Αφηρημένο

KRAS

μεταλλάσσεται σε ~ 40% του καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC), και υπάρχουν περιορισμένες αποτελεσματικές θεραπείες για προχωρημένους

KRAS

μεταλλαγμένο CRC. Ως εκ τούτου, είναι σημαντικό ότι οι μεταγενέστεροι μεσολαβητές των ογκογόνων KRAS συνεχίσει να μελετηθεί. Εντοπίσαμε p190RhoGAP ως φωσφορυλιώνεται στην κυτταρική σειρά DLD1 CRC, το οποίο εκφράζει μια ετερόζυγη

KRAS

αλληλόμορφο G13D, και όχι σε DKO4 στην οποία το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο έχει διαγραφεί από σωματικών ανασυνδυασμού. Βρήκαμε ότι ένα πανταχού παρόν εταίρο δέσμευσης του p190RhoGAP, p120RasGAP (RasGAP), εκφράζεται σε πολύ χαμηλότερα επίπεδα σε κύτταρα DKO4 σύγκριση με DLD1, και αυτή η έκφραση ρυθμίζεται από KRAS. Διάσωση της έκφρασης RasGAP σε DKO4 διασωθεί ενεργοποίηση μονοπατιού Rho και μερικώς διασωθεί ογκογονικότητα σε κύτταρα DKO4, υποδεικνύοντας ότι ο συνδυασμός του μεταλλαγμένου KRAS και έκφραση RasGAP είναι ζωτικής σημασίας για αυτούς τους φαινοτύπους. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι RasGAP είναι ένα σημαντικό τελεστής του μεταλλαγμένου KRAS σε CRC

Παράθεση:. Οργάνου SL, Hai J, Radulovich Ν, Marshall CB, Leung L, Sasazuki T, et al. (2014) p120RasGAP είναι ένας μεσολαβητής του Rho μονοπάτι ενεργοποίησης και Ογκογονικότητα στην γραμμή κυττάρων DLD1 καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 9 (1): e86103. doi: 10.1371 /journal.pone.0086103

Επιμέλεια: Ιουλιέτα Spencer, Πανεπιστήμιο του Σαν Φρανσίσκο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 28 Οκτώβρη 2013? Αποδεκτές: 5 Δεκεμβρίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 21 Ιανουαρίου, 2014

Copyright: © 2014 Οργάνου et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίζεται σε μέρη με επιχορηγήσεις από τις καναδικές Ινστιτούτα Ερευνών Υγείας MOP-64345 (MST), Cancer Research Society of Canada (ΜΙ), και το Υπουργείο Υγείας του Οντάριο και της μακροχρόνιας περίθαλψης. SLO υποστηρίζεται από το CIHR Banting και Βραβείο Καλύτερης Διδακτορικής Έρευνας. MI κατέχει την προεδρία του Καναδά Έρευνα στον Καρκίνο Δομική Βιολογία. MST είναι ο πρόεδρος Μ Κασίμ Choksi στον Καρκίνο του Πνεύμονα Translational Research. Η εγκατάσταση UHN NMR υποστηρίζεται από το Ίδρυμα του Καναδά για την Καινοτομία. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

στη Βόρεια Αμερική, καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC) είναι η τρίτη πιο διαδεδομένη μορφή καρκίνου στους άνδρες και στις γυναίκες. Το 2013, εκτιμάται ότι πάνω από 100.000 νέες περιπτώσεις θα διαγνωστούν στις Ηνωμένες Πολιτείες, με αποτέλεσμα πάνω από 50.000 θανάτους [1]. Αν και το ποσοστό θανάτου από καρκίνο του παχέος εντέρου έχει μειωθεί κατά 3% κατά τα τελευταία δέκα χρόνια [1], μεταστατική νόσο, με πιο γνωστή στο ήπαρ, θα αναπτύξει σε 30% έως 40% των ασθενών CRC, και το 50% θα πεθάνουν από CRC υποτροπής [2]. Η χειρουργική εκτομή είναι το πρότυπο για τη θεραπεία της πρόωρης CRC στάδιο, αλλά περιορισμένη αποτελεσματικές θεραπείες είναι διαθέσιμες για ασθενείς με προχωρημένο [3]. Η ανάπτυξη του CRC περιλαμβάνει μια διαδικασία πολλών σταδίων με τη συσσώρευση των δύο γενετικές και επιγενετικές μεταβολές, καθώς και οι μεταβολές της οδού KRAS [4].

KRAS

ενεργοποιώντας μεταλλάξεις συμβαίνουν σε περίπου 40-50% των CRC, με τα πιο κοινά μεταλλάξεις που βρέθηκαν στο κωδικόνιο 12 (-80%) και το κωδικόνιο 13 (~ 20%).

