Abstract

Ο καρκίνος των ωοθηκών συζευγμένο με G πρωτεΐνη υποδοχέα 1 (OGR1) διέγερση από εξωκυτταρικό πρωτόνια προκαλεί την ενεργοποίηση των G πρωτεϊνών και επακόλουθη κυτταρικές λειτουργίες. Ωστόσο, οι φυσιολογικές και παθοφυσιολογικές ρόλοι των OGR1 σε αποκρίσεων αεροδού παραμένουν σε μεγάλο βαθμό άγνωστες. Στην παρούσα μελέτη, δείχνουμε ότι OGR1-ανεπαρκή ποντίκια είναι ανθεκτικά στα κύρια χαρακτηριστικά του άσθματος, συμπεριλαμβανομένης της ηωσινοφιλίας των αεραγωγών, υπεραντιδραστικότητα των αεραγωγών (AHR), και μεταπλασία λαγηνοειδών κυττάρων, σε συνδυασμό με ένα αξιόλογο παρεμπόδιση της Th2 κυτοκίνης και της παραγωγής IgE, με ένα ωολευκωματίνη (OVA) προκληθείσα μοντέλο άσθματος. Η ενδοτραχειακή μεταφορά σε ποντικούς άγριου τύπου OVA-ασταρωθεί οστών δενδριτικά κύτταρα που προέρχονται από μυελό (DCS) από OGR1-ανεπαρκή ποντίκια ανέπτυξαν χαμηλότερη AHR και ηωσινοφιλία μετά OVA εισπνοή σε σύγκριση με τη μεταφορά των ατόμων από ποντικούς άγριου τύπου. Η μετανάστευση των OVA-παλμική δενδριτικά κύτταρα να περιβρογχικές λεμφαδένες ανεστάλη επίσης από ανεπάρκεια OGR1 στα πειράματα έκδοση. Η παρουσία των λειτουργικών OGR1 στις ΑΧ επιβεβαιώθηκε από την έκφραση των OGR1 mRNA και την OGR1 ευαίσθητη Ca

2+ απάντηση. OVA-επαγόμενη έκφραση του CCR7, ένα ώριμο υποδοχέα χημειοκίνης DC, και απόκριση μετανάστευση προς συνδετήρες CCR7 σε μια in vitro δοκιμασία Transwell εξασθένησαν από ανεπάρκεια OGR1. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι OGR1 στις ΑΧ είναι κρίσιμης σημασίας για τη μετανάστευση στην αποστράγγιση των λεμφαδένων, η οποία, με τη σειρά της, διεγείρει την αλλαγή του φαινοτύπου Th2 και την επακόλουθη επαγωγή της φλεγμονής των αεραγωγών και AHR

Παράθεση:. Aoki Η, Mogi C, Hisada T, Nakakura Τ, Kamide Υ, Ichimonji I, et al. (2013) Proton-Sensing καρκίνου των ωοθηκών G πρωτεΐνη-υποδοχέα συζευγμένο 1 σε δενδριτικά κύτταρα απαιτείται για απαντήσεις των αεραγωγών σε ένα ποντικού Άσθμα μοντέλο. PLoS ONE 8 (11): e79985. doi: 10.1371 /journal.pone.0079985

Επιμέλεια: Bernhard Ryffel, γαλλικό Εθνικό Κέντρο Επιστημονικών Ερευνών της Γαλλίας

Ελήφθη: 20 Αυγούστου του 2013? Δεκτές: 7, Οκτ 2013? Δημοσιεύθηκε: 11 Νοεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Aoki et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από Grant-in-ενισχύσεις για την Επιστημονική Έρευνα (Β) (σε FO), Grant-in-Aid για Αμφισβήτηση αναγνωριστικής έρευνας (σε FO), Grant-in-ενισχύσεις για την Επιστημονική Έρευνα (Γ) (TI και CM), και Grant-in-ενισχύσεις για Νέους επιστήμονες (Β) (στο ΗΑ) από την Ιαπωνία Εταιρείας για την Προώθηση της Επιστήμης (JSPs). Η εργασία αυτή υποστηρίζεται επίσης εν μέρει από το κοινό ερευνητικό πρόγραμμα του Ινστιτούτου Μοριακής και Κυτταρικής κανονισμού, Πανεπιστήμιο Γκούνμα (12023) (με TN). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

το αλλεργικό άσθμα είναι μία Th2 λεμφοκυττάρων διαμεσολαβείται φλεγμονώδης νόσος των αεραγωγών που χαρακτηρίζεται από ηωσινοφιλία, αυξημένη παραγωγή βλέννας από λαγηνοειδή κύτταρα, και υπερευαισθησία των αεραγωγών (AHR) [1,2]. Αυτές οι ασθματικές αποκρίσεις διαμεσολαβούνται από Th2 κυτοκίνες, συμπεριλαμβανομένων των IL-4, IL-5 και IL-13? IL-5 διαδραματίζουν σημαντικούς ρόλους στη διαφοροποίηση, στρατολόγηση και ενεργοποίηση των ηωσινοφίλων και IL-4 και IL-13 θεωρούνται ότι συνδέονται με την οδήγηση της σύνθεσης IgE από Β-κύτταρα, μεταπλασία λαγηνοειδών κυττάρων, και AHR. Τα μακροφάγα και ουδετερόφιλα συσσωρεύονται επίσης στη φλεγμονώδη αλλοίωση. Τα δενδριτικά κύτταρα (DCs) είναι κύτταρα που παρουσιάζουν αντιγόνο και παίζουν κεντρικό ρόλο στην προσαρμοστική και έμφυτη ανοσοαποκρίσεων. Κατά την έκθεση του αντιγόνου στο επιθήλιο, ΑΧ μεταναστεύσουν σε λεμφαδένες παροχέτευσης και έχουν δειχθεί ότι είναι αναγκαία για την επαγωγή Th2 αποκρίσεων σε πολλά αντιγόνα με διέγερση παρθένα κύτταρα Τ κατά τη διάρκεια της ευαισθητοποίησης καθώς και τη διατήρηση προσαρμοστική απόκριση των κυττάρων Th2 [1,2].

