Αφηρημένο

SRC, επίσης γνωστή ως πρωτο-ογκογονιδίου c-Src, είναι ένα μη-υποδοχέα τυροσίνης κινάση που παίζει σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη του καρκίνου μέσω της προώθησης οδών επιβίωσης, της αγγειογένεσης, του πολλαπλασιασμού, και εισβολή. Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι τα επίπεδα πρωτεΐνης SRC ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω με συνέπεια σε ιστούς καρκίνου του πνεύμονα, αλλά ότι τα επίπεδα mRNA SRC μεταβάλλεται τυχαία, προτείνοντας ότι ένα μετα-μεταγραφικό μηχανισμό ενεπλάκη σε ρύθμιση SRC. Επειδή microRNAs (miRNAs) είναι ισχυρές μετα-μεταγραφική ρυθμιστές της γονιδιακής έκφρασης, χρησιμοποιήσαμε βιοπληροφορικής αναλύσεις για να ψάξετε miRNAs που ενδεχομένως στοχεύουν SRC. Εντοπίσαμε συγκεκριμένες τοποθεσίες στόχευσης για miR-203 στην 3′-μη μεταφραζόμενη περιοχή (3′-UTR) του SRC. Στη συνέχεια πειραματικά επικυρωμένη miR-203 ως άμεσο ρυθμιστή των SRC χρησιμοποιώντας δοκιμασίες κυτταρικής επιμόλυνσης και λουσιφεράσης και έδειξε ότι το miR-203 ανέστειλε την έκφραση SRC και συνεπώς ενεργοποιείται η καταστολή του /Ras οδού SRC /ERK. Τέλος, αποδείξαμε ότι η καταστολή του SRC με miR-203 κατέστειλε την πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση και προώθησε την απόπτωση των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα. Συνοπτικά, αυτή η μελέτη παρέχει τα πρώτα στοιχεία σχετικά με το ρόλο του miR-203 ως καταστολέας όγκων σε καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα μέσω της αναστολής της μετάφρασης SRC

Παράθεση:. Wang Ν, Liang Η, Zhou Υ, Wang C , Zhang S, Παν Y, et al. (2014) miR-203 καταστέλλει την πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση και προάγει την απόπτωση των κυττάρων του καρκίνου του πνεύμονα από Στόχευση SRC. PLoS ONE 9 (8): e105570. doi: 10.1371 /journal.pone.0105570

Επιμέλεια: Jin Ερ Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center & amp? Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 7 του Απρίλη, 2014? Αποδεκτές: 21 Ιουλίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 20, Αυγούστου 2014

Copyright: © 2014 Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Πρόγραμμα Βασικής Έρευνας της Κίνας (973 Program) (Αρ 2014CB542300), το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 81101330, 31271378, και 81250044), το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της επαρχίας Jiangsu (Αρ BK2011013 και BK2012014), και το Ειδικό Ταμείο Έρευνας για Κοινής Ωφέλειας Βιομηχανίας Υγείας (Νο 201302018). Το έργο αυτό υποστηρίζεται επίσης από το πρόγραμμα για New Century εξαιρετικά ταλέντα στο Πανεπιστήμιο από το Υπουργείο Παιδείας, η Κίνα (NCET-12-0261). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο που σχετίζονται με όλο τον κόσμο, και μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) αντιπροσωπεύει περίπου το 80% όλων των περιπτώσεων [1]. Η πλειονότητα των καρκίνων του πνεύμονα (56%) διαγιγνώσκονται σε ένα μακρινό στάδιο επειδή πρώιμο στάδιο της νόσου είναι συνήθως ασυμπτωματική? μόνο το 15% των περιπτώσεων διαγιγνώσκονται σε ένα τοπικό στάδιο [2]. Πράγματι, οι ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα παρουσιάζουν συχνά εισβολή καρκινικών κυττάρων και τη μετάσταση πριν από τη διάγνωση, η οποία καθιστά τρέχουσες θεραπείες, συμπεριλαμβανομένης της χειρουργικής επέμβασης, της ακτινοθεραπείας και χημειοθεραπείας, αναποτελεσματική. Το συνολικό ποσοστό επιβίωσης 5 ετών για μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα είναι εξαιρετικά χαμηλή (17,1%). Ως εκ τούτου, μελετώντας την μοριακή βάση του καρκίνου του πνεύμονα είναι ζωτικής σημασίας για τον σχεδιασμό νέων θεραπευτικών παραγόντων που θα βελτιώσουν το ποσοστό επιβίωσης.

Με τις σημαντικές προόδους στην κατανόηση της βιολογίας του όγκου, τα βασικά μονοπάτια σηματοδότησης που εμπλέκονται στη διαμεσολάβηση της ανάπτυξης του καρκίνου του πνεύμονα και εξέλιξης έχουν ταυτοποιηθεί [3]. Κυρίαρχα ογκογονίδια και ογκοκατασταλτικά γονίδια που εμπλέκονται στην παθογένεια του καρκίνου του πνεύμονα έχουν προσελκύσει σημαντικό ενδιαφέρον, και οι κεντρικές τους ρόλους τους και τα θεμελιώδη συμβολή στην κακή συμπεριφορά των καρκινικών κυττάρων έχουν γίνει σαφές [4]. Αυτά τα γονίδια προσφέρουν νέους στόχους για βιολογικές θεραπείες. Ένα τέτοιο στόχος είναι SRC (επίσης γνωστό ως c-Src), ένα πρωτο-ογκογονίδιο που κωδικοποιεί μία κινάση τυροσίνης που συχνά υπερεκφράζεται και ενεργοποιείται σε πολλούς τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του πνεύμονα [5], [6]. Με μοριακή βάση, SRC ρυθμίζει πολλαπλές καταρρακτών σηματοδότησης που συνδέονται με την ανάπτυξη και την εξέλιξη του όγκου, συμπεριλαμβανομένης της οδού της κινάσης εστιακής προσκόλλησης (ΡΑΚ), ο υποδοχέας του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) μονοπάτι, και το Ras /ERK μονοπάτι [7]. Κατά συνέπεια, SRC λειτουργεί ως ογκογονίδιο να ευνοούν τον πολλαπλασιασμό, μετανάστευση, και διείσδυση των διαφόρων τύπων καρκινικών κυττάρων [8], [9]. Παρά αυτές τις πρόσφατες προόδους στην κατανόηση από τους σημαντικούς ρόλους του SRC στην ογκογένεση, ο ακριβής μοριακός μηχανισμός μέσω του οποίου SRC συμβάλλει στην εξέλιξη του καρκίνου του πνεύμονα παραμένει να διευκρινιστεί πλήρως.

