Αφηρημένο

Ιστορικό

Παρά το γεγονός ότι οι πρόσφατες εξελίξεις στην κυκλοφορία ανάλυση του DNA επιτρέπουν την πρόβλεψη των γονιδιωμάτων του όγκου με μη επεμβατικό τρόπο, ορισμένες από τις προκλήσεις παραμένουν, τα οποία περιορίζουν την ευρεία εισαγωγή cfDNA στη διάγνωση του καρκίνου. Αναλύσαμε την κατάσταση των δύο καλύτερα χαρακτηρισμένες ορθοκολικό καρκίνο (CRC) γενετικές και επιγενετικές μεταβολές σε μια σειρά ασθενών CRC, και στη συνέχεια, σε σύγκριση με το βαθμό στον οποίο οι δύο μοτίβα κινούνται από ιστό σε πλάσμα προκειμένου να βελτιωθεί η κατανόηση της βιολογίας διαμόρφωση της αντιστοιχία μεταξύ των ιστών και μεθυλίωση του πλάσματος και προφίλ μετάλλαξης.

Μέθοδοι

Το πλάσμα και στους ιστούς όγκων συλλέχθηκαν από 85 ασθενείς (69 ± 14 χρόνια, 56 άνδρες).

KRAS

και

SEPT9

κατάσταση αξιολογήθηκε από αλληλόμορφο σύστημα πυρίμαχα μετάλλαξη ποσοτική PCR και ποσοτική μεθυλίωσης-ειδική PCR, αντίστοιχα. Έξι από τις πιο κοινές μεταλλάξεις σημείου στο κωδικόνιο 12 και 13 ερευνήθηκαν για

KRAS

ανάλυση.

Αποτελέσματα

KRAS

μεταλλάξεις και

SEPT9

μεθυλίωση υποστηρικτής ήταν παρόντες στο 34% (29/85) και 82% (70/85) των δειγμάτων ιστού πρωτοπαθούς όγκου. Και οι δύο γενετικών και επιγενετικών αναλύσεις cfDNA αποκάλυψε μια υψηλή συνολική συμφωνία και ειδικότητα σε σχέση με τις αναλύσεις του όγκου των ιστών. Οι ασθενείς που παρουσιάζουν τόσο γενετικοί όσο και επιγενετικές αλλοιώσεις σε δείγματα ιστών (31,8%, 27/85) θεωρήθηκαν για περαιτέρω αναλύσεις. Οι διάμεσες τιμές μεθυλίωση σε ιστούς όγκων και τα δείγματα πλάσματος ήταν 64,5% (12,2 – 99,8%) και 14,5% (μηδέν έως 45,5%), αντίστοιχα. Η διάμεση τιμή

KRAS

φορτίου μετάλλαξη (για συμφωνημένα μεταλλάξεις) ήταν 33,6% (1,8 – 86,3%) σε ιστούς και 2,9% (μηδέν έως 17,3) σε δείγματα πλάσματος. Το πλάσμα /ιστού (p /t) αναλογία

SEPT9

ποσοστό μεθυλίωσης ήταν σημαντικά υψηλότερο από το Ρ /Τ αναλογία

KRAS

φορτίου μετάλλαξη, ειδικά σε καρκίνους πρώιμο στάδιο (p = 0,0108) .

Συμπέρασμα

Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης δείχνουν αντιφατικά ποσοστό των επιγενετικών εναντίον γενετικές αλλαγές που μετακινούνται από ιστό σε πλάσμα. Πολλοί παράγοντες μπορεί να επηρεάσουν μετάλλαξη ανάλυση cfDNA, συμπεριλαμβανομένων τόσο η παρουσία του όγκου κλωνική ετερογένεια και αυστηρή διαμερισματοποίηση του

KRAS

προφίλ μετάλλαξης. Η παρούσα μελέτη αναδεικνύει τη σημασία της λαμβάνοντας υπόψη τη φύση της τροποποίησης κατά την ανάλυση των όγκων που προέρχονται από cfDNA

Παράθεση:. Danese E, Minicozzi AM, Benati Μ, Montagnana Μ, Paviati Ε, Σαλβάνιο GL, et al. (2015) Σύγκριση των Γενετικών και επιγενετικές διαταραχές των πρωτοπαθών όγκων και αντίστοιχα δείγματα πλάσματος σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 10 (5): e0126417. doi: 10.1371 /journal.pone.0126417

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Αντώνης W. Ι Lo, Queen Mary Hospital, ΧΟΝΓΚ ΚΟΝΓΚ

Ελήφθη: 11 Φλεβάρη του 2015? Αποδεκτές: 1η Απριλίου, 2015? Δημοσιεύθηκε: May 6, 2015

Copyright: © 2015 Danese et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

χρηματοδότηση:.. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Απόδειξη ότι καρκινικά ειδικές γενετικές και επιγενετικές μεταβολές μπορεί να ανιχνευθεί στην κυκλοφορία του DNA που εξάγεται από το πλάσμα των ασθενών με καρκίνο έχει δείξει υπόσχεση για τη βελτίωση της πρώιμης διάγνωσης, πρόγνωση και παρακολούθηση της νόσου. Ο πρωταρχικός στόχος της αξιοποίησης των κυττάρων ελεύθερο DNA ως βιοδείκτη συνεπάγεται ιατρική βελτιστοποίηση πρακτική, εξατομικευμένη ανάπτυξη της ιατρικής και της ποιότητας της βελτίωσης της ζωής λόγω της ελάχιστης εισβολής των δοκιμών του αίματος. Ωστόσο, η πιστοποίηση της πραγματικής κλινικής εγκυρότητας των διαφόρων κυττάρων χωρίς DNA (cfDNA) μεταβολές ως υποθετικό βιοδείκτες του καρκίνου στην κλινική πράξη παραμένει πρόκληση [1]. Η ηγετική ζήτημα σήμερα αντιπροσωπεύεται από το γεγονός ότι κυκλοφορούν τα θραύσματα DNA που φέρει όγκο συγκεκριμένες αλλοιώσεις αντιπροσωπεύουν μια μεταβλητή και γενικά μικρό κλάσμα του συνολικού DNA που κυκλοφορεί, δημιουργώντας έτσι ένα υψηλό μεταβλητότητα του ρυθμού αντιστοιχία μεταξύ των προτύπων μεταβολή ανιχνεύσιμη σε ιστό πρωτογενών όγκων και των αντίστοιχων πλάσμα.

