Αφηρημένο

Εισαγωγή

Εγγενής και επίκτητη αντίσταση σισπλατίνη μειώνει την αποτελεσματικότητα αυτού του παράγοντα στη διαχείριση των μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC). Η κατανόηση των μοριακών μηχανισμών στους οποίους αυτή η διαδικασία μπορεί να οδηγήσει στην ανάπτυξη νέων παραγόντων για την ενίσχυση της ευαισθησίας της σισπλατίνης.

Μέθοδοι

Ένα ισογονιδιακό μοντέλο σισπλατίνης αντίσταση δημιουργήθηκε σε ένα πάνελ κυτταρικών γραμμών NSCLC (Α549, SKMES-1, MOR, Η460). Για μία περίοδο δώδεκα μηνών, σισπλατίνη ανθεκτικά (άδΚ) κυτταρικές σειρές που προέρχονται από το αρχικό, με σύμπτωση ηλικίας πατρικά κύτταρα (ΡΤ) και στη συνέχεια χαρακτηρίστηκαν. Πολλαπλασιασμό (ΜΤΤ) και οι δοκιμασίες κλωνογόνο επιβίωση (crystal violet) διεξήχθησαν μεταξύ των κυττάρων PT και άδΚ. Cellular ανταπόκριση στη σισπλατίνη που προκαλείται από απόπτωση και κυτταρικό κύκλο διανομής εξετάστηκαν με ανάλυση FACS. Μια ομάδα κυττάρων και πολυδύναμων βλαστικών καρκινικοί δείκτες εξετάστηκε επιπροσθέτως των πρωτεϊνών EMT, c-Met και β-κατενίνης. σχηματισμό προϊόντος προσθήκης σισπλατίνη DNA, βλάβες στο DNA (γH2AX) και κυτταρική πρόσληψη της πλατίνας (ICP-MS) αξιολογήθηκε επίσης.

Αποτελέσματα

μελετών Χαρακτηρισμός κατέδειξαν μειωμένη ικανότητα πολλαπλασιασμού των κυττάρων του όγκου πνεύμονα σε απάντηση να σισπλατίνη, αυξημένη αντίσταση σε κυτταρικό θάνατο σισπλατίνη που προκαλείται από, συσσώρευση των ανθεκτικών κυττάρων στην φάση G0 /G1 του κυτταρικού κύκλου και την ενισχυμένη κλωνογονική ικανότητα επιβίωσης. Επιπλέον, ανθεκτικών κυττάρων εμφανίζεται ένα υποθετικό στέλεχος που μοιάζει με υπογραφή με αυξημένη έκφραση του CD133 + /CD44 + κυττάρων και την αυξημένη δραστηριότητα ALDH σε σχέση με αντίστοιχες γονικά κύτταρα τους. Οι δείκτες βλαστικών κυττάρων, Nanog, Oct-4 και SOX-2, ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω όπως και οι δείκτες EMT, c-Met και β-κατενίνης. Ενώ ανθεκτικές υποσειρές έδειξαν μειωμένη πρόσληψη της σισπλατίνης σε απόκριση σε θεραπεία, μειωμένο σχηματισμό προϊόντος προσθήκης σισπλατίνη GpG DNA και μειώθηκαν σημαντικά γH2AX εστίες παρατηρήθηκαν σε σύγκριση με γονικές κυτταρικές σειρές.

Συμπέρασμα

Αποτελέσματα προσδιορίζονται σισπλατίνη μας ανθεκτικών υποπληθυσμών των κυττάρων NSCLC με ένα υποθετικό στέλεχος που μοιάζει με την υπογραφή, παρέχοντας μια περαιτέρω κατανόηση των κυτταρικών γεγονότων που σχετίζονται με τον φαινότυπο αντοχής σισπλατίνη στον καρκίνο του πνεύμονα

Παράθεση:. Barr MP, Gray SG, Hoffmann AC, Hilger RA , Thomale J, O’Flaherty JD, et al. (2013) Παραγωγή και Χαρακτηρισμός των ανθεκτικών σε σισπλατίνη μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικές γραμμές Βλέπετε μια Stem-Like Υπογραφή. PLoS ONE 8 (1): e54193. doi: 10.1371 /journal.pone.0054193

Επιμέλεια: Pan-Chyr Γιανγκ, Εθνικό Πανεπιστήμιο της Ταϊβάν Νοσοκομείο, Ταϊβάν

Ελήφθη: έβδομης Φλεβάρη 2012? Αποδεκτές: 10, Δεκεμβρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 17 Ιανουαρίου, 2013

Copyright: © 2013 Barr et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Περισσότεροι από ένα εκατομμύριο περιπτώσεις καρκίνου του πνεύμονα διαγιγνώσκονται. κάθε χρόνο. Η νόσος είναι η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο σχετίζονται σε άνδρες και γυναίκες [1]. Παρά τις εντατικές προσπάθειες για τον έλεγχο της νοσηρότητας και της θνησιμότητας από καρκίνο του πνεύμονα, το συνολικό ποσοστό πενταετούς επιβίωσης παραμένει φτωχή.

Η σισπλατίνη,

cis

-Diamminedichloro-λευκόχρυσου (ΙΙ), είναι ένα από τα πιο που χρησιμοποιούνται συνήθως χημειοθεραπευτικών παραγόντων στη θεραπεία του καρκίνου, ιδίως των μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) [2]. Τα κυτταροτοξικά αποτελέσματα της σισπλατίνης διαμεσολαβούνται από την αλληλεπίδρασή του με το DNA, με αποτέλεσμα το σχηματισμό προϊόντων προσθήκης DNA οι οποίες ενεργοποιούν διάφορα μονοπάτια μεταγωγής σήματος και κατέληγε στην ενεργοποίηση της απόπτωσης [3]. Ενώ 20-40% των ασθενών με μεταστατικό ΜΜΚΠ εμπειρία μερική απάντηση νεοαποκτηθέντα συνδυαστικές θεραπείες [4], οι περισσότεροι ανταποκρίθηκαν υποτροπή μέσα σε έξι μήνες [5]. Εντός του πληθυσμού των ασθενών που υποτροπιάζουν, έχει προταθεί η επιλογή των προϋπαρχόντων ανθεκτικά κύτταρα ή /και την απόκτηση ανθεκτικών κυττάρων κατά τη διάρκεια της θεραπείας με χημειοθεραπεία. Ως εκ τούτου, μια καλύτερη κατανόηση της μοριακής βάσης της αντίστασης σισπλατίνη δικαιολογείται προκειμένου να φωτιστούν οι μηχανισμοί και δείκτες βασίζεται η παρούσα ανθεκτικών στα φάρμακα φαινότυπο, η οποία προς το παρόν περιορίζει δραστικά την κλινική χρησιμότητα αυτού του φαρμάκου σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα.

