Αφηρημένο

περιγράφηκε προηγουμένως μια νέα αυτοκτονία (ή «ελέγχου μοίρα των κυττάρων» ) σύστημα ενζύμου /προφαρμάκου γονιδιακής θεραπείας με βάση την γενετική μηχανική παραλλαγή της ανθρώπινης θυμιδυλικής κινάσης (ΤΜΡΚ) η οποία ενισχύει αζιδοθυμιδίνη ΑΖΤ ενεργοποίησης (). Παράδοση μιας αλληλουχίας γονιδίου αυτοκτονίας σε όγκους από λεντοϊού μεταγωγή ενσαρκώνει μια γονιδιακή θεραπεία του καρκίνου που θα μπορούσε να χρησιμοποιήσει θανάτωση των παρευρισκομένων κύτταρο ως μηχανισμός οδήγησης σημαντική υποχώρηση του όγκου

in vivo

. Εδώ παρουσιάζουμε ένδειξη μιας σημαντικής κυττάρων παριστάμενος σκοτώνοντας

in vitro

και

in vivo

διαμεσολαβείται από τον άξονα του γονιδίου αυτοκτονίας ΤΜΡΚ /ΑΖΤ που εξαρτάται από τη διαμόρφωση των λειτουργικών κενών συνάψεων μεσοκυττάρια επικοινωνιών ( GJICs). Ενίσχυση της ενεργοποίησης ΑΖΤ από το μηχανικής ΤΜΡΚ εκφράζονται στην ανθρώπινη κυτταρική σειρά καρκίνου του προστάτη, PC-3, οδήγησε σε αποτελεσματική θανάτωση των παρευρισκομένων PC-3 κύτταρα που στερούνται έκφρασης ΤΜΡΚ – ένα αποτέλεσμα που θα μπορούσε να μπλοκαριστεί από τον αναστολέα GJIC, καρβενοξολόνη. Αν και οι GJICs σχηματίζονται κυρίως από συνδετίνες, μια νέα οικογένεια των μορίων GJIC οριστεί pannexins έχει πρόσφατα αναγνωριστεί. PC-3 κύτταρα εξέφρασαν τόσο συνδετίνης 43 (Cx43) και Pannexin1 (Panx1), αλλά η έκφραση Panx1 κυριαρχούσε στην πλασματική μεμβράνη, ενώ η έκφραση Cx43 ήταν πρωτίστως εντοπίζεται στην κυτοσόλη. Η συμβολή των επιδράσεων παριστάμενος στη μείωση του στερεού ξενομοσχευμάτων όγκου καθορίζονται από την κυτταρική γραμμή PC-3 αξιολογήθηκε σε ένα ζωικό μοντέλο. Έχουμε αποδείξει τη συμβολή των παρευρισκομένων θανάτωσης κυττάρων να υποχώρηση του όγκου σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος στηριζόμενη στην παράδοση της έκφρασης του γονιδίου αυτοκτονίας ΤΜΡΚ σε όγκους μέσω απευθείας εντός του όγκου ένεση ανασυνδυασμένου θεραπευτικών φακοϊό. Λαμβανόμενα μαζί, τα δεδομένα μας υπογραμμίζουν ότι ο άξονας ενζύμου-προφαρμάκου ΤΜΡΚ /ΑΖΤ μπορούν να χρησιμοποιηθούν αποτελεσματικά στη γονιδιακή θεραπεία αυτοκτονίας στερεών όγκων, όπου σημαντική υποχώρηση του όγκου μπορεί να επιτευχθεί μέσω επιδράσεων παριστάμενος διαμεσολαβούνται από GJICs

Παράθεση:. Sato Τ, Neschadim Α, Lavie Α, Yanagisawa Τ, Medin JA (2013) Η Μηχανική Thymidylate κινάσης (ΤΜΡΚ) /ΑΖΤ ενζύμου-προφαρμάκου Άξονα Προσφορές αποτελεσματική Bystander θανάτωση κυττάρων για αυτοκτονία Γονιδιακή θεραπεία του καρκίνου. PLoS ONE 8 (10): e78711. doi: 10.1371 /journal.pone.0078711

Επιμέλεια: Ιωσήφ Najbauer, Πανεπιστήμιο του Πετς Ιατρική Σχολή, την Ουγγαρία

Ελήφθη: 3 Ιουνίου του 2013? Αποδεκτές: 16, Σεπ 2013? Δημοσιεύθηκε: 23 του Οκτώβρη, 2013

Copyright: © 2013 Sato et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από την Grant-in ενισχύσεις για την Επιστημονική Έρευνα (C) (20.590.533) σε TS από την Ιαπωνία Εταιρείας για την Προώθηση της Επιστήμης (JSPs) και από την επιχορήγηση της έρευνας από το Ίδρυμα Saito Ευγνωμοσύνη προς τους T.S. .. Α.Ν. χρηματοδοτήθηκε από τις καναδικές Ινστιτούτα Ερευνών Υγείας (CIHR) Πρόγραμμα Κατάρτισης στην Αναγεννητική Ιατρική. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η γονιδιακή θεραπεία προσεγγίσεις με τη χρήση ανασυνδυασμένου oncoretroviral ή φορείς λεντοϊών να παραδώσει γονίδια που ενισχύουν διάφορες φαρμακολογικές θεραπείες κατευθείαν μέσα συμπαγείς όγκους υπόσχονται στη θεραπεία στερεών κακοήθειες που είναι δύσκολο να αφαιρεθούν χειρουργικά, όπως καρκίνων που προσβάλλουν τον εγκέφαλο [1]. γονιδιακή θεραπεία αυτοκτονίας του καρκίνου (SGTC), ονομάζονται επίσης και θεραπεία ενζύμου-προφαρμάκου γονίδιο-κατευθυνόμενη (GDEPT), τυπικά βασίζεται στην ενδοογκική διανομή των γονιδίων αυτοκτονίας που διευκολύνουν την επιλεκτική και εντοπισμένη ενεργοποίηση ειδικών προφαρμάκων σε κυτοτοξική παράγωγα τελεστή τους. Transcriptional- και ψευδότυπου που βασίζεται στόχευση λοιμογόνων παραγόντων σε καρκινικά κύτταρα επεκτείνει περαιτέρω τις πιθανές εφαρμογές για να συμπεριλάβει μεταστατικές βλάβες και να επεκτείνει τη μέθοδο παράδοσης για συστηματική χορήγηση [2,3]. Οι σημαντικές προκλήσεις που συνδέονται με την παράδοση του γονιδίου αυτοκτονίας σε κάθε κακοήθες κύτταρο συχνά ξεπεράσει επικαλούμενος παρευρισκομένων θανάτωση κυττάρων, ή των αποτελεσμάτων των παρευρισκομένων, οι οποίες δημιουργούν μια τοπική ζώνη σκοτώσει γύρω από τις μετάγονται επιτυχώς καρκινικά κύτταρα που λειτουργικά εκφράζουν το γονίδιο αυτοκτονίας, ενισχύοντας έτσι η συνολική αποτελεσματικότητα SGTC [4].

