Αφηρημένο

Η έγκαιρη διάγνωση του καρκίνου της ουροδόχου κύστης (BCA) είναι ζωτικής σημασίας για την επιτυχή θεραπεία και διαχείριση των ασθενών. Μέσω της γονιδιωματικής και πρωτεομικής μελέτες, έχουμε εντοπίσει μια σειρά από καρκίνο της ουροδόχου κύστης που σχετίζεται με βιοδείκτες που έχουν πιθανή κλινική χρησιμότητα. Σε μια μελέτη ασθενών-μαρτύρων, εξετάσαμε άκυρους ούρων από 127 άτομα: 64 άτομα που φέρουν όγκους και 63 ελέγχους. Οι συγκεντρώσεις στα ούρα των ακόλουθων πρωτεϊνών εκτιμήθηκε με ανοσοπροσροφητική δοκιμασία συνδεδεμένη με ένζυμο (ELISA)? C-C χημειοκίνης μοτίβο 18 (CCL18), Αναστολέας του Ενεργοποιητή Πλασμινογόνου 1 (ΡΑΙ-1) και CD44. Τα δεδομένα συγκρίθηκαν με μια εμπορική δοκιμασία ανίχνευσης BCA βασισμένο σε ELISA (BTA-Trak ©) και ακυρώνεται ουρικής κυτταρολογία. Χρησιμοποιήσαμε ανάλυση της περιοχής κάτω από την καμπύλη του δέκτη λειτουργίας χαρακτηριστικές καμπύλες για να συγκρίνουμε την ικανότητα των CCL18, ΡΑΙ-1, CD44, και BTA για την ανίχνευση BCA σε άκυρο δείγματα ούρων. Ακράτεια συγκεντρώσεις CCL18, ΡΑΙ-1, και ΒΤΑ ήταν σημαντικά αυξημένα σε άτομα με BCA. CCL18 ήταν η πιο ακριβή βιοδεικτών (AUC? 0,919? 95% διάστημα εμπιστοσύνης [CI], 0,8704 – 0,9674). πολυπαραγοντική ανάλυση παλινδρόμησης τόνισε CCL18 (OR? 18,31? 95% CI, 4,95 έως 67,70,

σ

& lt? 0.0001) και BTA (OR? 6,43? 95% CI, 1,86 έως 22,21,

p

= 0,0033) ως ανεξάρτητοι προγνωστικοί παράγοντες της BCA σε ακυρώνονται δείγματα ούρων. Ο συνδυασμός των CCL18, ΡΑΙ-1 και CD44 βελτίωσε την περιοχή κάτω από την καμπύλη to0.938. Προκαταρκτικά αποτελέσματα δείχνουν ότι CCL18 ήταν μια εξαιρετικά ακριβή βιοδείκτης για την ανίχνευση BCA σε αυτή την ομάδα. CCL18 παρακολούθησης ακυρώνονται δείγματα ούρων έχει τη δυνατότητα να βελτιώσει τις μη επεμβατικές εξετάσεις για BCA διάγνωση. Επιπλέον, χρησιμοποιώντας το συνδυασμό των CCL18, ΡΑΙ-1 και CD44 μπορεί να κάνει το μοντέλο πιο ισχυρή σε σφάλματα για την ανίχνευση BCA πάνω από τις ατομικές βιοδείκτες ή BTA

Παράθεση:. Urquidi V, Kim J, Chang Μ, Dai Υ, Rosser CJ, Goodison S (2012) CCL18 σε Multiplex Βασίζεται στα ούρα δοκιμασίας για την ανίχνευση καρκίνου της ουροδόχου κύστης. PLoS ONE 7 (5): e37797. doi: 10.1371 /journal.pone.0037797

Επιμέλεια: Konradin Metze, Πανεπιστήμιο της Campinas, Βραζιλία

Ελήφθη: 26 Ιανουαρίου, 2012? Αποδεκτές: 28, Απρίλη του 2012? Δημοσιεύθηκε: May 21, 2012 |

Copyright: © 2012 Urquidi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από ερευνητικές επιχορηγήσεις από το National Cancer Institute RO1 CA116161 (SG), Φλόριντα Υπουργείο Υγείας James και η Εσθήρ βασιλιά βραβείο επιστημονικής ομάδας 10kt-01 (CJR), Flight Attendant Medical Research Institute (CJR). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, απόφαση για τη δημοσίευση και την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν διαβάσει την πολιτική του περιοδικού και έχουν τα ακόλουθα συγκρούσεις: Charles J. Rosser, Steve Goodison και Virgina Urquidi είναι υπάλληλοι της Nonagen Βιοεπιστήμης Corp. Οι συγγραφείς κατέχουν τα διπλώματα ευρεσιτεχνίας για την υπογραφή του καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Δεν υπάρχουν προϊόντα στην ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Η έγκαιρη διάγνωση του καρκίνου της ουροδόχου κύστης (BCA) βελτιώνει σημαντικά την πιθανότητα επιτυχούς θεραπείας ασθενούς και τη διαχείριση. Η ανάπτυξη της μοριακής δοκιμασίες που μπορεί να διαγνώσει την ασθένεια με ακρίβεια, ή ότι μπορεί να αυξήσει τις τρέχουσες μεθόδους αξιολόγησης, θα ήταν μια σημαντική πρόοδος. Μια μοριακή δοκιμασία που ίσχυε για μη επεμβατικά λαμβάνονται τα υγρά του σώματος, που θα διευκόλυνε όχι μόνο τη διάγνωση σε ασθενείς υψηλού κινδύνου, αλλά και ασυμπτωματικές έλεγχο, την παρακολούθηση της υποτροπής της νόσου και την ανταπόκριση στη θεραπεία. Η έλευση των προηγμένων πρωτεομική και τεχνολογιών γονιδιωματικής, και της συναφούς ανάπτυξης βιοπληροφορικής, φέρνει αυτούς τους στόχους στο επίκεντρο.