Πρόσφατα, η (CSC) θεωρία του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων προτάθηκε για να εξηγήσει την ετερογένεια του όγκου και την καρκινογένεση [6]. Σύμφωνα με αυτό το μοντέλο, οι όγκοι μπορεί να θεωρηθεί ως αποτέλεσμα της ανώμαλης οργανογένεση οδηγείται από της CSC. Αυτά είναι αυτο-ανανέωση καρκινικά κύτταρα που είναι σε θέση να αρχίσει και να διατηρήσει την ανάπτυξη του όγκου μέσω υποπληθυσμών των κυττάρων του όγκου με χαρακτηριστικά βλαστικών ή προγονικών κυττάρων. Χρησιμοποιώντας

in vitro

συστήματα και

in vivo

μοντέλα ανθρώπινων πρωτογενών ξενομοσχευμάτων καρκίνου του πνεύμονα σε ποντίκια, πρόσφατη έρευνα έδειξε ότι τα κύτταρα του πνεύμονα όγκου που εκφράζουν ειδικούς δείκτες CSC ήταν ιδιαίτερα όγκων, προικισμένο με βλαστικά όπως χαρακτηριστικά και να γλιτώσει από τη θεραπεία με σισπλατίνη [7].

σε αυτή τη μελέτη, έχουμε δημιουργήσει και χαρακτηρίζεται ένα πάνελ ανθεκτικών σισπλατίνη κυτταρικές σειρές NSCLC, παρέχοντας ένα πολύτιμο εργαλείο με το οποίο θα διερευνήσει τις μοριακές οδοί και υποθετική βλαστικά κύτταρα δείκτες που μπορεί να σχετίζονται με αυτό το φαινότυπο αντοχής στον καρκίνο του πνεύμονα.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρικές Γραμμές

Το ανθρώπινο μεγάλο πνεύμονα κυτταρική σειρά καρκίνου, ΝΟΙ-Η460 (εφεξής αναφέρεται ως Η460) και ανθεκτική παραλλαγή της ήταν ευγενική δωρεά του Δρ Dean Fennell, Κέντρο Έρευνας για τον Καρκίνο και Κυτταρικής Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Μπέλφαστ [8]. Η κυτταρική γραμμή αδενοκαρκινώματος ανθρώπινης, MOR [9], και τα αντίστοιχα ανθεκτικά σισπλατίνη παραλλαγή του ελήφθη από την American Type Culture Collection (ATCC) (LGC Promochem, Teddington, Ηνωμένο Βασίλειο). Α549 (αδενοκαρκίνωμα) και SKMES-1 (καρκίνωμα πλακωδών) κυτταρικές γραμμές επίσης αγοράστηκαν από την ATCC [10], [11]. MOR και Η460 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640) μέσο. Τα κύτταρα Α549 καλλιεργήθηκαν σε μέσα του Ham F12 συμπληρωμένο με 4 mM Ε-γλουταμίνη ενώ κύτταρα SKMES-1 καλλιεργήθηκαν σε ΕΜΕΜ μέσο συμπληρωμένο με 2 mM L-γλουταμίνη και 1% μη-βασικά αμινοξέα (ΝΕΑΑ). Για όλες τις κυτταρικές σειρές, τα μέσα συμπληρώθηκαν με 10% θερμο-απενεργοποιημένο ορό εμβρύου μόσχου (FBS), πενικιλλίνη (100 U /ml) και στρεπτομυκίνη (100 μg /ml) (Lonza, Ηνωμένο Βασίλειο). Όλα τα κύτταρα αναπτύχθηκαν όπως μονοστρωματικές καλλιέργειες και διατηρήθηκαν σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2 στον αέρα στους 37 ° C.

Drugs

Cisplatin [

cis

-diammineplatinum (II) διχλωρίδιο] ελήφθη από την Sigma-Aldrich και διαλύθηκε σε 0,15 Μ NaCl. Κλάσματα φυλάχθηκαν στους -20 ° C για μέχρι τρεις μήνες και αποψύχθηκαν αμέσως πριν από τη χρήση.

Επαγωγή Cisplatin-Αντίστασης σε NSCLC Κύτταρα

Cisplatin ανθεκτικά (άδΚ) παραλλαγές του κάθε κυτταρική σειρά που προέρχεται από κάθε αρχικό γονικό (PT) κυτταρική γραμμή με συνεχή έκθεση σε σισπλατίνη (Sigma-Aldrich, UK) μετά από τις αρχικές μελέτες δόσης-απόκρισης της σισπλατίνης (0,1 μΜ-100 μΜ) επί 72 h από την οποία IC

ελήφθησαν 50 τιμές. Αρχικά, κάθε υπογραμμή άδΚ υποβλήθηκε σε επεξεργασία με σισπλατίνη (IC

50) για 72 ώρες. Το μέσο απομακρύνθηκε και τα κύτταρα αφέθηκαν να ανανήψουν για περαιτέρω 72 ώρες. Αυτή η περίοδος ανάπτυξης πραγματοποιήθηκε για περίπου 6 μήνες, μετά τον οποίο χρόνο IC

50 συγκεντρώσεις επαναξιολογήθηκαν σε κάθε ανθεκτική κυτταρική γραμμή. Τα κύτταρα στη συνέχεια διατηρήθηκαν συνεχώς υπό την παρουσία σισπλατίνης σε αυτά τα νέα IC

50 συγκεντρώσεις για ακόμη 6 μήνες. Ενώ Α549 κύτταρα αρχικά σε επεξεργασία με IC

50 συγκεντρώσεις σισπλατίνης, τα κύτταρα ευαίσθητα σε θεραπεία σε αυτή τη συγκέντρωση καταλήγοντας σε κυτταρική γήρανση και καθυστερημένη ανάπτυξη. Για το λόγο αυτό, η συγκέντρωση σισπλατίνης ήταν μειωμένη (IC

25), μέχρις ότου τα κύτταρα απέδειξαν την ευαισθησία στη σισπλατίνη στο κατάλληλο

50 συγκέντρωση IC.