Αρκετές γονίδια αυτοκτονίας έχουν χαρακτηριστεί και αξιολογήθηκαν μέχρι σήμερα σε σχέση με τη χρησιμότητά τους για SGTC. Μεταξύ αυτών, ιός του απλού έρπητα που προέρχεται κινάσης θυμιδίνης (HSV-tk) είναι ένα από τα πιο εκτεταμένα μελετηθεί γονίδια αυτοκτονίας για SGTC [5]. HSV-tk και διάφορα καταλυτικά ενισχυμένη μεταλλάκτες αυτού του ενζύμου έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως ως ένα γονίδιο αυτοκτονίας σε συνδυασμό με το ανάλογο γουανοσίνης, ganciclovir (GCV), για την θεραπεία διαφόρων καρκίνων [1,6]. HSV-tk μετατρέπει το μη τοξικό GCV σε GCV-μονοφωσφορική (GCV-MP), η οποία είναι φωσφορυλιωμένη περαιτέρω από κυτταρικές κινάσες για να παραχθεί το τοξικό μεταβολίτη, GCV-τριφωσφορική (GCV-ΤΡ), η οποία αναστέλλει την αντιγραφή κυττάρου ξενιστή DNA με αποτέλεσμα την επαγωγή της απόπτωσης [7]. επιπτώσεις παρατηρητή έχουν καλώς χαρακτηρισμένα στο σύστημα γονιδιακής θεραπείας αυτοκτονίας HSV-tk /GCV, και πιστεύεται ότι περιλαμβάνει τη διάχυση ενεργοποιημένων GCV, είτε μονο- ή πολλαπλά-φωσφορυλιωμένες μορφές, από HSV-tk κύτταρα που εκφράζουν προς παρατυχόντα κύτταρα μέσω χάσμα-συνδετικούς μεσοκυττάρια επικοινωνιών (GJICs) που συνδέουν τα κυτοσόλες των γειτονικών κυττάρων σε πολλούς συμπαγείς όγκους και την ανταλλαγή των μικρών μεταβολιτών μοριακού βάρους με διάχυση [8]. Ένας αριθμός παραγόντων περιορίζουν την συνολική αποτελεσματικότητα του HSV-tk για χρήση σε SGTC συμπεριλαμβανομένων: κακή ενεργοποίηση της GCV με HSV-tk σε κυτταροτοξική μορφή του, που σχετίζονται κυρίως με το στάδιο περιορισμού του ρυθμού στην ενεργοποίηση GCV είναι φωσφορυλίωση GCV-ΜΡ σε GCV -DP από την κινάση κυτταρικό γουανυλικής (GMPK) [9]? περιορισμένη κυτταροτοξικότητα της GCV, ιδίως έναντι αργά αναπτυσσόμενοι όγκοι, δεδομένου του περιορισμένου μηχανισμού δράσης του, που στηρίζεται αποκλειστικά σε αντιγραφή του DNA [10]? και, τέλος, η κακή λιποφιλικότητα GCV με αποτέλεσμα τη μειωμένη επιδράσεις των παρευρισκομένων και μια φτωχή ικανότητα να διαπερνά τον φραγμό αίματος-εγκεφάλου περιορίζοντας έτσι εφαρμοσιμότητα στην SGTC εγκεφαλικό στόχο [11]. Στο σύνολό τους, SGTC προσεγγίσεις με τη χρήση ο άξονας HSV-tk /GCV έτσι περιορίζονται από την περιορισμένη κυτταροτοξικότητα και τα θέματα με την αποτελεσματική δόση με GCV, η οποία μπορεί να πρέπει να χρησιμοποιούνται σε συγκεντρώσεις που είναι συστημικά μυελοκατασταλτική να επιτευχθεί σημαντική εκτομή του όγκου.

Έχουμε περιγράφηκε προηγουμένως εναλλακτικά συστήματα ενζύμου προφαρμάκου για αυτοκτονία (ή «ελέγχου κύτταρο μοίρα») γονιδιακή θεραπεία [12,13], ένα από τα οποία χρησιμοποιεί ένα καταλυτικά-ενισχυμένη παραλλαγή του ανθρώπινου θυμιδυλικής κινάσης (ΤΜΡΚ-F105Y) που έχει ενεργοποιηθεί να ενισχύει την ταχεία ενεργοποίηση του προφαρμάκου αζιδοθυμιδίνης (ΑΖΤ) [12]. Καταλυτικά, άγριου τύπου ΤΜΡΚ είναι σχετικά αργή στην φωσφορυλίωση του ΑΖΤ μονοφωσφορικό, το οποίο είναι το βήμα εμπόδιο στο μονοπάτι ενεργοποίησης του σε κύτταρα θηλαστικών. Η μετάλλαξη F105Y, υιοθετούνται βάσει της σύγκρισης μιας ομόλογης περιοχής της αλληλουχίας ΤΜΡΚ ζύμης, καταλήγει σε ένα ένζυμο παραλλαγή που είναι πολύ πιο ισχυρή στο φωσφορυλίωση ΑΖΤ μονοφωσφορικό και λιγότερο δραστικές σε φυσικό υπόστρωμα της, θυμιδυλική μονοφωσφορικής [14]. Αυτή η νέα άξονας γονιδιακή θεραπεία αυτοκτονίας χρησιμοποιεί ένα ένζυμο ανθρώπινης προέλευσης με ελάχιστη δυνατότητα να προκαλέσει δυσμενείς ανοσολογικές αντιδράσεις κατευθύνονται έναντι του διαγονιδίου, όπως παρατηρείται με προσεγγίσεις HSV-tk-based. Χρησιμοποιεί επίσης ένα ένζυμο που είναι καταλυτικά ισχυρή και δρα στο περιοριστικό του ρυθμού στάδιο της ενεργοποίησης ΑΖΤ. Περαιτέρω, χρησιμοποιεί ένα προφάρμακο του οποίου η μορφή κυτταροτοξική μπορεί να στοχεύσει αποτελεσματικά τόσο διαιρούμενα και μη διαιρούμενα κύτταρα λόγω δύο διακριτούς μηχανισμούς κυτταροτοξικότητα [12]. Τέλος, χρησιμοποιεί ένα προ-φάρμακο που έχει καλύτερο προφίλ λιποφιλικότητα και είναι πιθανόν πιο κατάλληλο για χρήση σε SGTC. Συγκεκριμένα, ΑΖΤ εκτιμάται ότι είναι τουλάχιστον 30 φορές περισσότερο λιπόφιλες από GCV [11], η οποία προβλέπει την καλύτερη παθητική διάχυση και αυξημένη καταλληλότητα του προφαρμάκου ΑΖΤ για γονίδιο αυτοκτονίας θεραπεία συμπαγών όγκων, καθώς και την καλύτερη παράδοση του προφαρμάκου στο του εγκεφάλου, για παράδειγμα. Λόγω αυτών ανώτερα χαρακτηριστικά της αυτοκτονίας άξονα γονιδιακή θεραπεία ΤΜΡΚ /ΑΖΤ, στόχος μας ήταν να αξιολογήσει την καταλληλότητα του συστήματος αυτού και το μέγεθος των επιπτώσεων των παρευρισκομένων που θα μπορούσε να προκύψει σε SGTC.