Το χρυσό πρότυπο για τη διάγνωση του BCA περιλαμβάνει εξέταση κυστοσκοπικές της ουροδόχου κύστης, μαζί με βιοψία και παθολογικές αξιολόγηση της βλάβης της ουροδόχου κύστης. Ακυρώνεται ουρικής κυτταρολογική εξέταση (VUC) παραμένει ως το go-to μη επεμβατική συμπλήρωμα στη κυστεοσκόπηση στην ανίχνευση του BCA. Ενώ VUC έχει ειδικότητα & gt? 93%, η ευαισθησία του είναι αρκετά μελαγχολική κατά 25-40%, ειδικά για χαμηλής ποιότητας και χαμηλής σταδίου όγκους [1], [2]. Η ανάγκη για πιο ακριβή ουροποιητικού βιοδείκτες για την ανίχνευση BCA είναι προφανής. Ένας αριθμός μοριακών δοκιμών έχουν αναπτυχθεί για την ανίχνευση όγκων της ουροδόχου κύστης, συμπεριλαμβανομένων αντιγόνων όγκου κύστης (ΒΤΑ) [3], πρωτεΐνη πυρηνικής μήτρας 22 (NMP-22) [4], και ImmunoCyt Urovysion [5]. Δυστυχώς, λόγω της περιορισμένης ευαισθησίας και /ή ειδικότητας τους, καμία από αυτές τις δοκιμασίες έχουν αποδειχθεί αρκετά ακριβείς για να αντικαταστήσει κυστεοσκόπηση ή VUC. Έτσι, δεν υπάρχουν ούρων που βασίζεται δοκιμές BCA που κυριαρχούν στο πεδίο εφαρμογής μέχρι σήμερα. Η ανεπαρκής δύναμη του ενιαίου βιοδεικτών μπορεί εν μέρει να εξηγήσει γιατί την ανίχνευση BCA χρησιμοποιώντας ανάλυση ούρων παραμένει μια πρόκληση. πρέπει να αποτελεί εξέλιξη προς τεστ που παρακολουθούν πολλαπλά βιοδείκτες, προκειμένου να επιτευχθεί η επιθυμητή διαγνωστική ακρίβεια εκεί.

Η έλευση των νέων υψηλής απόδοσης γονιδιωματική και πρωτεομική τεχνικές είναι η κινητήρια δύναμη βιοδεικτών ανακάλυψη προς τα εμπρός, και έχουμε απασχολούνται οι τεχνικές αυτές σε μια σειρά πειραμάτων [6], [7], [8] από την οποία έχουμε προέρχονται και τα δύο οξύ και πρωτεΐνη βιοδεικτών πάνελ νουκλεϊκών που διευκολύνουν μη επεμβατική ανίχνευση BCA με απόλυτη ακρίβεια. Περαιτέρω επιλογή και την επικύρωση των 14 πρωτεϊνών από τις πρωτεομική μελέτες, και ορισμένα προϊόντα πρωτεΐνης από τη γονιδιωματική υπογραφή, βασίστηκε σε στατιστικά κατάταξη της σύνδεσης με την BCA, και τη διαθεσιμότητα των εμπορικών κιτ ELISA. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε κατά πόσον η παρακολούθηση ορισμένων από αυτούς τους στόχους χρησιμοποιώντας δοκιμασίες ανίχνευσης του ανοσοποιητικού που βασίζεται μπορούσε να επιβεβαιώσει την πιθανή κλινική χρησιμότητα ενός μη επεμβατική διαγνωστική εξέταση. Χρησιμοποιώντας δοκιμασίες ELISA, παρακολουθήσαμε τρεις πρωτεΐνες-στόχους (CC μοτίβο χημειοκίνης 18, CCL18? Αναστολέας του Ενεργοποιητή Πλασμινογόνου 1, ΡΑΙ-1? Και CD44) σε δείγματα ούρων από μία κοόρτη 127 άτομα, και σε σύγκριση με διαγνωστική απόδοση με εκείνη που λαμβάνεται χρησιμοποιώντας τον εμπορικό ΒΤΑ -Trak δοκιμασία και VUC.