Σήμερα , τα νεότερα εγκεκριμένες θεραπείες για CRC είναι με τον υποδοχέα του παράγοντα στοχευμένες επιδερμικού αυξητικού αναστολείς (EGFR), όπως cetuximab και panitumumab σε συνδυασμό με χημειοθεραπεία. Ωστόσο, μόνο οι ασθενείς με άγριου τύπου

KRAS

αντλούν σημαντικό κλινικό όφελος από αυτή τη θεραπεία, όπως εκείνοι με

KRAS

μεταλλάξεις δεν δείχνουν ένα σημαντικό όφελος επιβίωσης [5]. Ως εκ τούτου, οι τρέχουσες μελέτες με σκοπό την εξεύρεση νέων κατάντη επενεργητές του μεταλλαγμένου

KRAS

ότι μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε συνδυασμό για την αναστολή της σηματοδότησης από αυτή την οδό.

Η δραστηριότητα του RAS άγριου τύπου είναι στενά ελεγχόμενη από οικογένειες GTP-άσης ενεργοποίησης πρωτεΐνες (διάκενα), οι οποίες απενεργοποιούν RAS διευκολύνοντας την υδρόλυση του δεσμευμένου GTP, και παράγοντες ανταλλαγής GTP (GEFs), οι οποίες διευκολύνουν την απελευθέρωση του ΑΕΠ ώστε RAS μπορούν και πάλι να δεσμεύσει GTP [6]. Από την μεγάλη οικογένεια των RasGAPs που είναι τώρα γνωστό, ένα από τα πρώτα προσδιορίζονται και πιο εκτεταμένα μελετηθεί είναι p120RasGAP, ή απλά RasGAP, το προϊόν της

RASA1

γονίδιο [7], [8]. Η διακοπή του

RASA1

γονιδίου σε ποντικούς οδηγεί σε εμβρυϊκά θνησιμότητα σε Ε10.5, λόγω παρεκκλίνουσα ανάπτυξη καρδιαγγειακού συστήματος [9]. Τα διαγονιδιακά έμβρυα ποντικού που δημιουργήθηκαν από μεσολάβηση RNAi

RASA1

knockdown σε κύτταρα ES έδειξε ότι η σοβαρότητα των αγγειακών ελαττωμάτων συσχετίζεται με το επίπεδο έκφρασης του υπολειμματικού RasGAP, και ψηφιδωτό έμβρυα αναπτύσσονται εντοπισμένη ελαττώματα [10]. Σύμφωνα με αυτές τις μελέτες ποντίκι, μεταλλάξεις στο

RASA1

γονίδιο έχουν συνδεθεί με οικογενή τριχοειδή φλεβική σύνδρομα δυσμορφία που μπορεί να παρουσιάσει με ένα ευρύ φάσμα των φαινοτύπων, συνηθέστερα ότι γνωστό ως «λεκές κρασί port» [11] [12], [13], [14], [15]. Πρόσφατες πρωτεομική ανάλυση αυτών των δερματικών αλλοιώσεων έδειξε σταθερή μειωμένη έκφραση RasGAP σύγκριση με περιβάλλοντα φυσιολογικό ιστό [16]. Αυτό υποδηλώνει κοινού ότι

RASA1

διαδραματίζει κρίσιμο ρόλο στην αγγειογένεση και την αγγειακή ανάπτυξη. Ωστόσο, αν και διαμόρφωση πρωτεΐνη RasGAP έχει βρεθεί σε πολλά νεοπλάσματα, συμπεριλαμβανομένων χρόνιας μυελογενούς λευχαιμίας [17], αστροκύτωμα [18], τροφοβλαστική όγκους [19], του καρκίνου του προστάτη [20], ο καρκίνος του ήπατος [21], και καρκίνωμα βασικών κυττάρων [22 ], τα επίπεδα πρωτεΐνης έχουν όχι απαραίτητα βρέθηκε να συσχετίζεται με δραστικότητα RAS ή τη σοβαρότητα του καρκίνου [22], [23]. Ως εκ τούτου, ο ρόλος των RasGAP στον καρκίνο Απομένει να διευκρινιστεί.

Η διαμόρφωση του τομέα SH2-SH3-SH2 στην Ν-τελική περιοχή της RasGAP έχει από καιρό προτείνει στους ερευνητές ότι RasGAP θα μπορούσε να παίξει ένα ρόλο ως έναν προσαρμογέα σηματοδότηση πρωτεΐνη, συμβάλλοντας στην, καθώς επίσης και όντας ανεξάρτητη από, GAP δραστηριότητα της [7], [24]. Σημαντικά, αυτές οι περιοχές βρέθηκαν να δεσμεύονται με φωσφορυλιωμένη τυροσίνη p190RhoGAP (εδώ αναφέρεται ως RhoGAP) σε απόκριση στην ανάντη δραστικότητα κινάσης και κυτταρικής προσκόλλησης [25], [26], [27]. Το εύρημα αυτό παρείχε την πρώτη μηχανιστική στοιχεία για μια σχέση μεταξύ της ενεργοποίησης RAS και Rho σηματοδότηση μονοπατιού. Η ομάδα μας έχει πρόσφατα διαπίστωσε ότι RhoGAP γίνεται φωσφορυλιωμένη τυροσίνη κατάντη της γ-ΜΕΤ σηματοδότησης στο μεταλλαγμένο DLD1

