Αφηρημένο

Ο καρκίνος του παγκρέατος, παρά το γεγονός ότι η πιο φοβερή μεταξύ των γαστρεντερικών καρκίνων, είναι ανεπαρκώς διαγνωστεί, και επιπλέον, η κατάσταση έχει επιδεινωθεί λόγω της επίκτητης αντοχής φάρμακο κατά του ενιαίου γνωστή φαρμακευτική θεραπεία. Ενώ προηγούμενες μελέτες έχουν καταδείξει τις ανασταλτικές επιδράσεις στην ανάπτυξη των παλαιότερων φθοριοκινολόνες γενιάς, η τρέχουσα μελέτη στοχεύει να αξιολογήσει τα ανασταλτικά αποτελέσματα αύξησης του φθοροκινολόνης νεότερης γενιάς, Gatifloxacin, επί παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές ΜΙΑ PaCa-2 και Panc-1, καθώς και για τη διαλεύκανση της υποκείμενων μοριακών μηχανισμών. Εδώ, αναφέρουμε ότι Gatifloxacin καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό ΜΙΑ PaCa-2 και Panc-1 κύτταρα προκαλώντας S και G

2 φάσεων διακοπή του κυτταρικού κύκλου χωρίς επαγωγή απόπτωσης. Αποκλεισμός στη φάση S του κυτταρικού κύκλου συσχετίστηκε με αυξημένη έκφραση του ΤΟΡ-β1 και μετατόπιση του συμπλόκου Smad3-4 προς τον πυρήνα με την επακόλουθη ενεργοποίηση των ρ21 σε κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2, ενώ ο ΤΟΡ-β σηματοδότηση εξασθενημένων κυττάρων Panc-1 έδειξε διακοπή φάσης S με άμεση ενεργοποίηση του ρ27. Ωστόσο, Gatifloxacin μεσολάβηση G

2 φάσεων διακοπή του κυτταρικού κύκλου βρέθηκε να είναι εξαρτώμενη από ρ53 και στις δύο κυτταρικές σειρές. Η μελέτη μας είναι ενδιαφέρον διότι φθοριοκινολόνες έχουν την ικανότητα να διεισδύουν παγκρεατικού ιστού που μπορεί να είναι πολύ αποτελεσματική στην καταπολέμηση καρκίνους του παγκρέατος που συνήθως συνδέονται με την απώλεια ή προς τα κάτω ρύθμιση της CDK αναστολείς ρ21 /ρ27, καθώς και μεταλλακτική αδρανοποίηση της p53. Επιπλέον, Gatifloxacin βρέθηκε επίσης να συνεργούν την επίδραση της γεμσιταβίνη, το μόνο γνωστό φάρμακο κατά του καρκίνου του παγκρέατος, καθώς και το ευρύ αντικαρκινικό φάσμα σισπλατίνη φάρμακο. Στο σύνολό τους τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι Gatifloxacin διαθέτει αντικαρκινική δραστηριότητες κατά του καρκίνου του παγκρέατος και είναι μια πολλά υποσχόμενη υποψήφιος για να επανατοποθετηθούν από αντιβιοτικά ευρέως φάσματος για αντικαρκινικό παράγοντα

Παράθεση:. Yadav V, Σουλτάνα S, Yadav J, Saini Ν (2012 ) Gatifloxacin Προκαλεί S και G

2-φάση του κύκλου κυττάρων σύλληψης σε κύτταρα καρκίνο του παγκρέατος μέσω του p21 /p27 /p53. PLoS ONE 7 (10): e47796. doi: 10.1371 /journal.pone.0047796

Επιμέλεια: Γκύντερ Schneider, Τεχνικό Πανεπιστήμιο του Μονάχου, Γερμανία

Ελήφθη: 3 Μαΐου, 2012? Αποδεκτές: 17 Σεπτεμβρίου, 2012? Δημοσιεύθηκε: 25 Οκτωβρίου 2012 |

Copyright: © 2012 Yadav et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις (NWP-13 και EXP0011) από το Συμβούλιο Επιστημονικής και Βιομηχανικής Έρευνας (CSIR), Ινδία. VY υποστηρίχθηκε με Senior Research Fellowship από CSIR. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του παγκρέατος, ο κακόηθες νεόπλασμα του παγκρέατος είναι σήμερα η πέμπτη πιο κοινή αιτία θανάτου από καρκίνο [1]. Παρά τις βελτιώσεις στη διάγνωση, η πρόγνωση παραμένει φτωχή, λόγω της καθυστέρησης παρουσίασης των συμπτωμάτων, επιθετική ανάπτυξη του όγκου και βαθιά δεσμοπλαστικού αντίδραση [2]? [3]. Το ποσοστό επιβίωσης 5-ετών είναι περίπου 15-20%, μετά από μεταμόσχευση παγκρέατος εκτομή σε περίπτωση καρκίνου του παγκρέατος [4]. Εκτός από τη χειρουργική επέμβαση, επικουρική χημειοθεραπεία με γεμσιταμπίνη και erlotinib έχει αποδειχθεί ότι βελτιώνει την πρόγνωση σε χειρουργήσιμη παγκρέατος περιπτώσεις καρκίνου του [5]. Έτσι, υπάρχει μια αύξηση στο ποσοστό επιβίωσης με τη συμβατική κυτταροτοξική χημειοθεραπεία, σε σύγκριση με τη χειρουργική επέμβαση [6], ωστόσο εξακολουθεί να υπάρχει ανάγκη για την ανάπτυξη ή την αναγνώριση του δυναμικού αντικαρκινικού φαρμάκου με αυξημένη εκλεκτικότητα και μειωμένη τοξικότητα.

Τα τελευταία χρόνια παλαιότερα φθοριοκινολόνες γενιάς, όπως Moxifloxacin και Ciprofloxacin διαθέτουν ευρύ φάσμα αντιβιοτική δράση, έχουν δείξει αύξηση ανασταλτικά αποτελέσματα επάγοντας απόπτωση και κύκλου κυττάρου σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές γραμμές [7] – [10]. Αυτές nonantimicrobial δραστηριοτήτων τους κατέστησαν μοναδική μεταξύ άλλων αντιβιοτικών ευρέος φάσματος. Gatifloxacin ή 8-μεθοξυ φθοριοκινολόνες είναι η νεότερη (τέταρτο) φθοροκινολόνη γενιάς που δείχνει παρόμοια αντιβιοτικά αποτελέσματα με τη στόχευση βακτηριακή γυράση του DNA και τοποϊσομεράση [11] – [13], και είναι επίσης ένα ισχυρό φάρμακο σε αρκετές υψηλά μολυσματικών ασθενειών, όπως η Σεξουαλικά Μεταδιδόμενα Νοσήματα, τοξοπλάσμωση και Τουλεραιμία [14] – [16]. Όπως και άλλα μέλη της οικογένειας φθοριοκινολόνες είναι επίσης γνωστό ότι έχει ορισμένα ανοσορυθμιστικά αποτελέσματα