Στην παρούσα μελέτη, αναφέρουμε ότι παρατεταμένη έκφραση του καταλυτικά ενισχυμένη, ΑΖΤ-δραστική παραλλαγή ΤΜΡΚ, ΤΜΡΚ-F105Y, στον ανθρώπινο προστάτη καρκινική κυτταρική γραμμή καρκινώματος, PC-3, με μεταγωγή με λεντοϊού κατασκευάσματα ευαισθητοποιεί εύκολα αυτά τα κύτταρα σε αγωγή με ΑΖΤ και διευκολύνει την ενισχυμένη κυτταρική θανάτωση μέσω επιπτώσεις των παρευρισκομένων τόσο

in vitro

και

in vivo

. Έχουμε αποδείξει ότι η παριστάμενος θανάτωση αποτέλεσμα, παρατηρήθηκε μετά τη θεραπεία ΑΖΤ, εξαρτάται από την ύπαρξη των λειτουργικών GJICs σε μεγάλο βαθμό και καταργείται δια κατεργασίας με έναν αναστολέα μεσοκυττάριου. Επιπλέον, δείχνουμε το Pannexin1, και όχι συνδετίνης 43, πιθανόν σχηματίζει τις λειτουργικές διασταυρώσεις χάσμα μεταξύ PC-3 κύτταρα. Τα αποτελέσματα αυτά υπογραμμίζουν την χρησιμότητα του λεντοϊού μεσολάβηση SGTC με βάση το σύστημα ελεγχόμενης ΤΜΡΚ /ΑΖΤ και απαιτούν περαιτέρω αξιολόγηση του

in vivo

σε συγκεκριμένα μοντέλα καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

πειραματικές διαδικασίες των ζώων ακολούθησε ένα πρωτόκολλο που εγκρίθηκε από την Επιτροπή Φροντίδας ζώων του δικτύου Υγείας του Πανεπιστημίου (Toronto, ON, Καναδάς). Τα ζώα διατηρήθηκαν στο Κέντρο Ζώων Πόρων του Princess Margaret Hospital (Toronto, ON, Καναδάς).

καλλιέργειας κυττάρων

κυτταρική σειρά

Ανθρώπινο προστατικό αδενοκαρκίνωμα PC-3 λήφθηκε από την American Type Culture Collection (ATCC? Manassas, VA, USA) και διατηρήθηκαν σε RPMI (Roswell Park Memorial Institute) -1640 μέσο (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS? ΡΑΑ Laboratories GmbH, Pasching , Αυστρία), 100 μονάδες /κ.εκ πενικιλλίνη (Nakalai Tesque, Inc., Kyoto, Japan), 100 μg /mL στρεπτομυκίνης (Nakalai Tesque, Inc.), και 250 ng /mL του Αμφοτερικίνη Β (Nakalai Tesque, Inc. ) σε 37 ° C, 5% CO

2 ατμόσφαιρα σε σταθερή υγρασία. Η ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά προερχόμενο 293Τ κυτταρική γραμμή ελήφθη από την American Type Culture Collection (ATCC? Manassas, VA, USA) και διατηρήθηκαν σε Dulbecco Τροποποιημένο Eagle Medium (ϋ-ΜΕΜ? Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) συμπληρωμένο με 10% FBS , 100 μονάδες /κ.εκ πενικιλίνης, 100 μg /mL στρεπτομυκίνης και 2 mM L-γλουταμίνη (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).

Παραγωγή ανασυνδυασμένης LV /ΤΜΡΚ και μεταγωγή του PC 3-κύτταρα

Η διαδικασία για την παραγωγή της φυσαλιδώδους στοματίτιδας ιού-γλυκοπρωτεΐνη (VSV-G) -pseudotyped ανασυνδυασμένου φακοϊού, έχουν αναφερθεί στο παρελθόν με μας ομάδα [12], χρησιμοποιήθηκε με μικρές τροποποιήσεις. Εν συντομία, η επιμόλυνση από τρία πλασμίδια (πλασμίδιο PHR «μεταφοράς γονιδίων, το πλασμίδιο συσκευασία pCMVR8.91, και ο ιός της φυσαλιδώδους στοματίτιδας γλυκοπρωτεϊνης φακέλου που κωδικοποιεί πλασμίδιο pMD.G) σε κύτταρα 293Τ διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα πολυαιθυλενοϊμίνη (ΡΕΙ) -procedure [15 ] και τα υπερκείμενα ιού συλλέχθηκαν στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, διήθηση μέσω ενός φίλτρου 0,45 μm και συμπυκνώνεται στα 50,000 χ g για 2 ώρες. κύτταρα PC-3 μολύνθηκαν με τα συμπυκνωμένα αποθέματα ιού παρουσία 8 μg /ml θειικής πρωταμίνης. Τα μολυσμένα κύτταρα στη συνέχεια μονοκύτταροι κλωνοποιήθηκαν με περιοριστική αραίωση. Η διαγονιδιακή έκφραση στα μεταχθέντα κύτταρα PC-3 επιβεβαιώθηκε με ανάλυση στυπώματος Western χρησιμοποιώντας κουνελιού αντι-ανθρώπινης ΤΜΡΚ (ευγενική προσφορά του Dr. Manfred Konrad, Max Plank Institute for Biophysical Chemistry, Göttingen, Germany). Για την ανάλυση αυτή, συνολικά κυτταρολύματα αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση πηκτώματος δωδεκυλθειικού νατρίου πολυακρυλαμιδίου 12,5% (SDS-PAGE) και στυπώθηκαν σε μεμβράνη φίλτρο διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF) (Millipore, Billerica, ΜΑ). Η μεμβράνη μπλοκαρίστηκε με 0,5% χωρίς λιπαρά αποβουτυρωμένο γάλα σε 20 mM Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα με 0,05% Tween-20, ρΗ 7.4 (TBS-T, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Η μεμβράνη ανιχνεύθηκε με το αντι-ανθρώπινο ΤΜΡΚ (αραίωση 1: 5000), και στη συνέχεια με το κατάλληλο δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας (αραιωμένο 1: 5000, Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA). Ίση φόρτωση πρωτεΐνης επιβεβαιώθηκε με ποντικού αντι-GAPDH αντίσωμα (αραίωση 1: 5000, Ambion Austin, TX, USA.). Οι μεμβράνες, μετά την ανάπτυξη με το υπόστρωμα Immobilon Western χημιφωταύγειας HRP (Millipore, Billerica, ΜΑ, USA), απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα LAS-1000 (Fuji Film Corp., Tokyo, Japan) φορτισμένη-ζευγάρι κάμερα της συσκευής. Η έκφραση της ενισχυμένης πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (eGFP) στις μετάγονται μονοκύτταροι κλώνων επιβεβαιώθηκε με ανίχνευση με κυτταρομετρία ροής (FACS Canto II, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA).