Μια κατηγορία των μικρών, μη-κωδικοποίησης, ενιαία -stranded RNAs γνωστό ως microRNAs (miRNAs) έχει αποδειχθεί ότι εμπλέκονται στον καρκίνο. miRNAs προσδένονται mRNAs στόχο σε συμπληρωματικές θέσεις στο 3′-αμετάφραστες περιοχές τους (3′-UTRs), καταστέλλοντας έτσι την έκφραση του γονιδίου στόχου στο μετα-μεταγραφικό επίπεδο [10], [11]. Μέσω αυτού του μηχανισμού, miRNAs ρυθμίζουν ένα ευρύ φάσμα βιολογικών διαδικασιών, συμπεριλαμβανομένων του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της διαφοροποίησης, η μετανάστευση, η απόπτωση, την ανάπτυξη, και τον μεταβολισμό [10]. Από την άλλη πλευρά, η δυσλειτουργία του miRNAs εμπλέκεται σε διάφορους ανθρώπινους καρκίνους, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του πνεύμονα, και miRNAs μπορούν να λειτουργήσουν τόσο ως ογκογονίδια και κατασταλτικά όγκου κατά την διάρκεια καρκινογένεση [12], [13]. Για παράδειγμα, η χαμηλή έκφραση του let-7α και υψηλή έκφραση του συμπλέγματος miR-17-92 συνδέονται με κακή κλινική έκβαση σε καρκίνο του πνεύμονα [14], [15]. Επιπλέον, αναφέρθηκε ότι miR-31 θα μπορούσε να καταστείλει άμεσα τα καταστολείς όγκων LATS2 και PPP2R2A στον καρκίνο του ανθρώπινου πνεύμονα [16]. Τα ευρήματα αυτά υπογραμμίζουν την ανάγκη για μια σε βάθος έρευνα για miRNAs που εκφράζονται ανώμαλα κατά τη διάρκεια του πνεύμονα καρκινογένεση, καθώς και την ανάγκη για μια εντατική έρευνα για το ρόλο τους στη βιολογία του όγκου.

Αν και η απορρύθμιση των miRNAs και το παιχνίδι SRC σημαντικούς ρόλους στον πνεύμονα καρκινογένεση, καμία συσχέτιση μεταξύ SRC και miRNAs στον καρκίνο του πνεύμονα έχει αναφερθεί. Σε αυτή τη μελέτη, είχαμε προβλέψει ότι SRC είναι ο στόχος του miR-203. Μετά τη μέτρηση των επιπέδων έκφρασης του miR-203 και SRC σε ανθρώπινο ιστό καρκίνου του πνεύμονα και ζευγαρωμένα δείγματα noncancerous ιστού, εντοπίσαμε μια αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ miR-203 και τα επίπεδα πρωτεΐνης SRC. Επιπλέον, έχουμε πειραματικά επικύρωσε την άμεση αναστολή της SRC μετάφραση του miR-203 χρησιμοποιώντας δοκιμασίες κυτταρικής επιμόλυνσης και λουσιφεράσης. Τέλος, δείξαμε ότι miR-203 ανέστειλε έκφραση SRC και, κατά συνέπεια, προκάλεσε την καταστολή των επακόλουθων οδών σηματοδότησης του SRC, όπως το /Ras /ERK μονοπάτι SRC, η οποία τελικά κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση και προώθησε την απόπτωση των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα.

Υλικά και Μέθοδοι

Cells και ανθρώπινους ιστούς

το ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικών γραμμών Α549, HCC827, και H1975, και το ανθρώπινο φυσιολογικό πνεύμονα κυτταρική γραμμή ινοβλαστών HLF αγοράστηκαν από η Σαγκάη Ινστιτούτο Κυτταρικής Βιολογίας, κινεζική Ακαδημία Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα). Α549, HCC827, και H1975 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε DMEM συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (GIBCO, CA, USA), και τα κύτταρα HLF καλλιεργήθηκαν σε Ρ12Κ συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (GIBCO) και 2,5 g /L NaHCO

3. Όλα τα κύτταρα επωάστηκαν σε ένα 5% CO

2 στους 37 ° C σε νερό-κορεσμένη ατμόσφαιρα. Οι όγκοι του πνεύμονα και σε συνδυασμό κανονική παρακείμενους ιστούς προήλθαν από ασθενείς που υποβάλλονται σε χειρουργική επέμβαση στο Ενταγμένο Gulou Νοσοκομείο του Πανεπιστημίου Nanjing (Nanjing, Κίνα). Στη συνέχεια, τα πλακίδια τμήμα όγκου υποβλήθηκαν σε ανοσοϊστοχημική ανάλυση του SRC (sc-8056, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Όλοι οι ασθενείς ή οι κηδεμόνες τους με την προϋπόθεση γραπτής συγκατάθεσης, και η Επιτροπή Δεοντολογίας του Πανεπιστημίου Nanjing ενέκρινε όλες τις πτυχές αυτής της μελέτης. θραύσματα ιστού καταψύχθηκαν αμέσως σε υγρό άζωτο κατά τη στιγμή της επέμβασης και αποθηκεύεται στους -80 ° C. Τα κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών παρατίθενται στον Πίνακα S1 στο S1 File.