Είναι γνωστό ότι το άσθμα σχετίζεται με την αύξηση της οξύτητας των αεραγωγών, φτάνοντας ρΗ 5,2 υπό σοβαρές ασθματικές καταστάσεις [3-5], λόγω της συσσώρευσης των φλεγμονωδών κυττάρων σε περιβρογχικές και περιαγγειακή χώρους, όπου η διέγερση της γλυκόλυσης και της αναπνευστικής έκρηξη μπορεί να προκαλέσει την παραγωγή του γαλακτικού και πρωτονίων [6]. Υπό τέτοιες σοβαρές όξινο ρΗ, το πρωτόνιο ανίχνευσης καψαϊκίνη ευαίσθητο κανάλι TRPV1 και /ή οξύ ανίχνευσης διαύλων ιόντων σε αισθητήρια νεύρα έχουν προταθεί ότι εμπλέκεται στην έναρξη και την ανάπτυξη των ασθματικών συμπτωμάτων [4,7].

Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι οι υποδοχείς OGR1-οικογένεια συζευγμένου με πρωτεΐνη (GPCRs), συμπεριλαμβανομένων των OGR1, συζευγμένου με πρωτεΐνη receptor4 (GPR4), και Τ-κυτταρικό θάνατο που σχετίζεται γονίδιο 8 (TDAG8), τα οποία ήταν προηγουμένως προτείνεται ως υποδοχείς για λυσολιπίδια, όπως sphingosylphosphorylcholine (SPC), αίσθηση εξωκυτταρικής οξίνισης μέσω υπόλειμμα ιστιδίνης [8-10], με αποτέλεσμα την διέγερση μιας ποικιλίας οδών ενδοκυτταρικής σηματοδότησης μέσω ετεροτριμερών πρωτεΐνες G [11-13]. OGR1 συνδέεται με την φωσφολιπάση C και Ca

2+ μονοπάτια σηματοδότησης και μεσολαβεί μια ποικιλία όξινων δράσεων ρΗ που προκαλείται σε αεραγωγών λείων μυϊκών κυττάρων [14-16] και άλλους τύπους κυττάρων [17,18]. Επιπλέον, OGR1 έχει δειχθεί ότι εκφράζεται σε επιθηλιακά κύτταρα [19], τα μακροφάγα [20], και ουδετερόφιλα [21]. Έτσι, OGR1 δυνητικά εμπλέκονται στην παθογένεση της ασθματικής αποκρίσεων. Ωστόσο, οι ρόλοι των OGR1 στην επαγωγή καρδινάλιος αποκρίσεων σε φλεγμονή των αεραγωγών δεν έχουν ακόμα αναφερθεί in vivo. Στην παρούσα μελέτη, δείχνουμε ότι OGR1-ανεπαρκή ποντίκια είναι ανθεκτικά στην ηωσινοφιλική φλεγμονή των αεραγωγών και AHR σε σχέση με την άγριου τύπου (WT) ποντίκια τουλάχιστον εν μέρει μέσω της μεταβολής της δραστηριότητας μετανάστευσης DC.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Αυτή η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε αυστηρά σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές της Επιτροπής Animal Care και πειραματισμός του Πανεπιστημίου Γκούνμα, και όλα τα ζώα είχαν εκτραφεί στο Ινστιτούτο Ζωικής Εμπειρία Ερευνών του Πανεπιστημίου Γκούνμα. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Φροντίδας Ζώων και πειραματισμός του Πανεπιστημίου Γκούνμα (Αριθμός Άδειας: 11-019). Όλες οι χειρουργικές επεμβάσεις έγινε υπό αναισθησία πεντοβαρβιτάλης νατρίου, και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία.

Ποντίκια

Έχουμε δημιουργήθηκε πρόσφατα OGR1 ανεπάρκεια C57BL /6 ποντίκια [22]. Θηλυκά ποντίκια με στοχευμένες διατάραξη της OGR1 (

OGR1

– /- ποντίκια

) διασταυρώθηκαν για δέκα γενιές σε ένα BALB /c γενετικό υπόβαθρο. BALB /c

OGR1

– /-

ποντίκια και των αδερφών τους (

OGR1

+ /+

ή WT) χρησιμοποιήθηκαν σε 5-6 εβδομάδες της ηλικίας. Οι ποντικοί στεγάστηκαν κάτω από ειδικές συνθήκες ελεύθερες παθογόνων και διατηρήθηκαν σε ΟνΑ χωρίς δίαιτα.

Ευαισθητοποίηση και Airway Πρόκληση

OGR1

– /-

και

OGR1

+ /+

(ή WT) ποντίκια ανατεθεί στις ακόλουθες δύο ομάδες: PBS /PBS ομάδα ή ομάδα ελέγχου, ενδοπεριτοναϊκή ευαισθητοποίηση με PBS και η πρόκληση των αεραγωγών με PBS, και OVA ευαισθητοποίηση /ομάδα πρόκληση, ενδοπεριτοναϊκή ευαισθητοποίηση με OVA και η πρόκληση των αεραγωγών με OVA. Ευαισθητοποίηση και πρόκληση με ΟνΑ διεξήχθησαν όπως περιγράφεται [23]. Εν συντομία, οι ποντικοί ευαισθητοποιούνται με ενέσεις 10 μg OVA (Βαθμός V) (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ), μαζί με 1 mg υδροξειδίου αργιλίου (Alu-Gel-S? SERVA, Heidelberg, Germany) χρησιμοποιείται ως ένα πρόσθετο σε 0,2 ml, κατά τις ημέρες 0 και 14. οι ποντικοί προκλήθηκαν στη συνέχεια μέσω των αεραγωγών με έκθεση εισπνοής σε αερολύματα ΟνΑ (1% σε PBS) για 20 λεπτά κατά τις Ημέρες 28, 29, και 30. την Ημέρα 32, οι αποκρίσεις αεραγωγών αξιολογήθηκαν.

