)

Η

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, υπό τον όρο μυθιστόρημα πληροφορίες των SNPs της miRNA499 σχετικά με τη σύνδεση της ευαισθησίας στον καρκίνο του στόματος. Μετά το συνδυασμό του σημαντικός παράγοντας κινδύνου του καρκίνου του στόματος, αυτές γενετική επηρεάζει μπορεί επίσης να αυξήσει την ευαισθησία του καρκίνου του στόματος. Λαμβάνοντας υπόψη τα προηγούμενα ευρήματα, miRNA499 έχει προσδιορισθεί ότι εμφανίζουν υψηλή έκφραση στην καρδιά και τους ιστούς των σκελετικών μυών [16]. Ιδιαίτερα στην καρδιά, προηγούμενες μελέτες έχουν επίσης βρεθεί ότι η υψηλή έκφραση της miRNA499 αυξάνει τον κίνδυνο καρδιακών υπερτροφία και μυοκαρδιοπάθεια. Επιπλέον, ορισμένα στοιχεία δείχνουν ότι μπορεί να ρυθμίσει miRNA499 μιτοχονδριακή δυναμική μέσω που στοχεύουν σε ειδικές πρωτεΐνες όπως ρ53 [17]. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει επίσης ότι είναι ιδιαίτερα miRNA499 συνδέεται με καρδιακές παθήσεις από ρυθμίζουν την κυτταρική διαφοροποίηση και πολλαπλασιασμό [18], [19]. Τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι miRNA499 είναι πιθανώς συνδέεται με καρδιακές παθήσεις, αλλά και καρκινογένεση.

Με βάση την κλινική κατάσταση, προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι miRNA-486, miRNA-30D, miRNA-1, και miRNA-499 παρουσίασαν υψηλή έκφραση στον ορό και επίσης σχετίζονται με την επιβίωση στον καρκίνο του πνεύμονα μη-μικρού κυττάρου [20]. Άλλες μελέτες έχουν δείξει ότι η γενετική παραλλαγή σε προ-miRNA μπορεί να συμβάλλει στη διαδικασία της καρκινογένεσης στον καρκίνο του μαστού [14], [21], γαστρικού καρκίνου [22], ο καρκίνος του τραχήλου της μήτρας [23], [24], και το κεφάλι και το λαιμό καρκίνος [15]. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι πρώτα πολυμορφισμός του miRNA499 συνδέεται με τον καρκίνο του στόματος.

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι miRNA146a μπορούν να συμβάλλουν στην εξέλιξη του όγκου, μετάσταση, την πρόγνωση και την επιβίωση σε γαστρικό καρκίνο και καρκίνο του στόματος [25 ], [26]. Ένα άλλο εύρημα έδειξε επίσης ότι miRNA146a πολυμορφισμός μπορεί να ρυθμίσει την έκφραση miRNA146a [27]. Αρκετές εργαστηριακές μελέτες έχουν επίσης ανακαλύψει ότι θα μπορούσε να αναστείλει miRNA146a κυτταρική διαφοροποίηση και την επιβίωση στο αιμοποιητικό σύστημα [28]. Επιπλέον, συνδέεται με τον καρκίνο, θα μπορούσε να καταστείλει miRNA146a κύτταρο εισβολή σε παγκρεατικού καρκίνου [29]. Αναλυτικά, ορισμένα στοιχεία συνδέει miRNA146a με παράγοντες μεταγραφής όπως ΝΡ-κΒ [30]. Αυτά τα ευρήματα παρέχουν ένα νέο όραμα που miRNA146a θα μπορούσαν να επηρεάσουν την εξέλιξη του καρκίνου με τη ρύθμιση της κυτταρικής διαφοροποίησης, αλλά δεν μπορεί να επηρεάσει την απόπτωση. Παρά το γεγονός ότι βρήκαμε καμία συσχέτιση μεταξύ miRNA146a και αρκετές κλινικές καταστάσεις στη μελέτη μας, με βάση τα ευρήματα αυτά, οι μελλοντικές μελέτες θα μπορούσαν να εξετάσουν από κοινού την κατάσταση πρόγνωση ή ακόμα και το ποσοστό επιβίωσης.