απομόνωση του RNA και ποσοτική RT-PCR

Το συνολικό RNA εκχυλίστηκε από τα καλλιεργημένα κύτταρα και τους ανθρώπινους ιστούς χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen , Carlsbad, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Δοκιμασίες για την ποσοτικοποίηση miRNAs διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας Taqman miRNA ανιχνευτές (Applied Biosystems, Foster City, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, 1 μg ολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας αντίστροφη μεταγραφάση ΑΜν (Takara, Dalian, Κίνα) και ενός εκκινητή stem-loop RT (Applied Biosystems). Οι συνθήκες αντίδρασης ήταν ως εξής: 16 ° C για 30 λεπτά, 42 ° C για 30 λεπτά, και 85 ° C για 5 λεπτά. Real-time PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας κιτ TaqMan PCR σε ένα Applied Biosystems 7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Οι αντιδράσεις επωάστηκαν σε 96 φρεατίων οπτική πλάκα στους 95 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους των 95 ° C για 15 s και 60 ° C για 1 λεπτό. Όλες οι αντιδράσεις διεξήχθησαν εις τριπλούν. Μετά την αντίδραση, το κατώφλι κύκλου (C

Τ) δεδομένα προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας τις ρυθμίσεις σταθερού κατωφλίου, και η μέση C

T των τριπλών PCRs προσδιορίστηκε. Μια συγκριτική μέθοδος Γ

T χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνει κάθε κατάσταση με τους ελέγχους. Τα σχετικά επίπεδα των miRNAs σε κύτταρα και ιστούς ομαλοποιήθηκαν προς U6. Το ποσό των miRNA σε σχέση με το U6 εσωτερικού ελέγχου υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το

-ΔΔCT εξίσωση 2, στην οποία ΔΔC

T = (C

T miRNA – C

T U6)

στόχος – (C

T miRNA – C

T U6)

έλεγχο. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό του mRNA SRC, 1 μg συνολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας ολίγο dT και Thermoscript (Takara) στην αντίδραση, η οποία διεξήχθη με τις ακόλουθες συνθήκες: 42 ° C για 60 λεπτά και 70 ° C για 10 λεπτά . Στη συνέχεια, σε πραγματικό χρόνο PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του προϊόντος RT, Syber πράσινη χρωστική (Invitrogen) και ειδικούς εκκινητές για SRC και GAPDH. Οι αλληλουχίες των εκκινητών ήταν ως εξής: SRC (με νόημα): 5′-CATCCAAGCCTCAGACCCA-3 ‘? SRC (αντιπληροφοριακό): 5’-TGACACCACGGCATA CAGC-3 ‘? GAPDH (με νόημα): 5’-GATATTGTTGCCATCAATGAC-3 ‘? και GAPDH (αντιπληροφοριακό): 5’-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3 ‘. Οι αντιδράσεις επωάστηκαν στους 95 ° C για 5 λεπτά, ακολουθούμενο από 40 κύκλους των 95 ° C για 30 s, 60 ° C για 30 s, και 72 ° C για 30 s. Αφού οι αντιδράσεις ήταν πλήρεις, η C

τιμές Τ προσδιορίστηκαν με τον καθορισμό ενός σταθερού κατωφλίου. Η σχετική ποσότητα του SRC mRNA ομαλοποιήθηκε με GAPDH.

Η υπερέκφραση και νοκ ντάουν του miR-203

Συνθετικά προ-miR-203, αντι-miR-203 και χτυπητά αρνητικό RNAs ελέγχου αγοράστηκαν από Ambion (Austin, TX, USA). Όλα τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων ή πιάτα 60 mm, και τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με Lipofectamine 2000 (Invitrogen) την επόμενη ημέρα όταν τα κύτταρα ήταν περίπου 70% συρρέοντα. Σε κάθε φρεάτιο, ίσες ποσότητες προ-miR-203, χρησιμοποιήθηκαν αντι-miR-203 ή ομελέτα αρνητικού RNA ελέγχου. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 24 ώρες μετά την επιμόλυνση για ποσοτική RT-PCR και κηλίδωση Western.

λουσιφεράσης ανταποκριτής δοκιμασία

Για να δοκιμαστεί η άμεση δέσμευση του miR-203 προς το γονίδιο-στόχο SRC, ένα ανταποκριτή λουσιφεράσης δοκιμασία διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [17]. Ολόκληρη η 3′-αμετάφραστη περιοχή (3′-UTR) του ανθρώπινου SRC ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας PCR με ανθρώπινο γονιδιωματικό DNA ως μήτρα. Τα PCR προϊόντα εισήχθησαν εντός του πλασμιδίου ρ-MIR-ανταποκριτή (Ambion), και η ένθεση επιβεβαιώθηκε ως σωστή δια προσδιορισμού σειράς. Προκειμένου να ελεγχθεί η εξειδίκευση δέσμευσης, οι αλληλουχίες που αλληλεπιδρούν με την αλληλουχία σπόρο miR-203 μεταλλάχθηκαν (από AUUUCA να UAAAGU) και εισήχθη σε ένα ισοδύναμο αναφοράς λουσιφεράσης ο μεταλλαγμένος SRC 3′-UTR. Για λουσιφεράση δοκιμασίες ρεπόρτερ, τα κύτταρα Α549 καλλιεργήθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων και κάθε φρεάτιο διαμολύνθηκε με 1 μα πυγολαμπίδας πλασμιδίου αναφοράς λουσιφεράσης, 1 μg ενός β-γαλακτοσιδάσης (β-gal) πλασμίδιο έκφρασης (Ambion), και ίσες ποσότητες (100 pmol) του προ-miR-203, αντι-miR-203 ή το περιπλεγμένο RNA αρνητικού μάρτυρα χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen). Το πλασμίδιο β-gal χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος επιμόλυνσης. Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα κιτ δοκιμασίας λουσιφεράσης (Promega, Madison, WI, USA).