KRAS

CRC κυτταρική γραμμή [28]. Ως εκ τούτου, ζήτησε να προσδιοριστεί ο ρόλος των ενεργών KRAS στην αλληλεπίδραση RhoGAP-RasGAP, και το αποτέλεσμα αυτής της αλληλεπίδρασης σε καρκινικά κύτταρα CRC.

Πειραματικές Διαδικασίες

Κυτταρική καλλιέργεια

DLD1 (ATCC, Manassas, VA) είναι μία κυτταρική σειρά ορθοκολικού καρκίνου που είναι ετερόζυγο για το G13D

KRAS

μετάλλαξη. κύτταρα DKO4 προήλθαν από DLD1 με διάσπαση του μεταλλαγμένου

KRAS

αλληλόμορφο δια σωματικής ανασυνδυασμό [29]. Αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές αναπτύχθηκαν σαν ρουτίνα σε Τροποποιημένο μέσο Eagle του Dulbecco (DMEM) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS).

τροποποίηση της γονιδιακής έκφρασης

Ο RASA1 υπερεκφράζουν λεντοϊού φορέας κατασκευάστηκε χρησιμοποιώντας το Σύστημα πύλη ανασυνδυασμού (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA). διάνυσμα εισόδου που περιέχουν είτε CMV προαγωγό ή RASA1 ORF (OpenBiosystems, ThermoScientific, Ottawa, ON) συνδυάστηκαν με φορέα Plenti-CMV-GFP-DEST (Addgene πλασμίδιο 19732) δημιουργώντας pLentiCMV και pLentiRASA1. κύτταρα ΗΕΚ293Τ επιμολύνθηκαν με αυτούς τους φορείς Plenti και φορείς λεντοϊού συσκευασία όπως περιγράφηκε προηγουμένως [30]. Viral υπερκείμενα συλλέχθηκαν, διηθήθηκαν, και χρησιμοποιήθηκε για να μολύνει κύτταρα στόχους σε παρουσία 4 μg /mL πολυβρένιο (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ). 72 ώρες μετά την μεταγωγή, κύτταρα ταξινομήθηκαν ως προς την έκφραση GFP. Για KRAS μεταλλαγμένο υπερέκφραση, ρετροϊοί παράχθηκαν με επιμόλυνση κυττάρων Phoenix συσκευασία οικοτροπικό με τον ρετροϊικό φορέα που περιέχει pBABEpuro είτε άγριου τύπου KRAS-4Β, το μεταλλαγμένο

KRAS

κατασκευάσματα, ή κενό φορέα χρησιμοποιώντας FuGENE 6 αντιδραστηρίου επιμόλυνσης (Promega, Madison, WI). Οι ρετροϊικοί υπερκείμενα συλλέχθηκαν ως ανωτέρω, και τα κύτταρα επιλέχθηκαν με 0,5 μg /mL πουρομυκίνη (ICN Biomedicals, Irvine, CA) έως ότου δεν υπάρχουν μη επιμολυσμένα κύτταρα ελέγχου αφέθηκαν ζωντανός.

Ανοσοκαθίζηση και στύπωμα Western

τα κύτταρα λύθηκαν σε 1% Triton-X 100 ρυθμιστικό διάλυμα (1% Triton Χ-100, 10% γλυκερίνη, 50 mM Hepes, 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 10 mM πυροφωσφορικό νάτριο, 100 mM NaF, 10 mM Na