AHR

AHR μετρήθηκε από τις δύο έμμεση μη επεμβατική και άμεσες επεμβατικές μεθόδους σε ποντικούς 48 ώρες μετά την τελική πρόκληση OVA. Στην έμμεση μη επεμβατική μέθοδο [24], η αντιδραστικότητα με μεταχολίνη εκτιμήθηκε σε ολόκληρο πληθυσμογράφο σώματος (Buxco Electronics, Inc, Τροία, NY). Εν συντομία, φυσιολογικό ορό ή μεθαχολίνη δόθηκε από αεροζόλ μέσω μιας εισόδου του θαλάμου για 3 λεπτά. Οι αναγνώσεις άρχισαν στα 3 λεπτά και συνεχίστηκε για 10 λεπτά. προσδιορίστηκαν οι μέγιστες τιμές των 5 λεπτών κατά μέσο όρο ενισχυμένη παύση (Penh). Penh ορίζεται ως μια αξιολόγηση των μεταβολών στο σχήμα του προτύπου ροής αέρα που εισέρχονται και εξέρχονται ένα πληθυσμογράφο ροή σε ολόκληρο το σώμα, όπως ένα ζώο αναπνέει. Τα δεδομένα εκφράζονται ως επί τοις εκατό μεταβολή από την αρχική τιμές που ελήφθησαν μετά την εισπνοή του φυσιολογικού ορού. Δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στις τιμές βασικής γραμμής μεταξύ των διαφορετικών ομάδων. Για επεμβατική μέτρηση της αντίστασης των πνευμόνων, οι ποντικοί ναρκώθηκαν, τραχειοστομία, και μηχανικό αερισμό. AHR αξιολογήθηκε με μέτρηση μεταβολές στην πνευμονική αντίσταση (RL) σε απόκριση σε εισπνεόμενη μεθαχολίνη, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25]. Τα δεδομένα εκφράζονται ως επί τοις εκατό μεταβολή από την αρχική τιμή RL τιμές που λαμβάνονται μετά την εισπνοή του φυσιολογικού ορού. Δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στις τιμές βασικής γραμμής μεταξύ των διαφορετικών ομάδων στις δύο μεθόδους.

βρογχοκυψελιδική πλύση (BAL)

Οι ποντικοί δέχθηκαν μια θανατηφόρα δόση πεντοβαρβιτάλης (60 mg /kg ίρ) και οι πνεύμονες πλένονται με 1 ml υποπολλαπλάσια του διαλύματος ισορροπημένου άλατος Hanks (HBSS) μέσα από την τραχειοτομή. Το υγρό πλύσης φυγοκεντρήθηκε (300 χ g για 10 λεπτά στους 4 ° C), και το υπερκείμενο υγρό BAL φυλάχθηκε στους -80 ° C πριν από την επακόλουθη δοκιμασία. Το κυτταρικό ίζημα επαναιωρήθηκε σε 1 ml HBSS. Σύνολο μετρήσεις κυττάρων εκτελέστηκαν με την προσθήκη 50 μΙ του κυτταρικού εναιωρήματος σε 50 μΙ Kimura λεκέ, και τα κύτταρα μετρήθηκαν σε ένα θάλαμο Neubauer υπό μικροσκόπιο φωτός. Διαφορικές μετρήσεις κυττάρων πραγματοποιήθηκαν σε παρασκευάσματα κυτταροσπίν, παρασκευάστηκαν με φυγοκέντρηση στις 500 rpm για 5 λεπτά και χρώση με May-Grünwald-Giemsa χρώση. Τα κύτταρα ταυτοποιήθηκαν ως μακροφάγα, ουδετερόφιλα, ηωσινόφιλα, λεμφοκύτταρα και σύμφωνα με το πρότυπο μορφολογία. Τριακόσια κύτταρα μετρήθηκαν υπό μεγέθυνση × 400, και το ποσοστό και ο απόλυτος αριθμός των κάθε κυτταρικό τύπο υπολογίστηκαν.

ιστολογικές μελέτες

Lung τμήματα από διαφορετικές πειραματικές ομάδες ποντικών παρασκευάστηκαν και αναλύθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26]. Εν συντομία, τα αριστερά πνεύμονες μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη και εγκλείστηκαν σε παραφίνη. Τα τμήματα (4 μm) βάφτηκαν με περιοδικό οξύ-Schiff (PAS) για την αναγνώριση των κυττάρων που εκκρίνουν βλέννα-(λαγηνοειδή κύτταρα) των αναπνευστικών οδών και αντίθετα με αιματοξυλίνη. Τα βαμμένα κύτταρα λαγηνοειδών καταμετρήθηκαν σε μεγάλου διαμετρήματος προτελικά βρόγχοι τουλάχιστον τρία τμήματα του πνεύμονα που λαμβάνεται από κάθε ζώο. Το μήκος του βασικού πετάλου των αντίστοιχων βρόγχων μετρήθηκε με Image J (National Institutes of Health). Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως ο μέσος όρος των PAS θετικών λαγηνοειδών κυττάρων σε βρόγχο ανά χιλιοστό του βασικής μεμβράνης. Ο βαθμός περιβρογχικές και περιαγγειακή φλεγμονή (βαθμολογία φλεγμονής) αξιολογήθηκε σε μία υποκειμενική κλίμακα από το 0 έως 3, όπως περιγράφεται [27]. Τρεις ανεξάρτητες τυφλές ερευνητές βαθμολογούνται τη βαθμολογία φλεγμονής. Η τιμή 0 αποδόθηκε όταν δεν φλεγμονή ήταν ανιχνεύσιμη, μια τιμή 1 ανατέθηκε για περιστασιακή cuffing με φλεγμονώδη κύτταρα, μία τιμή 2 ανατέθηκε για τους περισσότερους βρόγχους ή σκάφη που περιβάλλονται από ένα λεπτό στρώμα (ένα έως πέντε κελιά πάχος) των φλεγμονωδών κύτταρα και η τιμή 3 δόθηκε όταν οι περισσότεροι βρόγχοι ή σκάφη που περιβάλλεται από ένα παχύ στρώμα (περισσότερο από πέντε κύτταρα πάχος) των φλεγμονωδών κυττάρων.

Δημιουργία μυελό οστών δενδριτικά κύτταρα (BMDCs)

ΑΧ παρήχθησαν από τα κύτταρα του μυελού των οστών του WT ή

OGR1

– /-

ποντικούς σύμφωνα με τη διαδικασία που περιγράφηκε προηγουμένως [28]. Εν συντομία, τα κύτταρα του μυελού των οστών που λαμβάνονται από μηρούς και κνήμες ποντικών τοποθετήθηκαν σε μέσο RPMI 1640 (ρΗ 7.4) που περιέχει 10% FBS με ανασυνδυασμένο GM-CSF ποντικού (10 ng /ml? Κ &? D Systems) και ανασυνδυασμένου ποντικού IL-4 (10 ng /ml? Κ &? D Systems). Το μέσο καλλιέργειας αλλάχθηκε με το ίδιο μέσο με αυτές τις κυτοκίνες κάθε δύο ημέρες. Την ημέρα 7, τα κύτταρα σημάνθηκαν με 100 μg /ml OVA (Grade V από την Sigma-Aldrich) για 24 ώρες στο ίδιο μέσο καλλιέργειας με FBS, GM-CSF, και IL-4. Σημειώνεται ότι το μέσο ρΗ 7.4 ήταν ελαφρώς οξινίστηκε σε 7,2 σε 6 ώρες και 7,0 στις 24 ώρες μετά την καλλιέργεια των κυττάρων με ΟνΑ σε ένα υγροποιημένο αέρα /CO