in vitro

σε διάφορες κυτταρικές σειρές όπως επίσης και ότι είναι υπό κλινικές δοκιμές για τη θεραπεία της πνευμονικής φυματίωσης [17]? [18]. Έχοντας τόσο πολύ παρόμοιες επιπτώσεις με άλλα μέλη της οικογένειας φθοριοκινολόνες, καμία δραστηριότητα αναστολής αύξησης έναντι κυτταρικών σειρών καρκίνου έχει αναφερθεί για Gatifloxacin. Επιπλέον, ο παγκρεατικός αποτελεσματικότητα διείσδυσης σε ιστό είναι πολύ καλά αναφερθεί [19] σε περίπτωση φθοριοκινολόνες που μας μπαίνουν στον πειρασμό να εξερευνήσετε το μηχανισμό με τον οποίο Gatifloxacin καταστέλλει παγκρέατος ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε την επίδραση της γκατιφλοξασίνης στην επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό των παγκρεατικών καρκινικών κυτταρικών γραμμών (ΜΙΑ PaCa-2 και Panc-1) και βρήκαν ότι Gatifloxacin ήταν σε θέση να καταστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των δύο κυτταρικών σειρών, με ΜΙΑ PaCa-2 είναι πιο ευαίσθητη από Panc-1. Το διαφορικό αποτέλεσμα μπορεί να οφείλεται σε διαφορά στη λειτουργικών υποδοχέων ΤΟΡ-β στις δύο κυτταρικές σειρές με ΜΙΑ PaCa-2 είναι ευαίσθητα σε ΤΟΡ-β1 και Panc-1 να είναι ανθεκτικά καθώς δεν έχουν λειτουργικού τύπου ΤΟΡ-β Ι υποδοχέα [20]. Βρήκαμε ότι Gatifloxacin συλλήψεις κύτταρα σε G

2-φάση μέσω απενεργοποίησης των πολύπλοκων cdc2-cyclinB1 με φωσφορυλίωση της cdc2 για Tyr15 μέσω της ενεργοποίησης p53. Επιπλέον δείχνουμε ότι Gatifloxacin μπορεί να προκαλέσει τα επίπεδα ρ21 και ρ27 σε ΜΙΑ PaCa-2 και τα κύτταρα Panc-1 αντίστοιχα προκαλώντας έτσι διακοπή φάσης S. Δείξαμε επίσης ότι Gatifloxacin ήταν σε θέση να συνεργήσουν την ανασταλτική δράση της γεμσιταβίνη και Cisplatin και στις δύο κυτταρικές σειρές.

Αποτελέσματα

Gatifloxacin καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό του καρκινώματος του παγκρέατος κύτταρα

In Vitro

Για την αξιολόγηση της αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση της γκατιφλοξασίνης, χρησιμοποιήσαμε κυτταρικές γραμμές καρκινώματος Panc-1 παγκρεατικού ΜΙΑ PaCa-2 και. Μελετήσαμε πρώτα το αποτέλεσμα διαφορετικών δόσεων (0-400 μg /ml) της γκατιφλοξασίνης στη βιωσιμότητα των ΜΙΑ PaCa-2 και Panc-1 κύτταρα για 24 ώρες και 48 ώρες χρησιμοποιώντας ΜΤΤ δοκιμασία. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1, η θεραπεία GFX οδήγησε σε χρόνο και εξαρτάται από τη δόση μείωση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε ΜΙΑ PaCa-2 και Panc-1 κύτταρα αν και σε διαφορετικά επίπεδα. θεραπεία Gatifloxacin είχε σαν αποτέλεσμα 15-46% (ρ = 0,002) μείωση στη βιωσιμότητα κυττάρου σε ΜΙΑ PaCa-2 και 1-43% (p = 0,007) μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων σε κύτταρα Panc-1 μετά από 24 ώρες, αντίστοιχα (Σχήμα 1Α i) . Παρατηρήσαμε 19 έως 73% (p = 0,0016) μείωση στη βιωσιμότητα κυττάρου σε ΜΙΑ PaCa-2 και 11-72% (ρ = 0,00016) μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων σε κύτταρα Panc-1 στις 48 ώρες αντίστοιχα (Σχήμα 1Α ii). Τα παραπάνω δεδομένα δείχνουν σαφώς ΜΙΑ PaCa-2 να είναι περισσότερο ευαίσθητα σε Gatifloxacin από Panc-1 σε όλες τις δόσεις. Ένα εντυπωσιακό παρατήρηση από αυτά τα δεδομένα ήταν η μείωση στην βιωσιμότητα, όντας περισσότερο έντονη σε υψηλότερες δόσεις (100, 200 και 400 μg /ml) της θεραπείας Gatifloxacin μετά από 24 ώρες και 48 θεραπεία h σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές και συνεπώς πήραμε αυτές τις συγκεντρώσεις και ο χρόνος σημεία για τη διεξαγωγή περαιτέρω πειράματα.

δοκιμασίας ΜΤΤ της MIA PaCa-2 και Panc-1 κύτταρα μετά τη θεραπεία με Gatifloxacin (0-400 μg /ml) για 24 ώρες (Ai) και 48 ώρες (ΠΑΙ). Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων (1 χ 10