4P

2O

4, 1 mM EDTA, 1 mM ορθοβαναδικό νάτριο συν ένα πλήρες mini EDTA-free δισκίο αναστολέα πρωτεάσης (Roche, Laval, Κεμπέκ), αφέθηκε να ξεκουραστεί σε πάγο για 10 λεπτά και στη συνέχεια καθαρίζεται με φυγοκέντρηση στα 14.000 g στους 4 ° C για 30 λεπτά. τυποποίηση συγκέντρωση πρωτεΐνης εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας Bradford αντιδραστήριο δοκιμασίας πρωτεΐνης (Bio-Rad, Hercules, CA). για ανοσοκαταβυθίσεις, συγκέντρωση πρωτεΐνης εξισωθεί μεταξύ δειγμάτων, και προϊόντα λύσης συνδυάστηκαν με 2-5 μλ αντισώματος και αφέθηκε να ροκ όλη τη νύκτα στους 4 ° C. 30 μΐ πρωτεΐνης G PLUS-αγαρόζης (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) σε συνδυασμό με τα προϊόντα λύσης και ανακινείται για 1 ώρα στους 4 ° C. Ανοσοκαταβυθισμένες πρωτεΐνες στη συνέχεια πλύθηκαν 3χ με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης, που εκλούεται με 20 μί 2xSDS ρυθμιστικό δείγματος και ζέση για 5 λεπτά. Ολόκληρο lyates κύτταρο κανονικοποιήθηκαν για συγκέντρωση πρωτεΐνης, σε συνδυασμό με ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος 6xSDS και έβρασαν για 5 λεπτά, καθώς και. Τα προϊόντα λύσης στη συνέχεια φορτώθηκε σε μια κλίση 4-20% SDS γέλη πολυακρυλαμιδίου (Bio-Rad) και τρέχει στα 120 V. Τα πηκτώματα μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF πριν μπλοκαριστεί είτε με 5% ξηρό αποβουτυρωμένο γάλα σε TBST ή 5% BSA σε TBST για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια ανιχνεύθηκαν όλη τη νύχτα με κατάλληλο αντίσωμα. Westerns ανιχνεύθηκαν με κατάλληλο δευτερογενές αντίσωμα, αντέδρασε με ECL Prime (GE Healthcare, Piscataway, NJ) και εκτίθεται σε φιλμ XRAY για το κατάλληλο χρονικό διάστημα. Αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες:. RasGAP κλώνος B4F8 και αντι-φωσφοτυροσίνης κλώνος 4G10 (EMD Millipore, Billerica, ΜΑ), p190A-RhoGAP (Cell Signaling, Danvers, ΜΑ), GAPDH και KRAS 4Β κλώνος F234 (Santa Cruz Biotechnology)

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR

Ολικό RNA (1-2 μα) απομονώθηκε από κυτταρικές σειρές και ιστούς χρησιμοποιώντας ένα κιτ Qiagen RNeasy (Qiagen, Hilden, Germany) και μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας με SuperScript ΙΙΙ ανάστροφης μεταγραφάσης (Invitrogen, Life Technologies, Burlington, ΟΝ). Ένα 10 ng ισοδύναμο cDNA χρησιμοποιήθηκαν για κάθε ποσοτικό προσδιορισμό PCR (qPCR) εκτελέστηκε με το Stratagene Mx3000p Σύστημα Ανίχνευσης Αλληλουχίας, χρησιμοποιώντας SYBR πράσινο 2 × κύριο μείγμα. Εκκινητές που χρησιμοποιούνται είναι:

GAPDH F – CCCCCACCACACTG,

GAPDH R – GCCCCTCCCCTCTTCAAG

RPS13 F – GTTCTGTTCGAAAGCATTG

RPS13 R – AATATCGAGCCAAACGGTGAA

RASA1 F – GGACGAAGGTGACTCTCTGGAT

RASA1 R – GGAGGAGCGGTCAACGGTAT

KRASF – CAGGCTCAGGACTTAGCAAGAAG

KRASR-TGTTTTCGAATTTCTCGAACTAATGTA

Προβλεπόμενη σειρές προϊόντων της PCR επαληθεύθηκαν με τη χρησιμοποίηση BLAST για την αναγνώριση αλληλουχιών στόχου και μη στόχου. Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με τη χρήση του δέλτα-δέλτα μέθοδο Ct, ομαλοποίηση έναντι του μέσου όρου των δύο γονιδίων καθαριότητας.

προσδιορισμοί κυττάρων με βάση

καταμέτρηση των κυττάρων.

5 × 10

3 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλήρη μέσα άνευ ορού, εις τριπλούν, για 5 ημέρες από την καταμέτρηση σε μία πλάκα 24 φρεατίων. Ξεκινώντας στις 72 ώρες μετά την επίστρωση, οι 3 φρεάτια από κάθε κυτταρική σειρά με θρυψίνη και στη συνέχεια μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας έναν μετρητή κυττάρου Beckman Coulter Z2 (Beckman-Coulter, Brea, CA).

δοκιμασία προσκόλλησης κυττάρου.

1 × 10

5 κύτταρα σπάρθηκαν σε ένα πιάτο 24 φρεατίων επικαλυμμένες με κολλαγόνο 0,01% PureCol (Sigma-Aldrich) για 15 λεπτά. Τα φρεάτια χρώσθηκαν με 0,2% κρυσταλλικό ιώδες και λύονται με 0,1% Triton Χ-100. Το λύμα διαβάστηκε στα 590 nm σε αναγνώστη πλακός Tecan XFlour4 (Μάνερντορφ, Ελβετία).

κυτταρική ανάλυση κινητικότητας.