Οι παράγοντες που επηρεάζουν την ποσοτική όσο και τις ποιοτικές μεταβολές των cfDNA σε σχέση με τους ιστούς των ασθενών με καρκίνο είναι πολλά και δεν έχουν ακόμη διερευνηθεί πλήρως μέχρι στιγμής. Ωστόσο, οι προσπάθειες κατά την τελευταία δεκαετία έχουν οδηγήσει σε σημαντικές προόδους.

Με την αξιολόγηση του προτύπου μεθυλίωσης του

γονίδιο PCDH10

στον ιστό και το πλάσμα των ασθενών με καρκίνο παχέος εντέρου (CRC) έχουμε δείξει πρόσφατα ότι το ποσοστό μεθυλίωσης ανιχνεύεται στο πλάσμα αυξάνεται με ενισχυμένη ποσοστό μεθυλίωσης σε ιστούς όγκων μόνο σε καρκίνους πρώιμου σταδίου, ενώ η συσχέτιση αυτή ήταν προφανώς έχασε σε προχωρημένους καρκίνους. Επιπλέον, δείξαμε ότι ο βαθμός της μεθυλίωσης cfDNA συνδέθηκε με ορισμένα χαρακτηριστικά του cfDNA, όπως η συγκέντρωση και η ακεραιότητα του, και ότι αυτές οι συσχετίσεις διέφερε σε δύναμη και την κατεύθυνση παράλληλα με το στάδιο του όγκου [2].

Κατά τα τελευταία δύο χρόνια δύο ανεξάρτητες ερευνητικές ομάδες έδειξαν ότι η δυνατότητα για ανίχνευση όγκο συγκεκριμένες cfDNA στο πλάσμα των ασθενών CRC εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από την ευαισθησία της μεθόδου που βασίζεται στην PCR για σύντομες μεταλλαγμένες αλληλουχίες [3-5], τονίζοντας έτσι τη σημασία της ελαχιστοποίησης το μήκος δοκιμασίας κατά την ανάλυση εξαιρετικά κατακερματισμένη cfDNA, όπως στη ρύθμιση των ασθενών με καρκίνο.

η ενδονεοπλασματική ετερογένεια και κλωνική εξέλιξη κατά τη διάρκεια της εξέλιξης είναι περαιτέρω ζητήματα που περιπλέκει τη χρήση του cfDNA ως υγρό βιοψίας για τον καρκίνο, καθώς και οι δύο παράγοντες δημιουργούν αξιόλογες διαφορές στο ποσοστό και το σχέδιο των εκτροπών ανιχνεύσιμα σε πρωτοπαθή όγκο και κυκλοφορούν DNA [6,7].

Σύμφωνα με αυτά τα στοιχεία, διαφορετικές τεχνικές και βιολογικές πτυχές θα πρέπει να λαμβάνονται υπόψη κατά την ανάλυση της μεταβλητής συμφωνία μεταξύ του ιστού και πλάσματος αλλαγές σε ασθενείς με καρκίνο, κυρίως η φύση των υποκείμενων αλλοιώσεις.

Τόσο επιγενετικών και γενετικών αλλοιώσεων είναι πολύ γνωστές ανωμαλίες που εμπλέκονται στην καρκινογένεση του παχέος. Με δεδομένο το τεράστιο δυναμικό τους ως βιοδείκτες στο CRC διάγνωση, σταδιοποίηση, την πρόγνωση και την ανταπόκριση στη θεραπεία, έχουν ερευνηθεί εκτενώς κατά την τελευταία δεκαετία. Ωστόσο, ένα κρίσιμο σύγκριση της κατάστασης τους στον ιστό και cfDNA λείπει. Ως εκ τούτου, η παρούσα μελέτη είχε ως στόχο να αναλύσει την κατάσταση των δύο καλύτερες χαρακτηρίζεται γενετικές και επιγενετικές αλλοιώσεις του CRC (δηλαδή,

KRAS

μετάλλαξη και

SEPT9

μεθυλίωση προαγωγού) σε μια ομάδα ασθενών CRC, προκειμένου να βελτιωθεί η κατανόηση των βιολογικών πτυχών διαμόρφωση της αντιστοιχίας μεταξύ των ιστών και μεθυλίωση του πλάσματος και προφίλ μετάλλαξης. Στη συνέχεια, συγκρίναμε επίσης το βαθμό στον οποίο η γενετική και οι επιγενετικές σχήματα κινούνται από ιστό σε πλάσμα.

Υλικό και Μέθοδοι

Ασθενείς και δείγματα

Η ομάδα μελέτης περιελάμβανε 85 διαδοχικοί ασθενείς που υποβάλλονται σε χειρουργική επέμβαση για CRC στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο της Βερόνα (Ιταλία) μεταξύ Ιανουαρίου 2010 και Δεκεμβρίου 2010. δείγματα αίματος συλλέχθηκαν πριν από την χειρουργική εκτομή. δείγματα όγκου λήφθηκαν κατά την διάρκεια χειρουργικής επέμβασης, αμέσως καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C. Η ιστολογική διάγνωση και το στάδιο του όγκου αξιολογήθηκαν σύμφωνα με το σύστημα ταξινόμησης του 2000 του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας (ΠΟΥ) για όγκους του πεπτικού συστήματος και την αμερικανική μεικτής επιτροπής για τον Καρκίνο του συστήματος (AJCC) στάσης, αντίστοιχα [8]. Μόνο οι ασθενείς με πρωτογενή ορθοκολικό αδενοκαρκινώματα χωρίς θεραπεία με εισαγωγική ραδιο-χημειοθεραπεία περιλήφθηκαν στη μελέτη. Όλα τα άτομα έδωσαν γραπτή συγκατάθεση για να εγγραφεί σε αυτή την έρευνα. Η μελέτη εγκρίθηκε από την τοπική επιτροπή δεοντολογίας (Τμήμα ζωή και την αναπαραγωγή Επιστημών, Πανεπιστήμιο της Βερόνα) και εκτελούνται σε συμφωνία με τη Διακήρυξη του 1975. Οι κλινικές πληροφορίες Ελσίνκι ελήφθη από τα ιατρικά αρχεία.