Αποτελέσματα

οι δημογραφικές, τα κλινικά και παθολογικά χαρακτηριστικά της σειράς ασθενών παρουσιάζονται στον πίνακα 1. Μόνο το 28% της κλάσης του καρκίνου είχε θετική VUC ενώ VUC ειδικότητα ήταν 98 %. Ακράτεια CCL18 και ΡΑΙ-1 ήταν ανιχνεύσιμα στην πλειοψηφία των ασθενών χωρίς ένδειξη BCA. Τόσο ΒΤΑ και CD44 ανιχνεύθηκαν σε δείγματα από τις δύο που φέρει όγκο και ομάδες ελέγχου. Η μέση ουρική επίπεδα (Πίνακας 2) του CCL18 (637,39 pg /ml έναντι 4,81 pg /ml,

ρ

& lt? 0,0001), ΡΑΙ-1 (6,82 ng /ml έναντι 0,06 ng /ml,

σ

& lt? 0,0001), και BTA 1.630,55 U /ml έναντι 14,54 U /ml,

σ

& lt? 0,0001) ήταν σημαντικά υψηλότερη σε άτομα με BCA σε σύγκριση με άτομα χωρίς ενδείξεις BCA. Η μέση ουροποιητικού CD44 ήταν αυξημένα σε άτομα χωρίς BCA σε σύγκριση με άτομα με BCA (117,22 ng /ml έναντι 53.09 ng /ml,

σ

& lt? 0,0001). Τα δεδομένα ELISA παρουσιάζονται σε boxplot σχήμα (Σχήμα 1).

Η

Η ικανότητα των βιοδεικτών δοκιμή για να προβλέψουμε την παρουσία BCA αναλύθηκε χρησιμοποιώντας αναλύσεις μη παραμετρική ROC, σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές Εθνικού Ινστιτούτου Καρκίνου [9]. Με βάση την περιοχή κάτω από την καμπύλη ROC (AUROC), προσδιορίσαμε τις τιμές αποκοπής Youden Index να μεγιστοποιηθεί το ποσό της ευαισθησίας και εξειδίκευσης. Ακράτεια CCL18 ήταν η πιο ακριβή βιοδεικτών με εμβαδόν κάτω από την καμπύλη των 0,919 (95% CI: 0,8704 – 0,9674). Χρησιμοποιώντας την τιμή αποκοπής Youden Index (Σχήμα 2), την ουροδόχο CCL18 παρέχεται μία ευαισθησία 88%, εξειδίκευση 86%, θετική προγνωστική αξία του 86% και αρνητική προγνωστική αξία του 87%. ΡΑΙ-1 ήταν ένα λιγότερο ακριβής βιοδείκτης για την ανίχνευση BCA (περιοχή κάτω από την καμπύλη: 0.686? 95% CI: 0,6119 – 0,7601). Χρησιμοποιώντας την τιμή αποκοπής Youden Index (Σχήμα 2), την ουροδόχο αναλύσεις ΡΑΙ-1 αποκάλυψε μια ευαισθησία 42%, ειδικότητα 100%, θετική προγνωστική τιμή 100% και αρνητική προγνωστική αξία του 63%. Αυξημένα επίπεδα ουρικής CD44 δεν ήταν ενδεικτικά του BCA (περιοχή κάτω από την καμπύλη: 0.488? 95% CI: 0,383 έως 0,5937). ΒΤΑ χρησίμευσε ως θετικός προσδιορισμός αναφορά μας και παρατηρήθηκε να έχει μια AUROC του 0,818 (95% CI: 0.74-0.90, Σχήμα 2). Χρησιμοποιώντας την τιμή αποκοπής Youden Index, του ουροποιητικού BTA παρείχε μια ευαισθησία 80%, ειδικότητα 84%, θετική προγνωστική αξία 84% και αρνητική προγνωστική αξία 80%.

Τα δεδομένα κανονικοποιούνται στο ουροποιητικό κρεατινίνης. Τα διάμεσα επίπεδα απεικονίζονται με οριζόντιες γραμμές. Σημασία (

σ

& lt? 0,05). Αξιολογήθηκε από τη δοκιμή αθροίσματος κατάταξης Wilcoxon

Η

Με βάση την περιοχή κάτω από την καμπύλη ROC (AUROC), οι τιμές αποκοπής Youden Δείκτης που μεγιστοποιείται η άθροισμα της ευαισθησίας και της ειδικότητας προσδιορίστηκαν για κάθε βιοδείκτη (διαμάντι). Ο πίνακας παρέχει τιμές επιδόσεων για κάθε βιοδείκτη

Η

Στην πολυπαραγοντική ανάλυση λογιστικής παλινδρόμησης που προσαρμόζονται για τις επιδράσεις της ηλικίας και φυλής, αυξημένα CCL18 (OR:. 18.31? 95% CI: 4,95 – 67,70?

σ

& lt? 0,0001), αυξημένα BTA (OR: 6,43? 95% CI: 1,86 – 22,21?

σ

= 0,0033) και μείωσε ουροποιητικού επίπεδα CD44 (OR: 0,039? 95% CI: 0,004 -0.35?