7 × 10

4 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε 70 μί πλήρους ορού μέσα σε κάθε πλευρά ενός μ-πιάτο ενθέτου κυτταρικής καλλιέργειας (Ibidi, Planegg, Γερμανία) σε μια πλάκα καλλιέργειας κυττάρων των 24 φρεατίων και αφέθηκαν να αναπτυχθούν για 72 ώρες ή μέχρι ένα συρρέουσα μονοστιβάδα επιτεύχθηκε. Το ένθετο αφαιρέθηκε και μέσα αλλάχθηκαν για DMEM χωρίς ορό. εικόνες αντίθεσης φάσης αποκτήθηκαν από την Zeiss Axio Παρατηρητής χρησιμοποιήθηκε για να λάβει μια φωτογραφία σε 32 × μεγέθυνση σε αυτό το σημείο (χρόνος 0) και κάθε 24 ώρες μετά. Η ανάλυση εικόνας πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [31]. Εικόνα-Pro Plus λογισμικό (MediaCybernetics, Rockville, MD) χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των προσδιορισμών επούλωση της πληγής. Χρησιμοποιώντας άκρη και κατάτμηση φίλτρα, περιοχές με μεγάλες διακυμάνσεις έντασης των εικονοστοιχείων (κύτταρα) εμφανίζονται ελαφρά, ενώ ομαλή περιοχές της εικόνας (πληγή) εμφανίζονται με σκούρο χρώμα. Η φιλτραρισμένη εικόνα στη συνέχεια μετατρέπεται σε δυαδική εικόνα εφαρμόζοντας ένα κατώφλι pixel και η περιοχή του τραύματος προσδιορίσθηκε με μέτρηση του αθροίσματος των pixels εκχωρηθεί. Το ποσό pixel εκφράστηκε στη συνέχεια ως το κλείσιμο τοις εκατό του τραύματος, όπου το μηδέν pixels στην πληγή αντιπροσωπεύει το 100% κλείσιμο.

ανοσοφθορισμού

Γυάλινες πλάκες θαλάμου (BD Biosciences, San Jose, CA) επιστρώθηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με 0.01% κολλαγόνο σε PBS. Trypsanised κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε DMEM + 5% BSA, απλώθηκαν σε πλάκες και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα. Τα πλακίδια στη συνέχεια πλύθηκαν μία φορά με PBS και σταθεροποιήθηκαν με παραφορμαλδεΰδη για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα κατέστησαν διαπερατά με 0,01% Tween-20 σε PBS για 20 λεπτά, αποκλείστηκαν με 3% BSA σε PBS και βάφτηκαν με 1:300 ροδαμίνη phalloidin για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Γυάλινες καλυπτρίδες εφαρμόστηκαν με Vectashield που περιείχε ϋΑΡΙ (Vector Laboratories, Burlingame, CA) για την πυρηνική χρώση. Εικόνες που παρουσιάζονται εδώ ελήφθησαν σε 43 × μεγέθυνση με ένα φακό εμβάπτισης σε λάδι σε ένα συνεστιακό μικροσκόπιο Zeiss LSM 700.

CRC συλλογής δειγμάτων

Τα δείγματα ασθενούς ιστού ελήφθησαν από το UHN snap-κατεψυγμένα τράπεζα ιστών μετά την έγκριση από το Διοικητικό συμβούλιο UHN Δεοντολογίας Έρευνας. Όλοι οι ιστοί συλλέχθηκαν μέσα σε 30 λεπτά από εκτομή και καταψύχονται σε υγρό άζωτο καθώς και να φορμόλη σταθερό και ενσωματωμένα σε παραφίνη (FFPE), και η ποιότητά τους έχει ελεγχθεί από ιστολογία. Οι ιστοί που περιλαμβάνονται 63 πρωτογενείς καρκίνους του παχέος εντέρου και 30 μεταστατικό ορθοκολικό καρκίνου. Οι μεταστατικοί όγκοι ήταν από το ήπαρ (22 περιπτώσεις) και πνεύμονα (8 περιπτώσεις) δείγματα metastasectomy.

μετάλλαξη RASA1 ανάλυση

cDNA απομονώθηκε από κυτταρικές σειρές ιστούς ασθενούς όπως περιγράφεται παραπάνω από ολικό RNA.