Πρόσφατες μελέτες έχουν εντοπίσει ότι miRNA196 μπορεί να αλληλεπιδρά με διάφορους παράγοντες μεταγραφής και αφορούν στην ανάπτυξη καρκίνου και την εξέλιξη [31], [32]. Ορισμένα ευρήματα υποδεικνύουν ότι η υπερέκφραση του miRNA196 οδηγεί σε πιο ευνοϊκή πρόγνωση και την επιβίωση στη λευχαιμία [33]. Επιπλέον, miRNA196 σχετίζεται με φλεγμονή σε συγκεκριμένες καρκίνους [34]. Επιπλέον, Christensen et al., Αναφέρει ένα πολυμορφισμό στην ώριμη ακολουθία miRNA196a2 σε μια μελέτη ασθενών-μαρτύρων (n = 1.039) της κεφαλής και του τραχήλου καρκινώματος από πλακώδες επιθήλιο (HNSCC) [35]. Όταν οι συγγραφείς στρωματοποίηση στην περιοχή του όγκου δεν παρατηρούμε μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ του καρκίνου του στόματος και miRNA196a2, αν και η εκτίμηση αποτέλεσμα ήταν προστατευτική, παρόμοια με τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται σε αυτή τη μελέτη. Αν και ο λόγος για αυτές τις διαφορές δεν είναι γνωστό, τα διαφορετικά αποτελέσματα από την έκθεση και την παρούσα μελέτη μπορεί να σχετίζονται με την φυλετική /εθνοτική διαφορά.

Λαμβάνοντας υπόψη ότι οι αιτίες των καρκινωμάτων είναι πολύπλοκες, αναλύσαμε αρκετά κίνδυνο παράγοντες, όπως το κάπνισμα και η betel καρύδι συνήθειες μάσημα, σε αυτή τη μελέτη. Αναμένουμε ότι αυτές οι πολυμορφισμοί του γονιδίου θα μπορούσε να επηρεάσει την ευαισθησία του καρκίνου του στόματος. Με βάση τα αποτελέσματα, παρατηρήσαμε ότι αυτές οι πολυμορφισμοί αύξησε σημαντικά την αναλογία πιθανοτήτων σε κάθε ομάδα, πιθανώς επειδή οι λειτουργίες αυτών των miRNAs ρυθμίζουν τις διαφοροποιήσεις και πολλαπλασιασμοί στην πρόοδο του όγκου. Βρήκαμε επίσης ότι γενετικού πολυμορφισμού του miRNA499 συνδέεται με απώτερο μετάσταση OSCC. Μια προηγούμενη μελέτη για τον ορθοκολικό καρκίνο έχει βρεθεί ότι η υπερέκφραση του miRNA499 μπορεί να διευκολύνουν τη μετανάστευση και την εισβολή των καρκινικών κυττάρων in vitro, καθώς και τη μετάσταση στον πνεύμονα και το ήπαρ in vivo [36]. Επιπλέον, η μελέτη αυτή επίσης εντοπιστεί κουτί forkhead Ο4 (FOXO4) και προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο 4 (PDCD4) η άμεση και λειτουργική τους στόχους της miRNA499 [36]. Επιπλέον, Reis et al., Αναφέρει επίσης ότι PDCD4 ως καταστολέας της μετανάστευσης και εισβολής και μπορεί να είναι μια κλινικά σχετική βιοδεικτών με προγνωστική αξία σε OSCC [37]. Αυτά τα προαναφερθέντα ευρήματα μπορεί να δώσει μια πρώτη εξήγηση με τη διαπίστωση μας για τη συσχέτιση μεταξύ miRNA499 και άπω μετάσταση των OSCC. Λεπτομερής σχετικών μηχανισμών μπορεί να απαιτούν περαιτέρω μελέτες.