κατασκευή πλασμιδίου και siRNA δοκιμασία παρεμβολής

Μια αλληλουχία siRNA που στοχεύει το ανθρώπινης SRC cDNA σχεδιάστηκε και συντέθηκε από GenePharma (Σαγκάη, Κίνα). Η αλληλουχία siRNA ήταν 5′-CACUACAAGAUCCGGAAAC-3 ‘. Ένα περιπλεγμένο siRNA συμπεριλήφθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Ένα πλασμίδιο έκφρασης θηλαστικού που κωδικοποιεί την ανθρώπινη SRC ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης (pReceiver-M02-SRC) αγοράστηκε από GeneCopoeia (Germantown, MD, USA). Ένα άδειο πλασμίδιο χρησίμευσε ως αρνητικός έλεγχος. Ο φορέας έκφρασης SRC και SRC siRNA διαμολύνθηκαν σε κύτταρα Α549 χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ολικό RNA και πρωτεΐνης απομονώθηκαν 24 ώρες μετά την επιμόλυνση. Τα επίπεδα mRNA SRC και έκφραση πρωτεΐνης αξιολογήθηκαν με ποσοτική RT-PCR και κηλίδωση Western.

εκχύλιση πρωτεϊνών και κηλίδωση Western

Όλα τα κύτταρα ξεπλύθηκαν με PBS (ρΗ 7.4) και λύθηκαν σε RIPA Lysis ρυθμιστικού (Beyotime, Κίνα) συμπληρωμένο με ένα κοκτέιλ πρωτεάσης και φωσφατάσης Αναστολέας (Thermo Scientific 78440) σε πάγο για 30 λεπτά. Τα δείγματα ιστού καταψύχθηκαν στερεού με υγρό άζωτο, αλεσμένα σε σκόνη και λύθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA λύσης που περιέχει το κοκτέιλ πρωτεάσης και φωσφατάσης αναστολέα σε πάγο για 30 λεπτά. Όταν είναι απαραίτητο, κατεργασία με υπερήχους χρησιμοποιείται για να διευκολύνει τη λύση. Κυτταρολύματα ή ομογενοποιήματα ιστού φυγοκεντρήθηκαν για 10 λεπτά (12.000 g, 4 ° C). Το υπερκείμενο συλλέχθηκε, και η συγκέντρωση πρωτεΐνης υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ προσδιορισμού πρωτεϊνών Pierce BCA (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA). Τα επίπεδα πρωτεΐνης αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας κηλίδες Western με αντίστοιχα αντισώματα. Τα επίπεδα πρωτεΐνης κανονικοποιήθηκαν με διερεύνηση των ίδιων στυπώματα με αντίσωμα GAPDH. Τα αντισώματα αγοράστηκαν από τις ακόλουθες πηγές: αντι-c-Src (Β-12) (sc-8056, Santa Cruz Biotechnology), αντι-ERK1 /2 (pT202 /pY204) (BD Biosciences 612359, USA), αντι-ERK1 (BD Biosciences 610031, USA), αντι-PKCalpha (H-7) (sc-8393, Santa Cruz Biotechnology) και αντι-GAPDH (SC-365062, Santa Cruz Biotechnology). δραστηριότητα ras ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας το Ras ενεργοποίηση Assay Kit από Upstate-Millipore (17-218). Οι ζώνες πρωτεΐνης αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ.

Κυτταρική βιωσιμότητα δοκιμασία

Για να αξιολογηθεί η βιωσιμότητα των κυττάρων, τα κύτταρα Α549 σπάρθηκαν εις τριπλούν σε πλάκες 96 φρεατίων σε πυκνότητα 5 χ 10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο σε 100 μΐ μέσου καλλιέργειας. Ο δείκτης κυτταρικού πολλαπλασιασμού μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλ τετραζόλιο (ΜΤΤ) (Sigma, USA), η οποία διεξήχθη 12, 24, 36, και 48 h μετά τη διαμόλυνση σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Η μετανάστευση των κυττάρων δοκιμασία

Η ικανότητα μετανάστευση κυττάρων Α549 επιμολύνονται με το miR-203 μιμούνται ή SRC υπερέκφραση πλασμίδιο ελέγχθηκε σε ένα Transwell Boyden τμήμα (6,5 -mm, Costar, USA). Οι μεμβράνες πολυανθρακικό (8- μm μέγεθος πόρων) στο κάτω μέρος του άνω διαμερίσματος των Transwells επικαλύφθηκαν με 1% ανθρώπινη ινονεκτίνη (R &? Συστήματα D 1918-FN, USA). Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 24 ώρες μετά την επιμόλυνση και αιωρούνται σε FBS μέσο ελεύθερο DMEM καλλιέργειας. Στη συνέχεια, τα κύτταρα προστέθηκαν στον άνω θάλαμο (4 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο). Ταυτόχρονα, 0.5 ml ϋΜΕΜ με 10% FBS προστέθηκε στο κάτω διαμέρισμα, και οι Transwell που περιέχουν πλάκες επωάστηκαν για 12 ώρες σε ένα 5% CO

2 ατμόσφαιρα κορεσμένη με H

2O. Μετά την επώαση, τα κύτταρα που είχαν εισέλθει στην κάτω επιφάνεια της μεμβράνης φίλτρου μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη για 25 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, πλύθηκαν 3 φορές με απεσταγμένο νερό και χρωματίστηκαν με 0.1% κρυσταλλικό ιώδες σε 0,1 Μ βορικού και 2% αιθανόλη για 15 min σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα που παραμένουν στην άνω επιφάνεια της μεμβράνης φίλτρου (μη διακινούμενο) έχουν ξύνεται απαλά με μια μπατονέτα. Εικόνες από τις κάτω επιφάνειες (με μετανάστες κύτταρα) συνελήφθησαν από φωτομικροσκόπιο (5 πεδία ανά θάλαμο) (BX51 Ολύμπου, Ιαπωνία), και τα κύτταρα μετρήθηκαν στα τυφλά.