δοκιμασίας μεταφορά Dye χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής και συνεστιακή μικροσκοπική παρατήρηση

Για την επισήμανση καλσεϊνης, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε ημι-συρροή πλύθηκαν δύο φορές με PBS (χωρίς ασβέστιο και μαγνήσιο), και στη συνέχεια βάφτηκαν για 15 λεπτά με 20 μΜ calcein-ακετοξυ μεθυλ (calcein-ΑΜ? Doujin Chemical Co., Kumamoto, Japan) διαλυμένο σε PBS (χωρίς ασβέστιο και μαγνήσιο). Μετά από χρώση με καλσεϊνη, τα κύτταρα πλύθηκαν με RPMI-1640 που περιείχε 10% FBS. Για ΡΚΗ26-σήμανση, τα κύτταρα πλύθηκαν σε PBS και επαναιωρήθηκαν σε Διαλύτη C (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ, USA) σε πυκνότητα 10

7 κύτταρα /mL και χρωματίστηκαν με 20 μΜ ΡΚΗ26 (Sigma-Aldrich ) διαλυμένο σε Διαλύτη C για 5 λεπτά. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν 3 φορές με RPMI-1640 που περιείχε 10% FBS. Τόσο η καλσεΐνη-σημασμένο και ΡΚΗ26-επισημασμένα κύτταρα αναμείχθηκαν και συν-καλλιεργήθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων (Corning Incorporated, Coming, ΝΥ, USA) για 3 ημέρες. μεταφορά Dye αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής (FACS Canto II, BD Biosciences) με μέτρηση του φθορισμού καλσεΐνης ανιχνεύθηκε σε 514nm και ΡΚΗ26 ανιχνεύθηκε σε 567nm. Σε μια ξεχωριστή δοκιμασία, 100 μΜ καρβενοξολόνη (CBX? Sigma-Aldrich) προστέθηκε στις κυτταρικές καλλιέργειες για να εξετάσει την ικανότητά της να μπλοκάρει μεταφοράς βαφής. Περαιτέρω, για την ανίχνευση των μορίων που συμμετέχουν στον σχηματισμό διασταύρωση κενό, ανοσοχρώση PC-3 κύτταρα διεξήχθη. Εν συντομία, κύτταρα PC-3, τηρείται Lab-TekII slide θάλαμο (Nalge Nunc International Corp., Naperville, IL, USA), μονιμοποιήθηκαν με 4% (w /v) ρυθμιστικό διάλυμα φορμόλης (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) σε 0.1 Μ φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα, ρΗ 7,4, και κατέστησαν διαπερατά με 0.1% (ν /ν) TritonX-100 για 15 λεπτά. Τα κύτταρα στη συνέχεια δεσμεύτηκαν με 5% φυσιολογικό ορό αίγας, και διαδοχικά αντιδρά με διάλυμα πρωτογενούς αντισώματος (1: 100 αραίωση σε PBS που περιέχει 1% αλβουμίνη βόειου ορού (BSA)) στους 4 ° C όλη τη νύκτα, που ακολουθείται από επώαση σε PBS που περιέχει τη δευτερεύουσα αντίσωμα (αραίωση 1: 500 σε PBS που περιέχει 1% BSA) επισημάνθηκαν με Alexa488 (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, USA) και αντίθετα με ροδαμίνη φαλλοϊδίνη (Cytskelton, Inc., Denver, CO, USA) για 3 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου θερμοκρασία. Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη ήταν ως ακολούθως: αντι-συνδετίνης 43 αντίσωμα κουνελιού (Signalway Antibody, College Park, ΜΑ, USA), αντι-κουνελιού αντίσωμα pannexin1 (EMD Millipore Corp., Billerica, ΜΑ, USA), και Alexa488 σημασμένο αντίσωμα κατσίκας αντι Κουνέλι αντίσωμα IgG (Molecular Probes, Inc.). σήματα φθορισμού αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα συνεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης λέιζερ LSM-5 και την έκδοση LSM Συστήματος 3,98 (Carl Zeiss, Oberkochen, Γερμανία) στο Ιατροβιολογικών Ερευνών Πυρήνα του Πανεπιστημίου Tohoku Graduate School of Medicine.

προσδιορισμούς πολλαπλασιασμού των κυττάρων

τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων (Corning Incorporated) στους 5 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο σε 200 μΙ RPMI-1640, συμπληρωμένο όπως περιγράφεται παραπάνω, και επωάστηκαν με αυξανόμενες συγκεντρώσεις ΑΖΤ (0, 0.1, 1, 10, 100 μΜ και 1 mM? Sigma-Aldrich). Το μέσο ανανεώνεται καθημερινά. Μετά από 4 ημέρες καλλιέργειας, η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το κινητό Μετρώντας Kit-8 (Doujin Chemical Co.). Για τον προσδιορισμό της βέλτιστη αναλογία των κυττάρων για μετέπειτα πειράματα γειτνιάσεως, και οι δύο eGFP-κύτταρα που εκφράζουν και ΤΜΡΚ-F105Y-μεταδιηγερμένα κύτταρα σπάρθηκαν επί πλακών 96 φρεατίων σε διαφορετικές αναλογίες, και καλλιεργήθηκαν παρουσία 10 μΜ ΑΖΤ για 5 ημέρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε όπως παραπάνω χρησιμοποιώντας την καταμέτρηση των κυττάρων Kit-8 (Doujin Chemical Co.).