2 (19: 1). Η μεταβολή στο μέσο ρΗ μπορεί να είναι εν μέρει σχετίζονται με την ωρίμανση των DC με ωάρια που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη, η οποία περιέχει μια χαμηλή ποσότητα LPS [29]. Για να διατηρηθεί το ρΗ σε σταθερή κατάσταση, καλλιεργήσαμε τα κύτταρα στο μέσο που περιέχει 20 mM HEPES? Ωστόσο, έχουμε παρατηρήσει ότι η επίδραση της ΟνΑ παλμού για την έκφραση του CCR7 είναι εξασθενημένο. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιούνται εμπορικώς διαθέσιμα μέσο RPMI 1640 χωρίς επιπλέον ρυθμιστικό παραγόντων σε in vitro πειράματα, εκτός από το βραχυπρόθεσμο Ca

2+ απόκριση όπως φαίνεται παρακάτω. Όταν άλλαξε το ρΗ μέσο, ​​HCl ή ΝαΟΗ προστέθηκε στο μέσο καλλιέργειας.

Έγκριση Πείραμα με BMDCs

Αυτό διεξήχθη όπως περιγράφεται [30]. Εν συντομία, BMDCs παρασκευάζεται από WT ή OGR1-ανεπαρκή ποντίκια ευαισθητοποιήθηκαν με ΟνΑ ή του φορέα της (PBS) 24 ώρες πριν από τα πειράματα υιοθεσία. OVA-παλμική BMDCs (1 Χ 10

6 κύτταρα σε 40 μΐ PBS) ενσταλάχθηκαν σε ποντικούς WT μέσω της τραχείας. Δέκα ημέρες αργότερα, τα ποντίκια εκτέθηκαν σε εναιώρημα ΟνΑ (1% σε PBS) για 20 min /ημέρα για τρεις διαδοχικές ημέρες? 48 ώρες μετά την τελευταία πρόκληση, AHR αξιολογήθηκε και λήφθηκε υγρό BAL. Έτσι, το πείραμα υιοθέτηση αφέθηκε να ανιχνεύσει σημαντική ασθματικών αντιδράσεων σε 14 ημέρες, η οποία είναι πολύ μικρότερη από το χρόνο (32 ημέρες) που απαιτείται για την ανίχνευση των αποκρίσεων των αεραγωγών από την τακτική in vivo ΟνΑ πρωτόκολλο ευαισθητοποίηση /πρόκληση. Αυτό μπορεί να οφείλεται στην in vitro αποτελεσματική ευαισθητοποίηση των DCs με ΟνΑ στα πειράματα υιοθέτηση DC.

BMDC Μετανάστευση Δοκιμασία in vivo

Για να μελετηθεί η κατανομή των εγχέεται BMDCs, τα κύτταρα παρασκευάστηκαν από WT ή OGR1-ανεπαρκή ποντίκια και πάλλεται με PBS ή ΟνΑ όπως περιγράφεται παραπάνω. Τα κύτταρα σημάνθηκαν με 10 μg /ml καρβοξυφλουοροσκεϊνης ηλεκτριμιδυλεστέρας διοξικής εστέρα (CFSE) (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) για 10 λεπτά στους 37 ° C σε RPMI 1640 που περιέχει 0.5% BSA (κλάσμα V) (Sigma-Aldrich) . Τέσσερις ομάδες των επισημασμένων κυττάρων (PBS-θεραπεία WT DC, PBS-θεραπεία OGR1 ανεπάρκεια DC, OVA επεξεργασμένο WT DC, και ωάρια που έλαβαν OGR-1 ανεπάρκεια DC) ενσταλλάχθηκαν ενδοτραχειακά σε 3 αφελείς WT ποντίκια για κάθε ομάδα. Οι περιβρογχικές λεμφαδένων από 3 ποντικούς συλλέχθηκαν ανά κάθε ομάδα και CFSE

+ DCs μεταναστεύουν στις περιβρογχικές λεμφαδένες κατά τη διάρκεια 96 h αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [30]. Παρόμοια πειράματα εκτελέστηκαν 3 φορές. δραστηριότητα μετανάστευση εκφράστηκε ως ποσοστό του CFSE

+ ΑΧ (CFSE

+ CD 11 c

+) ανά συνολικό κύτταρα εφαρμόζονται.

δραστικότητα μετανάστευσης

DC αξιολογήθηκε περαιτέρω με προσδιορισμό πέλματος ποδός, στην οποία OVA-παλμική BMDCs σημάνθηκαν με CFSE όπως περιγράφεται και κύτταρα ενέθηκαν υποδορίως στην πατούσα των ποντικών WT. Η μετανάστευση των κυττάρων εντός ιγνυακοί λεμφαδένες αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής 24 ώρες μετά την ένεση των κυττάρων.

Μέτρηση κυτταροκινών και IgE

επιπέδων κυτοκίνης σε υγρό BAL μετρήθηκαν με Bio-Plex Σύστημα ανάρτησης Array (Nippon Bio-Rad Laboratories, Tokyo, Japan) για την ΙΡΝ-γ, IL- 4, και IL-5 και με κιτ ELISA (eBioscience, San Diego, CA) για IL-13, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα επίπεδα πλάσματος του OVA-ειδικών IgE μετρήθηκαν με DS ποντικού IgE ELISA (OVA) κιτ (DS Pharma Biomedical, Osaka, Japan), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23].

Μέτρηση των mRNAs

Ολικό RNA απομονώθηκε και αντίστροφη μεταγραφή χρησιμοποιώντας τυχαία εκκίνηση και Multiscribe αντίστροφης μεταγραφάσης (Applied Biosystems, Foster City, CA). Τα mRNAs μετρήθηκαν με μια ποσοτική πραγματικού χρόνου TaqMan PCR με Mx3000P πραγματικό χρόνο PCR System (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) με τη χρήση ειδικών ανιχνευτών για OGR1 (Mm01335272), TDAG8 (Mm00433695), GPR4 (Mm00558777), G2A (Mm00490809 ), CCR7 (Mm01301785), και GAPDH (4352932E), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14].