σ

= 0,0036) συνδέθηκαν με BCA σε ακυρώνονται δείγματα ούρων (Πίνακας 3)

Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, μόνο βιοδείκτες υπολείπονται μη λαμβάνοντας υπόψη την πολυπλοκότητα των ετερογενών όγκων. , έτσι ένα πολλαπλό δοκιμασία για την ανίχνευση ένα πάνελ βιοδεικτών μπορεί να αποδειχθεί ευεργετική. Χρησιμοποιώντας τις τιμές αποκοπής Youden Δείκτης CCL18, ΡΑΙ-1 και CD44, αυτές οι βιοδείκτες συνδυάστηκαν και αναλύθηκαν (Σχήμα 3). Ο συνδυασμός των CCL18, ΡΑΙ-1 και CD44 (περιοχή κάτω από την καμπύλη: 0.938). Επιτευχθεί μία ευαισθησία 86%, ειδικότητα 89%, θετική προγνωστική αξία 89% και αρνητική προγνωστική αξία 86%

συζήτηση

Χρησιμοποιώντας καινοτόμες προσεγγίσεις [6] – [8], έχουμε εντοπίσει μια προκαταρκτική διαγνωστική υπογραφή των 14 δεικτών που σχετίζονται με BCA. Σε αυτή τη μελέτη, αναφέρουμε τα ευρήματά μας από τρία από αυτά τα 14 βιοδείκτες.

Η βάση για την περιοχή κάτω από την καμπύλη ROC (AUROC), οι τιμές αποκοπής Youden Δείκτης που μεγιστοποιείται το άθροισμα της ευαισθησίας και της ειδικότητας προσδιορίστηκαν

. Δεδομένων στο πλαίσιο του σχήματος παρέχουν τιμές απόδοσης. PPV, θετική προγνωστική αξία. ΚΠΑ, αρνητική προγνωστική αξία.

Η

Αυξημένα ουρικά επίπεδα της CCL18, ΡΑΙ-1, και BTA, συσχετίστηκαν σε σημαντικό βαθμό με την παρουσία του BCA. Στην μονοπαραγοντική ανάλυση, CCL18 αποδείχθηκε ότι είναι ο δείκτης που συνδέεται με τα BCA (AUC? 0,919? 95% CI, 0,8704 – 0,9674), με συνολική θετική προγνωστική αξία του 86%, και αρνητική προγνωστική αξία 87%. πολυπαραγοντική ανάλυση παλινδρόμησης τόνισε CCL18 (OR? 18,31? 95% CI, 4,95 έως 67,70,

σ

& lt? 0,0001), BTA-Trak © (OR? 6,43? 95% CI, 1,86 έως 22,21,

p

= 0,0033) και CD44 (OR? 0,039? 95% CI, 0,004 – 0,35, p = 0,0036) ως ανεξάρτητες μεταβλητές στην ανίχνευση BCA σε ακυρώνονται δείγματα ούρων. Με συνολική ακρίβεια του 92%, CCL18 ξεπέρασε σαφώς τους άλλους βιοδείκτες, συμπεριλαμβανομένων BTA, ως πρωτεΐνη-στόχο για την ανίχνευση BCA από την ανάλυση ούρων. Η συμπερίληψη πρόσθετων δεικτών (π.χ., ΡΑΙ-1 και CD44) σε ένα multiplex ομάδα δεν μπορεί να αυξήσει την προγνωστική δύναμη σημαντικά (AUC 0.919 έναντι 0.938), αλλά η προσθήκη τους μπορεί να κάνει το μοντέλο πιο ισχυρή σε σφάλματα απεικονίζοντας έτσι το όφελος ενός multiplex δοκιμασία για τη διάγνωση BCA.

CCL18 είναι ένα μέλος της οικογένειας κυτοκινών εκκρινόμενων πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην ανοσορυθμιστικές και φλεγμονώδεις διεργασίες. CCL18 θεωρείται ότι προάγει την διεισδυτικότητα των καρκινικών κυττάρων με την ενεργοποίηση της ιντεγκρίνης ομαδοποίηση και ενισχύοντας την προσκόλλησή τους στην εξωκυτταρική μήτρα, και ένας υποδοχέας (PITPNM3) για αυτήν την κυτοκίνη έχει πρόσφατα εντοπιστεί [10]. Μια σειρά κυτοκινών και των υποδοχέων τους είναι γνωστό ότι εκφράζεται με παρεκκλίνοντα σε καρκινικά κύτταρα και έτσι είναι κατανοητό ότι CCL18 μπορεί να δράσει κατά παρακρινή τρόπο κατά την διάρκεια του όγκου έναρξης /εγκατάστασης. Ως βιολογικός δείκτης κακοήθους νόσου, CCL18 έχει αναφερθεί ότι είναι ενδεικτική της ωοθήκης [11], [12] και του καρκίνου του τραχήλου [13]. Μια προσέγγιση πρωτεομική εντοπίζονται αυξημένα CCL18 ορό ως συσχετίζονται με καρκίνο των ωοθηκών, και το εύρημα αυτό ελέγχθηκε με τη χρήση ELISA σε 535 δείγματα. Σε συνδυασμό με CXCL1, παρακολούθηση CCL18 ξεπέρασε CA125 ως ένα κυκλοφορούν βιοδείκτη ωοθηκών [12]. Μια μελέτη αναλύει διαφορική γονιδιακή έκφραση σε 33 δείγματα στερεού ιστού προσδιορίζονται CCL18 ως ένα από είκοσι μεταγραφές σημαντικά υπερεκφράζεται σε καρκίνους του τραχήλου επεμβατική [13].