4 κύτταρα /φρεάτιο), τα οποία αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με την αύξηση της συγκέντρωσης της γκατιφλοξασίνης για 24 και 48 ώρες. Κάθετος άξονας αντιπροσωπεύει ρυθμό πολλαπλασιασμού% ενώ οριζόντιος άξονας αναπαριστά την αύξηση της συγκέντρωσης της γκατιφλοξασίνης σε μg /ml. Τα δεδομένα είναι μέσες ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων που εκτελούνται εις τριπλούν. * Ρ & lt? 0,01 σε σύγκριση με τον έλεγχο του οχήματος. πρόσδεσης (Β) αννεξίνης V-ΡΕ σε ΜΙΑ PaCa-2 (i-V) και Panc-1 (vi-χ) μετά από θεραπεία με Gatifloxacin για 48 ώρες όπως εκτιμήθηκαν από 7-AAD και χρώση Αηηβχίην. (I) και (vi) κύτταρα ελέγχου έλαβαν όχημα, (ii) και (vii) υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 100 μg /ml, (iii) και (viii) κύτταρα επεξεργασμένα με 200 μg /ml, (iv) και (ix) κύτταρα κύτταρα υποβάλλεται σε επεξεργασία με 400 μg /ml της γκατιφλοξασίνης. (V) κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2 και (x) Panc-1 κύτταρα κατεργασμένα με κουρκουμίνη 60 μΜ για 24 ώρες ως θετικός έλεγχος. Κάθετος άξονας παριστάνει 7-AAD θετικά κύτταρα ενώ οριζόντιος άξονας αντιπροσωπεύει αννεξίνης V-ΡΕ θετικά κύτταρα. Αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων έχει αποδειχθεί με παρόμοια αποτελέσματα. (Γ) ανάλυση κηλίδας Western της έκφρασης του Βαχ πρωτεΐνης υπό την επίδραση της γκατιφλοξασίνης σε έναν χρόνο (24, 48 ώρες) και η δόση (0, 100, 200, 400 μg /ml) εξαρτώμενο τρόπο. β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (D) κασπάσης 3, 8, 9 δραστικότητα ΜΙΑ PaCa-2 και Panc-1 κύτταρα κατεργασμένα με Gatifloxacin στο χρόνο (24, 48 ώρες) και η δόση (0, 100, 200, 400 μg /ml) εξαρτώμενο τρόπο. ραβδόγραμμα αντιπροσωπεύει μέση τιμή ± SEM από τρία ανεξάρτητα πειράματα

Η

Gatifloxacin Προκαλεί κυτταρικού κύκλου σύλληψης σε S και G

2 -. Φάση σε καρκίνωμα του παγκρέατος κύτταρα χωρίς επαγωγή της απόπτωσης

επόμενη διερευνηθεί αν Gatifloxacin διαμεσολαβούμενη μείωση στην βιωσιμότητα του ΜΙΑ PaCa-2 και Panc-1 κύτταρα είναι λόγω της απόπτωσης /νέκρωσης. Ελέγξαμε πρώτα για την επαγωγή απόπτωσης με δοκιμασία αννεξίνης. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Β δεν βρήκαμε καμία σημαντική αλλαγή στην αποπτωτική /νεκρωτική πληθυσμός καθόλου δόσεις της γκατιφλοξασίνης σε σύγκριση με κύτταρα που έλαβαν φορέα στις δύο κυτταρικές σειρές στις 24 ώρες όσο και στις 48 ώρες, αντίστοιχα. Για την περαιτέρω εγκάρσια επικύρωση δεδομένων αννεξίνης μας, έχουμε την επόμενη ελεγχθεί το επίπεδο έκφρασης της πρωτεΐνης προαποπτωτικών Βαχ με κηλίδωση Western και η δράση της κασπάσης -3, -8 και -9 σε μια δόση και το χρόνο εξαρτώμενο τρόπο κάτω από την επίδραση της γκατιφλοξασίνης. Δεν βρήκαμε καμία σημαντική μεταβολή είτε στο επίπεδο Βαχ πρωτεΐνης (Εικόνα 1Γ) ή κασπάσης -3, -8 και -9 δραστηριότητα (Σχήμα 1D), η οποία δείχνει ότι Gatifloxacin δεν εμποδίζει τη βιωσιμότητα των κυττάρων. Αποτελέσματα της αννεξίνης V και δραστικότητα κασπάσης επίσης επικυρωθεί χρησιμοποιώντας ένα θετικό δείγμα αναφοράς, η κουρκουμίνη (60 μΜ για 24 ώρες).

Εμείς επόμενο

μετράται το

κυτταρικού κύκλου

της κατάστασης του ΜΙΑ PaCa-2 και τα κύτταρα Panc-1 σε παρουσία 100, 200, 400 μg /ml της γκατιφλοξασίνης στις 24 ώρες και 48 ώρες αντίστοιχα (Σχήμα 2 ). ανάλυση κατανομής κυτταρικού κύκλου έδειξε ότι Gatifloxacin παρεμποδίζει την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου συλλαμβάνοντας τα κύτταρα σε S και G

2 φάσεων και στις δύο κυτταρικές σειρές. Σε κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2, αύξηση του ποσοστού των κυττάρων σε S-φάση ήταν από 9 ± 1,1% (κύτταρα κατεργασμένα όχημα) σε 21 ± 2,1% (400 μg /ml), με ταυτόχρονη μείωση στο ποσοστό των κυττάρων σε G

2 φάσης από όχημα αγωγή 31 ± 2,1% σε 18 ± 2,7% (400 μg /ml) και καμία αλλαγή στο ποσοστό των κυττάρων σε G

1 φάση παρατηρήθηκε σε κύτταρα που εκτίθενται μέχρι 24 ώρες. Ωστόσο από 48 ώρες, τα κύτταρα άρχισαν συσσωρεύεται στα G

2 φάσης από 24 ± 3% (όχημα θεραπεία) σε 67 ± 2,5% στα 200 μg /ml της γκατιφλοξασίνης και αυτό μειώθηκε σε 40 ± 2% στα 400 μg /ml της γκατιφλοξασίνης (Εικόνα 2i και άνω πίνακα). Σε Panc-1, τα κύτταρα άρχισαν συσσωρεύονται σε φάση S από 8 ± 1% (όχημα θεραπεία) σε 14 ± 1,5% (400 μg /ml), αλλά σε αντίθεση με ΜΙΑ PaCa-2, τα κύτταρα άρχισαν συσσωρεύεται στα G

2- φάση από 24 ώρες και μετά από 29 ± 1% (όχημα θεραπεία) σε 56 ± 3% και περιορίστηκε πίσω σε 32 ± 1.05% στα 400 μg /ml (Σχήμα 2ii και άνω πάνελ). Καμία αύξηση σε SubG1 αιχμή παρατηρήθηκε και στις δύο κυτταρικές σειρές. Στο σύνολό τους τα δεδομένα μας υποδεικνύουν έντονα ότι Gatifloxacin δεν επάγει την απόπτωση, αλλά προκαλεί τη σύλληψη των κυττάρων στην S και G

2-φάση στα κύτταρα του παγκρέατος καρκινώματος.

Επιδράσεις της γκατιφλοξασίνης σε κυτταρικό κύκλο διερευνήθηκαν χρησιμοποιώντας PI ( ιωδιούχου προπιδίου) χρώση. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με (0-400 μg /ml) Gatifloxacin για 24 και 48 ώρες, συλλέγονται και χρωματίζονται με ΡΙ. Εδώ ροζ κορυφή αντιπροσωπεύει G

1-φάσης, πράσινη κορυφή αντιπροσωπεύει S-φάσης και μπλε κορυφή αντιπροσωπεύει G

2-φάση, αντίστοιχα. Άνω πάνελ δείχνει αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων με παρόμοια αποτελέσματα και κατώτερο πάνελ αντιπροσωπεύει το ιστόγραμμα των κυττάρων σε διαφορετικές φάσεις. γράφημα μπάρα αντιπροσωπεύει τη μέση ± SEM από τρία ανεξάρτητα πειράματα. (I) Εκπρόσωπος ραβδόγραμμα για ΜΙΑ PaCa-2, (ii) Εκπρόσωπος ραβδόγραμμα για Panc-1.