DNA απομόνωση από το πλάσμα και δείγματα ιστού

τα δείγματα αίματος συλλέχθηκαν σε σωλήνες 7 mL EDTA και επεξεργασία μέσα σε 1 ώρα μετά τη συλλογή. Μετά διπλή φυγοκέντρηση (800 g για 10 min φυγοκέντρηση, ακολουθούμενη από διαχωρισμό και μια δεύτερη 1600g για 10 λεπτά φυγοκέντριση), το πλάσμα διαχωρίστηκε, αποθηκεύονται σε κλάσματα και καταψύχθηκαν στους -80 ° C μέχρι την επεξεργασία. DNA εκχυλίζεται από το πλάσμα και τα τμήματα του φρέσκου κατεψυγμένου ιστού χρησιμοποιώντας το κιτ midi QIAamp DNA του αίματος και την Gentra Purgene Kit (Qiagen, Hilden, Γερμανία), αντίστοιχα.

συγκέντρωση cfDNA και Ακεραιότητα δείκτη

cfDNA κατακερματισμός αξιολογήθηκε με τον υπολογισμό του δείκτη ακεραιότητα του DNA όπως περιγράφεται προηγουμένως [2]. Εν συντομία, προσδιορίστηκε με υπολογισμό της αναλογίας των μεγαλύτερων (247 bp) έναντι βραχύτερη (115 bp) στόχους της συναινετικής αλληλουχίας της ανθρώπινης ALU επαναλαμβάνεται. Το αποτέλεσμα ALU-qPCR λαμβάνεται με εκκινητές ALU115 χρησιμοποιήθηκε επίσης για την ποσοτικοποίηση ολικό DNA.

μεθυλίωσης ειδική PCR (MSP)

Το καθαρισμένο γονιδιωματικό ϋΝΑ που εξάγεται από ιστούς και πλάσμα υποβλήθηκε σε κατεργασία όξινου θειώδους και DNA καθαρισμό χρησιμοποιώντας το κιτ Epitect Bisulfite (Qiagen, Hilden, Germany) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ένα λεπτομερές πρωτόκολλο έχει προηγουμένως αναφερθεί αλλού [2].

όξινο θειώδες τροποποιημένο DNA χρησιμοποιήθηκε ως μήτρα για PCR Πραγματικού χρόνου χρησιμοποιώντας SYBR Green-based ποσοτική MSP. Εκκινητές για MSP σχεδιάστηκαν για να ενισχύσουν ειδικά είτε ένα διθειώδες ευαίσθητη, μη μεθυλιωμένα κλώνο ή διθειώδες ανθεκτικό, μεθυλιωμένη σκέλος για την

SEPT9

γονιδιακή περιοχή υποκινητή. Το web-based λογισμικό MethPrimer (https://itsa.ucsf.edu/urolab/MethPrimer) χρησιμοποιήθηκε για να επιλέξετε ένα συγκεκριμένο νησί CpG, το οποίο βρέθηκε πρόσφατα ως η πιο ευάλωτη σε αλλαγές μεθυλίωσης στην ακολουθία αδένωμα-καρκινώματος [9] .

Οι αλληλουχίες των συνόλων εκκινητών ήταν ως εξής:

M-Fo: TTATTATGTCGGATTTCGCGGTTAAC

M-Rev: AAAATCCTCTCCAACACGTCCG

U- Fo: TAGTTATTATGTTGGATTTTGTGGTTAATG

U- Re: CAAAATCCTCTCCAACACATCCAC (Μ: μεθυλιωμένο, U: μη μεθυλιωμένα).

Η CpGenome Οικουμενική Methylated DNA (Chemicon, Millipore Billerica, ΜΑ, USA) χρησιμοποιήθηκε ως 100% μεθυλιωμένο (θετική ) έλεγχος, ενώ το DNA που εξάγεται από μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος φυσιολογικών ατόμων χρησιμοποιήθηκε ως μη μεθυλιωμένη (αρνητικό) έλεγχος

Το μίγμα της αντίδρασης PCR παρασκευάστηκε σε τελικό όγκο 20 μΐ, που αποτελείται από τις ακόλουθες συγκεντρώσεις:. 0.375 μΜ εμπρόσθιοι και αντίστροφοι εκκινητές, 250 μΜ από κάθε dNTP (GE Healthcare, Little Chalfont, UK), 1 × HotStart Buffer (Qiagen), 2.5 mM MgCl2, 1,5 μονάδες HotStart πολυμεράση (Qiagen), 2 μΜ Syto 9 (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA), και 1 χ ROX χρωστική αναφοράς (Invitrogen), 3 μl όξινου θειώδους-τροποποιημένου DNA.

Η PCR ενίσχυση διεξήχθη με precycling θερμική ενεργοποίηση της DNA πολυμεράσης στους 95 ° C για 10 λεπτά , που ακολουθείται από 40 κύκλους μετουσίωσης στους 95 ° C για 30 δευτερόλεπτα, ανόπτηση στους 64 ° C για 30 sec και επέκταση στους 72 ° C για 30 sec. Μια ΑΒΙ Prism 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems-Foster City, CA, USA) χρησιμοποιήθηκε.

Το προϊόν της PCR εκτελείται σε 2% πηκτή αγαρόζης για να επιβεβαιωθεί το μέγεθος του προϊόντος και της ειδικότητας της PCR, και στη συνέχεια οπτικοποιήθηκαν υπό υπεριώδες φως. Μια μπάντα των 110 bp θεωρήθηκε ως διαγνωστική της κατάστασης μεθυλίωσης, ενώ μια μπάντα των 114 bp θεωρήθηκε ως διαγνωστική της κατάστασης unmethylation.