ΡΑΙ-1 είναι ένα μέλος του αναστολέα πρωτεϊνάσης σερίνης σούπερ οικογένεια και είναι ο αναστολέας κύριος του ενεργοποιητή πλασμινογόνου ιστού (tPA) και την ουροκινάση (υΡΑ), έτσι ρυθμίζει ινωδόλυσης [14]. ΡΑΙ-1 θεωρείται ότι είναι μια πολυλειτουργική πρωτεΐνη, η οποία μπορεί επίσης να ρυθμίζουν την ανάπτυξη του όγκου των κυττάρων και της μετανάστευσης, της αγγειογένεσης και προσκόλλησης κυττάρου [15], [16]. Τα αποτελέσματα από διαφορετικές ανθρώπινους καρκίνους έχουν δείξει ότι τα επίπεδα του tPA ή υΡΑ είναι σημαντικά υψηλότερα σε καρκινικό ιστό σε σχέση με αντίστοιχο φυσιολογικό ιστό [17] – [19]. Hudson

et

al.

Ανέφεραν ότι και οι δύο μη επεμβατική και επεμβατική ανθρώπινες κυτταρικές σειρές BCA παράγουν ΡΑΙ-1 [20], και αυξημένα ΡΑΙ-1 γονίδιο και η έκφραση πρωτεΐνης σε ιστούς και πλάσμα έχει έχουν παρατηρηθεί σε ασθενείς BCA με κακή πρόγνωση [21]. Σε μια μελέτη παρακολούθησης ΡΑΙ-1 σε ιστούς, ορό και στα ούρα, σημαντικά υψηλότερα επίπεδα σε ιστούς και στον ορό συσχετίζεται με κακή πρόγνωση, αλλά αυτό δεν ήταν αλήθεια για την ακράτεια ΡΑΙ-1 [21]. Στη μελέτη μας, ψάχναμε για την παρουσία του BCA, και δεν θεωρούν την πρόγνωση. Ήμασταν σε θέση να αποδείξει ότι η ακράτεια ΡΑΙ-1 ήταν σημαντικά αυξημένα σε άτομα με BCA (6.82 έναντι 0.06,

σ

& lt? 0,0001), ωστόσο, στην πολυπαραγοντική ανάλυση, ΡΑΙ-1 δεν ήταν ανεξάρτητος προγνωστικός δείκτης της BCA. PAI-1 δεν μπορεί να είναι ένα ισχυρό αυτόνομο βιοδεικτών για την ανίχνευση BCA, αλλά απαιτείται περαιτέρω έρευνα για να διαπιστωθεί εάν προσθέτει αξία σε πολλούς πίνακες βιοδείκτη.

Πολλές μελέτες έχουν διερευνήσει CD44 ως βιοδείκτη για τον καρκίνο, συμπεριλαμβανομένων BCA. CD44 είναι ένα πανταχού εκφραζόμενη διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη που μπορεί να αλληλεπιδράσει με μια ποικιλία συνδετών, π.χ., συνθετάσες υαλουρονικό οξύ, και εμπλέκεται σε αλληλεπιδράσεις κυττάρου-κυττάρου, κυτταρική προσκόλληση και μετανάστευση [22]. Μεταγραφές για αυτό το γονίδιο υποβάλλονται σε πολύπλοκες εναλλακτικό μάτισμα με αποτέλεσμα σε μια μυριάδα των mRNA και πρωτεΐνης ισομορφών με λειτουργική ποικιλομορφία, και αυτό καθιστά δύσκολο να επιτευχθεί συναίνεση επί των οποίων οι στόχοι CD44 ισχύουν βιοδείκτες. Klatte

et

al.

Απέδειξαν ότι απουσιάζει η έκφραση CD44v6 σε αποκοπέντος ιστού είναι ένας ανεξάρτητος προγνωστικός δυσμενής του BCA υποτροπής και συνολικής επιβίωσης [23], και υπερ-έκφραση του CD44V8-10 σε απολεπιδωμένου ουροθηλιακό κύτταρα έχει αναφερθεί ότι είναι ένας ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας πρόβλεψης σε ασθενείς με BCA [24]. Έχουμε προηγουμένως αναπτύξει μία δοκιμασία σάντουιτς ELISA που μέτρησε την πρωτεΐνη ισομορφή πρωτεΐνη CD44v6 σε λύματα ουροθηλιακό κύτταρο. Σε μια μελέτη 65 περιπτώσεων, η ανίχνευση σάντουιτς ELISA επιτευχθεί 81% ευαισθησία και 100% ειδικότητα για BCA διάγνωση [25]. Σύμφωνα με τις διαπιστώσεις αυτές, μια μελέτη ήταν σε θέση να συνδέσει διαλυτό CD44v6 mRNA σε καρκινικά ούρα ασθενών με BCA [26]. ουροθηλιακά κυττάρων προφίλ και την επικύρωση της μελέτης μας [7] επιβεβαιώνουν ότι οι μεταγραφές παρακολούθηση CD44 μπορεί να έχει αξία στην κλινική αξιολόγηση, αλλά διαλυτή πρωτεΐνη CD44 ουροποιητικού δεν φαίνεται να είναι μια πολλά υποσχόμενη διαγνωστικών βιοδεικτών.