RASA1

cDNA ενισχύθηκε πρώτα με 6 σετ εκκινητών για να καλύψει το μήκος του γονιδίου, και αλληλούχιση διεξήχθη επί του ενισχυμένου DNA με αυτές τις ίδιες αντίστοιχες εκκινητές, οι οποίες έχουν ως εξής:

F1 – CTCAGCCTGGGGAGCTGAAGG

R1 – TGGAGGAGCGGTCAACGGTATG (bp 2-649)

F2 – GGCCTCGGGACAGTGGACGA

R2 – GGGCCTCACAAGAAAACTGCAGAC (bp 563 με 1252)

F3-AGGTGGGCCGGGAAGAAGATCC

R3-TCCAATCCTCTGCTTGTTCTGGAGT (bp 1131-1823)

F4-TGGCAGGCCAAACTGTTTTCAGA

R4-TGCTGGCCAGTAGTGTTCGGT (bp 1723-2381)

F5-CCGAACACTACTGGCCAGCATCC

R5 – TGACACCTTCCATGTAGGGCTCC (bp 2362-2987)

F6-CGACTCATCTGTCCTGCCATCCT

R6 – CTGGGGCGAAGGCTGCTACC (bp 2825 έως 3277)

Για την ενίσχυση PCR, 0,3 ul κάθε της προς τα εμπρός και αντίστροφοι εκκινητές (50 υΜ) προστέθηκαν σε 6 μΐ cDNA (20 ng /ul), 12,5 μΙ 2χ Taq επιλέξτε DNA πολυμεράση, 0.2 μΙ 25 mM dNTP και υπερ-καθαρό νερό (Sigma-Aldrich) για να ένα συνολικό όγκο 25 ιιΐ για κάθε αντίδραση. Οι συνθήκες κυκλοποίησης ήταν: 95 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 39 κύκλους, με μετουσίωσης στους 95 ° C για 45 «, ανόπτηση στους 64 ° C για 45», και επέκταση στους 72 ° C για 1 λεπτό, μία επώαση 10 λεπτών στους 72 ° C ακολουθούμενη από 4 ° C. 5 ul προϊόντος PCR ελέγχθηκε σε μία γέλη αγαρόζης 2%. Το PCR προϊόν καθαρίστηκε με ExoSAP-IT (Affymatrix, Santa Clara, CA).

Για την επικύρωση αλληλούχιση σε γενωμικού DNA, οι ίδιες μέθοδοι χρησιμοποιήθηκαν ως ανωτέρω, χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους εκκινητές για την ενίσχυση και το εξώνιο ακολουθία 16 :

F – CGCTGCCAGTTGAGCCGATTACA

R – CTCTGGCATCATTGTGCTACTAAGC

Real-Time NMR δραστηριότητα GAP δοκιμασία

τα επισημασμένα τομέα ΟΤΡάσης των RAS 1-171 εκφράστηκαν από pET15b φορείς σε

Ε. coli

σε Μ9 μέσο συμπληρωμένο με

χλωριούχο αμμώνιο 15N και καθαρίστηκε με χρωματογραφία συγγένειας Νϊ-ΝΤΑ. ετικέτες His απομακρύνθηκαν με διάσπαση θρομβίνης και μονομερή ΟΤΡάσες καθαρίστηκαν περαιτέρω με χρωματογραφία μοριακής διήθησης (Superdex 75) [32], [33]. Τα δείγματα συμπυκνώθηκαν, και εάν είναι απαραίτητο ανταλλάσσονται σε ρυθμιστικό NMR (π.χ., 25 mM HEPES ρΗ 7,0, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl

2, 1 mM DTT, και 10% D

2O).

Για την ανίχνευση ενδογενή υδρόλυση GTP, ένα δείγμα GTP-φορτωμένο παρασκευάστηκε με επώαση της πρωτεΐνης RAS (~ 10 λεπτά στους 37 ° C ή και περισσότερο σε θερμοκρασία δωματίου) με την παρουσία 10-πλάσια μοριακή περίσσεια GTP και 10 mM EDTA [34 ]. Μετά την ανταλλαγή, MgCl

2 προστίθεται σε μια τελική συγκέντρωση 20 mM για τη σταθεροποίηση του πρόσφατα δεσμευμένο νουκλεοτίδιο, και το δείγμα διέρχεται μέσω στήλης διήθησης πηκτής ή αφαλάτωση (PD MidiTrap ™ G-25 (GE Healthcare) εξισορροπημένη με NMR ρυθμιστικό διάλυμα για να απομακρυνθεί η περίσσεια νουκλεοτίδιο και το εκλουόμενο δείγμα στη συνέχεια γρήγορα συμπυκνώθηκε και καταψύχθηκαν.

τα κύτταρα συλλέχθηκαν με απόξεση σε ελάχιστο όγκο (150 μΐ για μία πλάκα 10 cm) του ρυθμιστικού λύσης όπως περιγράφεται για κηλίδωση Western, τότε εκκαθαρίζονται με σύντομη φυγοκέντρηση (16.000 g για 30 s) και της συνολικής κυτταρικής πρωτεΐνης στο υπερκείμενο αναλύθηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο δοκιμασίας Bradford (BioRad) για την τυποποίηση της ποσότητας πρωτεΐνης που χρησιμοποιούνται σε κάθε δοκιμασία. Μία συγκέντρωση 10-20 μg /μl ολική πρωτεΐνη στο προϊόν λύσης επιτεύχθηκε και 35 ug σε 3,5 μΙ προστέθηκε στο καθαρισμένο GTP-δεσμευμένη RAS θραύσμα.