Μέτρηση του ενδοκυτταρικού Ca

2+ Συγκέντρωση

Τα μη παλμική BMDCs συλλέχθηκαν από 10-cm πιάτα με 4 mM EDTA /PBS και επισημάνθηκαν με fura2 /ΑΜ. Ενδοκυτταρικού Ca

2+ συγκέντρωση ([Ca

2 +]

i) μετρήθηκε σε κυτταρικό εναιώρημα υπό ήπια ανάδευση κατάστασης σε ΗΕΡΕδ-ρυθμισμένο μέσο με βάση την αλλαγή σε fura-2 φθορισμό όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14 ]. Η ΗΕΡΕδ-ρυθμισμένο μέσο αποτελείτο από 20 mM HEPES (ρΗ 7,4), 134 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM ΚΗ

2 ΡΟ

4, 1,2 mM MgSO

4, 2 mM ΟαΟ

2 , 2,5 mM NaHCO

3, 5 mM γλυκόζη και 0,1% BSA. Το ρΗ του μέσου ρυθμίστηκε με την προσθήκη κατάλληλης ποσότητας HCI.

Κυτταρομετρίας Ροής

BMDCs βάφτηκαν με μονοκλωνικά αντισώματα συζευγμένα με ΡΕ (mAbs) αραιωμένο σε PBS που περιέχει 1% BSA ( ρυθμιστικό FACS). Η ΡΕ-συζευγμένα Abs, συμπεριλαμβανομένων των αντι-Οϋ11ο και αντι-CCR7, και έλεγχος ισότυπου ελήφθησαν από BD Biosciences, San Diego, CA. Μετά από επώαση με Abs για 10 λεπτά στους 4 ° C, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με ρυθμιστικό FACS και αναλύθηκαν με κυτταρόμετρο ®FACScan ροής χρησιμοποιώντας λογισμικό CellQuest (Becton Dickinson, Mountain View, CA).

In vitro δοκιμασία μετανάστευσης

Την ημέρα 7, WT ή

OGR1

– /-

BMDCs επωάστηκαν με ή χωρίς OVA (100 μg /ml) όπως περιγράφεται παραπάνω. Μετά από 24 ώρες, τα καλλιεργημένα κύτταρα συλλέχθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε RPMI 1640 μέσο σε ρΗ 7.4 με 0.1% BSA. Τα κύτταρα (4 χ 10

5) προστέθηκαν στην κορυφή ενός ενθέτου καλλιέργειας Transwell με διάμετρο 8 mm και 5-μm μέγεθος πόρου chemotaxicell (Kurabo, Osaka, Japan). Οι παράγοντες δοκιμής προστέθηκαν στο κάτω διαμέρισμα των πλακών 24 φρεατίων. Ο αριθμός των κυττάρων που μετανάστευσαν στο κατώτερο θάλαμο εντός 2,5 h προσδιορίστηκε από την αλλαγή του φθορισμού με CyQUANT GR Dye (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) μετά από λύση των κυττάρων.

Στατιστική Ανάλυση

Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις διπλούν ή εις τριπλούν. Τα αποτελέσματα των πολλαπλών παρατηρήσεις που παρουσιάζονται ως μέσος όρος + SEM ή ως αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα από περισσότερες από τρεις διαφορετικές παρτίδες των κυττάρων, εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά. Σε πειράματα vivo, εμείς συνήθως εκτέλεσε τέσσερις να έξι ποντικοί ανά ομάδα σε κάθε πείραμα και διεξάγονται δύο ή τρεις φορές τα ίδια πειράματα. Για την παρουσίαση των αποτελεσμάτων των in vivo μελέτη, συνήθως σε συνδυασμό όλα τα αποτελέσματα, εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά. Όλες οι στατιστικοί υπολογισμοί πραγματοποιήθηκαν με GraphPad Prism 5 (La Jolla, Calif). ANOVA χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστούν τα επίπεδα της διαφοράς μεταξύ όλων των ομάδων. Συγκρίσεις για όλα τα ζεύγη έγιναν με αταίριαστα Φοιτητής

t

τεστ. Η τιμή του

σ

& lt? 0.05 θεωρήθηκε σημαντική.

Αποτελέσματα

Δημιουργία OGR1

– /- ποντίκια Balb /C

Για να κατανοήσουμε το ρόλο της OGR1 σε ασθματικούς φλεγμονή των αεραγωγών, δημιουργήσαμε OGR1 ανεπάρκεια BALB /c ποντίκια. έκφραση OGR1 mRNA παρατηρείται σε πνεύμονες από ποντικούς WT, αν και τα επίπεδα έκφρασης δεν είναι τόσο υψηλές όσο εκείνες των άλλων πρωτονίων ανίχνευσης GPCRs (Σχήμα 1). Στο βρογχικό άσθμα μοντέλο, τα ποντίκια ευαισθητοποιήθηκαν με ενδοπεριτοναϊκή ένεση ΟνΑ σε στυπτηρία ανοσοενισχυτικό δύο φορές και προκλήθηκαν με OVA αεροζόλ τρεις φορές (βλέπε Εικόνα 2Α), με αποτέλεσμα 2,5 φορές αύξηση στην έκφραση mRNA OGR1 στους πνεύμονες (Σχήμα 1). Μια τέτοια σημαντική αύξηση στην έκφραση mRNA δεν παρατηρήθηκε σε άλλες GPCRs πρωτονίων αίσθησης. Όπως αναμενόταν, η έκφραση mRNA OGR1 ήταν εντελώς χαθεί, ενώ άλλες οικογενειακές OGR1 έκφραση GPCR mRNA ήταν αμετάβλητη, στους πνεύμονες του

OGR1

– /-.

Ποντίκια, ανεξάρτητα από την αγωγή ΟνΑ (Σχήμα 1)

WT και

OGR1

– /-

ποντίκια ευαισθητοποιήθηκαν από OVA /στυπτηρία και αμφισβητήθηκε από OVA. Για nonsensitized ποντίκια, PBS εγχύθηκε και εισπνέονται. έκφραση Lung mRNA του OGR1 και άλλων GPCRs πρωτονίων ανίχνευσης μετρήθηκε 48 ώρες μετά την τελευταία πρόκληση αντιγόνου. Τα αποτελέσματα είναι μέσες + SEM της 9ης προσδιορισμών από τρία ξεχωριστά πειράματα. * Η επίδραση της OVA αναρρόφησης (WT-PBS εναντίον WT-OVA) ήταν σημαντική.

§The έκφραση OGR1 mRNA ήταν μη ανιχνεύσιμο.