Αναγνωρίζουμε ότι η μελέτη μας έχει αρκετούς περιορισμούς. Πρώτα ως εγκατάσταση τριτοβάθμιας περίθαλψης, έχουμε την τάση να δείτε περισσότερες υψηλής ποιότητας, η νόσος υψηλής στάδιο, το οποίο αντανακλάται στην ομάδα μελέτης μας. Για να επιβεβαιώσετε την ευρωστία του CCL18, μεταγενέστερες μελέτες πρέπει να αξιολογούν μεγαλύτερες ομάδες που περιλαμβάνουν άτομα με χαμηλής ποιότητας, χαμηλής στάδιο της νόσου. Δεύτερον, επεξεργασία, κλίση ούρα αναλύθηκαν. Ούρα φυγοκεντρήθηκαν και διαχωρίστηκαν σε κυτταρικό σβώλο και υπερκείμενο πριν από την αποθήκευση στους -80 ° C. Είναι εφικτό ότι προσφάτως ακυρώνεται δείγματα ούρων μπορούν να παρέχουν διαφορετικά αποτελέσματα, και είναι φρέσκο ​​ούρων που θα ήταν το υλικό που χρησιμοποιείται για προσδιορισμούς point-of-care. Αυτή τη στιγμή ερευνά την απόδοση των επιλεγμένων βιοδεικτών στα ούρα σε επεξεργασία μέσω ενός αριθμού διαφορετικών πρωτοκόλλων, συμπεριλαμβανομένου του πρόσφατα ακυρώνονται ούρα. Στη συνέχεια, η ευαισθησία της VUC σε ομάδα μας από κυρίως υψηλής ποιότητας (βαθμού 3) νόσο (28%) ήταν χαμηλότερο από θα αναμενόταν. Αυτό θέτει υπό αμφισβήτηση τη γνωστή μεταξύ παρατηρητή μεταβλητότητα της ερμηνείας VUC. Σε μεταγενέστερες μελέτες, θα αξιοποιήσει δύο κυτταροπαθολόγους να ερμηνεύσει αυτά τα αποτελέσματα. Επιπλέον, δεν είναι βέβαιο πως η σύνθεση πρωτεΐνης του υπερκείμενου υγρού ούρων μπορεί να αλλάξει κατά τη διάρκεια της φύλαξης σε κατάψυξη. Ο αριθμός των κύκλων ψύξης-απόψυξης διατηρήθηκε σε 1-2 με τη διαίρεση του υπερκειμένου των ούρων σε πολλαπλά μικρά κλάσματα. Τέλος, το μέγεθος του δείγματος μας 127 είναι μικρό και οι δύο ομάδες που αποτελούνται τα 127 άτομα ήταν σχετικά ομοιογενής, δηλαδή είτε ενεργό καρκίνο, ή περιπτώσεις ελέγχου χωρίς ενεργό καρκίνο, χωρίς ιστορικό καρκίνου, χωρίς λοίμωξη του ουροποιητικού συστήματος, χωρίς νεφρολιθίαση, και δεν ακαθάριστο αιματουρία. Έτσι, δεν ήμασταν σε θέση να εκτιμήσει την ευαισθησία /ειδικότητα των βιοδεικτών μας μεταξύ των διαφόρων σταδίων /βαθμούς. Η ιδιαιτερότητα του υπόσχεται βιοδείκτες, όπως CCL18 πρέπει να δοκιμαστεί σε ομάδες που είναι γνωστό ότι είναι προβληματικό με άλλες αναλύσεις ούρων με βάση (π.χ., αιματουρία, λοίμωξη του ουροποιητικού συστήματος, πέτρες και διαταραχές της ούρησης). Όπως έχουμε βελτιώσετε διαγνωστικές μοριακές υπογραφές μας και να επιλέξετε συγκεκριμένους στόχους για την ανάπτυξη νουκλεϊκών οξέων που βασίζονται ή του ανοσοποιητικού που βασίζεται σε δοκιμασία, τα ευρήματά μας θα επιβεβαιωθεί σε μεγάλες, προοπτική και πολυκεντρική συνεργατική φάση 2 και 3 δοκιμές που αποτελείται από άτομα όχι μόνο με το BCA, αλλά με λοίμωξη του ουροποιητικού συστήματος, νεφρολιθίαση, το ακαθάριστο αιματουρία και συμπτώματα κένωσης.