η συλλογή δεδομένων στη συνέχεια, κινήθηκε όσο το δυνατόν ταχύτερα. ζωές μισοί από αντιδράσεις αρχικά εκτιμήθηκε με οπτική επιθεώρηση των φασμάτων, τότε, το κλάσμα του ΑΕΠ δεσμευμένου ΟΤΡάσης παρόν σε κάθε χρονικό σημείο αξιολογήθηκε από αρκετά ζεύγη κορυφών και τα δεδομένα προσαρμόσθηκαν σε μία λειτουργία μονής φάσης εκθετική αποσύνθεση για να ληφθούν οι τιμές συναλλάγματος /υδρόλυσης [35].

δραστικότητα RAS δοκιμασία

τα κύτταρα στερήθηκαν ορού για 24 ώρες και στη συνέχεια προσδιορίστηκαν για ενεργή RAS χρησιμοποιώντας το κιτ ενεργοποίησης RAS (Millipore) σύμφωνα με τις οδηγίες. Εν συντομία, τα κύτταρα λύθηκαν σε 1 χ ρυθμιστικό διάλυμα λύσης MLB και ίσες ποσότητες πρωτεΐνης αναμίχθηκαν με τα RAS-πεδίο σύνδεσης του RAF1 συγχωνευμένο με γλουταθειόνη-

S

-transferase και συζευγμένο με γλουταθειόνη-sepharose σφαιρίδια. Μετά από ανάδευση στους 4 ° C για 1 ώρα, τα σφαιρίδια πλύθηκαν στο ίδιο ρυθμιστικό λύσης και επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος 2χ SDS. Κηλίδωση Western προχώρησε όπως περιγράφεται παραπάνω.

δοκιμασία υποδόρια ογκογενετικότητας

Ηθική δήλωση.

Όλοι οι χειρισμοί έγιναν για την ελαχιστοποίηση της ταλαιπωρίας των ζώων, σύμφωνα με τα πρωτόκολλα που εγκρίθηκε από το Αντικαρκινικό Ινστιτούτο του Οντάριο (OCI) Επιτροπή Φροντίδας ζώων με αριθμό πρωτοκόλλου χρήση ζώων ΠΑΧ 736,9.

Σοβαρή συνδυάζουν ανοσοανεπάρκεια (SCID) εκτράφηκαν στο χώρο του ξενοδοχείου και έλαβε από το Ινστιτούτο Οντάριο Καρκίνου (OCI, Toronto, ON). Ένα εκατομμύριο κύτταρα ενέθηκαν υποδορίως στην δεξιά περιοχή του ώμου του 4- έως 6-εβδομάδων ποντίκια SCID αρσενικούς (n = 5-8 ανά κυτταρική σειρά). Μόλις οι όγκοι ήταν ψηλαφητοί αυτοί μετρήθηκαν κάθε 3 ημέρες μέχρις ότου επετεύχθη τελικά σημεία ευθανασίας, η οποία ήταν είτε όταν οι όγκοι έφθασαν 1,5 cm, ή όταν έγιναν έλκος στο σημείο της δυσφορίας των ζώων. Ο όγκος του όγκου μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο (μήκος χ πλάτος

2) x π /6. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία με τη χρήση CO

2, όπως έχει εγκριθεί από την Επιτροπή Φροντίδας Ζώων OCI, οι όγκοι αποκόπηκαν και μερίδες ήταν είτε καταψύχθηκαν γρήγορα σε υγρό άζωτο για το DNA και πρωτεϊνών απομόνωση ή σταθεροποιήθηκαν σε φορμαλίνη για εμβάπτιση σε παραφίνη και ανοσοϊστοχημική χρώση. Για στατιστική ανάλυση, ένα γραμμικό μικτά αποτελέσματα (LME) μοντέλο χρησιμοποιήθηκε για να ενσωματώσει την υψηλή συσχέτιση που συμβαίνουν μεταξύ των μετρήσεων που λαμβάνονται με το ίδιο ποντίκι. Όλες οι μετρήσεις όγκου των όγκων τετραγωνικής ρίζας μετατραπεί για τη σταθεροποίηση της διακύμανσης και τιμή p Wald χρησιμοποιήθηκε για να καταδειχθεί η σημασία.