Drug Δοκιμασία Ευαισθησία (ΜΤΤ)

τα κύτταρα (2.5 × 10

3) σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα στους 37 ° C. Εν συντομία, μετά την επεξεργασία των κυττάρων με σισπλατίνη για 72 ώρες, το αντιδραστήριο ΜΤΤ [3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου] προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν για 4 ώρες στους 37 ° C . Διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και αναμείχθηκαν για 5 λεπτά σε τροχιακό αναδευτήρα. Η απορρόφηση καταγράφηκε στα 595 nm και ευαισθησία σε σισπλατίνη υπολογίστηκε με βάση τις μετρήσεις του πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε 72 ώρες

Κυτταρικού Κύκλου & amp.? Η απόπτωση Ανάλυση

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση, σφαιροποιήθηκαν με φυγοκέντρηση στις 1300 rpm για 3 λεπτά και αιωρούνται σε 1 ml ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο (PBS). Τα κύτταρα στη συνέχεια καθορίζεται σε 90% ψυχρής αιθανόλης και επωάζεται σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. Τα κύτταρα σφαιροποιήθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε 1 ml PBS που περιείχε ιωδιούχο προπίδιο (25 μg /ml) και άνευ ϋΝάσης RNase Α (100 μg /ml). Μετά την επώαση στους 37 ° C για 30 λεπτά, κατανομή του κυτταρικού κύκλου των κυττάρων ΡΤ και άδΚ αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας FACS (Becton Dickinson, UK). Τα αποπτωτικά κύτταρα (SubG0) μετρήθηκαν σε απόκριση σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις σισπλατίνης μεταξύ των κυττάρων PT και άδΚ μετά από θεραπεία για 24 ώρες.

κλωνογονική δοκιμασία επιβίωσης

Η ευαισθησία των κυττάρων NSCLC να σισπλατίνη μετρήθηκε χρησιμοποιώντας η κλωνογονική δοκιμασία, η μέθοδος επιλογής για τον προσδιορισμό της αποτελεσματικότητας των κυτταροτοξικών παραγόντων όπως η χημειοθεραπεία [12]. Τα κύτταρα αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα στους 37 ° C και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις σισπλατίνης για 9-14 ημέρες. Οι αποικίες σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με μεθανόλη (25% ν /ν) που περιέχει κρυσταλλικό ιώδες (0,05% w /v) για 30 λεπτά μετά τον οποίο χρόνο διάλυμα υπολειμματικό χρώσης απομακρύνθηκε και οι πλάκες πλύθηκαν με νερό. Αποικίες που αποτελούνται από 100 κύτταρα ή περισσότερο μετρήθηκαν με τη χρήση του μετρητή αποικιών ColCount ™ (Oxford Optronix Ltd, Oxford, UK). Οι ικανότητες επίστρωσης (ΡΕ) υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τον τύπο: ΡΕ = αριθμός αποικιών /Αριθμός κύτταρα εμβολιάζονται. Το κλάσμα που επιβίωσαν (SF) υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο: SF = Αριθμός αποικιών /Αριθμός κύτταρα εμβολιάζονται × PE). Οι καμπύλες επιβίωσης κατασκευάσθηκαν για τον προσδιορισμό της ικανότητας επιβίωσης των cisplatin ανθεκτικών κυττάρων σε σχέση με γονικά κύτταρα σε απόκριση σε διάφορες συγκεντρώσεις σισπλατίνης.

Ανάλυση Κυτταρομετρίας Ροής του Καρκίνου Υποθετικές Stem Markers Κυττάρων

Μητρική και σισπλατίνη ανθεκτικών κύτταρα συλλέχθηκαν με κατεργασία τρυψίνης και πλύθηκαν σε ρυθμιστικό FACS (2% FBS 0,1% αζίδιο του νατρίου εντός PBS) και σφαιροποιήθηκαν με φυγοκέντρηση στις 1300 rpm για 3 λεπτά. Διπλή χρώση για CD133 και CD44 (δείκτης επιθηλιακών κυττάρων) πραγματοποιήθηκε. Κύτταρα (1 χ 10

6) επωάστηκαν είτε με CD133 /1 (AC133) φυκοερυθρίνη (ΡΕ) και έχουν αντίσωμα αντίσωμα ή ισοτύπου ελέγχου (IgG 1) (Miltenyi Biotec GmbH), ή αντι-ανθρώπινο CD44 FITC-συζευγμένο αντίσωμα και αντίστοιχος έλεγχος ισοτύπου (IgG2b) (Immunotools GmbH, Γερμανία) για 30 λεπτά στο σκοτάδι στους 4 ° C. Τα κύτταρα πλύθηκαν για λίγο και επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα FACS για μετέπειτα ανάλυση. Τα δείγματα αποκτήθηκαν και αναλύθηκαν με FACS. Πλευρά διασποράς και προς τα εμπρός προφίλ διασποράς χρησιμοποιήθηκαν για να εξαλειφθούν τα συντρίμμια και κυττάρων ζεύγη. Το ποσοστό CD133 + και τα κύτταρα CD44 + προσδιορίστηκε σε κυτταρικές σειρές PT και άδΚ με κυτταρομετρία ροής.

Δοκιμασία Aldefluor

Το κιτ Aldefluor (Stem τεχνολογίες κυψελών, Βανκούβερ, Καναδάς) χρησιμοποιήθηκε για τον εντοπισμό κυτταρικών πληθυσμών με αφυδρογονάση αλδεΰδης (ΑΙ_ϋΗ1) δραστηριότητα. Η δοκιμασία διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα (1 χ 10