Η ανάπτυξη των ούρων που βασίζονται σε βιοδείκτες του καρκίνου της ουροδόχου κύστης θα ήταν τεράστιο όφελος για τους ασθενείς και τα συστήματα υγείας. Έχουμε αποδείξει σε μια προκαταρκτική μελέτη που αυξημένα ουρική συγκέντρωση της πρωτεΐνης CCL18 συνδέεται στενά με την παρουσία του BCA. Επιπλέον, ο συνδυασμός της CCL18, ΡΑΙ-1 και CD44 μπορεί να μην αυξήσει την προβλεπτική ικανότητα των CCL18 σημαντικά, αλλά μπορεί να κάνει το μοντέλο πιο ισχυρή σε σφάλματα. Μεγαλύτερο, οι προοπτικές μελέτες που απαιτούνται για τον προσδιορισμό του δυναμικού ρόλου της CCL18 στην αξιολόγηση των ασθενών που βρίσκονται σε κίνδυνο BCA.

Υλικά και Μέθοδοι

Ασθενείς και την επεξεργασία δειγμάτων

υπό την έγκριση MD Anderson Cancer Center του Ορλάντο Institutional Review Board και ενημέρωσε γραπτή συγκατάθεση, ακυρώνονται δείγματα ούρων, και οι σχετικές κλινικές πληροφορίες προοπτικά συλλέγονται. Η ομάδα μελέτης αποτελούνταν από 63 άτομα χωρίς προηγούμενο ιστορικό καρκίνου urothelia, το ακαθάριστο αιματουρία, ενεργή λοίμωξη του ουροποιητικού συστήματος ή νεφρολιθίαση, και 64 άτομα με νεοδιαγνωσμένο ουροθηλιακό καρκίνωμα. Οι ασθενείς με γνωστή νεφρική νόσο ή τεκμηριωμένη νεφρική ανεπάρκεια που δεν είχαν εγγραφεί. Σύμφωνα με τη διεθνή συναίνεση Πίνακας των δεικτών της ουροδόχου κύστης όγκων [27], αυτή η ομάδα χρησίμευε ως ΙΙ (μελέτη επικύρωσης) φάση. Τα δεδομένα αναφέρονται με βάση τα κριτήρια stard [28]. Στην ομάδα μας καρκίνος, αξονική απεικόνιση της κοιλίας και της πυέλου και κυστεοσκόπηση διεξήχθησαν, και καρκίνωμα ουροθηλίου κυττάρου επιβεβαιώθηκε με ιστολογική εξέταση του αποκοπέντος ιστού. Σχετικές πληροφορίες για κλινική παρουσίαση, σταδιοποίηση, ιστολογική διαβάθμιση [29], [30] και το αποτέλεσμα καταγράφηκε (Πίνακας 1).

Πριν από οποιοδήποτε τύπο θεραπευτικής παρέμβασης, 50-100 κ.εκ. ακυρώνεται ούρων ελήφθη από κάθε θέμα. Πενήντα χιλιοστόλιτρα ούρων χρησιμοποιήθηκε για κλινικές εργαστηριακές αναλύσεις ανά τυπικές διαδικασίες. Το υπόλοιπο δείγμα ούρων αποδίδεται ένα μοναδικό αριθμό αναγνώρισης πριν από άμεση εργαστήριο επεξεργασίας. Κάθε δείγμα ούρων φυγοκεντρήθηκε στις 600 χ g στους 4 ° C για 5 λεπτά. Το υπερκείμενο αποχύθηκε και κλασματοποιήθηκε, ενώ η ουρική σφαιρίδιο ήταν καταψύχθηκαν. Τόσο το υπερκείμενο και στο ίζημα φυλάχθηκαν στους -80 ° C πριν από την ανάλυση. Δείγματα των υπερκειμένων ούρων αποψύχθηκαν και αναλύθηκαν για περιεκτικότητα πρωτεΐνης με χρήση Pierce 660-nm Kit Protein Assay (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, ΜΑ, USA). Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας το φασματοφωτόμετρο NanoDrop (ND-1000, ThermoScientific, Wilmington, DE, USA).

Δοκιμασία ούρων Βασισμένο ενζυματικής ανοσοαπορρόφησης (ELISA)