ανάλυση μετάλλαξη KRAS

DNA από δείγματα ιστών και το πλάσμα ήταν υποβάλλεται σε ένα αλληλόμορφο σύστημα πυρίμαχα μετάλλαξη qPCR (ΟΠΛΑ-qPCR) για την ανίχνευση των έξι από τις πιο κοινές μεταλλάξεις στα κωδικόνια 12 και 13 του

KRAS

γονίδιο (G12A, G12D, G12V, G12S, G12C, και G13A ). DNA ενισχύθηκε σε ένα μίγμα αντίδρασης 25 μΐ που περιέχει 0.25 μΜ από κάθε εκκινητή ενισχύσεως, 200 μΜ από κάθε dNTP (GE Healthcare, Little Chalfont, UK), 1 × HotStart Buffer (Qiagen, Hilden, Germany), 2 mM MgCl

2, 2 μονάδες πολυμεράσης HotStart (Qiagen, Hilden, Γερμανία), 2 μΜ Syto 9 (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA), 1 × χρωστική αναφοράς ROX (Invitrogen) και 25 ng DNA. Οι αλληλουχίες εκκινητών έχουν περιγραφεί προηγουμένως αλλού [10], με την εξαίρεση της κοινής αντίστροφου εκκινητή ο οποίος έχει επανασχεδιαστεί ώστε να ελαττώσει τα αμπλικόνια τόσο κωδικόνιο 12 (90 bp) και το κωδικόνιο 13 (85 bp) (αρχικά του 149 και 144 bp σε μήκος). Η προκύπτουσα αλληλουχία ήταν ως εξής: α. TGTTGGATCATATTCGTCCACA

Η PCR ενίσχυση διεξήχθη με precycling θερμική ενεργοποίηση της DNA πολυμεράσης στους 95 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους αποδιάταξης στους 95 ° C για 30 δευτερόλεπτα, ανόπτηση στους 64 ° C για 30 sec και επέκταση στους 72 ° C για 30 δευτερόλεπτα, σε ένα ΑΒΙ Prism 7500 Σύστημα ανίχνευσης αλληλουχίας (Applied Biosystems-Foster City, CA, USA). Το προϊόν PCR μεταλλαγμένων δειγμάτων εκτελέστηκε σε 2% πηκτή αγαρόζης για να επιβεβαιωθεί η παρουσία των συγκεκριμένων ζωνών.

Ποσοτική ανάλυση και αναλυτική επίδοση

κύκλους Threshold (Ct) χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό συντελεστή μεθυλίωση και το φορτίο μετάλλαξης σε κάθε δείγμα, σύμφωνα με τον ακόλουθο τύπο:% = 100 /[1 + 2 {Ct

συναντήθηκε /Mut-Ct

ανικανοποίητες /WT}] [2,11]. Ctmet και Ctunmet δηλώνουν κύκλοι όριο ειδικά για τα μεθυλιωμένα και μη μεθυλιωμένα κράτη, ενώ Μουτ και WT αναφέρονται σε μεταλλαγμένα και άγριου-τύπου αλληλόμορφα, αντίστοιχα. Οι αναλογίες (%) του ρυθμού μεθυλίωσης ή του φορτίου μετάλλαξη ανιχνεύθηκε στο πλάσμα σε σύγκριση με εκείνα που ανιχνεύθηκαν σε ιστούς εκφράστηκαν ως πλάσμα /αναλογία ιστού (ρ /τ αναλογία).

Η διάμεση τιμή των τουλάχιστον δύο πανομοιότυπες μετρήσεις υπολογίσθηκε για κάθε δείγμα, και στη συνέχεια χρησιμοποιούνται για τη στατιστική ανάλυση. τέθηκαν κριτήρια προκαθορισμένα ποιότητας, έτσι ώστε οι μετρήσεις με Ct τιμές μεγαλύτερες από ό, τι είχαν αποκλεισθεί 38 κύκλους.

Επειδή έχει παρατηρηθεί ότι η ευαισθησία των δοκιμασιών cfDNA μπορεί να αυξηθεί με μείωση του μεγέθους των αμπλικονίων [5,6] , εκκινητές για τις δύο αναλύσεις έχουν σχεδιαστεί για να επιτρέπουν την ενίσχυση των προϊόντων μικρότερα από 120 bp. Η ανακρίβεια ενδο-δοκιμασίας για τη δοκιμασία μεθυλίωσης ήταν 9%. Το κατώτερο όριο ανίχνευσης των μεθυλιωμένων DNA για τις δοκιμασίες MSP (αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας διαδοχικές αραιώσεις της Οικουμενικής Methylated DNA) ήταν 1,5%.

Η ενδο-δοκιμασία ανακρίβεια για το

KRAS

αναλύσεις κυμάνθηκε μεταξύ 2% και 8%, ανάλογα με τον τύπο της μετάλλαξης. πρόσμικτα γραμμή κυττάρων DNA που περιέχει την μετάλλαξη που ενδιαφέρει σε ένα φυσιολογικό υπόβαθρο DNA χρησιμοποιήθηκαν για να αξιολογηθεί το όριο ανίχνευσης και ενισχύονται με τον ίδιο όργανο λειτουργεί για να ενεργεί ως θετικοί έλεγχοι. Η αναλυτική ευαισθησία της ΟΠΛΑ-qPCR ήταν κάτω του 2%, όπως έχει ήδη αναφερθεί [12].

Η στατιστική ανάλυση

διανομής Κανονικότητα ελέγχθηκε με το τεστ Shapiro-Wilk και συνεχείς μεταβλητές αναφέρονται ως μέση (εύρος) ή μέση τιμή ± SD, κατά περίπτωση. Οι στατιστικές αναλύσεις και αποτύπωση των δεδομένων εκτελέστηκαν χρησιμοποιώντας GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA). Η διαγνωστική απόδοση της ανάλυσης cfDNA συγκρίθηκε με την ανάλυση του όγκου των ιστών (το ισχύον πρότυπο του χρυσού) για την ευαισθησία και την ειδικότητα του στη διάκριση μεταξύ μεταλλαχθεί /υπερμεθυλίωση και μη μεταλλαγμένη /μη μετουσιωμένο άτομα. Τα προγνωστικά θετική και αρνητική προγνωστική αξία ήταν υπολογίζονται επίσης με την ακριβή δοκιμασία του Fisher. Το ποσοστό της αντιστοιχίας μεταξύ των προφίλ των ιστών και το πλάσμα προσδιορίστηκε με δοκιμή συμφωνίας (και τις αξίες που παρουσιάζονται ως σταθμισμένα κάππα (k) ± τυπικό σφάλμα). Διαφορές μεταξύ συνεχείς μεταβλητές αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το Mann-Whitney U. Οι συσχετίσεις εξετάστηκαν με τη συσχέτιση Spearman. Οι τιμές των p & lt? 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές

Αποτελέσματα

Πενήντα έξι από τα 85 ασθενείς αρχικά αξιολογούνται για ενδεχόμενη ένταξή τους στη μελέτη ήταν άνδρες, οι υπόλοιπες γυναίκες (μέσης ηλικίας 69 ± 14 χρόνια. ). Η κατανομή στάδιο του όγκου ήταν ως εξής: 15 ασθενείς ήταν στο στάδιο Ι (17,6%), 35 στο στάδιο II (41%), 24 στο στάδιο III (28,2%) και το υπόλοιπο 11 στο στάδιο IV (12,9%). Είκοσι εννέα από 85 δείγματα ιστού όγκου (34%) ήταν θετικά για ένα από τα έξι

KRAS

μεταλλάξεις που έχουμε δοκιμαστεί. Από αυτά, 22 ιστοί όγκου έδειξε συμφωνημένα μεταλλάξεις σε δείγματα πλάσματος. Συνολικά, η ανάλυση έδειξε cfDNA 89,4% (76/85) συμφωνία για

KRAS

ανίχνευσης με την ανάλυση του όγκου των ιστών (k = 0,753 ± 0,077, p & lt? 0,0001). Υπήρχαν εννέα αντικρουόμενα αποτελέσματα μεταξύ των 85 δειγμάτων που εξετάστηκαν. Πέντε αποτελέσματα έδειξαν γονότυπο WT για

KRAS

ελεγμένα μεταλλάξεις με ανάλυση cfDNA, ενώ η ανάλυση του όγκου ιστών έδειξε ένα

KRAS

G13D μετάλλαξη (n = 2), ένα

KRAS

μετάλλαξη G12D (n = 2) ή

KRAS

μετάλλαξη G12V (n = 1). Δύο ασθενείς (τόσο στο στάδιο ΙΙ) εμφανίζεται ένα

KRAS

G12S και G12A μετάλλαξη από την ανάλυση του πλάσματος, αλλά προσδιορίστηκαν ως WT από τη δοκιμή με όγκο ιστού. Τέλος, δύο ασθενείς (και οι δύο με προχωρημένο μεταστατικό CRC) παρουσίασαν απαράμιλλη μεταλλάξεις μεταξύ των ιστών και το πλάσμα.

Το

SEPT9

μεθυλίωση υποστηρικτής ήταν παρούσα σε 82.3% (70/85) των δειγμάτων ιστού πρωτοπαθούς όγκου . Η ανάλυση εμφάνισε 86% (73/85) συμφωνία με την ανάλυση cfDNA (k = 0,630 ± 0,092, p & lt? 0,0001). Αντικρουόμενα αποτελέσματα μόνο ενδιαφερόμενο ασθενείς με παρεκκλίνουσα μεθυλίωση του

SEPT9

σε δείγματα ιστού και δείγματα μη μεθυλιωμένο πλάσματος (n = 12).

Η κατανομή των θετικών και αρνητικών δειγμάτων στον ιστό και το πλάσμα παρουσιάζεται στον πίνακα 1, σε συνδυασμό με την αναλυτική απόδοση του cfDNA αναλύσεις.

η

Μετά τον αποκλεισμό των δύο ασθενείς με διαφορετικές

KRAS

γονότυπο στον ιστό και το πλάσμα, οι 27 ασθενείς (81,5% άνδρες) που εμφανίζουν τόσο γενετικές και επιγενετικές αλλοιώσεις σε δείγματα ιστών (31,8%, 27/85) θεωρήθηκαν για περαιτέρω ποσοτικές αναλύσεις. Σε αυτούς τους ασθενείς το ποσοστό της αντιστοιχίας μεταξύ των ιστών και το πλάσμα ήταν 93% (25/27) για την επιγενετική μεταβολή και 81% (22/27) για το

KRAS

ανάλυση μετάλλαξης (δηλαδή, δύο δείγματα ήταν αρνητικά cfDNA για τη μεθυλίωση του

SEPT9

και πέντε ήταν αρνητικά για την παρουσία του

KRAS

μεταλλάξεις). Μεταξύ των διαφόρων μεταλλάξεων KRAS που έχουμε δοκιμαστεί, η υποκατάσταση G12V ήταν η πιο εκπροσωπείται (n = 11), ακολουθούμενη από G12D (n = 7) και G13D (n = 7). Τέλος, ένα δείγμα εμφάνισε τη μετάλλαξη G12A, ενώ η G12S βρέθηκε σε ένα άλλο. Συνολικά, 74% και 26% των θέσεων μετάλλαξης βρίσκονταν στα κωδικόνια 12 και 13, αντίστοιχα.

Το μεσαίο

SEPT9

ποσοστά μεθυλίωσης σε ιστούς όγκων και δείγματα πλάσματος ήταν 64,5% (12,2 – 99,9 %) και 14,5% (μηδέν έως 45,5%), αντίστοιχα. Η διάμεση τιμή

KRAS

φορτίου μετάλλαξη ήταν 33,6% (1,8 – 86,3%) σε ιστούς και 2,9% (μηδέν έως 17,3%) σε δείγματα πλάσματος. Ποσοτικά στοιχεία για τις δύο γενετικών και επιγενετικών αλλαγών, σύμφωνα με διάφορες κλινικές παθολογικές χαρακτηριστικά συνοψίζονται στον Πίνακα 2. Δεν σημαντικές συσχετίσεις βρέθηκαν με το φύλο, την αρχική τοποθεσία του όγκου και την κατάσταση διαφοροποίησης σε δύο ιστούς όγκων και δείγματα πλάσματος. Από την άποψη της παθολογικής ταξινόμησης στάδιο, ο μέσος ρυθμός μεθυλίωσης του

SEPT9

ήταν σημαντικά υψηλότερη σε προχωρημένο στάδιο καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με τους ιστούς πρώιμο στάδιο. Μια στατιστικά σημαντική συσχέτιση βρέθηκε μεταξύ του ιστού και πλάσματος

SEPT9

ποσοστό μεθυλίωσης (r = 0,407, p = 0,035), ενώ δεν διαπιστώθηκε καμία συσχέτιση μεταξύ του ιστού και πλάσματος

KRAS

φορτίου μετάλλαξη (r = 0,092, p = 0,651).