Η

(Α) OVA ευαισθητοποίηση και την πρόκληση του πρωτοκόλλου. WT και

OGR1

– /-

ποντίκια ευαισθητοποιήθηκαν με ε.π. έγχυση OVA /στυπτηρία και προκλήθηκαν από αεροζόλ OVA (τρίγωνο). Για nonsensitized ποντίκια, PBS εγχύθηκε και εισπνέονται (κύκλος). AHR στο εισπνεόμενη μεθαχολίνη εκτιμήθηκε από τις αλλαγές στο μη επεμβατικό Penh (Β) και της δυναμικής αντίστασης (C) 48 ώρες μετά την έκθεση τελευταίο αντιγόνο. Τα δεδομένα είναι μέσοι + SEM του

n

= 13-16 ανά ομάδα. *

σ

& lt? 0.05 (WT-OVA εναντίον OGR1

– /- OVA).

Η

OGR1 Ανεπάρκεια εξασθενεί AHR και φλεγμονή των αεραγωγών σε ΟνΑ ευαισθητοποιημένους ποντικούς

Οι παθοφυσιολογικές ρόλοι των OGR1 στο βρογχικό άσθμα χαρακτηρίστηκαν χρησιμοποιώντας το μοντέλο OVA άσθμα (Σχήμα 2Α). Εκτιμήσαμε πρώτα μια αύξηση στην ενισχυμένη παύση (Penh) χρησιμοποιώντας βαρομετρικό πληθυσμογραφίας ολόκληρου του σώματος ως δείκτης της συστολής των αεραγωγών σε απόκριση σε αυξανόμενες δόσεις μεθαχολίνης (Σχήμα 2Β). Η εισπνεόμενη μορφή αερολύματος μεταχολίνης είναι γνωστό ότι προκαλεί βρογχοσυστολή. OVA ευαισθητοποίηση /πρόκληση αυξήθηκε σαφώς Πενχ σε απάντηση μεταχολίνη σε ποντίκια WT? Ωστόσο, ο AHR σε ΟνΑ ευαισθητοποίηση /πρόκληση ήταν σημαντικά εξασθενημένος σε OGR1-ανεπαρκή ποντίκια στο επίπεδο εκείνης των ποντικών ευαισθητοποιούνται και προκλήθηκαν με PBS μόνο (Σχήμα 2Β). Δεδομένου ότι η μέτρηση της Πενχ ως AHR είναι αμφιλεγόμενη [31-33], μετρήσαμε την αντίσταση των πνευμόνων με άμεση επεμβατική μέθοδο, καθώς και. Σταθερά με τα αποτελέσματα του Penh, OVA ευαισθητοποίηση /πρόκληση αύξησε την αντίσταση των πνευμόνων σε απόκριση προς μεταχολίνη σε ποντικούς WT και ανεπάρκεια OGR1 εξασθένησε την OVA-επαγόμενη αύξηση της αντίστασης των πνευμόνων με το επίπεδο αυτό του ποντικούς ελέγχου ευαισθητοποιούνται και προκλήθηκαν με PBS (Σχήμα 2C ).

OVA ευαισθητοποίηση /πρόκληση προκαλούνται πυκνή περιβρογχικές και περιαγγειακή συσσώρευση φλεγμονωδών κυττάρων, καθώς και μεταπλασία και βλέννα υπερπαραγωγή των τοιχωμάτων των αεραγωγών σε ποντικούς WT (Σχήμα 3Α και Β). Αυτές οι αλλαγές ήταν ελάχιστες σε OGR1-ανεπαρκή ποντίκια με OVA ευαισθητοποίηση /πρόκληση (Σχήμα 3Α). Ο βαθμός μεταπλασία λαγηνοειδών κυττάρων και βλέννα υπερπαραγωγή εκτιμήθηκε με χρώση PAS, το οποίο προσδιορίστηκε ποσοτικά ως αριθμοί κυττάρων ΡΑδ ανά μήκος του βασικού υμένα (mm) (Σχήμα 3C). Διεγείρεται χρώση PAS με OVA ευαισθητοποίηση /πρόκληση ανεστάλη σημαντικά από την έλλειψη OGR1. Όσο για το περιβρογχικές και περιαγγειακή φλεγμονή, ο βαθμός της συσσώρευσης των φλεγμονωδών κυττάρων εκτιμήθηκε ως βαθμολογία φλεγμονής (Σχήμα 3D και Ε), η οποία έδειξε ότι OGR1 ανεπάρκειας ανέστειλαν σημαντικά τη συσσώρευση OVA ευαισθητοποίηση /πρόκληση επαγόμενη φλεγμονωδών κυττάρων. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι OGR1 εμπλέκεται στην υπερπλασία των καλυκοειδών κυττάρων και περιβρογχικές και περιαγγειακή φλεγμονή.

Οι ποντικοί ευαισθητοποιήθηκαν και προκλήθηκαν με OVA ή PBS όπως περιγράφεται στο Σχήμα 2. (Α) Η ιστολογική ανάλυση των τμημάτων του πνεύμονα διεξήχθη 48 ώρες μετά την τελευταία έκθεση αντιγόνου. Τα τμήματα αιματοξυλίνη και ΡΑδ που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών τμημάτων του πνεύμονα ανά ποντικό από 5 έως 6 ποντικούς σε κάθε ομάδα. μπαρ κλίμακα, 200 μm. (Β) Η μεγαλύτερη μεγέθυνση της εικόνας της πλατείας WT-OVA εμφανίζεται. υπερπλασία των κυττάρων (C) Goblet ποσοτικοποιήθηκε ως αριθμός PAS-χρώση κυττάρων (C), και ο βαθμός περιβρογχικές φλεγμονής (D) και περιαγγειακή φλεγμονή (Ε) αξιολογήθηκε σε μία υποκειμενική κλίμακα από το 0 έως 3 ως φλεγμονώδεις σκορ, χρησιμοποιώντας το ίδια τμήματα όπως αυτά που χρησιμοποιούνται στο (Α). Ο σχεδιασμός στήλη προσδιορίζει κάθε ομάδα (D) και (Ε) είναι τα ίδια με εκείνα στο (C). Επιπτώσεις της ανεπάρκειας OGR1 (WT-OVA εναντίον OGR1

– /- OVA) ήταν σημαντική (*

σ

& lt? 0,05) σε όλο το σχήμα

Η

Αναλύσαμε. οι αριθμοί και πληθυσμός των κυττάρων που υπάρχουν στα υγρά BAL (Σχήμα 4Α και Β). Τα αύξησε τον συνολικό αριθμό κυττάρων σε ποντίκια με ΟνΑ ευαισθητοποίηση /πρόκληση ήταν σημαντικά μειωμένη σε OGR1-ανεπαρκή ποντίκια σε σχέση με τα ποντίκια WT. Διαφορικές μετρήσεις κυττάρων αποκάλυψε την εξέχουσα πρόσληψη ηωσινόφιλα σε υγρά BAL στο WT ποντίκια με OVA ευαισθητοποίηση /πρόκληση, η οποία ήταν εξαιρετικά μειωμένη σε OGR1-ανεπαρκή ποντίκια με τις ίδιες θεραπείες. Η περιεκτικότητα των λεμφοκυττάρων σε υγρά BAL μειώθηκε επίσης σημαντικά από την ανεπάρκεια OGR1. Δεν υπήρχε σημαντική επίδραση της ανεπάρκειας OGR1 σχετικά με τον αριθμό των μακροφάγων και ουδετερόφιλων.