Ένας από τους περιορισμούς της μελέτης μας είναι ότι οι πληροφορίες σχετικά με το αλκοόλ, betel καρύδι, και η χρήση καπνού διχοτομήθηκε σε «ποτέ-χρήστη» έναντι «ποτέ-χρήστη.» Καθώς η αποτέλεσμα, πιο λεπτομερή ανάλυση με βάση την ποσότητα, τη διάρκεια, και το ιστορικό του betel καρύδι, το αλκοόλ και η κατανάλωση καπνού δεν ήταν σε θέση να εκτελεστεί. Η συλλογή δεδομένων βασίστηκε στην αυτο-αναφορών, για τα οποία ορισμένα άτομα μπορεί να διστάζουν να αναφέρουν τη συνήθη χρήση των εν λόγω ουσιών. Ως εκ τούτου, μπορεί να υπάρχει υπολειπόμενη συγχυτική δράση από betel καρύδι, το αλκοόλ και η χρήση καπνού εσφαλμένη κατάταξη. Επιπλέον, ο λειτουργικός ρόλος των miRNA στην ανάπτυξη ή μετάσταση του καρκίνου του στόματος είναι αξίζει για περαιτέρω έρευνα, η οποία θα πρέπει να περιλαμβάνονται στις μελλοντικές εργασίες μας. Οι κλώνοι που περιέχουν διάφορα γονότυπους του miRNA499 SNPs θα κατασκευαστεί για τη διαλεύκανση των πιθανών λειτουργιών miRNA499 (πολλαπλασιασμός, ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, τη μετανάστευση και εισβολή) σε στοματική καρκινικές κυτταρικές σειρές, όπως επίσης και των υποκείμενων μηχανισμών. Επιπλέον, η μελέτη αυτή αποκάλυψε την μη συμμόρφωση των miRNA 149 (rs2292832) γονότυποι σε ισορροπία Hardy-Weinberg στην ομάδα ελέγχου. Μια προηγούμενη μελέτη με 107.000 γονότυπους που παράγεται από 443 SNPs διαπίστωσε ότι κατανομές γονότυπου για 36 από 313 δοκιμασίες (11,5%) είχαν παρεκκλίνει από HWE (P & lt? 0.05) [38]. Κατά την αναζήτηση για τους πιθανούς λόγους, δοκιμασίες για SNPs αποδειχθεί ότι η μη ειδική ή τον προσδιορισμό του γονότυπου λάθη έχουν εντοπιστεί. Ωστόσο, βρήκαν επίσης την απόκλιση από HWE για τις υπόλοιπες 10 SNPs ήταν ανεξήγητο. Αν και ο λόγος για τη μη συμμόρφωση των miRNA 149 γονότυπους να HWE στην ομάδα ελέγχου μας δεν έχει εξερευνηθεί ακόμα, τα αποτελέσματα από την προαναφερθείσα μελέτη μπορεί να παρέχει κάποια κατεύθυνση για τη μελλοντική μελέτη μας.

Εν κατακλείδι, ανακαλύψαμε μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ miRNA499 πολυμορφισμών του γονιδίου και η ευαισθησία του καρκίνου του στόματος. Ωστόσο, δεν υπάρχουν συνδέσεις μεταξύ του SNPs και της κλινικής κατάστασης. Μετά την εξέταση betel καρύδι μάσημα, το οποίο είναι ο πιο σημαντικός παράγοντας του καρκίνου του στόματος, βρήκαμε ότι οι τέσσερις αυτές miRNAs που φέρουν το γονότυπο μετάλλαξη μπορεί να αυξήσει την ευαισθησία του καρκίνου του στόματος. Αυτές οι μεταλλάξεις του γονιδίου μπορεί να επηρεάσει την αποτελεσματικότητα στόχο miRNA και τη σταθερότητα και να αυξήσει τη συχνότητα εμφάνισης του καρκίνου του στόματος, αλλά οι λεπτομερείς μηχανισμοί από τα επίπεδα του γονιδίου σε επίπεδα πρωτεΐνης που επηρεάζουν τελικά την ανάπτυξη του όγκου θα πρέπει να ταξινομούνται, ίσως αποτύπωση μια νέα κατεύθυνση για τη θεραπεία του στόχου.