6 κυττάρων /ml) συλλέχθηκαν από κυτταρικές γραμμές PT και άδΚ και επαναιωρήθηκαν σε Aldefluor Assay Buffer και επωάζονται για 60 λεπτά στους 37 ° C. Η ποσότητα του φθορίζοντος προϊόντος αντίδρασης ΑΙ_ϋΗ που συσσωρεύεται στα κύτταρα συσχετίζεται άμεσα με τη δραστηριότητα ALDH σε αυτά τα κύτταρα. Ενεργό εκροή από τα κύτταρα αναστέλλεται από την ειδική διαμόρφωση του ρυθμιστικού ανάλυσης Aldefluor. Για κάθε κυτταρική σειρά (PT και άδΚ), κύτταρα ελέγχου χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας τις ίδιες συνθήκες αλλά περιελάμβανε ένα συγκεκριμένο αναστολέα ΑΙ_ϋΗ, diethylaminobenzaldehyde (ϋΕΑΒ), για να χρησιμεύσει ως αρνητικός μάρτυρας για κάθε πείραμα. Τέτοια κύτταρα αναγνωρίζονται με σύγκριση του φθορισμού σε ένα ελεγχόμενο δείγμα σε αυτό σε ένα δείγμα ελέγχου που περιέχει ϋΕΑΒ. Δεδομένου ότι μόνο τα κύτταρα με ένα ανέπαφο κυτταρική μεμβράνη μπορεί να διατηρήσει το προϊόν αντίδρασης Aldefluor, εντοπίστηκαν μόνο βιώσιμο ΑΙ_ϋΗ1-θετικά κύτταρα. Τα φωτεινά fluourescent κύτταρα ΑΙ_ϋΗ1 εκφράζουν (ΑΙ_ϋΗ1-θετικό) ανιχνεύτηκαν στο πράσινο φθορίζον κανάλι (520-540 nm) ενός κυανού

ADP κυτταρόμετρο ροής (Dako, Glostrup, Δανία) και υπολογίζεται ως το ποσοστό των κυττάρων ΑΙ_ϋΗ1 θετικών σε κάθε κυτταρική σειρά.

Ανάλυση Western Blot

η ολική πρωτεΐνη εκχυλίστηκε από γονέα και σισπλατίνη ανθεκτικά κύτταρα χρησιμοποιώντας παγωμένο ρυθμιστικό RIPA (50 mM Tris HCI, ρΗ 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% (ν /ν) Triton-X 100, 0,1% (w /v) SDS) συμπληρωμένο με φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο (PMSF) και κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (2 mM AEBSF, 1 mM EDTA, 130 μΜ Bestatin, 14 μΜ Ε-64, 1 μΜ Leupepin, 0.3 μΜ απροτινίνης). Οι πρωτεϊνικές συγκεντρώσεις προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας την δοκιμασία δικινχονινικού οξέος σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (BCA). Πρωτεΐνη (40 μg) από λύματα ολόκληρων κυττάρων κλασματώθηκε σε 12% πηκτώματα SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μία μεμβράνη PVDF (PALL Corporation, FL, USA). απόδοση μεταφοράς και φόρτωσης επιβεβαιώθηκαν με αναστρέψιμη χρώση της μεμβράνης με διάλυμα Ponseau S (Sigma-Aldrich, UK) μετά τη μεταφορά της πρωτεΐνης. Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου με 5% άπαχο ξηρό γάλα σε ρυθμισμένο με Tris φυσιολογικό ορό (TBS) που περιείχε 0,1% Tween-20 (ΤΒδ-Τ) και υποβλήθηκαν σε διαλογή χρησιμοποιώντας ένα πάνελ ανθρώπινων εμβρυϊκών δείκτη βλαστικών κυττάρων (Abcam plc, Ηνωμένο Βασίλειο) . Αυτά περιλαμβάνονται πολύκλωνα αντισώματα ποντικιού πρωτογενή κουνέλι να Nanog, Οκτ-4 και SOX-2 (1:1000). Πρωτεΐνη έκφραση του c-Met (Millipore) και β-κατενίνης (BD Transduction Laboratories) Εξετάστηκε επίσης χρησιμοποιώντας μονοκλωνικά αντισώματα ποντικού κατά 1:100 και 1:2000, αντίστοιχα. Οι μεμβράνες πλύθηκαν σε TBST και επωάστηκαν με ένα δευτερεύον υπεροξειδάση (HRP) αντίσωμα για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου (1:2000). Οι μεμβράνες πλύθηκαν σε TBST μετά την επώαση με δευτερογενή αντισώματα. σύμπλοκα συνδεδεμένο αντίσωμα ανιχνεύθηκαν και οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας SuperSignal

® West Pico ενισχυμένη χημειοφωταύγεια υπόστρωμα (Pierce, IL, USA). Οι κηλίδες γδύθηκαν και την εκ νέου ανιχνεύθηκαν με α /β αντίσωμα τουμπουλίνης (Cell σηματοδότηση) για τον έλεγχο της φόρτωσης. Η πυκνομετρική ανάλυση διεξήχθη χρησιμοποιώντας λογισμικό και το ποσοστό έκφρασης TINA ™ αντιπροσωπεύονται σε σχέση με τους μάρτυρες (100%).

μικροσκοπία ανοσοφθορισμού και Μέτρηση της Cisplatin-DNA Adducts

Cells (PT και άδΚ) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με σισπλατίνη (IC

50) για 0, 4, 12 και 24 ώρες μετά τον οποίο χρόνο συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση και εκπλύθηκαν δύο φορές σε PBS. Κύτταρα (1 χ 10