Οι ποντικοί ευαισθητοποιήθηκαν και προκλήθηκαν με OVA ή PBS όπως περιγράφεται στο Σχήμα 2. BAL υγρό αναλύθηκε 48 ώρες μετά την τελευταία έκθεση αντιγόνου για συνολικό αριθμό των κυττάρων και το προφίλ των κυτταρικών τύπων. Αντιπροσωπευτικές εικόνες των φλεγμονωδών κυττάρων (Α) και ο αριθμός των διαφορικών κυττάρων (Β) σε υγρά BAL. Αιχμές βελών και τα βέλη παριστούν μακροφάγα και ηωσινόφιλα, αντίστοιχα. μπαρ κλίμακα, 200 μm. Mac, μακροφάγων? Lym, λεμφοκυττάρων? Eos, ηωσινόφιλα? και Neu, ουδετερόφιλα. Τα δεδομένα είναι μέσοι + SEM του

n

= 10-12 ανά ομάδα. Οι ίδιες BAL υγρά χρησιμοποιήθηκαν για τη μέτρηση της IL-4, IL-5, IL-13, και IFN-γ (C). Τα δεδομένα είναι μέσοι + SEM του

n

= 10-12 ανά ομάδα. Το πλάσμα συλλέχθηκε για μέτρηση της ΟνΑ-ειδικών επίπεδα IgE μετά τη συλλογή του υγρού BAL (D). Τα δεδομένα είναι μέσοι + SEM του

n

= 6-15 ανά ομάδα. Ο σχεδιασμός στήλη προσδιορίζει κάθε ομάδα (C) και (D) είναι οι ίδιες με εκείνες στο (Β). Οι επιπτώσεις της ανεπάρκειας OGR1 (WT-OVA εναντίον OGR1

– /- OVA) ήταν σημαντική (*

σ

& lt? 0,05) σε όλο το σχήμα

Η

Για να. αξιολόγησε τους μηχανισμούς της μειωμένης AHR, ηωσινοφιλία, και μεταπλασία λαγηνοειδών κυττάρων, Th1 /Th2 κυτοκινών στα υγρά BAL μετρήθηκαν με ELISA (Σχήμα 4C). OVA ευαισθητοποίηση /πρόκληση επάγεται σημαντικές αυξήσεις στην Th2 κυτοκίνες, συμπεριλαμβανομένων των IL-4, IL-5 και IL-13, και Th1 κυτοκίνης ΙΡΝ-γ σε ποντικούς WT. Η περιεκτικότητα σε κυτοκίνη Th2 σε υγρά BAL ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε OGR1-ανεπαρκή ποντίκια από ό, τι σε ποντικούς WT. Από την άλλη πλευρά, η ευαισθητοποίηση /πρόκληση επαγόμενη αύξηση OVA της παραγωγής IFN-γ δεν επηρεάστηκε από την ανεπάρκεια OGR1 (Σχήμα 4C). Τα επίπεδα πλάσματος της IgE ειδικών για OVA ήταν επίσης παρεμποδίζεται από ανεπάρκεια OGR1 ωαρίων ευαισθητοποίηση /προκλήθηκαν ποντίκια (Εικόνα 4D).

DCs εκφράζουν λειτουργική OGR1

Τα in vivo αποτελέσματα που περιγράφονται παραπάνω υποδεικνύουν ότι OGR1 παίζει ένα ρόλο στη διαδικασία ή ανάντη διεργασία επαγωγής της Th2 απόκρισης στην παθογένεια του άσθματος αεραγωγών. Θεωρούμε ότι οι λειτουργίες DC ρυθμίζονται από OGR1. Δεν έχει υπάρξει καμία προηγούμενη έκθεση σχετικά με την έκφραση OGR1 και τις λειτουργίες του σε ΑΧ. Δεδομένου ότι αντισώματα ειδικά για OGR1 δεν ήταν διαθέσιμα, το επίπεδο έκφρασης OGR1 εκτιμήθηκε με μέτρηση του mRNA (Σχήμα 5Α). Επιβεβαιώσαμε την έκφραση OGR1 mRNA αξιολογείται από πραγματικού χρόνου TaqMan PCR σε ανώριμα BMDCs των ποντικών WT. Είναι ενδιαφέρον ότι, η έκφραση του mRNA του OGR1 ήταν ελαφρώς αλλά αυξήθηκε σημαντικά με OVA ευαισθητοποίηση (Σχήμα 5Α). Όπως ήταν αναμενόμενο, η έκφραση OGR1 mRNA ήταν εντελώς χαθεί σε ΑΧ, ανεξάρτητα από το OVA ευαισθητοποίησης σε

OGR1

– /-

ποντίκια (Εικόνα 5Α). Μετρήσαμε επίσης την έκφραση των mRNA των άλλων πρωτονίων-αισθητήρια GPCRs σε ΑΧ. Σε αντίθεση με τα δείγματα πνεύμονα (Σχήμα 1), η έκφραση GPR4 ήταν πολύ χαμηλή σε DCs ανεξαρτήτως του παλμού ΟνΑ (Σχήμα S1). Από την άλλη πλευρά, παρόμοια με OGR1, TDAG8 και έκφραση G2A mRNA αυξήθηκε σημαντικά από την OVA ευαισθητοποίηση (Σχήμα S1).

DCs εκφράζουν OGR1 mRNA και λειτουργική δραστηριότητα OGR1. Έκφραση των OGR1 mRNA σε ΑΧ και την αύξηση της από OVA αναρρόφησης (Α). Η έκφραση του mRNA OGR1 εκτιμήθηκε με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR TaqMan. Τα δεδομένα είναι μέσοι ± SEM από 9 προσδιορισμών από τρία ξεχωριστά πειράματα. Επίδραση της OVA αναρρόφησης (WT-PBS εναντίον WT-OVA) ήταν σημαντική (*

σ

& lt? 0,05).