Η

Πρόσθετες αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν σε ρ /Τ αναλογία

KRAS

φορτίου μετάλλαξη και

SEPT9

ποσοστό μεθυλίωσης, για τον εντοπισμό πιθανών διαφορές μεταξύ γενετικών και επιγενετικών βαθμός της μετάβασης από τον ιστό προς πλάσμα. Ο λόγος p /t

SEPT9

ποσοστό μεθυλίωσης ήταν σημαντικά υψηλότερο από το Ρ /Τ αναλογία

KRAS

φορτίου μετάλλαξη (24,2% έναντι 7,9%, p = 0,0228), και οι δύο παράμετροι που δείχνουν μια ευρύ φάσμα των τιμών (εύρος μηδέν έως 72,9% για το

SEPT9

ρ /Τ αναλογία και μηδέν έως 62,6% για το

KRAS

t δείκτης p /). Αυτό το εύρημα ήταν σχεδόν εξ ολοκλήρου οφείλεται στη μεγάλη απόκλιση μεταξύ γενετικών και επιγενετικών ρ /τ αναλογίες ανιχνεύσιμη σε καρκίνους πρώιμο στάδιο (p = 0,0108), δεδομένου ότι η διαφορά σε προχωρημένους καρκίνους στάδιο ήταν πλέον σημαντική (ρ = 0.6806) (Σχήμα 1). Η συγκέντρωση του cfDNA σε πρώιμα στάδια ασθενείς CRC (διάμεση 30,6 ng /mL, 4,6 έως 66,8) ήταν χαμηλότερη από ότι σε ασθενείς σε προχωρημένο στάδιο (80,2 ng /mL, 31,0 έως 195,0? P = 0,0001). Η cfDNA βρέθηκε επίσης να είναι πιο κατακερματισμένη (δείκτης ακεραιότητας: 0.36, 0.0.7-0.85 vs 0,63, 0,33 – 0,95? P = 0,0163). Δεν σημαντικές συσχετίσεις βρέθηκαν μεταξύ των παραμέτρων cfDNA και γενετικών ή επιγενετικών αλλαγών, εκτός από μια ασθενή συσχέτιση μεταξύ του δείκτη ακεραιότητα cfDNA και

KRAS

φορτίου μετάλλαξη σε προχωρημένους καρκίνους (r = 0,572, p = 0,040).

Συζήτηση

Αν και η χρήση των cfDNA ως πιθανά υποκατάστατα του γονιδιώματος του καρκίνου έχει αρχικά προταθεί πάνω από 30 χρόνια [13], και ο ρόλος των υγρών βιοψία έχει αξιολογηθεί για την προβλεπτική και προγνωστική της αξία σε μια σειρά από ρυθμίσεις με ελπιδοφόρα αποτελέσματα, cfDNA δοκιμών με βάση τον καρκίνο δεν έχουν αναπτυχθεί για κλινική χρήση μέχρι σήμερα.

Ο υψηλός βαθμός κατακερματισμού σε συνδυασμό με τη χαμηλή συγκέντρωση στο αίμα κάνει cfDNA μια προκλητική αναλύτη υπό τεχνικό προοπτική. Επιπλέον, οι ακόμα αβέβαιη κινητική του όγκου που σχετίζονται με την απελευθέρωση cfDNA στην κυκλοφορία του αίματος και οι αλλαγές γενετική σύνθεση κατά τη διάρκεια της εξέλιξης και οι δύο συμβάλλουν στο να κάνουν cfDNA ένα «δύσκολο να διαβαστεί» αναλυτή, ακόμα και κάτω από βιολογική άποψη.

Τα αποτελέσματα της μελέτη μας, εκτός από επιβεβαιώνοντας ότι το υγρό βιοψία προβλέπει αλλοιώσεις ιστών όγκου, είναι συνεπείς με την υπόθεση ότι μπορεί να υπάρχουν κάποιες διαφορές μεταξύ των ρυθμό με τον οποίο γενετικές και επιγενετικές μεταβολές κινούνται από τον ιστό προς πλάσμα.

προκειμένου να καταστεί αποτελέσματα λιγότερο ευάλωτα σε τεχνικές παρεμβάσεις και να κάνει γενετικών και επιγενετικών δεδομένα αξιόπιστα και άμεσα συγκρίσιμα, υιοθετήσαμε μια σειρά μεθοδολογικών τεχνασμάτων προσαρμοστεί από τις πρόσφατες εκδόσεις. Πρώτον, η ανάλυση πραγματοποιήθηκε στο πλάσμα αφού αυτή η βιολογική μήτρα αντιπροσωπεύει μια καλύτερη πηγή cfDNA από ορό [1, 6]. Στη συνέχεια, χρησιμοποιήσαμε σχετικά σύντομη αμπλικόνια και για τις δύο προσδιορισμούς, και αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι το μήκος του θραύσματος μπορεί να επηρεάσουν την ευαισθησία της ανίχνευσης μετάλλαξης και μεθυλίωσης [5, 14, 15]. Έχουμε επίσης εξασφαλίζεται υψηλό επίπεδο ευαισθησίας του επιγενετικών δοκιμασίας με στόχευση ενός ειδικού CpG νησίδας, η οποία έχει βρεθεί πρόσφατα για να εμφανιστεί η υψηλότερη ευαισθησία στις αλλαγές μεθυλίωσης στην αλληλουχία αδένωμα-καρκίνωμα [9]. Τέλος, σύμφωνα με την Αμερικανική Εταιρεία Κλινικής Ογκολογίας και το Εθνικό Δίκτυο Comprehensive Cancer (NCCN), ένα υψηλό επίπεδο ποσοστό ανίχνευσης έχει ληφθεί για

KRAS

ανάλυση μετάλλαξης με τη στόχευση hotspots στο κωδικόνιο 12 και 13, οι οποίες είναι γνωστές να αντιπροσωπεύουν περίπου το 95% του συνόλου των μεταλλάξεων [16].