6 κυττάρων /ml) επαναιωρήθηκαν σε PBS και στίγματα (10 μΐ) εις τριπλούν σε Superfrost Gold πλακίδια (ThermoFisher). Τα πλακίδια αφέθηκαν να στεγνώσουν στον αέρα για λίγο σε θερμοκρασία δωματίου. χρώση ανοσοφθορισμού και μέτρηση των προϊόντων platination ειδικών DNA πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [13], με μικρές τροποποιήσεις. Εν συντομία, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν επί μία νύκτα σε παγωμένη μεθανόλη και υποβλήθηκε σε πρωτεολυτική πέψη με 60 μg /mL πεψίνη και 40 μg /ml πρωτεϊνάσης Κ (100 μΐ ανά κηλίδα επί 10 λεπτά στους 37 ° C σε υγροποιημένο θάλαμο). Μετά τον αποκλεισμό των μη ειδικών θέσεων δέσμευσης με 5% (w /v) μη λιπαρό γάλα σε σκόνη σε PBS, τα πλακίδια επωάστηκαν με ένα πρωτογενές αντίσωμα αρουραίου που αναγνωρίζει εξειδικευμένα προϊόντα προσθήκης DNA CDDP-GpG (RC-18) στους 37 ° C για 2 ώρες ή στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Πρωτογενής σύνδεση αντισώματος ανιχνεύθηκε με τη χρήση αντι-αρουραίου Cy3®-επισημασμένο αντίσωμα (Dianova, Hamburg). Τα πλακίδια στη συνέχεια επωάστηκαν σε 1 μg /ml (β /ο) DAPI σε PBS για 30 λεπτά σε RT για την πυρηνική αντιχρωματισμός. Εικόνες αποκτήθηκαν σε ένα μικροσκόπιο φθορισμού Αχίορίαπ (Carl Zeiss GmbH, Göttingen, Γερμανία) σε συνδυασμό με μια φωτογραφική μηχανή C4880 CCD (Hamamatsu Photonics, Herrsching, Γερμανία). Για τον ποσοτικό προσδιορισμό των προϊόντων προσθήκης DNA-CDDP GpG με μικροσκοπία ανοσοφθορισμού, σήματα φθορισμού μετρήθηκαν με ποσοτική ανάλυση ψηφιακής εικόνας με τη χρήση του ACAS 6.0 CytometryAnalysis Σύστημα (ACAS II, Ahrens Electronics, Bargterheide, Germany). Επίπεδα προϊόντα προσθήκης σε κάθε δείγμα υπολογίστηκαν ως αυθαίρετες μονάδες φθορισμού (AFU του), κατόπιν ομαλοποίηση της ολοκληρωμένης που προέρχονται από αντισώματα φθορισμού από 200 μεμονωμένους πυρήνες /δείγμα με το αντίστοιχο περιεχόμενο DNA. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος διαστήματος εμπιστοσύνης AFU ± 95% (CI) από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

γH2AX Εστίες Δοκιμασία Σχηματισμού

Κύτταρα (5 × 10

3) σπάρθηκαν, σε τριπλούν σε πλάκες των 96-φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα. Γονείς και ανθεκτικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με σισπλατίνη για 0, 4, 8, 12 και 24 ώρες. Σε κάθε χρονικό σημείο, μέσα κυτταρικής καλλιέργειας απομακρύνθηκε από κάθε φρεάτιο και σταθεροποιήθηκαν για 10 λεπτά σε 100 μΐ φορμαλδεΰδη (4% ν /ν σε PBS). Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές σε PBS. Ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού (5% ορό κατσίκας, 3% Triton Χ-100 σε PBS) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με ένα αντι-ανθρώπινο αντι-φωσφο-ιστόνης 2AX πρωτογενούς κουνελιού (Ser139) αντίσωμα (1:100) (Cell Technology Σηματοδότηση) σε ρυθμιστικό αραίωσης αντισώματος (1% BSA.0.3% Triton Χ- 100 σε PBS). Μετά την απομάκρυνση του πρωτογενούς αντισώματος, τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές σε PBS και επωάστηκαν με δευτερογενές αντίσωμα Alexafluor 488-επισημασμένο γίδινο αντι-κουνελιού (Invitrogen) (1:2000) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. Δευτερογενής αντίσωμα απομακρύνθηκε και τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές σε PBS. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με Hoechst 33342 πυρηνική χρώση (3 μg /ml) για 30 λεπτά στους 37 ° C, που ακολουθείται από τρία πλύθηκαν σε PBS. Κύτταρα χρώση για φωσφορυλιωμένη 2AX ιστόνης (ανιχνεύεται ως πράσινη εστίες φθορισμού) απεικονίστηκαν με immunofluroescence τη χρήση υψηλής ανάλυσης περιεχομένου (GE Healthcare). Δέκα οπτικά πεδία ανά καθώς αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα στόχο 20Χ. Πυρηνική χρώση ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας ένα φίλτρο διέγερσης των 360 nm και εκπομπή φίλτρο 460 nm, ενώ Alexafluor 488 ανιχνεύθηκε σε 480 nm και 535 nm, αντίστοιχα. Η μέση ένταση φθορισμού πυρηνικά χρησιμοποιήθηκε ως μέτρο της γH2AX χρησιμοποιώντας InCell αναλυτή 1000 λογισμικό ανάλυσης εικόνας.

Η ποσοτικοποίηση της πρόσληψης Κυτταρικής Cisplatin με ICP-MS

Για τις μελέτες πρόσληψης σισπλατίνη, τα κύτταρα (1 × 10

7 κύτταρα /ml) σπάρθηκαν σε φιάλες καλλιέργειας και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με σισπλατίνη για 24 ώρες. Μετά την αγωγή, τα κύτταρα πλύθηκαν σε PBS, συλλέχθηκαν και μετρήθηκαν. Για την ανάλυση πρόσληψη φαρμάκου, τα κύτταρα (1 χ 10

6) αιωρήθηκαν σε 1% HNO

3 για 24 ώρες στους 70 ° C. Λυμένα κύτταρα αναλύθηκαν με επαγωγικά συζευγμένου πλάσματος φασματομετρία μάζας (ICP-MS). ICP-MS παρέχει μια ποσοτική ανάλυση της συγκέντρωσης ενός στοιχείου σε υδατικό διάλυμα και έχει μία ευαισθησία 5 ΡΡΤ ή καλύτερα για προϊόντα Platinum. Η συγκέντρωση αναλυόμενης ουσίας είναι ανάλογη με τον αριθμό των ιόντων ενός συγκεκριμένου στοιχείου που φτάνουν το φασματόμετρο μάζας από το ατμοποιημένο διάλυμα στους 6000 ° C. Μια ενιαία μέτρηση ICP-MS αντιπροσωπεύει το μέσο όρο 20 σαρώσεις ανά επαναληπτικές εντός πέντε αντίγραφα από το ίδιο υγρό δείγμα, με ένα πολύ μικρό σφάλμα (& lt? 5%). Οι συγκεντρώσεις σισπλατίνης ανέφεραν κατά μέσο όρο σε τέσσερις σειρές των πολιτισμών, διασφαλίζοντας ότι οι τιμές είναι σωστά κλίμακα για να ληφθούν υπόψη οι διαφορές του πληθυσμού των κυττάρων και αραιώσεις.

Πρότυπες καμπύλες παράχθηκαν με τη χρήση υδατικών διαδοχικές αραιώσεις διαλύματα παρακαταθήκης ανιχνεύσιμα πίσω με το πρότυπο υλικό αναφοράς (SRM) από το NIST (Εθνικό Ινστιτούτο Προτύπων και Τεχνολογίας). Οι συντελεστές διακύμανσης κυμαίνονταν από 1 έως 4% (ενδο-δοκιμασίας) και από 5 έως 10% (ενδο-δοκιμασίας).