Υλικά και Μέθοδοι

Θέματα και συλλογή δειγμάτων

Έχουμε προσληφθεί 470 άνδρες ασθενείς στην Chung Shan Medical University Hospital στο Taichung και Changhua Christian Νοσοκομείο και Εμφάνιση Chwan Memorial Hospital στο Changhua, Ταϊβάν ως μια υπόθεση ομάδα μεταξύ του 2007 και του 2011. Εν τω μεταξύ, οι έλεγχοι είχαν εγγραφεί από την φυσική εξέταση κατά τη διάρκεια αυτών των τριών νοσοκομείων, οι οποίες είναι και οι εγκαταστάσεις που τις περιπτώσεις συλλέχθηκαν από. Στο τέλος των προσλήψεων, συνολικά 425 άρρενες συμμετέχοντες που δεν είχε ούτε τον εαυτό ανέφεραν ιστορικό καρκίνου του συμπεριλήφθηκαν τοποθεσιών. Επιπλέον, τα άτομα με από του στόματος προκαρκινικών ασθένεια όπως από του στόματος υποβλεννογόνια ίνωση, λευκοπλακία, ερυθροπλακία, μυρμηκιώ υπερπλασία, κλπ εξαιρέθηκαν από την ομάδα ελέγχου. Το ποσοστό συμμετοχής ήταν περίπου 91% για τις περιπτώσεις και το 76% για τους ελέγχους. Δεδομένου ότι όλες οι περιπτώσεις και οι έλεγχοι έγιναν διαδοχικά συλλέγονται χωρίς καμία επιλογή, και με βάση τις πληροφορίες που παρέχονται σε ερωτηματολόγια, δεν υπάρχει σημαντική γενετική σχέση ή οικογενειακό ιστορικό βρέθηκαν.

Όσον αφορά τις περιπτώσεις και τους ελέγχους, πληροφορίες έκθεσης, συμπεριλαμβανομένων betel λίρες μάσημα ( διαρκώς εναντίον ποτέ-χρήστη), η χρήση του καπνού (καπνιστή έναντι μη-καπνιστής) και η κατανάλωση αλκοόλ (σημερινό βαρύ πότη, που ορίζεται από το CDC και καταναλώνουν κατά μέσο όρο περισσότερο από 2 ποτά την ημέρα εναντίον όχι τρέχουσες βαρύ πότη), ήταν όλα προέρχονται από ερωτηματολόγια. Ενώ ιατρικών πληροφοριών των περιπτώσεων, συμπεριλαμβανομένων των TMN κλινική σταδιοποίηση, πρωτοβάθμια μέγεθος του όγκου, η συμμετοχή των λεμφαδένων και ιστολογική βαθμό, ελήφθησαν από τα ιατρικά αρχεία. ασθενείς με καρκίνο του στόματος ανέβηκαν κλινικά κατά τη στιγμή της διάγνωσης, σύμφωνα με το σύστημα ΤΝΜ σταδιοποίηση της Αμερικανικής μεικτής επιτροπής για τον Καρκίνο (AJCC) [39]. διαφοροποίηση των όγκων εξετάζεται από παθολογοανατόμο, σύμφωνα με την κατάταξη AJCC. Η μελέτη αυτή έχει ελεγχθεί και εγκριθεί από το Διοικητικό Συμβούλιο κριτική θεσμικές και ενημέρωσε γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από κάθε άτομο.

DNA Extraction

Τα δείγματα ολικού αίματος, που συλλέγονται από υγιείς μάρτυρες και ασθενείς με καρκίνο του στόματος, ήταν τοποθετούνται σε σωλήνες που περιέχουν EDTA, μετά φυγοκεντρήθηκαν και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C. Φλεβικού αίματος από κάθε υποκείμενο συντάχθηκε σε σωλήνες που περιέχουν ΕϋΤΑ και αποθηκεύθηκε στους 4 ° C. Γενωμικό DNA εκχυλίστηκε από QIAamp DNA κιτ μίνι αίμα (Qiagen, Valencia, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. DNA διαλύθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα ΤΕ [10 mM Tris (ρΗ 7,8), 1 mM EDTA] και στη συνέχεια ποσοτικοποιήθηκε με μέτρηση της OD260. Τελική παρασκεύασμα αποθηκεύτηκε στους -20 ° C και χρησιμοποιήθηκαν ως μήτρες για αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης.

Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης-περιορισμού μήκους θραύσματος πολυμορφισμού (PCR-RFLP)

Ο miRNAs rs2910164 γονίδιο, rs11614913, και πολυμορφισμοί rs3746444 προσδιορίστηκαν με δοκιμασία PCR-RFLP [15]. Οι αλληλουχίες εκκινητών και το ένζυμο περιορισμού για ανάλυση των πολυμορφισμών του γονιδίου miRNAs περιγράφηκαν στον Πίνακα S5. PCR διεξήχθη σε συνολικό όγκο 10 μΐ που περιείχε 100 ng εκμαγείο DNA, 1,0 μΐ 10 χ ρυθμιστικό διάλυμα PCR (Invitrogen, Carslbad, CA, USA), 0.25 U Taq DNA πολυμεράσης (Invitrogen), 0,2 mM dNTPs (Promega, Madison, WI , USA) και 200 ​​ηΜ του κάθε εκκινητή (MDBio Inc. Taipei, Ταϊβάν). Οι συνθήκες των κύκλων PCR ήταν 5 λεπτά στους 94 ° C που ακολουθείται από 35 κύκλους του 1 min στους 94 ° C, 1 minat 58 ° C για miRNA146a, 1 λεπτό στους 63 ° C για miRNA196a2, και 1 λεπτό στους 67 ° C για miRNA499, και 2 λεπτά στους 72 ° C, με ένα τελικό στάδιο στους 72 ° C για 20 λεπτά για να επιτραπεί η πλήρης επέκταση όλων των PCR θραυσμάτων. Τα αποτελέσματα φαίνονται στο Σχήμα 1. Για κάθε δοκιμασία, κατάλληλους ελέγχους (nontemplate και γνωστές γονότυπος) συμπεριλήφθηκαν σε κάθε κύκλο πληκτρολόγηση για την παρακολούθηση της μόλυνσης του αντιδραστηρίου. Για την επικύρωση των αποτελεσμάτων από το PCR-RFLP και για τον έλεγχο της ποιότητας, περίπου το 10% των δοκιμασιών επαναλήφθηκαν από διαφορετικές παρτίδες και αρκετές περιπτώσεις κάθε γονότυπο επιβεβαιώθηκαν από την ανάλυση της αλληλουχίας του DNA.

(Α) Για miRNA146a γονίδιο rs2910164 πολυμορφισμός , οι άγριου τύπου ομόζυγα αλληλόμορφα (C /C) έδωσε 25 και 122-bp προϊόντων, τα ετερόζυγα αλληλόμορφα (C /G) έδωσε 25-, 122- και 147-bp προϊόντα, ενώ τα μεταλλαγμένα αλληλόμορφα τύπου ομόζυγη (G /G ) παρήγαγε ένα 147-bp προϊόν. (Β) Για miRNA196 (rs11614913) πολυμορφισμό του γονιδίου, οι άγριου τύπου ομόζυγα αλληλόμορφα (T /T) έδωσε ένα 149-bp προϊόν, οι ετερόζυγη αλληλόμορφα (C /T) έδωσε 24-, 125- και 149-bp προϊόντα, ενώ η μεταλλαγμένα αλληλόμορφα τύπου ομόζυγη (C /C) έδωσε 24- και 125-bp προϊόντα (Γ) Για miRNA499 (rs3746444) πολυμορφισμό του γονιδίου, το άγριου τύπου (T /T) απέδωσε 26- και 120-bp προϊόντα? οι ετερόζυγο αλληλόμορφα (C /T) έδωσε 26-, 120- και 146-bp προϊόντα, ενώ τα μεταλλαγμένα τύπου ομόζυγα αλληλόμορφα (C /C) έδωσε ένα 146-bp προϊόν.