Αξιολόγηση της απόπτωσης

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων (Corning Incorporated) στους 10

6 κύτταρα /φρεάτιο σε 5 ml μέσου κυτταρικής καλλιέργειας (RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% FBS, αντιβιοτικά, αντιμυκητιακά και, όπως περιγράφεται παραπάνω), με ή χωρίς 10 μΜ ΑΖΤ. Μετά από 4 ημέρες καλλιέργειας, η χρώση αννεξίνης V διεξήχθη σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Annexin V-APC? BD Pharmingen, San Diego, CA). Για να επιβεβαιώσετε την απαίτηση της GJICs για παρευρισκομένων θανάτωσης που προκαλείται από ΑΖΤ, 100 μΜ καρβενοξολόνη (CBX? Sigma-Aldrich) προστέθηκε ταυτόχρονα με ΑΖΤ στον πολιτισμό. Σχετική αποπτωτικών δείκτες υπολογίστηκαν ως κανονικοποιημένες αναλογίες απόπτωσης σε ΑΖΤ-επεξεργασία για να ΑΖΤ-μη επεξεργασμένα κύτταρα. Για να εξεταστεί η συμβολή των διαλυτών παραγόντων που εκκρίνονται από ΑΖΤ-επεξεργασμένα κύτταρα, PC-3 κύτταρα άγριου τύπου καλλιεργήθηκαν για 5 ημέρες στο ρυθμισμένο μέσο που συλλέγεται από άγριου τύπου ΤΜΡΚ ή ​​ΤΜΡΚ-F105Y που εκφράζουν τα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με 10 μΜ ΑΖΤ για 5 ημέρες, που ακολουθείται από αξιολόγηση της επαγωγής απόπτωσης σε αυτά τα κύτταρα όπως παραπάνω.

αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) δοκιμασία

Παραγωγή της ενδοκυτταρικής αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) παρακολουθήθηκε από την dihydroethidium ( DHE) διαδικασία [16]. Εν συντομία, μετά από τα υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία αγωγή, τα κύτταρα επωάστηκαν περαιτέρω με διυδροεργοταμίνης (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) για 30 λεπτά στους 37 ° C στο σκοτάδι. Ο φθορισμός ένταση εκπομπής στα 525 nm (μετά από διέγερση στα 488 nm) μετρήθηκε με ένα κυτταρόμετρο ροής (FACS Canto II, BD Biosciences). Η αλλαγή στην μέση ένταση φθορισμού (MFI) των δειγμάτων μετρήθηκαν από κάθε ομάδα αγωγής εκφράστηκε ως ποσοστό της διυδροεργοταμίνης φθορισμού των μη επεξεργασμένων κυττάρων ελέγχου.

Αξιολόγηση της επίδρασης των παρευρισκομένων in vivo μετά από ενδοογκική ένεση LV /ΤΜΡΚ

μη-παχύσαρκοι διαβητικοί /σοβαρή συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια (NOD /SCID) ποντίκια (ηλικίας 5-8 εβδομάδων, που αγοράστηκαν από Jackson Laboratories, Bar Harbor, μΕ) διατηρήθηκαν στο Κέντρο ζώων πόρων του Princess Margaret Hospital (Τορόντο , ON, Καναδάς). Τα ζώα εγχύθηκαν την ημέρα 0 σε δεξιά τους ραχιαία πλευρά με 4×10

6 LV /eGFP-μεταδιηγερμένα κύτταρα PC-3, αιωρήθηκε σε 200 μΙ αλατούχου φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος (PBS). Περίπου 10 μΙ ενός LV /ΤΜΡΚ-F105Y (1.5×10

8 /mL IU) παρασκεύασμα εγχύθηκε εντός του όγκου την ημέρα 11. Τα ζώα στις ομάδες αγωγής με φάρμακο έλαβαν δόση 50 mg /kg /ημέρα ΑΖΤ ενδοπεριτοναϊκά για 6 ημέρες αρχίζοντας την ημέρα 12. Οι πειραματικές ομάδες ήταν ως ακολούθως: PC-3-ΤΜΡΚ-F105Y αγωγή με ΑΖΤ και PC-3-ΤΜΡΚ-F105Y αγωγή με φορέα (PBS). Τα ζώα υποβλήθηκαν σε ευθανασία την ημέρα 18? όγκοι στη συνέχεια συλλέγονται και ζυγίζονται

Στατιστικά

Η στατιστική σημαντικότητα μεταξύ των ομάδων αξιολογήθηκε κατά ένα τρόπο ANOVA αναλύσεις με τη hoc-post test Bonferroni χρησιμοποιώντας GraphPad INSTAT (ver 3.0a για Macintosh..? GraphPad Software, San Diego CA).

Αποτελέσματα

PC-3 κύτταρα εκφράζουν λειτουργική GJICs αποτελείται από pannexin1

μεσοκυττάριου ενδοκυτταρική επικοινωνία (GJICs), εκτός από την αναπαραγωγή ενός άμεσο ρόλο στην εξέλιξη του όγκου [17], θεωρούνται σημαντικές για την θανάτωση φαινόμενο γειτνιάσεως κύτταρο σε εφαρμογές SGTC [18]. Οι GJICs τυπικά αποτελούνται από πρωτεΐνες της οικογένειας συνδετίνης, και, όπως δείχθηκε πρόσφατα, από πρωτεΐνες της οικογένειας pannexin καθώς [19]. GJICs επιτρέπουν την παθητική διάχυση μικρών μορίων (≤1 kDa σε μέγεθος) μεταξύ γειτονικών, συνδεδεμένες κυψέλες. Οι εκφράσεις των βασικών πρωτεϊνών GJIC, συνδετίνης 43 και pannexin1, επιβεβαιώθηκαν σε κύτταρα PC-3 με ανάλυση στυπώματος Western (Σχήμα 1Α)? εκφράσεις του άγριου τύπου ΤΜΡΚ και ΤΜΡΚ-F105Y επιβεβαιώθηκαν επίσης με ανάλογο τρόπο (Εικόνα 1Β). Τα σχήματα κατανομής των συνδετίνης 43 και pannexin1, όπως προσδιορίζεται με ομοεστιακό ανοσοφθορισμού ανάλυση μικροσκοπίας, αποκάλυψαν όμως ότι κύτταρα PC-3 κατά κύριο λόγο εκφράζουν συνδετίνης 43 σε κυτταροπλασματικά περιπυρηνική διαμερίσματα (Σχήμα 1 C, αριστερό πλαίσιο), ενώ pannexin1 πρώτιστα εντοπισμένη στην μεμβράνη του πλάσματος, που παρατηρούνται ως κηλίδες και ραβδώσεις που είναι το σήμα κατατεθέν του προτύπου εμφάνιση GJIC (σχήμα 1Γ, δεξιό πίνακα). Το εύρημα αυτό υποδηλώνει ότι pannexin1 μπορεί να επικρατήσει πάνω συνδετίνης 43 στο σχηματισμό λειτουργικών GJICs σε αυτή προστάτη καρκινική κυτταρική γραμμή.