Στατιστική Ανάλυση

Η στατιστική σύγκριση μεταξύ των ομάδων διεξήχθη χρησιμοποιώντας ανάλυση της διακύμανσης (ANOVA). Όπου συγκρίθηκαν τα μέσα των δύο συνόλων δεδομένων, τη σημασία προσδιορίστηκε με ένα δύο-ουρά Φοιτητές

t-

δοκιμή. Οι διαφορές θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές, όπου p ≤ 0,05. Τα δεδομένα παριστάνονται γραφικώς ως μέση ± τυπικό σφάλμα του μέσου (SEM). Όλα τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας GraphPad INSTAT ™ (έκδοση 3) λογισμικό στατιστικής.

Αποτελέσματα

Δημιουργία IC

50 Συγκεντρώσεις και Ανάπτυξης της NSCLC κύτταρα με Cisplatin-φαινότυπο ανθεκτικό

για να προσδιοριστεί IC

50 τιμές με τις οποίες για τη θεραπεία γονικές κυτταρικές σειρές στην παραγωγή ανθεκτικών cisplatin κυτταρικές γραμμές, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις σισπλατίνης που κυμαίνονται από 0,1 μΜ έως 100 μΜ. Η κυτταρική σειρά Η460 άδΚ προηγουμένως δημιουργήθηκε και συντηρείται με 5 μΜ σισπλατίνη. Η ευαισθησία του κάθε πρωτοτύπου (PT) κυτταρική γραμμή σε αυξανόμενες δόσεις cisplatin αποδείχθηκε, όπου σισπλατίνη σημαντικά (ρ & lt? 0.001). Ανέστειλαν τον πολλαπλασιασμό των Α549, SKMES-1 και τα κύτταρα MOR στα 10 μΜ-100 μΜ επί 72 ώρες (Εικ 1Α ). Οι καμπύλες δόσης-απόκρισης δημιουργήθηκαν και IC

50 συγκεντρώσεις υπολογίστηκαν για όλες τις κυτταρικές σειρές (Σχ. 1Β). Οι συγκεντρώσεις σισπλατίνης (IC

50) κυμαινόταν μεταξύ των τεσσάρων κυτταρικών σειρών (

Α549

5,95 μΜ,

SKMES-1

2,65 μΜ,

MOR

3.3 μΜ,

Η460

5,0 μΜ) και στη συνέχεια χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία κάθε κυτταρική γραμμή γονέα προκειμένου να παραχθεί αντίστοιχη δίοδο αντιστοίχιση σισπλατίνη ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές ηλικία και. Στην περίπτωση των κυττάρων Η460, η διατήρηση της ανθεκτική υπογραμμή συνεχίζεται εις 5 μΜ. Θεραπεία των κυττάρων Α549 με σισπλατίνη (IC

50) οδήγησε σε σημαντική καθυστέρηση της ανάπτυξης, με αργές περιόδους ανάκαμψης. Ως εκ τούτου, κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με IC

25 συγκεντρώσεις για αρκετές εβδομάδες πριν από την επιλογή ενός ανθεκτικού σισπλατίνης υπογραμμή στο IC

50 συγκέντρωση.

(Α) Κύτταρα NSCLC υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις σισπλατίνης ( 0,1 μΜ-100 μΜ) για 72 ώρες. Η επιβίωση των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ. Η σισπλατίνη μείωσε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των Α549, SKMES-1 και τα κύτταρα MOR NSCLC. (Β) Οι καμπύλες δόσης-απόκρισης δημιουργήθηκαν από την οποία IC

50 τιμές συναχθεί. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SEM από τρία ανεξάρτητα πειράματα (η = 3) (* ρ & lt? 0,001 vs μη επεξεργασμένα)

Η

ανθεκτικά Cisplatin υποσειρές υποβλήθηκαν σε θεραπεία με σισπλατίνη για 72 ώρες μετά τον οποίο απομακρύνθηκε το χρόνο μέσα ενημέρωσης. και τα κύτταρα αφέθηκαν να συνέλθουν και να συμπληρώσετε εκ νέου. Κατά τη διάρκεια αυτής της περιόδου, η επιβίωση των κυττάρων /πολλαπλασιασμός αξιολογήθηκε μεταξύ ΡΤ και άδΚ κύτταρα κάθε 4 εβδομάδες για να προσδιορισθούν οι μεταβολές στην ευαισθησία στη σισπλατίνη. Στους 6 μήνες, IC

50 τιμές επανεκτιμηθεί και εξάγεται από τις καμπύλες δόσης-απόκρισης μεταξύ των κυττάρων PT και άδΚ. Μία σημαντική αύξηση φορές παρατηρήθηκε στη συγκέντρωση σισπλατίνης απαιτείται για την αναστολή των κυττάρων κατά 50% σε σισπλατίνη ανθεκτικά κύτταρα σε σχέση προς το αντίστοιχο πατρικό τους κύτταρα (Εικ. 2). Τα κύτταρα στη συνέχεια διατηρήθηκαν σε σισπλατίνη σε αυτές τις συγκεντρώσεις για ακόμη 6 μήνες. Σε κύτταρα Α549, το IC

50 συγκέντρωση ανθεκτικών κυττάρων σισπλατίνης προσδιορίστηκε ως 23,60 μΜ σε σύγκριση με 1,58 μΜ στην αρχική γονική κυτταρική σειρά, μια 15 φορές αύξηση στη συγκέντρωση σισπλατίνης απαιτείται για να ληφθεί 50% αναστολή στο κελί ανάπτυξη. Μια σημαντική αύξηση IC

50 συγκεντρώσεις παρατηρήθηκε επίσης σε κύτταρα SKMES-1 (16,0 μΜ έναντι 4,09 μΜ), MOR κύτταρα (31,98 μΜ έναντι 6,39 μΜ) και τα κύτταρα Η460 (30.40 μΜ έναντι 5,72 μΜ), επιδεικνύοντας μία 4- fold (SKMES-1) και 5 φορές (MOR, Η460) αύξηση μεταξύ άδΚ και κυτταρικές σειρές ΡΤ. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αρχικά στοιχεία έδειξαν μια cisplatin ανθεκτικό φαινότυπο σε τέσσερις κυτταρικές σειρές NSCLC μετά από συνεχή

in vitro

έκθεση σε σισπλατίνη.