Η

Gatifloxacin προκαλεί ενεργοποίηση του TGF-β1 /SMAD Complex /p21 σε ΜΙΑ PaCa-2 και η ενεργοποίηση του ρ27 σε Panc-1

Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι ένας από φθοροκινολόνης, η ciprofloxacin καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου συλλαμβάνοντας τους σε S-φάση μέσω ΤΟΡ-β1 και ΤΟΡ-β1 είναι επίσης πολύ καλά γνωστές σε αιτία διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα [21]? [22]. Για να

ερευνήσει

αν Gatifloxacin-

που προκαλείται από τη σύλληψη

S-φάση ήταν

TGF -β

εξαρτάται

ελέγξαμε τα επίπεδα του TGF-β1 στο μεταγραφικό καθώς και μεταφραστικά επίπεδα. Βρήκαμε Gatifloxacin θεραπεία (100, 200, 400 μg /ml) για να αυξηθεί η έκφραση του ΤΟΡ-β1 σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο με 1.5-2 φορές (ρ & lt? 0,01) στο μεταγραφικό επίπεδο και 1,3-2 φορές (ρ & lt? 0,01) σε μεταφραστικό επίπεδο μετά από 48 ώρες σε ΜΙΑ PaCa-2 κυττάρων αλλά όχι σε κύτταρα Panc-1 (Σχήμα 3ΑΙ, 3Bi). Δεδομένου ότι

βρέθηκε σημαντική αύξηση στο επίπεδο έκφρασης

ΤΟΡ-β1 σε 400 μg /ml, κάναμε τη μελέτη χρονικής πορείας και παρατήρησε ότι ο TGF-β1 άρχισε να αυξάνεται μεταγραφικά μέσα σε 4 ώρες (ρ = 0.023) και της αγωγής φτάσει στο μέγιστο από 12 ώρες (p & lt? 0,01) και στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν σε 16 ώρες (Σχήμα 3Aii). Ωστόσο μεταφραστικά, ΤΟΡ-β1 ενεργοποιείται μέσα σε 8 ώρες (ρ = 0,039) μόνο και έφθασε σε μέγιστη έκφραση της από 16 ώρες (ρ & lt? 0,01) (Σχήμα 3Bii), όπως αξιολογήθηκε με πραγματικού χρόνου PCR και κηλίδωση Western. Υπάρχουν αυξανόμενες ενδείξεις ότι Smad παράγοντες μεταγραφής διαμεσολαβούν την επίδραση αναστολής της ανάπτυξης του μετασχηματισμού αυξητικού παράγοντα-β1 (ΤΟΡ-β1) σε πολλούς τύπους κυττάρων [23]. Για να διερευνηθεί η σχετική συμβολή των μεμονωμένων Smad πρωτεϊνών σε σηματοδότηση TGF-β1, πρωτεΐνη έκφραση Smad2 και Smad3 αναλύθηκε με στύπωση western των κυτταρικών εκχυλισμάτων μετά από 48 ώρες θεραπείας Gatifloxacin (100, 200, 400 μg /ml) σε ΜΙΑ PaCa-2 κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Ci, παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση της φωσφο-Smad3 (

pSmad3 σε Ser 423

), ενώ δεν υπήρξε καμία μεταβολή στα επίπεδα του

φωσφο

–

Smad2

(

pSmad2 σε Ser 467

) μετά από 48 ώρες θεραπείας Gatifloxacin σε όλες τις δόσεις σε κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2. Επιπλέον, η αύξηση σε φωσφο-

Smad3

(

pSmad3

) βρέθηκε να είναι σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο (1.3 – 2.4 φορές, ρ = 0,0127) σε σύγκριση με τα κύτταρα που έλαβαν φορέα. Αρκετά στοιχεία είναι εκεί για να υποστηρίξει ότι τα ενεργοποιημένα Smad2 ή Smad3 διμερίζεται με Smad4 και μετατοπίζεται στον πυρήνα, όπου η ενεργοποιημένη συγκροτήματα συνεργάτης με το στοιχείο Smad-δέσμευσης (SBEs) σε υποκινητές πολλών γονιδίων που οδηγούν στην επαγωγή τους [24] – [26]. ρ21

WAF1 /Cip1 είναι ένα τέτοιο γονίδιο το οποίο είναι γνωστό ότι εμπλέκεται στην ΤΟΡ-β1 με τη μεσολάβηση ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού [27]. Για να καθοριστεί εάν Smad3 μετατοπίζεται σε απόκριση προς διέγερση του ΤΟΡ-β1 σε κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2, εκτιμήσαμε την υποκυτταρική κατανομή της Smad3 /4 και όπως αναμένεται, σημαντική μείωση στην έκφραση της πρωτεΐνης Smad-3 και Smad-4 παρατηρήθηκε στο κυτοσολικό κλάσμα και υπήρχε ταυτόχρονη αύξηση στην έκφραση πρωτεΐνης Smad-3 και Smad-4 στο πυρηνικό κλάσμα σε Gatifloxacin αγωγή MIA κύτταρα PaCa-2 σε ένα δόση και το χρόνο εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 3Cii). Ταυτόχρονα αναλύσαμε επίσης την έκφραση του p21

WAF1 /Cip1, ο καθοδικός τελεστής του TGF-β1 που είναι γνωστό ότι είναι ένα κρίσιμο ρυθμιστής της προόδου του κυτταρικού κύκλου. Όπως ρ21, ρ27 είναι ένας εξαρτώμενος από κυκλίνη αναστολέας κινάσης που ρυθμίζει G