(Α) Εκφραση του GJIC συστατικών, συνδετίνης 43 και pannexin1, επιβεβαιώθηκε με κηλίδα Western επί προϊόντων λύσης ολικού κυττάρου από μη-μετατραπέντων, LV /ΤΜΡΚ μεταγωγή, και LV /eGFP-μεταδιηγερμένα κύτταρα PC-3. έκφραση GAPDH αξιολογήθηκε ως ισότιμος έλεγχος φόρτωσης. (Β) Έκφραση ΤΜΡΚ επιβεβαιώθηκε με κηλίδα Western επί προϊόντων λύσης ολικού κυττάρου από μη-μετατραπέντων, LV /ΤΜΡΚ μεταγωγή, και LV /ΤΜΡΚ-F105Y-μεταδιηγερμένα κύτταρα PC-3. έκφραση GAPDH αξιολογήθηκε ως ισότιμος έλεγχος φόρτωσης. (C) Πρότυπο έκφρασης συνδετίνης 43 (αριστερό πάνελ) και pannexin1 (δεξί πάνελ) συστατικά GJIC (πράσινος φθορισμός) εκτιμήθηκε με μικροσκοπία ανοσοφθορισμού συνεστιακό. Κυτταροσκελετού (F-ακτίνη) οπτικοποιήθηκε με ροδαμίνη phalloidin χρώση (ερυθρός φθορισμός). μεταφορά Dye καλσεΐνης σε γειτονικές ΡΚΗ26-επισημασμένα κύτταρα (D) μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής σε άμεση (κανονικό) ή επικοινωνούντα συν-καλλιέργειες από κύτταρα PC-3 ως ποσοστό κυττάρων διπλά θετικά για καλσεΐνη και φθορισμό ΡΚΗ26 (n = 3) . (Ε) μεταφορά Dye καλσεΐνης σε γειτονικές ΡΚΗ26-επισημασμένα κύτταρα ανεστάλη σημαντικά από καρβενοξολόνη (CBX) (n = 3). Η στατιστική σημασία υποδεικνύεται (ρ & lt? 0,0001).

Η

Στη συνέχεια εξετάσαμε το σχηματισμό λειτουργικών GJICs σε PC-3 κύτταρα σε ένα πείραμα μεταφοράς βαφής. Δύο κυτταρικών πληθυσμών, χωριστά και σταθερά επισημασμένα με μία από δύο διαφορετικές χρωστικές (calcein, η οποία είναι μη-διαπερατή μεμβράνη και είναι παγιδευμένος στο κύτταρο κυτοσόλιο και ΡΚΗ26, η οποία χαρακτηρίζει ειδικά κυτταρικές μεμβράνες) εμφάνισαν μεταφοράς βαφής σε 2-μέρα συνεργασία καλλιέργειες, όπως αποδεικνύεται από την εμφάνιση του διπλά επισημασμένου κυττάρων (Σχήμα 1D). Αυτή η καλσεϊνη μεταφοράς βαφής να ΡΚΗ26-επισημασμένα κύτταρα που απαιτείται άμεση επαφή κυττάρου-κυττάρου, καθώς η μεταφορά βαφής δεν ήταν εμφανής σε διαφορικά σημασμένα κύτταρα που καλλιεργήθηκαν σε ένα σύστημα transwell (Εικόνα 1D). Περαιτέρω, η μεταφορά χρωστικής ανεστάλη σημαντικά με την παρουσία ενός ειδικού αναστολέα μεσοκυττάριου, καρβενοξολόνη (CBX) (Σχήμα 1 Ε). Λαμβάνονται συλλογικά, τα δεδομένα δείχνουν ότι καλκεΐνη μεταφοράς βαφής σε ΡΚΗ26-σημασμένα κύτταρα απαιτείται άμεση επαφή κυττάρου-κυττάρου, και πιθανότατα διευκολύνεται από λειτουργικές GJICs.

Αξιολόγηση των ΑΖΤ μεσολάβηση θανάτωσης κυττάρων του LV /ΤΜΡΚ-μεταδιηγερμένα κύτταρα PC-3 και των παρευρισκομένων επιδράσεις

PC-3 κύτταρα σε μεταγωγή με φορείς λεντοϊού μηχανική έκφραση είτε άγριου τύπου ή ΤΜΡΚ ΤΜΡΚ-F105Y. έκφραση ΤΜΡΚ και ΤΜΡΚ-F105Y επιβεβαιώθηκε με ανάλυση στυπώματος Western χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα κουνελιού ΤΜΡΚ αντι-ανθρώπου σε ξεχωριστούς κλώνους κυττάρων απομονώθηκαν με περιοριστική αραίωση (Σχήμα 1Β). Ενώ ενδογενούς έκφρασης ΤΜΡΚ ήταν ανιχνεύσιμη σε μη μετατραπέντα κύτταρα (ΝΤ), ένα σημαντικό υπερέκφραση ΤΜΡΚ παρατηρήθηκε στα μεταγόμενα κύτταρα. Δόση εξαρτώμενη ευαισθησία ΑΖΤ του PC-3 κυττάρου κλώνους που εκφράζουν άγριου τύπου ΤΜΡΚ, τα οποία δεν είναι σε θέση να ενεργοποιήσει σημαντικά ΑΖΤ, ή το ΑΖΤ-ενεργό μεταλλαγμένο ΤΜΡΚ-F105Y, αξιολογήθηκε σε καλλιέργεια κυττάρων. PC-κύτταρα που εκφράζουν το μεταλλαγμένο ΤΜΡΚ-F105Y ήταν ιδιαίτερα ευαίσθητα σε θεραπεία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις ΑΖΤ (IC50 1,8 μΜ) σε σύγκριση με μη-μεταχθέντα κύτταρα ή κύτταρα που υπερεκφράζουν άγριου τύπου ΤΜΡΚ (IC50 του & gt? 1 mM και & gt? 0.1 mM , αντιστοίχως) (Σχήμα 2Α). Με βάση τα προσδιορίστηκε δόσης-αποκρίσεις, μια δόση 10 μΜ ΑΖΤ επιλέχθηκε για επακόλουθα πειράματα ως η δόση που ήταν πολύ αποτελεσματική σε ΤΜΡΚ-F105Y κύτταρα που εκφράζουν αλλά δεν παρουσίασαν ανιχνεύσιμη τοξικότητα σε μη μετατραπέντα κύτταρα ή κύτταρα που υπερεκφράζουν άγριου τύπου ΤΜΡΚ.