Τα επίπεδα της ανθρώπινης CC μοτίβο χημειοκινών 18 (CCL18), επίσης γνωστή ως CCL18 (Cat # ab100620 Abcam, Cambridge, ΜΑ, USA), τα ανθρώπινα Αναστολέας του ενεργοποιητή πλασμινογόνου 1 (ΡΑΙ-1, Cat # ΕΑ-0207 Signosis Inc., Sunnyvale, CA, USA), και CD44 (Cat # 45912 ab Abcam, Cambridge, MA, USA) παρακολουθήθηκαν σε δείγματα ούρων χρησιμοποιώντας ένζυμο-συνδεδεμένη ανοσορροφητική δοκιμασία. Εμπορικά διαθέσιμες δοκιμασίες ELISA χρησιμοποιήθηκαν επίσης για τη μέτρηση των επιπέδων του ουροποιητικού αιμοσφαιρίνης (Cat # E88-135 Bethyl Laboratories Inc., Μοντγκόμερι, Τέξας, ΗΠΑ), και BTA (BTA-Trak © Ca # 662150 Polymedco Inc. Cortlandt Manor, NY, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής ). Οι αναγνώστες αυτών των δοκιμασιών ήταν τυφλές ως προς την κατάσταση της ασθένειας. Όλες οι δοκιμασίες διεξήχθησαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι καμπύλες βαθμονόμησης παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας καθαρισμένη πρότυπα για κάθε πρωτεΐνη αξιολογηθεί. Προσαρμογή καμπύλης επιτεύχθηκε με είτε γραμμικές ή τεσσάρων παραμέτρων λογιστικής παλινδρόμησης ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Κρεατινίνη Δοκιμασία

Η κρεατίνη μετατρέπεται μη ενζυματικά προς την κρεατινίνη μεταβολίτη, το οποίο διαχέεται μέσα στο αίμα και εκκρίνεται στα ούρα από τα νεφρά με σταθερό ρυθμό. Κατά συνέπεια, ουρική κρεατινίνη είναι ένα χρήσιμο εργαλείο για την ομαλοποίηση των επιπέδων των άλλων μορίων που βρέθηκαν στα ούρα [31], [32]. Τα προκαταρκτικά αποτελέσματά μας (δεν φαίνονται) έδειξαν ότι λόγω της αιματουρία (μικροσκοπική ή μεικτό αίμα στα ούρα), η οποία περιέχει αυξημένα επίπεδα των πρωτεϊνών, η πρωτεΐνη δεν θα είναι ένας καλός δείκτης για την κανονικοποίηση. Έτσι, οι συγκεντρώσεις όλων των παρακολουθήθηκε πρωτεϊνών (CCL18, ΡΑΙ-1, CD44 και ΒΤΑ) ομαλοποιήθηκαν για ουρική κρεατινίνης και οι συγκεντρώσεις αυτές αναφέρθηκαν ως μια αναλογία σε σχέση με το ουροποιητικό τιμές κρεατινίνης. Η δοκιμασία της κρεατινίνης διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Cat # KGE005 R &? D Systems Inc., Minneapolis, ΜΝ, USA). Εν συντομία, τα υπερκείμενα ούρα αποψύχθηκαν, αραιώθηκαν με αποσταγμένο νερό και την επεξεργασία με αλκαλικό διάλυμα πικρικού. Τα επεξεργασμένα δείγματα μετρήθηκαν σε αναγνώστη μικροπλάκας (Bio-tek, Synergy

TM ΗΤ, VT) σε μήκος κύματος 490 nm. Μια πρότυπη καμπύλη χρησιμοποιώντας καθαρισμένη πρότυπα δημιουργήθηκε από την ανάλυση παλινδρόμησης χρησιμοποιώντας τεσσάρων παραμέτρων λογιστική καμπύλη προσαρμογής και εντάσεις σήματος μετατράπηκαν σε συγκεντρώσεις.

Στατιστική Ανάλυση

Η σχέση μεταξύ κάθε βιοδεικτών και BCA ήταν δοκιμάστηκε χρησιμοποιώντας την δοκιμή αθροίσματος κατάταξης Wilcoxon. Απαραμετρική λειτουργικό χαρακτηριστικό του δέκτη (ROC) καμπύλη στην οποία η τιμή για την ευαισθησία παρίσταται γραφικώς έναντι παράχθηκαν ψευδώς θετικό ποσοστό (1-ειδικότητα). Ορίσαμε μια διαγνωστική δοκιμή ως θετικό ή αρνητικό για την ανίχνευση BCA χρησιμοποιώντας μια τιμή αποκοπής. επιλέχθηκε Η βέλτιστη αποκοπής (δείκτης Youden) για να μεγιστοποιηθεί το ποσό της ευαισθησίας και της ειδικότητας [33]. Η ακρίβεια ενός βιοδείκτη για την πρόβλεψη της παρουσίας BCA ορίστηκε ως ο μέσος όρος της ευαισθησίας και της ειδικότητας. Για να εκτιμηθεί η ανεξάρτητη συσχέτιση μεταξύ βιοδεικτών και BCA, ανάλυση λογιστικής παλινδρόμησης διεξήχθη με BCA κατάσταση (ναι έναντι όχι) ως μεταβλητή απόκρισης, και CCL18, ΡΑΙ-1, CD44, συγκεντρώσεις BTA ως επεξηγηματικές μεταβλητές. Η στατιστική σημαντικότητα σε αυτή τη μελέτη ορίστηκε στο

σ

& lt? 0,05 και όλοι ανέφεραν

σ

τιμές ήταν 2 όψεων. Όλες οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με την έκδοση του λογισμικού της SAS 9.1.3.

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς είναι ευγνώμονες προς τους 127 άτομα που συμμετείχαν σε αυτή την κλινική μελέτη.