Δοκιμασίες απόπτωσης

Η απόπτωση κυττάρων Α549 επιμολύνονται με το miR-203 μιμούνται ή SRC υπερέκφραση πλασμίδιο ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας ένα αννεξίνης V-FITC /ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) δοκιμασία χρώσης. Κύτταρα Α549 καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 12 φρεατίων και επιμολύνθηκαν με miR-203 μιμούνται, siRNA, ή το πλασμίδιο υπερέκφραση SRC για να επάγει απόπτωση. Προ-miR-ελέγχου και ελέγχου siRNA που χρησίμευσαν ως αρνητικοί μάρτυρες. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για μία νύχτα με τόσο πλήρες μέσο και ορό μέσο απεμπλουτισμένο περιέχει ορό? και τα συνημμένα και επιπλέοντα κύτταρα στη συνέχεια συλλέχθηκαν. Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής των αποπτωτικών κυττάρων διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα αννεξίνης V-FITC κιτ χρώσης /ΡΙ (BD Biosciences, CA, USA). Μετά από πλύσεις με κρύο PBS, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα πρόσδεσης (100 mM HEPES, ρΗ 7,4, 100 mM NaCl, και 25 mM CaCl

2) που ακολουθήθηκε από χρώση με Annexin V-FITC /ΡΙ σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι για 15 λεπτά. Τα αποπτωτικά κύτταρα στη συνέχεια αξιολογήθηκαν από gating ΡΙ και αννεξίνης V-θετικά κύτταρα σε ένα ενεργοποιημένων με φθορισμό κυττάρων διαλογής (FACS) κυτταρόμετρο ροής (BD Biosciences, San Jose, CA). Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Στατιστική ανάλυση

όλες τις εικόνες του Western blotting είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Ποσοτική RT-PCR, η δοκιμασία λουσιφεράσης, και οι δοκιμασίες βιωσιμότητας των κυττάρων και την απόπτωση διεξήχθησαν εις τριπλούν και κάθε πείραμα επαναλήφθηκε αρκετές φορές. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι ο μέσος όρος ± SE από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. Οι διαφορές θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές σε ρ & lt?. 0.05 χρήση του Student t-test

Αποτελέσματα

Η αναβάθμιση της πρωτεΐνης SRC, αλλά όχι mRNA, σε πνεύμονα καρκινικούς ιστούς

πρώτα διερευνήθηκε η έκφραση SRC μέσω τόσο ανοσοϊστοχημική ανάλυση και ανάλυση ανοσοστυπώματος σε ανθρώπινους ιστούς καρκίνου του πνεύμονα και των αντίστοιχων noncancerous ιστούς. Βρήκαμε ότι τα επίπεδα της πρωτεΐνης SRC ήταν δραματικά υψηλότερα στους ιστούς καρκίνου του πνεύμονα (Σχήμα 1, A-C). Αν και η πρωτεΐνη SRC ρυθμίζεται αυξητικά με συνέπεια σε ιστούς καρκίνου του πνεύμονα, τα επίπεδα mRNA SRC δεν διέφερε σημαντικά μεταξύ του καρκίνου και noncancerous ιστούς (Σχήμα 1 D). Επιπλέον, βρήκαμε ότι το επίπεδο πρωτεΐνη SRC ήταν υψηλότερο σε ανθρώπινα κύτταρα Α549 αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα σε σύγκριση με εκείνη στην κανονική ινοβλαστών πνεύμονος HLF κύτταρα (Σχήμα S1, Α και Β σε S1 File), αλλά το επίπεδο SRC mRNA ήταν ίση σε αυτές τις δύο κυτταρικές σειρές (Σχήμα S1c σε S1 File). Αυτή η διαφορά μεταξύ της πρωτεΐνης και του mRNA σε έκφραση SRC σε καρκίνους του πνεύμονα υποδηλώνει σαφώς ότι ένας μετα-μεταγραφικός μηχανισμός εμπλέκεται στη ρύθμιση SRC.

(Α) Αντιπροσωπευτική εικόνα ανοσοϊστοχημική ανάλυση της έκφρασης SRC στον καρκίνο του πνεύμονα (CL) και φυσιολογικό γειτονικό ιστό (NL) δείγματα. (Β και Γ) Western blotting ανάλυση των επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης SRC σε έξι ζεύγη δειγμάτων CL και NL. Β: αντιπροσωπευτική εικόνα? C: ποσοτική ανάλυση. ανάλυση (Δ) Ποσοτική RT-PCR των σχετικών επιπέδων έκφρασης των SRC mRNA σε έξι ζεύγη δειγμάτων CL και NL. * P & lt? 0,05? ** P & lt?. 0.01

Η

Αναγνώριση των διατηρημένων miR-203 θέσεις στόχους εντός της 3′-UTR της SRC

Μια σημαντική λειτουργία της μετα-μεταγραφικής ρύθμισης είναι η καταστολή του mRNA μεταγραφές από miRNAs. miRNAs είναι, ως εκ τούτου, ενδέχεται να παίξουν ένα βιολογικώς σχετικό ρόλο στη ρύθμιση της έκφρασης SRC στον καρκίνο του πνεύμονα. Τρεις υπολογιστικών αλγορίθμων, συμπεριλαμβανομένων TargetScan [18], Miranda [19], και PicTar [20], χρησιμοποιήθηκαν σε συνδυασμό για τον εντοπισμό πιθανών miRNAs που μπορούν να στοχεύσουν SRC. Χρησιμοποιώντας αυτές τις προσεγγίσεις, miR-203 ταυτοποιήθηκε ως υποψήφιο ρυθμιστικές miRNA της SRC. Η προβλεπόμενη αλληλεπίδραση μεταξύ miR-203 και τις περιοχές στόχου στο SRC 3′-UTR απεικονίζονται στο Σχήμα 2Α. Τέσσερις πιθανές θέσεις στόχου miR-203 βρέθηκαν στο 3′-UTR της αλληλουχίας SRC mRNA. Οι ελάχιστες ελεύθερη ενέργεια τιμές αυτών των υβριδίων ήταν -16,9, -20,1, -15,8, -18,9 και kcal /mol, αντίστοιχα, τα οποία είναι καλά μέσα στην περιοχή των γνήσιων ζευγών miRNA-στόχου. Επιπλέον, τέλειο ζευγάρωμα βάσεων σημειώθηκε μεταξύ της περιοχής σπόρου (πυρήνα ακολουθία που περιλαμβάνει τα πρώτα 2-8 βάσεις της ώριμης miRNA) και τα συγγενή τους στόχους. Επιπλέον, οι αλληλουχίες πρόσδεσης miR-203 στο SRC 3′-UTR είναι πολύ συντηρημένες μεταξύ των ειδών.