φάσης 1-S του πρόοδο του κυτταρικού κύκλου, ως εκ τούτου, ελέγξαμε την έκφραση της ρ21 και ρ27 με ανάλυση στυπώματος Western [28]. Παρατηρήσαμε σημαντική αύξηση (01/04 – 01/07 φορές, ρ = 0,038) στα επίπεδα του ρ21 και σημαντική μείωση (0,57 έως 0,35 φορές, ρ = 0,012) στα επίπεδα του ρ27 σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο μετά από 48 ώρες της θεραπείας σε σύγκριση Gatifloxacin σε κύτταρα που έλαβαν φορέα (Σχήμα 4ΑΙ). Είναι ενδιαφέρον ότι αυξάνουν σε ρ21 παρατηρήθηκε μόνο μετά την ενεργοποίηση δηλαδή ΤΟΡ-β1 μετά από 12 h (p = 0,035), σε ΜΙΑ PaCa-2 κύτταρα (Σχήμα 4Aii). Ωστόσο, στην περίπτωση των Panc-1 κύτταρα που στερείται λειτουργικά TGF-β1 δεν βρήκαμε ενεργοποίηση της p21, αλλά κάνουμε βρείτε την ενεργοποίηση του p27. Παρατηρήσαμε σημαντική αύξηση (1.8 – 2.3 φορές, ρ = 0,021) στα επίπεδα του ρ27 σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο μετά από 48 ώρες θεραπείας Gatifloxacin σε σύγκριση με κύτταρα που έλαβαν φορέα (Σχήμα 4ΑΙ). Ταυτόχρονα ελέγξαμε επίσης τα επίπεδα του Skp2 που διαμεσολαβεί ουβικιτινίωση και την υποβάθμιση του ρ27 /ρ21 σε αμφότερα κυτταρικές γραμμές ΜΙΑ PaCa-2 και Panc-1 σε απόκριση σε θεραπεία Gatifloxacin (0, 100, 200 και 400 μg /ml) [29] . Βρήκαμε σημαντική αύξηση (2.7 – 4.3 φορές, ρ = 0.008 σε κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2 και 4.3 έως 6.3 φορές p = 0,005 σε Panc-1) στα επίπεδα Skp2 και στις δύο κυτταρικές σειρές. Όπως ήταν αναμενόμενο βρήκαμε αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ Skp2 και p27 /p21 (Σχήμα 4ΑΙ). Λαμβανόμενα μαζί αυτό μελέτη δείχνει ότι ο TGF-β1 /Smad3 /p21, είναι ένα από τα μονοπάτια που οδηγεί σε διακοπή φάσης S σε κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2 και ρ27 παίζει κρίσιμο ρόλο στη διακοπή φάσης S των κυττάρων Panc-1.

(Α) (i) ανάλυση Real Time PCR του ΤΟΡ-β1 έκφραση σε μΙΑ PaCa-2 και τα κύτταρα Panc-1 υποβάλλεται σε επεξεργασία με Gatifloxacin κατά εξαρτώμενο από τη δόση τρόπο, (ii) Real Time PCR ανάλυση του TGF-β1 έκφραση σε MIA κύτταρα PaCa-2 υποβάλλεται σε επεξεργασία με 400 μg /ml της γκατιφλοξασίνης σε έναν χρόνο εξαρτώμενο τρόπο. 18S rRNA χρησιμοποιήθηκαν για την κανονικοποίηση των αποτελεσμάτων. (Β) Ανάλυση Western blot του ΤΟΡ-β1 έκφραση σε PaCa-2 και Panc-1 κύτταρα ΜΙΑ κατεργάζεται με Gatifloxacin με δοσοεξαρτώμενο τρόπο (i) ανάλυση western blot του ΤΟΡ-β1 έκφραση σε κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2 υποβάλλεται σε επεξεργασία με 400 μg /ml της γκατιφλοξασίνης σε έναν χρόνο εξαρτώμενο τρόπο (ii). Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά του τυπικού πειράματος επαναλήφθηκε τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα. Bar Graph αντιπροσωπεύει τον μέσο όρο ± SEM. (Γ) (i) Επίδραση της γκατιφλοξασίνης στις Smads μεσολάβηση υποδοχέα (pSmad-2 και pSmad-3), όταν αξιολογείται στο σύνολό λύμα κυττάρων σε κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Ii) Η μετατόπιση του Smad 3-4 συμπλόκου από το κυτταρόπλασμα προς πυρήνα υπό την επίδραση της γκατιφλοξασίνης σε μία δόση (0, 100, 200, 400 μg /ml) και το χρόνο τρόπο εξαρτώμενο (0, 6, 12, 18, 24 h) εκτιμήθηκε με κηλίδωση Western. κλάσματα Πυρηνική και κυτταροπλασματικά διαχωρίστηκαν όπως περιγράφεται στην ενότητα «Υλικά και μέθοδοι». Lamin B (Nuclear ειδική πρωτεΐνη) και α-τουμπουλίνης (ειδική κυτταροπλασματική πρωτεΐνη) χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες φόρτωσης.