§The έκφραση OGR1 mRNA ήταν μη ανιχνεύσιμο. επάγει την αύξηση της οξύτητας [Ca

2 +]

i αυξήσει μέσω της OGR1 /G

q /11-πρωτεΐνης σε δενδριτικά κύτταρα (Β και Γ). DC προετοιμάστηκαν από την WT και

OGR1

– /-

ποντίκια και επωάζονται για την παρακολούθηση της [Ca

2 +]

i αξιολογείται από την αλλαγή στην Fura-2 φθορισμός. Τα κύτταρα προεπωάστηκαν σε εναιώρημα σε ρΗ 7,4 και, κατά το βέλος, HCl (τελικό ρΗ 7.0) ή ΑΤΡ (100 μΜ) προστέθηκε. Για να αξιολογηθεί ο ρόλος του G

q /11-πρωτεΐνης, το κυτταρικό εναιώρημα υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ΥΜ-254 890 (100 ηΜ) (ή DMSO ως όχημα). Ένας εκπρόσωπος ίχνος [Ca

2 +]

αλλάξω φάνηκε (Β). Καθαρή [Ca

2 +]

i αλλάξει (τιμή κορυφής – βασική τιμή) αξιολογήθηκε (C). Βασική αξία της [Ca

2 +]

i σε ρΗ 7,4 ήταν 125 ± 12 nM και η τιμή δεν επηρεάστηκε αισθητά από ανεπάρκεια OGR1. Τα δεδομένα είναι μέσοι ± SEM 8 προσδιορισμών από τέσσερα ξεχωριστά πειράματα. Επίδραση της ανεπάρκειας OGR1 (WT εναντίον OGR1

– /-) ήταν σημαντική (*

σ

& lt? 0,05).

Η

Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η λειτουργική έκφραση OGR1 στο ΑΧ, Ca

2+ απάντηση στην εξωκυττάρια πρωτόνια εξετάστηκε γιατί OGR1 είναι γνωστό ότι σε συνδυασμό με την G

q /11 πρωτεΐνης /φωσφολιπάση C /Ca

2+ μονοπάτια σηματοδότησης σε διάφορους τύπους κυττάρων [8,13-19]. Η οξίνιση του εξωκυτταρικό μέσο σε ρΗ 7.0 αυξήθηκαν σαφώς το ενδοκυτταρικό Ca

2+ συγκέντρωση ([Ca

2 +]

i), η οποία ήταν σχεδόν πλήρως ανασταλεί από την ανεπάρκεια OGR1 και ΥΜ-254 890, ένας ειδικός αναστολέας για G

/11 πρωτεΐνες q (Σχήμα 5Β και C). Η [Ca

2 +]

i απόκριση σε ΑΤΡ, ένα πρόσδεμα για το G

q /11 Ρ2Υ τύπου πουρινεργικούς υποδοχείς που συζευγνύονται με πρωτεΐνη, δεν επηρεάστηκε από την ανεπάρκεια OGR1 (Σχήμα 5Β και C). Έτσι,

OGR1

– /-

ποντίκια δεν δείχνουν μια γενική ελάττωμα G

/πρωτεΐνης q 11 σηματοδότησης. Εξεταστούν από κοινού, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι DCs εκφράζουν λειτουργική σύζευξη OGR1 έως G

q /11 πρωτεΐνες.

Ενδοτραχιακή Μεταφορά OGR1-Ελλιπή ΑΧ Αναπτύσσει Κάτω AHR και ηωσινοφιλία σε σύγκριση με εκείνη των WT ΑΧ

Για να αξιολογήσει τον κρίσιμο ρόλο της OGR1 στις ΑΧ στην παθογένεια του άσθματος, θετών OVA-παλμικό DC πειράματα μεταφοράς διεξήχθησαν. Τα OVA-παλμική ή μη παλμική DCs είχαν ενδοτραχειακά μεταφέρθηκαν σε WT ποντικούς, το οποίο ακολουθήθηκε από OVA εισπνοή 10 ημέρες μετά τη χορήγηση DC (Σχήμα 6Α). AHR μετρήθηκε όπως αυξήσεις στην Penh σε εισπνεόμενη μεθαχολίνη ήταν σημαντικά υψηλότερη στην ενδοτραχειακή μεταφορά του OVA-παλμική DCs από εκείνη του μη-παλμική DCs όταν DC προετοιμάστηκαν από WT ποντικούς (Σχήμα 6Β). Σε αντίθεση, τα ποντίκια που έλαβαν OVA-παλμική OGR1 ανεπάρκεια ΑΧ αναπτύσσονται μικρότερες αυξήσεις σε Πενχ σε σύγκριση με εκείνους που έλαβαν OVA-παλμική WT ΑΧ.

(Α) Πρωτόκολλο του πειράματος έκδοση DC. OVA ή PBS-παλμική BMDCs παρασκευάστηκαν από WT και

OGR1

– /-

ποντίκια και χορηγήθηκε ενδοτραχειακά σε ποντίκια WT. Δέκα ημέρες αργότερα, οι ποντικοί προκλήθηκαν με OVA εισπνοή για 20 λεπτά σε τρεις διαδοχικές ημέρες. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την τελευταία OVA-πρόκληση, AHR να μεθαχολίνη μετρήθηκε ως δραστηριότητες Penh (Β). Μετά τη μέτρηση της ευαισθησίας της αναπνευστικής οδού, BAL υγρά συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν για την καταμέτρηση των συνολικών κυττάρων και διαφοροποιημένων κυττάρων (C). Τα δεδομένα είναι μέσοι + SEM του

n

= 10-12 ανά ομάδα.

#

σ

& lt? 0.05 (DC (WT) -PBS έναντι DC (WT) -OVA) και *

σ

& lt? 0.05 (DC (WT) -OVA έναντι DC (

– /-) – OVA)

Η

Μετρήσαμε επίσης τους αριθμούς και τους τύπους των φλεγμονωδών κυττάρων στο BAL υγρά των ποντικών μεταφέρονται με τις ΑΧ. (Σχήμα 6C). Ο αριθμός των ηωσινοφίλων και λεμφοκυττάρων στα υγρά BAL ποντικών που έλαβαν OVA-παλμικά OGR1 ανεπάρκεια DCs ήταν σημαντικά χαμηλότερα από εκείνα των ποντικών που έλαβαν OVA-παλμική WT DCs. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η μεταβολή των λειτουργιών DC μπορεί να εξηγήσει, τουλάχιστον εν μέρει, τη μειωμένη AHR και τη φλεγμονή των αεραγωγών στο

OGR1

– /-

ποντίκια.