(Α) Σχηματική περιγραφή των υποθετικών διπόλων που σχηματίζονται από τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των θέσεων πρόσδεσης του SRC 3′- UTR (επάνω) και miR-203 (κάτω). Η προβλεπόμενη ελεύθερη ενέργεια αξίας κάθε υβριδικό ενδείκνυται. Οι θέσεις αναγνώρισης σπόρος συμβολίζεται, και όλα τα νουκλεοτίδια σε αυτές τις περιοχές είναι εξαιρετικά διατηρημένες μεταξύ των ειδών, συμπεριλαμβανομένου του ανθρώπου, ποντικού και αρουραίου. (Β) Η ποσοτική ανάλυση RT-PCR των επιπέδων έκφρασης του miR-203 (με τη μορφή του /αναλογία U6 miRNA) σε έξι ζεύγη δειγμάτων CL και NL. (Γ) της διασποράς συσχέτισης πλοκή του Pearson της πτυχής μεταβολή των επιπέδων του miR-203 και SRC πρωτεΐνη σε ανθρώπινους ιστούς καρκίνου του πνεύμονα. (D) της διασποράς συσχέτισης πλοκή του Pearson της πτυχής μεταβολή των επιπέδων του miR-203 και SRC mRNA σε ανθρώπινους ιστούς καρκίνου του πνεύμονα. * P & lt? 0,05? ** P & lt?. 0.01

Η

Ανίχνευση μια αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων του miR-203 και SRC στον καρκίνο του πνεύμονα δείγματα ιστού

miRNAs είναι γενικά πιστεύεται ότι έχουν μοτίβα έκφρασης που είναι αντίθετες με εκείνη των στόχων τους [21] – [23]. Είμαστε δίπλα διερευνηθεί αν miR-203 ήταν αντιστρόφως ανάλογη με SRC στον καρκίνο του πνεύμονα. Μετά τον προσδιορισμό των επιπέδων του miR-203 στα ίδια έξι ζεύγη πνευμόνων καρκινικούς ιστούς και τους αντίστοιχους ιστούς noncancerous, δείξαμε ότι τα επίπεδα miR-203 ρυθμίστηκαν προς τα κάτω με συνέπεια σε ιστούς καρκίνου του πνεύμονα (Σχήμα 2Β). Η αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ miR-203 επίπεδα και τα επίπεδα πρωτεΐνης SRC (Σχήμα 2C) και η διαφορά μεταξύ miR-203 επίπεδα και τα επίπεδα SRC mRNA (Εικόνα 2D) έχουν περαιτέρω απεικονίζεται χρησιμοποιώντας διαγράμματα διασποράς συσχέτισης κατά Pearson. Όπως παρατηρήθηκε, ένας αντίστροφος συσχετισμός μεταξύ των επιπέδων miR-203 και τα επίπεδα πρωτεΐνης SRC, αλλά όχι τα επίπεδα mRNA, παρατηρήθηκε σε ανθρώπινους ιστούς καρκίνου του πνεύμονα. Ομοίως, miR-203 επίπεδο ήταν επίσης χαμηλότερη στα κύτταρα Α549 σε σύγκριση με εκείνη σε κύτταρα HLF (Σχήμα S1D σε File S1). Τα αποτελέσματα έδειξαν έντονα ότι ένα τυπικό, miRNA μεσολάβηση, μετα-μεταγραφικό μηχανισμό ρύθμισης είχε εμπλακεί σε SRC καταστολή.

Επικύρωση της SRC ως άμεσο στόχο του miR-203

Η συσχέτιση μεταξύ miR -203 και SRC εξετάστηκε περαιτέρω με αξιολόγηση έκφρασης SRC σε ανθρώπινα κύτταρα πνεύμονα Α549 αδενοκαρκινώματος μετά υπερέκφραση του miR-203. Σε αυτά τα πειράματα, miR-203 υπερέκφραση επετεύχθη με επιμόλυνση των κυττάρων με προ-miR-203 (ένα συνθετικό ολιγονουκλεοτίδιο RNA duplex μιμούνται τον πρόδρομο miR-203). Όπως αναμενόταν, τα επίπεδα miR-203 σε κύτταρα Α549 αυξήθηκαν περισσότερο από 300 φορές όταν τα κύτταρα αυτά επιμολύνθηκαν με προ-miR-203 (Σχήμα 3Α). Για την επικύρωση ότι η επιμόλυνση του miR-203 ήταν επιτυχής, μία από τις αντιπροσωπευτικές γονιδίων στόχων του miR-203, PKCalpha (REF), εκτιμήθηκε και αποδείχθηκε ότι PKCalpha ήταν σημαντικά προς τα κάτω σε κύτταρα Α549 μετά την επιμόλυνση του miR-203 (Σχήμα S2 στο S1 αρχείου). Ομοίως, η έκφραση της πρωτεΐνης SRC μειώθηκε με την εισαγωγή του miR-203 σε κύτταρα Α549 (Εικόνα 3, Β και C). Για να προσδιοριστεί το επίπεδο στο οποίο miR-203 επηρεάζεται έκφραση SRC, επαναλάβαμε τα προαναφερθέντα πειράματα και εξέτασαν την έκφραση του mRNA SRC μετά την επιμόλυνση. Αν και το ενδοκυτταρικό ποσοστό του miR-203 ήταν σημαντικά επηρεάστηκαν μετά από θεραπεία με προ-miR-203, η υπερέκφραση του miR-203 δεν επηρέασε SRC mRNA σταθερότητα (Σχήμα 3D). Από την άλλη πλευρά, ο συσχετισμός μεταξύ miR-203 και SRC εξετάστηκε επίσης με αξιολόγηση έκφρασης SRC σε φυσιολογικά κύτταρα ινοβλαστών πνεύμονος HLF μετά knockdown του miR-203 με αντι-miR-203 (χημικώς τροποποιημένα αντινοηματικά ολιγονουκλεοτίδια σχεδιασμένα να στοχεύουν ειδικά ώριμη ΜΙΚ 203) (Σχήμα 3Α). Να χτυπήσει κάτω miR-203 σε κύτταρα HLF είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση των πρωτεϊνών SRC (Σχήμα 3, Β και Γ), αλλά δεν mRNA (Σχήμα 3D) επίπεδα. Αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι miR-203 ρυθμίζει ειδικά την έκφραση της πρωτεΐνης SRC στο μετα-μεταγραφικό επίπεδο, το οποίο είναι ένα τυπικό ζώο miRNA μεσολάβηση μηχανισμός ρύθμισης. Για να αποδειχθεί η ευρωστία της δοκιμής, επαναλάβαμε τις προαναφερθείσες πειράματα σε δύο πρόσθετες κυτταρικές γραμμές αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα, HCC827 και H1975. Ομοίως, τα επίπεδα miR-203 αυξήθηκαν σημαντικά όταν HCC827 και H1975 κύτταρα επιμολύνθηκαν με προ-miR-203 (Σχήμα S3, Α και Ε σε S1 File). Κατά συνέπεια, τα επίπεδα πρωτεΐνης SRC κατεστάλησαν όταν HCC827 και H1975 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με προ-miR-203 (Σχήμα S3, B, C, F και G στην S1 File), αλλά τα επίπεδα SRC mRNA δεν επηρεάστηκαν από τέτοια θεραπεία (Σχήμα S3, D και Η S1 αρχείου).