στην παρούσα μελέτη, η μεθυλίωση συγκεκριμένη qPCR και τελούν qPCR με βάση μεθόδους που χρησιμοποιήθηκαν για

SEPT9

μεθυλίωση και

KRAS

μετάλλαξη αναλύσεις, αντίστοιχα. Λόγω των σημαντικών τεχνολογικών εξελίξεων, νέων μεθόδων όπως η ψηφιακή PCR [17], Inteplex qPCR [14] τεχνολογία ακτινοβολούν [18], MethyLight ποσοτική ή MethyLight ψηφιακή PCR [19] και οι νέες βαθιές σειρές προσεγγίσεις [20] είναι πλέον διαθέσιμες, επιτρέποντας έτσι απόλυτη ποσοτικοποίηση των μεταλλαγμένων ή μεθυλιωμένων αλληλόμορφα σε πολύ χαμηλές συχνότητες και με χαμηλότερο ανακρίβεια από εκείνα που αναφέρονται εδώ. Ωστόσο, οι δοκιμασίες που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη αυτή είναι πιο ευρέως διαθέσιμα σε κλινικά εργαστήρια, και χαρακτηρίζονται επίσης από τη βέλτιστη ευαισθησία, να είναι σε θέση να ανιχνεύσει τουλάχιστον 2% μεταβολή σε ένα φυσιολογικό υπόβαθρο [21]. Ακόμη πιο σημαντικό, η αναλυτική απόδοση των γενετικών και επιγενετικών δοκιμασίες ήταν πολύ παρόμοια όσον αφορά την ευαισθησία και την ακρίβεια, επιτρέποντας έτσι την άμεση σύγκριση των δεδομένων από διαφορετικές αλλοιώσεις.

Το πρώτο μέρος της μελέτης, που διεξήχθη σε ολόκληρη την ομάδα των 85 ασθενών CRC, επιβεβαίωσε ουσιαστικά τις προηγούμενες ενδείξεις ότι η ανάλυση του

KRAS

και

SEPT9

στο πλάσμα μπορεί να θεωρηθεί ως μια αξιόπιστη εναλλακτική λύση στον ιστό. Η ιδιότητα του

KRAS

χρησιμοποιείται γενικά ως προγνωστικός δείκτης ανταπόκρισης στη ιδρύθηκε υποδοχέα επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) αναστολείς οφείλεται στο γεγονός ότι η μετάλλαξη

KRAS

συνδέεται με την αντίσταση στην αντι-EGFR μονοκλωνικά ανοσοθεραπεία αντισώματος με παράγοντες όπως centuximab ή panitumumab [22,23]. Αντιστρόφως, παρεκκλίνουσα μεθυλίωση στην περιοχή προαγωγέα του

SEPT9

γονίδιο έχει πειστικά προταθεί ως ευαίσθητη και ειδική βιοδείκτη για την πρόωρη μη επεμβατική διάγνωση του CRC [24].

Ακολουθώντας τις υποδείξεις προσφάτως προτείνει Wasserkort και coauthors [9], και στόχευση έτσι ένα συγκεκριμένο νησί CpG στον υποκινητή του

SEPT9

γονίδιο, βρήκαμε έναν πολύ υψηλό αριθμό hypermetylated δειγμάτων ιστών (82%), σε μεγαλύτερο βαθμό από ό, τι προηγουμένως αναφερθεί στην βιβλιογραφία (συνήθως κυμαίνεται μεταξύ 78 και 81%) [25]. Τα αποτελέσματα που λαμβάνονται σε αντίστοιχα δείγματα πλάσματος απεκάλυψε υψηλή παγκόσμια συμφωνία (86%) και η ειδικότητα (100%) σε σύγκριση με την ανάλυση του όγκου του ιστού. Στο ίδιο δείγμα, ένα

KRAS

μετάλλαξη ανιχνεύθηκε στο 34% των ασθενών, σύμφωνα με δεδομένα που λαμβάνονται σε άλλες ομάδες της CRC ασθενείς μη επιλεγμένων [10,26]. Η αντίστοιχη ανάλυση των δειγμάτων πλάσματος αποκάλυψε επίσης ένα υψηλό βαθμό αντιστοιχίας (89,4%) και η ειδικότητα (93%) σε σύγκριση με ιστό. Οι περισσότερες από τις μελέτες που συγκρίνουν τα αποτελέσματα από έναν προσδιορισμό cfDNA με ανάλυση του όγκου του ιστού που αναφέρθηκαν πολύ χαμηλότερη διαγνωστική απόδοση, με τιμές της ειδικότητας συνεχώς χαμηλότερη από 80% [27-29]. Κατ ‘εξαίρεση, μόνο δύο πρόσφατες μελέτες αναφερόμενες τιμές της ειδικότητας που περιλαμβάνεται μεταξύ 95,3% [30] και το 98% [14].

Στο δεύτερο μέρος της μελέτης, αναλύσαμε το ρυθμό της αντιστοιχίας μεταξύ των ιστών και πλάσματος φορτίο μετάλλαξης και ποσοστό μεθυλίωσης, και τα αποτελέσματα που λαμβάνονται με τις δύο δοκιμασίες στη συνέχεια συγκρίνονται. Στην υποομάδα των 27 ασθενών που φιλοξενούν ιστού γενετικών και επιγενετικών αλλαγών, η

KRAS

φορτίο μετάλλαξη κυμαινόταν από 1,8% έως 86,3% (σχεδόν 48 φορές), δείχνοντας έτσι υψηλότερη ατομικές ετερογένεια από το

SEPT9

ποσοστό μεθυλίωσης, η οποία κυμαίνεται από 12,2% έως 99,9% (δηλαδή, περίπου 8 φορές). Κατά τη μετάβαση από τον ιστό σε πλάσμα, πέντε δείγματα έγινε WT για την κατάσταση της μετάλλαξης και δύο πλέον υπερμεθυλίωση. Ο βαθμός μεθυλίωσης κινείται από τον ιστό προς το πλάσμα ήταν σχεδόν 3 φορές υψηλότερο από το ποσοστό του φορτίου μετάλλαξης, όπως προκύπτει από τη σύγκριση των δεικτών δύο p /t (24,2% έναντι 7,9% για το ρ /τ αναλογία