(Α) Δόση εξαρτώμενη κυτταρική θανάτωση LV-μετατραπέντων PC-3 κύτταρα επωάζονται με αυξανόμενες συγκεντρώσεις ΑΖΤ (μέση τιμή +/- SEM, η = 3). (Β) επαγωγή απόπτωσης με 10 μΜ ΑΖΤ αξιολογήθηκε με αννεξίνη V χρώση των επεξεργασμένων ΤΜΡΚ-F105Y κύτταρα. θανάτωση κυττάρων (C) παρευρισκομένου εκτιμήθηκε με σχετική εκτίμηση της αννεξίνης χρώσης V σε ΑΖΤ-αγωγή με τα μη επεξεργασμένα παρευρισκομένων eGFP που εκφράζουν PC-3 κύτταρα με κυτταρομετρία ροής σε άμεση (κανονικό) και επικοινωνούντα συν-καλλιέργειες των ΕΟΡΡ- μεταγωγή με ΤΜΡΚ-WT – ή ΤΜΡΚ-F105-μεταδιηγερμένα κύτταρα PC-3 (η = 3). Η στατιστική σημασία υποδεικνύεται (ρ & lt? 0,0001). (D) Προσδιορισμός της βέλτιστης αναλογίας eGFP-κυττάρων που εκφράζουν προς TMPKF105Y κύτταρα που εκφράζουν για την αξιολόγηση των παρευρισκομένων θανάτωση επιδράσεις από 10 μΜ ΑΖΤ (μέση τιμή +/- SEM, η = 4? * Ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt? 0,01 ). (Ε) Η επαγωγή της απόπτωσης σε άγριου τύπου PC-3 κύτταρα με ρυθμισμένα μέσα από ΑΖΤ επεξεργασμένο άγριου τύπου ΤΜΡΚ μεταγωγή και ΤΜΡΚ-F105Y-μεταδιηγερμένα κύτταρα PC-3 κανονικοποιημένη σε απόπτωση σε κύτταρα κατεργασμένα με ρυθμισμένα μέσα από ΑΖΤ-μη επεξεργασμένα κύτταρα (n = 3).

η

Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η ειδική επαγωγή απόπτωσης σε ΤΜΡΚ-F105Y κύτταρα που εκφράζουν μετά από επώαση με 10 μΜ ΑΖΤ, εκτιμήσαμε την έκθεση του αποπτωτικού δείκτη, φωσφατιδυλοσερίνη (PS ), στην κυτταρική επιφάνεια των επεξεργασμένων κυττάρων με χρώση με APC πρωτεΐνης-συζευγμένη αννεξίνη V. ΤΜΡΚ-F105Y-μετατραπέντα κύτταρα καλλιεργούνται παρουσία 10 μΜ ΑΖΤ, αλλά όχι άλλες κυτταρικές ομάδες ελέγχου, παρουσίασαν μια σημαντική επαγωγή απόπτωσης, όπως φαίνεται από ένα περισσότερο από 3-φορές αύξηση στην αποπτωτική δείκτη αυτών των κυττάρων (Εικόνα 2Β).

για να αξιολογηθεί η παριστάμενος θανάτωσης κυττάρων που προκαλείται από ΤΜΡΚ-F105Y προερχόμενο ενεργοποίηση ΑΖΤ σε κύτταρα PC-3, ΤΜΡΚ-μεταχθέντα και μη μεταχθέντα κύτταρα ελέγχου ήταν άμεσα συν-καλλιεργήθηκαν με ανεξάρτητους κύτταρα PC-3 κατασκευαστεί για να εκφράζουν σταθερά την ενισχυμένη πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (eGFP). Συν-καλλιέργειες που επεξεργάστηκαν με ΑΖΤ αξιολογήθηκαν με αννεξίνη V (και 7-AAD) χρώση για επαγωγή απόπτωσης στον πληθυσμό PC-3 κυττάρου eGFP-θετική. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Γ (λευκές ράβδοι), μόνο eGFP-θετικών κυττάρων παριστάμενος συν-καλλιεργήθηκαν με κύτταρα που εκφράζουν το ΑΖΤ-δραστικό ΤΜΡΚ-F105Y και όχι την άγριου τύπου ΤΜΡΚ επέδειξε σημαντική αύξηση στον αποπτωτικό δείκτη κατά την κατεργασία ΑΖΤ. ΤΜΡΚ εκφράζουν κύτταρα τελεστές και eGFP εκφράζουν παριστάμενο κυττάρων που απαιτούνται άμεση επαφή κυττάρου-κυττάρου, εφόσον δεν υπάρχει αύξηση στη αποπτωτικό δείκτη των κυττάρων παριστάμενος παρατηρήθηκε όταν οι κυτταρικοί πληθυσμοί όπου χωρίζονται από ένα σύστημα transwell (Σχήμα 2C, σκιασμένες ράβδοι). Η παριστάμενος θανάτωση επίδραση σε συν-καλλιέργειες με αναλογία 1: 4 του eGFP-κυττάρων που εκφράζουν (20%) για να ΤΜΡΚ-F105Y που εκφράζουν κύτταρα (80%) ήταν πολύ σημαντική που οδηγεί σε συνολική μείωση 80% στην επιβίωση των κυττάρων στο ομο καλλιεργείας ακόλουθες 5 ημέρες θεραπείας ΑΖΤ (Εικόνα 2D), υποδηλώνοντας ότι θα μπορούσε να παρατηρηθεί ένας ισχυρός παριστάμενος θανάτωση επίδραση. Για την περαιτέρω επιβεβαιώνουν ότι το φαινόμενο γειτνιάσεως που παρατηρήθηκε δεν διαμεσολαβείται από διαλυτούς παράγοντες που εκκρίνονται από ΤΜΡΚ-F105Y που εκφράζουν, ΑΖΤ-επεξεργασμένα κύτταρα, καλλιεργήσαμε μη-μεταχθέντα κύτταρα PC-3 στο ρυθμισμένο μέσο που συλλέγεται από άγριου τύπου ΤΜΡΚ ή ​​ΤΜΡΚ-F105Y εκφράζοντα κύτταρα κατεργασμένα με 10 μΜ ΑΖΤ για 5 ημέρες. Κάτω από αυτές τις συνθήκες καλλιέργειας, μη μεταδιηγερμένα κύτταρα PC-3 δεν εμφάνισαν σημαντική κυτταρικό θάνατο (Εικόνα 2Ε). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η παριστάμενος θανάτωση αποτέλεσμα που παρατηρείται μεσολαβείται από τη μεταφορά κυτταροτοξικών ΑΖΤ μεταβολιτών μέσω ενός μηχανισμού που απαιτεί την άμεση επαφή κυττάρου-προς-κύτταρο.