Μετά διατήρηση του sublines αγωγή σισπλατίνης σε καλλιέργεια για 6 μήνες με σισπλατίνη , IC

50 συγκεντρώσεις επαναξιολογούνται για κάθε κυτταρική σειρά χρησιμοποιώντας καμπύλες δόσης-απόκρισης που δημιουργούνται από το λογισμικό GraphPad Prism. Μια σημαντική αύξηση IC

50 συγκέντρωση προσδιορίστηκε για κάθε σισπλατίνη ανθεκτική κυτταρική γραμμή σε σχέση με εκείνη για την αντίστοιχη ίδιας ηλικίας γονική κυτταρική γραμμή.

Η

Κατά χαρακτηρισμός των κυττάρων σε 52 εβδομάδες μετά την έκθεση του κυττάρων σε σισπλατίνη, μια σημαντική διαφορά στην ικανότητα πολλαπλασιασμού μεταξύ των κυτταρικών σειρών ΡΤ και ανθεκτικά αντίστοιχες σισπλατίνη υποσειρές τους παρατηρήθηκε (Εικ. 3) που δείχνει την εμφάνιση ενός ανθεκτικού φαινοτύπου στα ανθεκτικά υποσειρές σε σχέση με τις μητρικές κυτταρικές σειρές. Ενώ Α549 και Η460 κύτταρα έδειξαν σημαντικές διαφορές στην ικανότητά τους πολλαπλασιασμού μεταξύ των γονικών και τα αντίστοιχα κύτταρα άδΚ σε συγκεντρώσεις που κυμαίνονται από τόσο χαμηλά όσο 0.1 μΜ (

Α549

, 65.56 ± 0.73 vs 102.50 ± 0.87?

Η460

, 87.66 ± 0.67 vs 114.06 ± 1,57, p & lt? 0.001) έως 100 μΜ (

Α549

, 16,56 ± 0,29 vs 41.44 ± 0.94, p & lt? 0.001?

Η460

, 20.89 ± 1.22 vs 34.32 ± 1.17, ρ & lt? 0,01), μία σημαντική διαφορά παρατηρήθηκε επίσης μεταξύ μητρικής και άδΚ SKMES-1 και MOR κύτταρα σε συγκεντρώσεις σισπλατίνης που κυμαίνεται από 10 μΜ (

SKMES-1

, 54,38 ± 1,56 vs 79.00 ± 2,25?

MOR

, 64,33 ± 2,33 έναντι 76,87 ± 2,77, ρ & lt? 0,01) σε 100 μΜ σε SKMES-1 και MOR κύτταρα, αντίστοιχα (

SKMES-1

, 32,79 ± 1,55 vs 59.33 ± 5,20, p & lt? 0,01?

MOR

, 34,33 ± 2,50 vs 45,33 ± 2,33, p & lt?. 0.05)

Μητρική (PT) και ανθεκτικά σισπλατίνη (άδΚ) κυτταρικές σειρές υποβλήθηκαν σε θεραπεία με την αύξηση της συγκεντρώσεις σισπλατίνης για 72 ώρες. Ο πολλαπλασιασμός μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ. Ενώ η σισπλατίνη ανέστειλε την ανάπτυξη των δύο κυτταρικές σειρές ΡΤ και άδΚ, η ανασταλτική δράση της σισπλατίνης ήταν πολύ μειωμένη σε κύτταρα άδΚ σχέση με πατρικά κύτταρα. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SEM από τρία ανεξάρτητα πειράματα (η = 3) (* ρ & lt? 0,001 vs ΡΤ χωρίς θεραπεία,

$$ ρ & lt? 0,001 vs άδΚ χωρίς θεραπεία,

# ρ & lt? 0.001 ΡΤ vs άδΚ,

$ ρ & lt? 0.01 vs άδΚ ανεπεξέργαστων [Α549],

$ ρ & lt? 0,01 PT vs άδΚ,

# $ p & lt?. 0.05 PT vs άδΚ [MOR])

Η

σισπλατίνη– επαγόμενη απόπτωση είναι σημαντικά ακυρωθεί ανθεκτικά κύτταρα σχέση με το μητρικό τους ομολόγους τους

Επίπεδα σισπλατίνη απόπτωση, όπως προσδιορίζεται χρησιμοποιώντας το κλάσμα SubG0 (αποπτωτικά) κυττάρων, αξιολογήθηκαν σε ΡΤ και αντίστοιχες κυτταρικές σειρές άδΚ μετά τη θεραπεία του κυττάρων με αυξανόμενες δόσεις cisplatin. Ενώ υπήρχε μια σημαντική αύξηση στον πνεύμονα των κυττάρων όγκου απόπτωση κυττάρων ΡΤ σε ανταπόκριση στη σισπλατίνη σε συγκεντρώσεις μεταξύ 10 μΜ και 100 μΜ, σισπλατίνη επαγόμενη απόπτωση κυττάρων άδΚ μειώθηκε σημαντικά σε όλες τις κυτταρικές σειρές (Σχ. 4), και ιδίως Α549 , SKMES-1 και τα κύτταρα Η460. Σε Α549 και SKMES-1 κύτταρα, παρατηρήθηκε σημαντική κυτταρικό θάνατο μόνο σε υψηλότερες συγκεντρώσεις μεταξύ 40 μΜ (

Α549

, σ & lt? 0,01?

SKMES-1

, σ & lt? 0,01) και 100 μΜ (p & lt? 0.001). Πιο σημαντικά, ωστόσο, τα κύτταρα Η460 άδΚ εμφανίζεται μεγαλύτερη αντοχή στη σισπλατίνη που προκαλείται θάνατος σε υψηλότερες συγκεντρώσεις σισπλατίνης σε σύγκριση με άλλες κυτταρικές σειρές, όπου σημαντική επαγωγή απόπτωσης παρατηρήθηκε σε ανταπόκριση στη σισπλατίνη σε συγκεντρώσεις τόσο υψηλές όσο 80 μΜ (ρ & lt? 0,01) και 100 μΜ (ρ & lt? 0.001). Σε όλες τις κυτταρικές σειρές όγκου πνεύμονα, παρατηρήθηκε μία σημαντική διαφορά στην κυτταρική απόκριση προς την σισπλατίνη που προκαλείται από αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο μεταξύ άδΚ και κυττάρων ΡΤ. Σημαντικές διαφορές στα επίπεδα της απόπτωσης μεταξύ των κυττάρων Η460 ΡΤ και άδΚ παρατηρήθηκαν σε ανταπόκριση στη σισπλατίνη σε όλες τις συγκεντρώσεις που κυμαίνονταν από 10 μΜ έως 100 μΜ, αναδεικνύοντας έτσι μεγαλύτερο σισπλατίνη ανθεκτικού φαινοτύπου σε αυτή την κυτταρική σειρά άδΚ.