(ανάλυση Α) Ποσοτική RT-PCR των επιπέδων του miR-203 σε κύτταρα Α549 σε επεξεργασία με προ-miR-ελέγχου ή προ-miR-203 και στα κύτταρα HLF θεραπεία με αντι-miR-ελέγχου ή αντι-miR-203. (Β και Γ) ανάλυση κηλίδας Western των επιπέδων πρωτεΐνης SRC σε κύτταρα Α549 σε επεξεργασία με προ-miR-ελέγχου ή προ-miR-203 και σε κύτταρα HLF θεραπεία με αντι-miR-ελέγχου ή αντι-miR-203. Β: αντιπροσωπευτική εικόνα? C: ποσοτική ανάλυση. (Δ) Η ποσοτική ανάλυση RT-PCR των επιπέδων SRC mRNA σε κύτταρα Α549 σε επεξεργασία με προ-miR-ελέγχου ή προ-miR-203 και σε κύτταρα HLF θεραπεία με αντι-miR-ελέγχου ή αντι-miR-203. ρεπόρτερ λουσιφεράσης (Ε) Firefly περιέχουν άγριου τύπου (WT) ή μεταλλαγμένης θέσεις σύνδεσης (MUT) miR-203 στο SRC 3′-UTR συν-επιμολύνεται σε κύτταρα Α549 με προ-miR-ελέγχου ή προ-miR-203 και σε HLF κύτταρα με αντι-miR-ελέγχου ή αντι-miR-203. Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα κιτ δοκιμασίας λουσιφεράσης. Τα αποτελέσματα υπολογίζονται ως ο λόγος της δραστηριότητας λουσιφεράσης πυγολαμπίδας στο προ-miR-203 και αντι-miR-203-μορφομετατραπέντα κύτταρα κανονικοποιημένη προς τα κύτταρα ελέγχου. * P & lt? 0,05? ** P & lt?. 0.01

Η

Για να καθοριστεί εάν οι αρνητικές ρυθμιστικές επιπτώσεις που miR-203 που ασκείται επί της έκφρασης SRC ήταν διαμεσολαβείται μέσω της πρόσδεσης του miR-203 με τους τεκμαίρεται θέσεις στο 3′-UTR της το mRNA SRC, το πλήρους μήκους SRC 3′-UTR που περιέχει τις τέσσερις θέσεις σύνδεσης τεκμαίρεται miR-203 συντήχθηκε προς τα κάτω του γονιδίου της λουσιφεράσης πυγολαμπίδας σε ένα πλασμίδιο ανταποκριτή. Το προκύπτον πλασμίδιο διαμολύνθηκε σε κύτταρα Α549 μαζί με ένα πλασμίδιο ελέγχου διαμόλυνση (β-gal) και προ-miR-203. Όπως ήταν αναμενόμενο, η υπερέκφραση του miR-203 οδήγησε σε μείωση άνω του 50% δραστικότητας ανταποκριτή λουσιφεράσης σε σύγκριση με κύτταρα κατεργασμένα με τον αρνητικό μάρτυρα RNA (Σχήμα 3Ε). Επιπλέον, εισαγάγαμε μεταλλάξεις σημείου στις αντίστοιχες συμπληρωματικές θέσεις στο SRC 3′-UTR για την εξάλειψη των προβλεπόμενων θέσεων πρόσδεσης miR-203 (όλες από τις τέσσερις θέσεις πρόσδεσης ήταν μεταλλαγμένο). Αυτή η μεταλλαγμένη αναφοράς λουσιφεράσης δεν επηρεάστηκε από την υπερέκφραση του miR-203 (Σχήμα 3Ε). Αντίθετα, όταν το προκύπτον πλασμίδιο διαμολύνθηκε σε κύτταρα HLF μαζί με ένα πλασμίδιο ελέγχου διαμόλυνση (β-gal) και αντι-miR-203, το knockdown του miR-203 είχε ως αποτέλεσμα μια αύξηση πάνω από 75% δραστικότητας ανταποκριτή λουσιφεράσης σε σύγκριση με κύτταρα κατεργασμένα με τον αρνητικό RNA ελέγχου, ενώ η μεταλλαγμένη αναφοράς λουσιφεράσης δεν επηρεάστηκε από την knockdown του miR-203 (Σχήμα 3Ε). Το εύρημα αυτό υποδηλώνει ότι οι θέσεις σύνδεσης συμβάλλουν σημαντικά στην miRNA: mRNA αλληλεπιδράσεων μεσολάβηση της μετα-μεταγραφική καταστολή της έκφρασης SRC. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι miR-203 αναγνωρίζει άμεσα και συνδέεται με το 3′-UTR της μεταγραφής SRC mRNA και αναστέλλει SRC μετάφραση.