Η

(Α) (i) ανάλυση κηλίδας Western των ρ21, ρ27 και έκφραση Skp2 σε ΜΙΑ PaCa -2 και Panc-1 κύτταρα κατεργασμένα με Gatifloxacin κατά δοσοεξαρτώμενο τρόπο. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης για ρ21 και ρ27, ενώ Lamin Β χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης για Skp2, (Α) (ii) την ανάλυση Western blot της έκφρασης p21 σε κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2 υποβάλλεται σε επεξεργασία με 400 μg /ml της γκατιφλοξασίνης σε έναν χρόνο εξαρτώμενο τρόπο. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά του τυπικού πειράματος επαναλήφθηκε τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα. Bar Graph αντιπροσωπεύει τον μέσο όρο ± SEM. * P & lt? 0,01, # p & lt? 0,05 έναντι του ελέγχου. Gatifloxacin σύλληψης διαμεσολαβείται φάση S είναι ΤΟΡ-β1 που εξαρτώνται σε ΜΙΑ PaCa-2 (Β) (i) ΜΤΤ δοκιμασία του ΜΙΑ PaCa-2 και Panc-1 κύτταρα σε παρουσία του ανασυνδυασμένου ΤΟΡ-β1 για 48 ώρες. Κάθετος άξονας αντιπροσωπεύει ρυθμό πολλαπλασιασμού% ενώ οριζόντιος άξονας αναπαριστά αυξανόμενη συγκέντρωση ανασυνδυασμένου ΤΟΡ-β1 σε ng /ml. Τα δεδομένα είναι μέσες ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων που εκτελούνται εις τριπλούν. * P & lt? 0,01, # p & lt? 0,05 έναντι του ελέγχου. (Β) (ii) Κατάργηση διακοπή φάσης S σε κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2, όπως εκτιμάται από ΡΙ χρώση (ιωδιούχο προπίδιο). Κύτταρα μετεμβολιασμένα με ΤΟΡ-β1 siRNA (48 ώρες) και κωδικοποιημένα siRNA alongwith μη επιμολυσμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία από 100 μg /ml έως 400 μg /ml Gatifloxacin (24 ώρες) μετά από 24 ώρες από την επιμόλυνση, συλλέχθηκαν και χρωματίστηκαν με ΡΙ. Αριστερό πλαίσιο αντιπροσωπεύει το ραβδόγραμμα όπου κάθετος άξονας αναπαριστά% περιεκτικότητα DNA σε S-φάση και οριζόντιος άξονας αναπαριστά τη συγκέντρωση Gatifloxacin σε μg /ml. γράφημα μπάρα αντιπροσωπεύει τη μέση ± SEM από τρία ανεξάρτητα πειράματα. * P & lt? 0,01, # p & lt? 0,05 έναντι του ελέγχου. Δεξιός πίνακας δείχνει Western Blot για την knockdown αποτελεσματικότητα του ΤΟΡ-β1 siRNA. (1) αντιπροσωπεύει μη επιμολυσμένα κύτταρα ελέγχου, (2) ΤΟΡ-β1 siRNA επιμολυσμένα κύτταρα, (3) TGF-β1 siRNA επιμολυσμένα κύτταρα με 400 μg /ml της γκατιφλοξασίνης, (4) siRNA επιμολυσμένα κύτταρα, (5) siRNA επιμολυσμένα κύτταρα με 400 μg /ml της γκατιφλοξασίνης. Gatifloxacin σύλληψη μεσολάβηση φάσης S εξαρτάται σε ΜΙΑ PaCa-2 και p27 εξαρτώνται σε κύτταρα Panc-1 p21. (Γ) Κατάργηση διακοπή φάσης S σε κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2 κύτταρα με ρ21 siRNA (i) και κύτταρα Panc-1 επιμολυσμένα με ρ27 siRNA (ii), αντίστοιχα, όπως αξιολογήθηκε με PI χρώσης (ιωδιούχο προπίδιο). Κύτταρα επιμολυσμένα με ρ21 /ρ27 siRNA και κωδικοποιημένο siRNA (48 ώρες) alongwith μη επιμολυσμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 μg /ml έως 400 μg /ml της γκατιφλοξασίνης (24 ώρες) μετά από 24 ώρες από την επιμόλυνση, συλλέχθηκαν και χρωματίστηκαν με ΡΙ. Αριστερό πλαίσιο αντιπροσωπεύει το ραβδόγραμμα όπου κάθετος άξονας αναπαριστά% περιεκτικότητα DNA σε S-φάση και οριζόντιος άξονας αναπαριστά τη συγκέντρωση Gatifloxacin σε μg /ml. Δικαίωμα πλαίσιο δείχνει Western Blot για την νοκ ντάουν αποτελεσματικότητα της p21 ή p27 siRNA. (1) αντιπροσωπεύει μη επιμολυσμένα κύτταρα ελέγχου, (2) ρ21 /ρ27 siRNA επιμολυσμένα κύτταρα, (3) ρ21 /ρ27 siRNA επιμολυσμένα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με 400 μg /ml της γκατιφλοξασίνης, (4) κωδικοποιημένα siRNA επιμολυσμένα κύτταρα, (5) κωδικοποιημένα siRNA επιμολυσμένη κύτταρα κατεργασμένα με 400 μg /ml της γκατιφλοξασίνης. γράφημα μπάρα αντιπροσωπεύει τη μέση ± SEM από τρία ανεξάρτητα πειράματα. * P & lt? 0,01, # p & lt?. 0,05 έναντι ελέγχου

Η

Gatifloxacin Mediated S-φάση σύλληψης εξαρτάται σε MIA TGF-β1 /p21 PaCa-2 και p27 Εξαρτάται σε Panc-1 κύτταρα

για να επιβεβαιωθεί ο ρόλος του ΤΟΡ-β1 στην καταστολή του πολλαπλασιασμού, ανασυνδυασμένο TGF-β1 επιμολύνθηκε σε ποικίλες δόσεις (0-100 ng /ml) σε ΜΙΑ PaCa-2 και τα κύτταρα Panc-1 για 48 ώρες και δοκιμασία ΜΤΤ διεξήχθη . Παρατηρήσαμε ότι πάνω έκφραση του ΤΟΡ-β1 κατέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ΜΙΑ PaCa-2 σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Παρατηρήσαμε σημαντική μείωση (35%, ρ & lt? 0,05, Σχήμα 4Bi) στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε συγκέντρωση 100 ng /ml σε κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2 αλλά όχι σε κύτταρα Panc-1. Τα ευρήματά μας συνάδουν με τα ευρήματα του Francisco ι nicolas

et al

που προτείνει Panc-1 να είναι ανθεκτικά σε TGF-β1 σύλληψης που προκαλείται από την ανάπτυξη. Περαιτέρω για την επιβεβαίωση του ρόλου του ΤΟΡ-β1 στη μεσολάβηση διακοπή φάσης S που προκαλείται από Gatifloxacin σε ΜΙΑ PaCa-2, θα σιγήσει την έκφραση του ΤΟΡ-β1 με τη χρήση siRNA και έκανε ανάλυση του κυτταρικού κύκλου. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Bii, διακοπή φάσης S ήταν εντελώς καταργούνται όλες τις τρεις δόσεις της γκατιφλοξασίνης χρησιμοποιούνται σε ΤΟΡ-β1 siRNA επιμολυσμένα κύτταρα σε σύγκριση με μπερδεμένο siRNA επιμολυσμένα κύτταρα ή μη επιμολυσμένα κύτταρα. Κατά συνέπεια, το επόμενο επιδίωξε να προσδιορίσει το ρόλο των p21 και p27 κατά τη σύλληψη S-φάση του ΤΟΡ-β1 ευαίσθητα ΜΙΑ PaCa-2 ή ανθεκτικά κύτταρα Panc-1 αντίστοιχα. Βρήκαμε ότι siRNA p21 επιμολυσμένα ΜΙΑ PaCa-2 (Σχήμα 4Ci) και ρ27 siRNA επιμολυσμένα κύτταρα Panc-1 (Σχήμα 4Cii) αναστέλλει έντονα την επαγόμενη Gatifloxacin σύλληψης φάσης S σε σύγκριση με μπερδεμένο siRNA σε όλες τις δόσεις. siRNA μεσολαβεί γκρεμίσουμε του TGF-β1, ρ21 και ρ27 επιβεβαιώθηκε επίσης χρησιμοποιώντας ανάλυση κηλίδος western (Σχήμα 4Bii, Ci και CII). siRNA αποτελέσματα μεσολάβηση knockdown υποδεικνύουν ότι η S σύλληψη φάση της γκατιφλοξασίνης είναι ΤΟΡ-β1 /ρ21 εξαρτάται εν ΜΙΑ PaCa-2 και ρ27 σε κύτταρα που εξαρτώνται Panc-1.