Μητρική και ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές υποβλήθηκαν σε θεραπεία με σισπλατίνη για 72 ώρες. Τα αποπτωτικά κύτταρα, όπως μετράται με τις ποσοστιαίες κυττάρων στη φάση SubG0 του κυτταρικού κύκλου, μετρήθηκαν. Επίπεδα της απόπτωσης που επάγεται από σισπλατίνη ήταν σημαντικά αυξημένα σε πατρικά κύτταρα ενώ σισπλατίνη απόπτωση ήταν σημαντικά μειωμένη στο αντίστοιχο ανθεκτική κυτταρική γραμμή. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SEM από τρία ανεξάρτητα πειράματα (η = 3) (* ρ & lt? 0,01 vs ΡΤ χωρίς θεραπεία, ** ρ & lt? 0,001 vs ΡΤ χωρίς θεραπεία,

$$ ρ & lt? 0,001 vs άδΚ χωρίς θεραπεία,

$ p & lt? 0.01 vs άδΚ χωρίς θεραπεία [Α549, Η460],

$ ρ & lt? 0,05 vs άδΚ ανεπεξέργαστων [MOR],

$ ρ & lt? 0,05 PT vs άδΚ,

# p & lt? 0.001 PT vs άδΚ, *

$ ρ & lt? 0,05 vs PT χωρίς θεραπεία)

Η

Η σισπλατίνη Ανθεκτικό NSCLC κύτταρα συσσωρεύονται στην G0 /G1 του κυτταρικού κύκλου

στα βασικά επίπεδα, και σε απάντηση στις αυξανόμενες συγκεντρώσεις σισπλατίνης. , μια αυξημένη συσσώρευση κυττάρων στην φάση G0 /G1 παρατηρήθηκε σε όλες τις κυτταρικές σειρές άδΚ σε σχέση με τις αντίστοιχες γονικές κυτταρικές σειρές τους (Σχ. 5Α). Αντιπροσωπευτικά ιστογράμματα παρουσιάζονται για SKMES-1 ΡΤ και άδΚ κύτταρα σε απόκριση σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις σισπλατίνης (Εικ. 5Β). Σε ανθεκτικές cisplatin κυτταρικές γραμμές, η θεραπεία με σισπλατίνη προκάλεσε μια σημαντική συσσώρευση κυττάρων στην φάση G0 /G1, σε σχέση με τα κύτταρα PT κατεργασία στις ίδιες συγκεντρώσεις. Τέτοιες παρατηρήσεις ήταν ταυτόχρονη με τη μείωση στη φάση S του κυτταρικού κύκλου. Τα βασικά κλάσματα των κυττάρων μεταξύ G0 /G1, S και G2 /M φάσεις του κυτταρικού κύκλου μελετήθηκαν επίσης μεταξύ PT και άδΚ κυτταρικές σειρές. Μια σημαντική αύξηση του κλάσματος G0 /G1 βρέθηκε στο SKMES-1 άδΚ (61,60 ± 2,734, ρ & lt? 0,05) και MOR άδΚ (60,20 ± 0,872, ρ & lt? 0,05) κυττάρων σε σχέση με τις μητρικές τους ομολόγους (47,01 ± 1,549, 42,44 ± 1.351, p & lt? 0,05). Σε Α549 και Η460 κύτταρα σισπλατίνη ανθεκτικά, μεγαλύτερη σημασία είχε δει στην G0 /G1 κλάσμα σε σχέση με τη μητρική τους ομολόγους (

Α549

, 85.19 ± 1.763 έναντι 52,83 ± 2.234,

Η460

, 69.12 ± 1.987 έναντι 39.61 ± 2.00, p & lt? 0.001). Στα βασικά επίπεδα, το κλάσμα των κυττάρων στην S και G2 /M φάσεις δεν μεταβλήθηκε σημαντικά μεταξύ των κυτταρικών σειρών ΡΤ και άδΚ. Αυτές οι μεταβολές στην κατανομή του κυτταρικού κύκλου μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην ανθεκτική σισπλατίνης φαινότυπο των κυτταρικών γραμμών NSCLC δημιουργούνται.

Γονείς και ανθεκτικά Cisplatin NSCLC κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με σισπλατίνη για 24 ώρες. Κυττάρων διανομή κύκλος των κυττάρων ΡΤ και άδΚ εξετάστηκε με χρώση με ιωδιούχο προπίδιο και προσδιορίζεται με FACS (Α). Μια σημαντική συσσώρευση κυττάρων άδΚ παρατηρήθηκε στην φάση G0 /G1 του κυτταρικού κύκλου σε όλη την ομάδα των κυτταρικών γραμμών. Αντιπροσωπευτικά ιστογράμματα δείχνουν διανομή του κυτταρικού κύκλου των SKMES-1 κύτταρα άδΚ και των ομολόγων ΡΤ σε ανταπόκριση σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις σισπλατίνης εμφανίζονται (Β). Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SEM από τρία ανεξάρτητα πειράματα (η = 3) (

# ρ & lt? 0.001,

* ρ & lt? 0,05).

Η

χημειοθεραπεία NSCLC Cells καταδεικνύουν αυξημένη κλωνογονιδιακή επιβίωση δυνατότητα

Η ικανότητα επιβίωσης των ΡΤ και άδΚ NSCLC κυττάρων μετά από θεραπεία με σισπλατίνη αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία κλωνογονική επιβίωση. Όλες οι κυτταρικές σειρές έδειξαν μεταβλητή αντίσταση μεταξύ των κυττάρων PT και άδΚ. Στην πλειοψηφία των κυτταρικών σειρών που εξετάστηκαν, υπήρχε ένα σημαντικά μεγαλύτερο κλάσμα των επιζώντων αποικίες Α549, SKMES-1 και τα κύτταρα Η460 άδΚ σχέση με πατρικά κύτταρα σε 1 μΜ και 10 μΜ κισπλατίνης (Εικ. 6).