Η

Σε πραγματικό χρόνο PCR

Η διάκριση αλληλομόρφων των πολυμορφισμών του γονιδίου rs2292832 miRNA149 εκτιμήθηκε με την ABI StepOne ™ Real-Time PCR System (Applied Biosystems) και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό v3.0 SDS (Applied Biosystems), χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία TaqMan. Ο τελικός όγκος για κάθε αντίδραση ήταν 5 μί, που περιείχε 2,5 μι TaqMan Γονοτυποποίηση Master Mix, 0.125 μL TaqMan διερευνητές μίγμα, και 10 ng γενωμικού DNA. Η αντίδραση PCR πραγματικού χρόνου που περιλαμβάνεται ένα αρχικό στάδιο μετουσίωσης στους 95 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους, το καθένα αποτελούμενο από 95 ° C για 15 δευτερόλεπτα και 60 ° C για 1 λεπτό.

Στατιστική Ανάλυση

Οι κατανομές των δημογραφικών χαρακτηριστικών και των συχνοτήτων γονοτύπου μεταξύ των περιπτώσεων και ελέγχων, καθώς και κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά σε διαφορετικούς γονότυπους αναλύθηκαν με την ακριβή δοκιμασία του Fisher, δεδομένου ότι το μικρό μέγεθος του δείγματος ήταν παρούσα σε ορισμένες κατηγορίες των μεταβλητών. Οι αναλογίες πιθανοτήτων (OR) με διαστήματα τους εμπιστοσύνης 95% (ΠΙ) της σχέσης μεταξύ των συχνοτήτων γονοτύπου και τον καρκίνο του στόματος εκτιμήθηκαν με πολλαπλά μοντέλα λογιστικής παλινδρόμησης, μετά τον έλεγχο για συμπαράγοντες. Απαραμετρική μέθοδος χρησιμοποιήθηκε λόγω της μη κανονικής κατανομής ορισμένων εκτιμώμενες μεταβλητές. Έχουμε τοποθετηθεί ένα μοντέλο λογιστικής παλινδρόμησης με κύριες επιπτώσεις (miRNAs γενετικό πολυμορφισμό, την κατάσταση και betel λίρες κατάσταση μάσημα το κάπνισμα), καθώς και μια θητεία αλληλεπίδραση μεταξύ τους (γονότυπων miRNAs * δημογραφικά χαρακτηριστικά), συγκρίνοντας το μοντέλο ενάντια σε ένα μοντέλο μόνο με τα κύρια αποτελέσματα . αποτέλεσμα της αλληλεπίδρασης ορίστηκε ως η διαφορά της απόκλισης τους, και να αξιολογούνται περαιτέρω με τη χρήση του τεστ λόγου πιθανοφάνειας για τον υπολογισμό χ

2 και

σ

τιμές [40]. Ένα

σ

τιμή μικρότερη του 0.05 θεωρήθηκε σημαντική. Τα δεδομένα αναλύθηκαν για την Ε στατιστικό λογισμικό.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακα S1.

Σύλλογος miRNA γονότυπου και betel καρύδι μάσημα κατάσταση.

doi: 10.1371 /journal.pone.0039777.s001

(DOC)

Πίνακας S2.

Σύλλογος miRNA γονότυπο και το κάπνισμα.

doi: 10.1371 /journal.pone.0039777.s002

(DOC)

Πίνακα S3.

Σχέση της κλινικής κατάστασης και miRNA499 γονότυπων σε ασθενείς με καρκίνο του στόματος (≤60 μόνο, Ν = 332).

doi: 10.1371 /journal.pone.0039777.s003

(DOC)

Πίνακας S4.

Σχέση της κλινικής κατάστασης και γονότυπους miRNA499 σε ασθενείς με καρκίνο του στόματος (& gt? 60 μόνο, Ν = 138).

doi: 10.1371 /journal.pone.0039777.s004

(DOC)

Πίνακας S5.

Primer ακολουθίες και τις συνθήκες της PCR για την ενίσχυση των miRNA SNPs.

doi: 10.1371 /journal.pone.0039777.s005

(DOC)