Gatifloxacin Αναστέλλει ρΑΚΤ και προκαλεί G

2 φάσεων σύλληψη στο p53 με τρόπο που εξαρτάται σε δύο γραμμές κυττάρων

Διάφορες μελέτες έχουν δείξει ότι η p53 μπορεί να ενεργοποιήσει την έκφραση του p21 η οποία στη συνέχεια αναστέλλει εξαρτώμενη από κυκλίνη κινάσες και οδηγεί σε αναστολή του κυτταρικού κύκλου [30]. Παρομοίως ρΑΚΤ έχει επίσης αποδειχθεί ότι είναι ένα κρίσιμο ρυθμιστή της επιβίωσης των κυττάρων και την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, εκτός από τη ρύθμιση αρνητικά p53 [31]. Ως εκ τούτου, εμείς επόμενο ελέγξει την έκφραση του p53, ολική Akt και ρΑΚΤ σε παρουσία ή απουσία ποικίλων δόσεων της γκατιφλοξασίνης. Σχήμα 5Α και 5Β παρουσίασαν ενεργοποίηση της ρ53 τόσο σε μεταγραφικό και μεταφραστικό επίπεδο. Βρήκαμε θεραπεία Gatifloxacin στα 100 και 200 ​​μg /ml δόσης αυξάνει την έκφραση ρ53 με 1,4 έως 2 φορές (ρ & lt? 0,01) γονιδιακή και 1.8-2.45 φορές (ρ & lt? 0,01) μεταφραστικά σε κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2 και 1,75 έως 2,5 φορές (ρ & lt ? 0.013) γονιδιακή και 1.4-2.0 φορές μεταφραστικά σε κύτταρα Panc-1 μετά από 48 ώρες (Σχήμα 5λε, 5Bi) σε σύγκριση με τα κύτταρα που έλαβαν φορέα. Εμείς δεν βρήκε καμία αλλαγή στο επίπεδο /επίπεδο πρωτεΐνης mRNA p53 και στις δύο κυτταρικές σειρές σε 400 μg /ml της γκατιφλοξασίνης (Εικόνα 5Β). Δεδομένου ότι πήραμε τη μέγιστη έκφραση στα 200 μg /ml, κάναμε το πείραμα χρονικής πορείας στα 200 μg /ml της γκατιφλοξασίνης και παρατήρησε ότι η έκφραση p53 άρχισε να αυξάνεται μέσα σε 8 ώρες θεραπείας Gatifloxacin, γονιδιακή (p = 0,032), καθώς και translationaly (p = 0.022) σε Panc-1 κύτταρα αλλά υπάρχουν καθυστέρησε αύξηση στην έκφραση ρ53 σε PaCa-2 κύτταρα ΜΙΑ η οποία ενεργοποιεί σημαντικά μόνο μετά από 24 ώρες γονιδιακή (p = 0,034), καθώς και translationaly (p = 0.048) και φτάσει στο μέγιστο κατά 40 h (ρ & lt? 0,01) και πέρα ​​στις δύο κυτταρικές σειρές (Σχήμα 5Αϋ, 5Bii). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Bi, Gatifloxacin (100, 200, /ml 400 μg) θεραπεία προκάλεσε σημαντική μείωση στην ρΑΚΤ (Ser 473) επίπεδα σε ένα τρόπο που εξαρτάται από τη δοσολογία σε 0.86-0.51 φορές (p = 0,027) σε ΜΙΑ PaCa-2 και 0,89 -0,41 φορές (p & lt? 0,01) σε κύτταρα Panc-1, αντίστοιχα, χωρίς καμία αλλαγή στο συνολικό επίπεδο ΑΚΤ. πείραμα χρονική πορεία μας έδειξε ότι έως και 16 ώρες δεν υπήρχε μεγάλη μείωση των επιπέδων p-Akt (Ser 473), αλλά μετά από 16 ώρες δεν υπήρχε

σημαντική

μείωση των επιπέδων ρΑΚΤ (p & lt? 0,01) σε ΜΙΑ PaCa -2 κύτταρα. Σε Panc-1 κύτταρα, μέχρι 24 ώρες δεν υπήρχε μείωση στην ρΑΚΤ επίπεδα και μείωση έγινε σημαντική από 32 ώρες (ρ & lt? 0,01). Και μετά, σε παρουσία 400 μg /ml της θεραπείας Gatifloxacin (Σχήμα 5Bii)

(Α) (i) ανάλυση Real Time PCR της έκφρασης p53 σε μΙΑ PaCa-2 και τα κύτταρα Panc-1 υποβάλλεται σε επεξεργασία με Gatifloxacin κατά εξαρτώμενο από τη δόση τρόπο, (ii) Real Time PCR ανάλυση της έκφρασης p53 σε μΙΑ PaCa-2 και κύτταρα Panc-1 υποβάλλεται σε επεξεργασία με 200 μg /ml της γκατιφλοξασίνης σε έναν χρόνο εξαρτώμενο τρόπο. 18S rRNA χρησιμοποιήθηκαν για την κανονικοποίηση των αποτελεσμάτων. (Β) (i) ανάλυση κηλίδας Western των p53, ΑΚΤ και έκφραση ρΑΚΤ σε ΜΙΑ PaCa-2 και τα κύτταρα Panc-1 υποβάλλεται σε επεξεργασία με Gatifloxacin κατά εξαρτώμενο από τη δόση τρόπο, (ii) ανάλυση κηλίδας Western των p53, ΑΚΤ και ρΑΚΤ έκφραση σε MIA PaCa-2 και τα κύτταρα Panc-1 υποβάλλεται σε επεξεργασία με Gatifloxacin σε έναν χρόνο εξαρτώμενο τρόπο. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά του τυπικού πειράματος επαναλήφθηκε τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα. Bar Graph αντιπροσωπεύει τον μέσο όρο ± SEM. * P & lt? 0,01, # p & lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο

Η

Στη συνέχεια, προκειμένου να διερευνηθεί κατά πόσον η σύλληψη που προκαλείται από Gatifloxacin είναι p53 εξαρτώνται, ο αναστολέας της μεταγραφής ActinomycinD (ActD) και την πρωτεϊνική σύνθεση αναστολέα Κυκλοεξιμίδιο. (CHX) χρησιμοποιήθηκε και ανάλυση κυτταρικού κύκλου εκτελέστηκε. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6Α, παρουσία 200 μg /ml της γκατιφλοξασίνης υπήρχε πλήρης σύλληψη G