καταστολή της οδού SRC /Ras /ERK σηματοδότησης με miR-203

επόμενο ανέλυσε τις βιολογικές συνέπειες της μειωμένης έκφρασης SRC προκαλείται από miR-203 σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Ως ισχυρός ογκογονιδίου, SRC ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό και την κινητικότητα των καρκινικών κυττάρων επηρεάζοντας τις διαβάσεις /ERK σηματοδότησης FAK, EGFR, Ras και [7]. Συνεπώς, διερευνήσαμε αν η καταστολή της έκφρασης SRC λόγω miR-203 ρυθμίζει τις δραστηριότητες των μορίων στο Ras μονοπάτι SRC //ERK σηματοδότησης. Πρώτον, επικύρωσε την επίδραση της δραστικότητας SRC επί της οδού σήματος Ras /ERK σε κύτταρα Α549. Σε συμφωνία με προηγούμενες αναφορές [7], [24], knockdown του SRC με siRNA μεσολάβηση παρεμβολή RNA οδήγησε σε μειωμένη SRC mRNA και τα επίπεδα της πρωτεΐνης (Σχήμα 4, Α-Ο), η οποία, με τη σειρά του, οδήγησε σε μειωμένη Ras-GTP και φωσφορυλιωμένη ERK1-/2 (Σχήμα 4, Α και Β). Σε αντίθεση, η υπερέκφραση του SRC οδήγησε σε αυξημένη SRC mRNA και τα επίπεδα της πρωτεΐνης (Σχήμα 4, Α-Ο), η οποία, με τη σειρά του, οδήγησε σε αυξημένη Ras-GTP και φωσφορυλιωμένη ERK1-/2 (Σχήμα 4, Α και Β). Στη συνέχεια, διερευνήσαμε εάν η επαγωγή miR-203 θα μπορούσε να μιμηθεί τη μείωση SRC στην καταστολή Ras μονοπάτι σηματοδότησης /ERK. Όπως αναμενόταν, η υπερέκφραση του miR-203 σε κύτταρα Α549 ρυθμίζεται προς τα κάτω την πρωτεΐνη SRC και κατέληξαν σε λιγότερο ενεργές Ras-GTP, η οποία, με τη σειρά του, οδήγησε σε λιγότερο φωσφορυλιωμένη ERK1 /2 (Σχήμα 4, D και Ε). Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματα δείχνουν ότι Ras /ERK, όπως το κατάντη μονοπατιού σηματοδότησης του SRC, μπορεί να ελέγχεται στενά από τη ρυθμιστική οδό miR-203 /SRC.

(Α και Β) Κηλίδωση Western ανάλυση της πρωτεΐνης επίπεδα SRC, Ras-GTP, σύνολο Ras, φωσφορυλιωμένη ERK1 /2, και ERK1 σε κύτταρα Α549 επιμολύνονται με έλεγχο siRNA, SRC siRNA, τον φορέα ελέγχου ή φορέα SRC. Α: αντιπροσωπευτική εικόνα? Β: ποσοτική ανάλυση. ανάλυση (C) Ποσοτική RT-PCR των επιπέδων SRC mRNA σε κύτταρα Α549 σε επεξεργασία με έλεγχο siRNA, SRC siRNA, τον φορέα ελέγχου ή φορέα SRC. (Δ και Ε) κηλίδωση Western ανάλυση των επιπέδων πρωτεΐνης του SRC, Ras-GTP, σύνολο Ras, φωσφορυλιωμένη ERK1 /2, και ERK1 σε κύτταρα Α549 επιμολύνονται με προ-miR-ελέγχου ή προ-miR-203. D: αντιπροσωπευτική εικόνα? Ε: ποσοτική ανάλυση. * P & lt? 0,05? ** P & lt?. 0.01

Η

Ο ρόλος του miR-203 στη ρύθμιση SRC στα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα

επόμενο επικεντρώθηκε στη μελέτη του ρόλου του miR-203 στη ρύθμιση SRC. Επειδή SRC είναι γνωστό ότι εμπλέκεται στη ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, της απόπτωσης, και τη μετανάστευση, ερευνήσαμε αν miR-203 θα ρυθμίζει SRC για να ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την απόπτωση, και μετανάστευση σε κύτταρα Α549. Προς στήριξη της έννοιας που SRC είναι απαραίτητη για την προώθηση του πολλαπλασιασμού [25], τα κύτταρα Α549 επιμολύνονται με SRC siRNA έδειξαν αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων (Σχήμα S4A σε S1 File)? Αντιθέτως, επιμόλυνση με το SRC-υπερεκφράζουν πλασμίδιο, το οποίο εκφράζει ειδικά το πλήρους μήκους ανοικτό πλαίσιο ανάγνωσης (ORF) του SRC χωρίς το miR-203 αποκρίνεται 3′-UTR, είχε ένα αντίθετο αποτέλεσμα επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων (Σχήμα S4B σε Αρχείο S1). Ακολούθως, αξιολογήσαμε το ρόλο του miR-203 επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Όπως ήταν αναμενόμενο, τα κύτταρα Α549 επιμολύνονται με προ-miR-203 είχε μειωθεί SRC επίπεδα πρωτεΐνης (Σχήμα 5, Α και Β) και πολλαπλασιάστηκαν σε σημαντικά χαμηλότερο ρυθμό (Σχήμα 5C). Πίνακας S1.