Ο ρόλος των GJICs στη μεσολάβηση της παριστάμενο φαινόμενο σε PC-3 κύτταρα

Για να διερευνήσουν περαιτέρω τους μηχανισμούς της επίδρασης των παρευρισκομένων που παρατηρείται στα κύτταρα PC-3 διευκολύνεται από το σύστημα αυτοκτονία ΤΜΡΚ-F105Y /ΑΖΤ, αξιολογήσαμε το κύτταρο παριστάμενο θανάτωσης που παρατηρείται στην eGFP-θετικό πληθυσμό άμεσα συν-καλλιεργήθηκαν με ΤΜΡΚ-F105Y κύτταρα που εκφράζουν σε επεξεργασία με 10 μΜ ΑΖΤ εν απουσία και παρουσία 100 μΜ ειδικού αναστολέα μεσοκυττάριου, καρβενοξολόνη (CBX). Η προσθήκη του CBX στον συν-καλλιέργειας καταργηθεί πλήρως θανάτωση των παρευρισκομένων κυττάρων (αποπτωτικό δείκτη 1) (Σχήμα 3Α), υποδεικνύοντας ότι η επίδραση των παρευρισκομένων σε PC-3 μας συν-καλλιέργειες διαμεσολαβείται κυρίως από λειτουργική GJICs.

(Α) θανάτωση κυττάρων παρευρισκομένου αξιολογήθηκε με σχετική εκτίμηση της χρώσης αννεξίνης V σε ΑΖΤ-αγωγή παρευρισκομένων ΕΟΡΡ- εκφράζουν PC-3 κύτταρα, συν-καλλιεργήθηκαν με ΤΜΡΚ-F105Y-tranduced κύτταρα PC-3, με ροή κυτταρομετρία. Συν-καλλιέργειες είτε αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή έλαβαν θεραπεία με τον αναστολέα τηγάνι GJIC, καρβενοξολόνη (CBX) (n = 3). (Β) πολλαπλή μεταβολή στην παραγωγή δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS) λόγω της θεραπείας με ΑΖΤ αξιολογήθηκε σε άγριου τύπου ΤΜΡΚ εκφράζουν και ΤΜΡΚ-F105Y που εκφράζουν PC-3 κύτταρα (n = 3). (C) Διπλώστε αλλαγή στην παραγωγή δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS) λόγω της θεραπείας με ΑΖΤ αξιολογήθηκε σε eGFP που εκφράζουν PC-3 κύτταρα, συν-καλλιεργήθηκαν με ΤΜΡΚ-F105Y-tranduced PC-3 κύτταρα, με και χωρίς καρβενοξολόνη (CBX ) θεραπεία (n = 3). Η στατιστική σημασία υποδεικνύεται (ρ & lt? 0,0001).

Η

προσδιορίστηκε ότι η ενεργοποίηση ΑΖΤ σε ΤΜΡΚ-F105Y κύτταρα που εκφράζουν αυξήσεις αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) παραγωγή (Σχήμα 3Β). Επειδή είναι γνωστό ότι η παραγωγή ROS επάγει συχνά την κυτταρική βλάβη που οδηγεί σε κυτταρικό θάνατο, εμείς εικάζουν ότι η παραγωγή των ROS μπορεί να συμβάλει στην παρευρισκομένων θανάτωσης κυττάρων που παρατηρούνται σε αυτό το σύστημα. Πράγματι, δείξαμε ότι η αγωγή CBX του μας συν-καλλιέργειες που θα διαταράξει λειτουργικά GJICs είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση των ROS παράγονται μετά τη θεραπεία ΑΖΤ στον πληθυσμό παριστάμενο κυττάρων (Σχήμα 3C), υποδηλώνοντας ότι η μεταφορά των ενεργοποιημένων μεταβολιτών ΑΖΤ να παριστάμενος κύτταρα επάγει η παραγωγή των ROS και δυνητικά συνεισφέρει στην επαγωγή κυτταρικής απόπτωσης σε αυτά τα κύτταρα.

Αξιολόγηση του ΑΖΤ-προκαλούμενα αποτελέσματα παριστάμενο σε ανθρώπινο προστάτη μοντέλα ξενομοσχεύματος καρκίνου in vivo

για να αξιολογηθεί η αποτελεσματικότητα των παρευρισκομένων επιπτώσεις που προκαλούνται στην ΤΜΡΚ-F105Y /σύστημα αυτοκτονία ΑΖΤ

in vivo

και την καταλληλότητα αυτής της προσέγγισης για SGTC, χρησιμοποιήσαμε ένα PC-3 μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού. Δεδομένου ότι η κακή μεταγωγή των καρκινικών κυττάρων με φορείς μηχανική την έκφραση των γονιδίων αυτοκτονίας είναι ένας γενικός περιορισμός του GDEPT προσεγγίσεων, επιδιώξαμε να εξετάσει κατά πόσον επιδράσεις παριστάμενο στο σύστημα αυτοκτονίας ΤΜΡΚ /ΑΖΤ είναι επαρκώς ισχυρές για την αντιστάθμιση ενδεχομένως περιορισμούς στις αποδόσεις μεταγωγής όγκου. Εδώ NOD ζώα /SCID εμβολιάστηκαν υποδορίως με μη-μεταχθέντα PC-3 όγκων, και μετά από 11 ημέρες της ανάπτυξης του όγκου, οι όγκοι ψηλαφητοί άμεσα με ένεση, εντός του όγκου, με ~ 1.5×10

6 μολυσματικά ιικά σωματίδια μηχανική την έκφραση των ΤΜΡΚ-F105Y γονίδιο αυτοκτονίας. Ξεκινώντας 24 ώρες μετά την ένεση των ιοσωματίων, τα ζώα έλαβαν ημερησίως ενδοπεριτονειακές ενέσεις ΑΖΤ (50 mg /kg /ημέρα) ή ενός ελέγχου του οχήματος για 6 συνεχείς ημέρες. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία στο τέλος της περιόδου αγωγής, και ιστοί όγκου συλλέχθηκαν και ζυγίστηκαν.