SEPT9

ποσοστό μεθυλίωσης και

KRAS

φορτίου μετάλλαξη, αντίστοιχα). Σε συμφωνία με πρόσφατες αναφορές, η διαπίστωση αυτή θα μπορούσε να εξηγηθεί από την ενδοογκική ετερογένεια του πρωτοπαθούς όγκου, η οποία εξασθενεί κατά προτίμηση γενετική αντί επιγενετικό ανάλυση [7, 31]. Παρ ‘όλα αυτά, δεδομένου ότι η απόκλιση που διαπιστώθηκε μεταξύ των αναλογιών δύο ρ /τ οφείλεται αποκλειστικά σε δεδομένα που λαμβάνονται σε καρκίνους πρώιμο στάδιο, ενώ κλωνική εξέλιξη που συνήθως συμβαίνει όταν η μετάσταση είναι η ανάπτυξη, η κλωνικότητας όγκου θα μπορούσε να εξηγήσει εν μέρει μόνο τα ευρήματά μας [32].

Για το

KRAS

ανάλυση, συγκρίσιμες τιμές του φορτίου μετάλλαξη ελήφθησαν από τις αρχές και προχωρημένους καρκίνους σε δύο ιστούς (26,9% έναντι 34,7%) και τα δείγματα πλάσματος (1,9% έναντι 4%), έτσι ώστε το p /t ανάλυση δεν έδειξε σημαντική διαφορά, σύμφωνα με τα στάδια του όγκου (8,6% έναντι 7,3%). Αντίθετα, μια στατιστικά σημαντική διαφορά δεν βρέθηκε για το

SEPT9

ανάλυση μεθυλίωσης μεταξύ p λόγου /τόνο στις αρχές και προχωρημένους καρκίνους (33,8% έναντι 19,0%, p = 0,0108). Αυτή η διακύμανση οφείλεται αποκλειστικά σε μια διαφορά στην τιμή του μεθυλίωση ανιχνεύθηκε στους ιστούς (57,2% έναντι 80,8%, p = 0,0009), δεδομένου ότι δεν βρέθηκαν διαφορές στα δείγματα πλάσματος (15,8% έναντι 12,9% για την πρόωρη vs προχωρημένα στάδια). Έτσι, η μετάβαση του DNA που φέρει το επιγενετικές μεταβολές στην κυκλοφορία σε καρκίνους πρώιμο στάδιο είναι φαινομενικά πιο συνεπής από τη μετάβαση του DNA που φιλοξενούν ένα

KRAS

μετάλλαξη. Σύμφωνα με τα πιο πρόσφατα στοιχεία της βιβλιογραφίας, αυτά τα στοιχεία θα μπορούσαν να ερμηνευθούν ως προκύπτουν από διαφορές στους τύπους συμμετοχή ιστών που παρατηρήθηκαν προηγουμένως για CRC γενετικές και επιγενετικές υπογραφές [33]. Συγκεκριμένα, ενώ το

SEPT9

παρεκκλίνουσα μεθυλίωση προέρχεται από επιθηλιακά κύτταρα και στη συνέχεια μεταφέρεται ταχέως σε στρωματικά κύτταρα [9], η

Οι KRAS μεταλλάξεις

που φιλοξενούνται από επιθηλιακά διαμέρισμα δεν συμμερίζονται στρωματικά κύτταρα [ ,,,0],34]. Κατά συνέπεια, η μοριακή cross-talk μεταξύ επιθήλιο του όγκου και το στρώμα που συνεπάγονται για το

SEPT9

επιγενετική μεταβολή θα μπορούσε να διευκολύνει τη μετάβαση της ανώμαλης DNA από πρωτοπαθή όγκο στην κυκλοφορία.

Επιπλέον, η συνολική χαμηλότερη βαθμός φορτίου μετάλλαξη σε σχέση με το ποσοστό μεθυλίωσης ανιχνεύεται σε ιστούς CRC (26,9% έναντι 57,2% στους καρκίνους πρώιμο στάδιο) θα μπορούσε να συμβάλει στην ενίσχυση του αποτελέσματος αραίωσης της άγριας τύπου

KRAS

DNA στην κυκλοφορία .

Εν κατακλείδι, τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης επιβεβαιώνουν ότι η ανάλυση cfDNA αντιπροσωπεύει μια κατάλληλη στρατηγική για την ολοκληρωμένη ανάλυση των όγκων γενετικών και επιγενετικών προφίλ, ακόμα και χρησιμοποιώντας μεθόδους ρουτίνας. Το πιο σημαντικό, παρείχαμε πρώτη απόδειξη ότι ο ρυθμός στον οποίο όγκου προερχόμενα cfDNA μπορεί να ανιχνευθεί στην κυκλοφορία όχι μόνο εξαρτάται από την ευαισθησία των μεθόδων που χρησιμοποιούνται και την πολυπλοκότητα της κινητικής απελευθέρωσης, αλλά επίσης και από τη φύση του ενιαίου μεταβολή. Σε μια εποχή που χαρακτηρίζεται από την αυξανόμενη χρήση των ολοκληρωμένες μελέτες γονιδιακής έκφρασης των συμπαγών όγκων για τη διαλεύκανση της πολυπλοκότητας των καρκινικών ιστών και της ετερογένειας των κυττάρων φαινοτύπων, η μελέτη μας υπογραμμίζει την ανάγκη να χαρακτηρίσει καλύτερα καρκίνο συγκεκριμένες γενετικές και επιγενετικές υπογραφές σύμφωνα με διαφορετικά τμήματα του όγκου, έτσι ότι η σημασία και η κλινική αξία της εκτίμησης cfDNA μπορεί να βελτιωθεί τελικά.

Επιπλέον επιβεβαιωτική μελέτες μπορούν να υποστηρίζουν την υπόθεση έχει ήδη προταθεί από ορισμένους συγγραφείς, σύμφωνα με την οποία η ανάλυση των cfDNA αντιπροσωπεύει μια πολύτιμη εναλλακτική λύση στην ανάλυση του ιστού, αλλά μπορεί επίσης να γίνει η πρώτη επιλογή τόσο για γενετικές και επιγενετικές χαρακτηρισμό του όγκου παρέχοντας μια καλύτερη συνολική πορτρέτο των κακοήθων νόσων [5, 14, 29, 30].