2-φάσεων, η οποία καταργήθηκε σε παρουσία CHX (2 μg /ml) και ActD (1 μg /ml) μετά από 48 h σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές. Δεξιός πίνακας του σχήματος δείχνει την αποτελεσματικότητα του CHX και Act D στη μείωση των επιπέδων ρ53. Τα αποτελέσματά μας πρότεινε ότι Gatifloxacin προκαλεί διακοπή G

2-φάσεων με τρόπο που εξαρτάται από το ρ53. Εμείς δεν θα μπορούσε να χρησιμοποιήσει siRNA εδώ επειδή είναι πολύ καλά τεκμηριωμένο ότι οι δύο ΜΙΑ PaCa-2 και Panc-1 έχουν μετάλλαξη σε p53 [32]. Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω ο ρόλος της p53 στη Gatifloxacin που προκαλείται G2 σύλληψη, μια σύγκριση μεταξύ των απαντήσεων σε ισογονιδιακές HCT116 άγριου τύπου p53 + /+ και ανεπάρκεια p53 – /- κυτταρικές σειρές έγινε. Εμείς αντιμετωπίζονται τόσο τις κυτταρικές γραμμές με Gatifloxacin (100, 200, 400 μg /ml) για 24 ώρες και βρέθηκε σημαντική αύξηση στο επίπεδο πρωτεΐνης ρ53 σε άγριου τύπου HCT116 ρ53 + /+ που ήταν παρόμοια με ΜΙΑ PaCa-2 και Panc-1. Αυτή η επαγωγή ωστόσο, δεν παρατηρήθηκε σε ρ53 ανεπάρκεια HCT116 ρ53 – /- κύτταρα κατεργασμένα υπό τις ίδιες συνθήκες (Εικόνα 6ΒΙ). Συγκρίναμε επίσης τον κυτταρικό πληθυσμό συλληφθεί στο G2-φάση μετά την αγωγή Gatifloxacin των δύο κυτταρικές σειρές κυτταρικές σειρές HCT116. Τα δεδομένα μας έδειξαν σημαντική αύξηση στη σύλληψη G2-φάση από 27% έως 41% σε HCT p53 + /+ κυτταρική σειρά, αλλά καμία αλλαγή σε υποπληθυσμό G2-φάση σε HCT ρ53 – /- κυτταρική σειρά με τον τρόπο αυτό δείχνει προς τη θεωρία μας του ρ53 ως ένας στόχος της gatifloxacin (Σχήμα 6Bii). Στη συνέχεια επιβεβαίωσε επίσης την επίδραση με ταυτόχρονη τον έλεγχο της έκφρασης της πρωτεΐνης ρ53 σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο (Gatifloxacin 0, 100, 200, 400 μg /ml) σε δύο θετικές κυτταρικές σειρές άλλα p53 MCF7 (2 έως 3,08 φορές αύξηση, ρ = 0,0078 ) και Α549 (2.1 έως 4.8 φορές αύξηση, p = 0,0085), αντιστοίχως (Σχήμα 6C).

(Α) Αριστερό πλαίσιο δείχνει την ανάλυση κυτταρικού κύκλου του ΜΙΑ PaCa-2 και Panc-1 κύτταρα όταν καλλιεργούνται σε ο παρουσία ή απουσία του ρ53 αναστολέα της μεταγραφής ActinomycinD (1 μg /ml) ή μεταγραφική αναστολέα κυκλοεξιμίδη (2 μg /ml) μαζί με 200 μg /ml Gatifloxacin για 48 ώρες και δεξιός πίνακας δείχνει την έκφραση της πρωτεΐνης ρ53 σε ΜΙΑ PaCa-2 και Panc- 1 κύτταρα σε παρουσία ή απουσία 200 μg /ml Gatifloxacin με ή χωρίς 2 μg /ml CHX ή 1 μg /ml ActD. % Εδώ δείχνει το ποσοστό των G

2 φάση υποπληθυσμό. (Β) (i) ανάλυση κηλίδας Western για έκφραση ρ53 σε HCT116 p53 + /+ και Ρ53 – /- κυτταρικές σειρές που έλαβαν θεραπεία με Gatifloxacin σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο για 24 ώρες. (Ii) Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου των HCT116 p53 + /+ και Ρ53 – /- σε επεξεργασία με Gatifloxacin (0-400 μg /ml) για 24 ώρες. % Εδώ δείχνει το ποσοστό των G

2 φάση υποπληθυσμό. (Γ) ανάλυση κηλίδας Western έκφρασης πρωτεΐνης ρ53 σε MCF 7 και κύτταρα Α549 σε επεξεργασία με Gatifloxacin κατά δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Bar Graph αντιπροσωπεύει τον μέσο όρο ± SEM. * P & lt?. 0.01, σε σύγκριση με τον έλεγχο

Η

Gatifloxacin μειώνει τα επίπεδα της S και G

2-φάση Ρυθμιστική CDKs και κυκλίνες σε δύο γραμμές κυττάρων

Για να αναλύσουμε τη βιοχημική γεγονότα που ελέγχει τη μετάβαση από μια φάση του κυτταρικού κύκλου εξετάσαμε τα επίπεδα αρκετών πρωτεϊνών του κυτταρικού κύκλου μετά από αγωγή με Gatifloxacin. Η κυκλίνη Α, κυκλίνη Ε και CDK2 ρυθμίζει κανονική πρόοδο S-φάσης [33]? [34] και βρήκαμε Gatifloxacin να μειώσει σημαντικά τα επίπεδα έκφρασης αυτών των πρωτεϊνών και στις δύο κυτταρικές σειρές σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο μετά από 48 h (Σχήμα 7Α). Κατά παρόμοιο τρόπο θεραπείας Gatifloxacin τόσο στις κυτταρικές γραμμές προκαλείται επίσης προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης Β1 Κυκλίνης, η οποία εμπλέκεται στην G

εξέλιξης 2 φάσεων. Ωστόσο, βρήκαμε αύξηση στην έκφραση της ανασταλτικής φωσφορυλίωσης cdc2 σε Tyr-15 καθώς και της συνολικής CDC-2 επίπεδα σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές, ενώ δεν υπήρξε καμία αλλαγή στην έκφραση του cdc25C.

(Α ) επίδραση της γκατιφλοξασίνης επί S και G

2 φάσεων ρυθμιστικών κυκλίνες και CDKs όπως εκτιμήθηκε με ανάλυση στυπώματος Western σε ΜΙΑ PaCa-2 και Panc-1 κύτταρα (Β) Gatifloxacin (100 μg /ml) συνεργεί στην αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση του γεμσιταβίνη (0.91nM /L) και Cisplatin (10 μΜ) σε ΜΙΑ PaCa-2 και τα κύτταρα Panc-1 όπως αξιολογείται με ανάλυση ΜΤΤ.