Αποτελέσματα

Απώλεια RasGAP οδηγεί σε απώλεια της φωσφορυλίωσης RhoGAP

Για να μελετήσει περαιτέρω το ρόλο της φωσφορυλίωσης RhoGAP στα κύτταρα DLD1, διερευνήσαμε την αλληλεπίδρασή του με RasGAP, έναν από τους σημαντικότερους εταίρους της δέσμευσης. Ταυτόχρονα, θα θέλαμε να γνωρίζουμε εάν η απώλεια των μεταλλαγμένων

KRAS

στο ισογονιδιακές παράγωγο κυτταρική σειρά DKO4 θα έχει επίδραση σε αυτή την αλληλεπίδραση. Βρήκαμε ότι RhoGAP μπορούσε να φωσφορυλιώνεται μόνο σε κύτταρα DLD1, όχι σε DKO4, ενώ τα συνολικά επίπεδα RhoGAP παραμένουν αμετάβλητες. Αυτή η φωσφορυλιωμένη RhoGAP συν-ανοσοκαταβυθίζεται με RasGAP (Σχήμα 1Α). Επιπλέον, βρήκαμε ότι η έκφραση του RasGAP δεν ήταν ανιχνεύσιμη στον DKO4 κυτταρική γραμμή (Σχήμα 1Α). Έχει αναφερθεί ότι η φωσφορυλίωση RasGAP παρουσιάζεται συχνά κατάντη σηματοδότησης υποδοχέα κινάσης τυροσίνης [18], [36], [37], [38], [39]. Ωστόσο, βρήκαμε ότι η κύρια φωσφορυλιωμένη τυροσίνη μπάντα που εμφανίζεται μετά ανοσοκαταβύθιση RasGAP ήταν στην πραγματικότητα σε ~190 kDa, πιθανότατα αντιπροσωπεύουν RhoGAP (Σχήμα 1Α), υποδεικνύοντας ότι η ίδια η RasGAP δεν είναι ιδιαίτερα φωσφορυλιωμένη σε αυτά τα κύτταρα.

Α) RhoGAP και RasGAP ανοσοκαταβυθίστηκαν από κύτταρα DLD1 και DKO4. Τα ανοσοϊζήματα υποβλήθηκαν σε κηλίδωση Western και διερευνήθηκαν για τη συνολική φωσφοτυροσίνη, RasGAP και RhoGAP. Κηλίδωση Western των προϊόντων λύσης ολικού κυττάρου (Α) και RT-QPCR (C) χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί η συνολική πρωτεΐνη και τα επίπεδα mRNA αντίστοιχα σε αυτές τις κυτταρικές γραμμές.

Η

RasGAP έκφραση χάνεται σε κύτταρα DKO4

Βρήκαμε ότι, ενώ η κυτταρική γραμμή DKO4 εξέφρασε λίγο ή καθόλου πρωτεΐνη RasGAP σε σύγκριση με DLD1, τα επίπεδα του mRNA της

RASA1

γονίδιο παρέμεινε στο 50% της μητρικής κυτταρικής σειράς (Εικόνα 1, B & amp? ΝΤΟ). Πραγματοποιήσαμε συστοιχίες SNP την εξέταση των πιθανών αριθμός αντιγράφων μεταβολές μεταξύ αυτών των ισογενετικών ζεύγη κυττάρων. Βρήκαμε πολύ μικρή διαφορά μεταξύ των δύο κυτταρικών σειρών (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ένα παρόμοιο αποτέλεσμα βρέθηκε πρόσφατα σε μια σειρά εναλλακτικών κλώνων (DKO3 και DKO1) που προέρχονται από το μοντέλο DLD1 [40]. Κυρίως, δεν αντίγραφο διαφορές αριθμό παρατηρήθηκαν στο χρωμόσωμα 5q13.3, που δείχνουν ότι η μείωση του επιπέδου mRNA σε DKO4 δεν οφείλεται σε χρωμοσωμική απώλεια.

RasGAP μετάλλαξη στο CRC

Στη συνέχεια, αναζήτησαν μεταλλάξεις που θα μπορούσε να εξηγήσει τις διαφορές στο επίπεδο έκφρασης RasGAP. Εμείς αλληλουχία τόσο το γενωμικό DNA και το cDNA από κύτταρα DLD1 και DKO4. Βρήκαμε ένα ετερόζυγη μετάλλαξη σημείου στο γονιδιωματικό DNA των δύο κυτταρικών σειρών. Αυτή η C & gt? T μετάβαση είναι μια ανοησία μετάλλαξη, το οποίο κωδικοποιεί ένα R709 * αλλαγή (Εικόνα 2, A & amp? Β), που βρίσκεται μεταξύ των περιοχών C2 και RasGAP της RasGAP. Εάν το μεταλλαγμένο γονίδιο εκφράστηκε σε κολοβωμένη πρωτεΐνη, ένα συγκρότημα ~77 kDa θα έπρεπε να είναι ανιχνεύσιμο σε κηλίδες Western, χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα RasGAP που αναγνωρίζει το Ν-τερματικό τμήμα της πρωτεΐνης. Ωστόσο, δεν είδαμε μια μπάντα αυτού του μεγέθους σε οποιεσδήποτε συνθήκες των κυττάρων.

Α) Χρωματογράφημα δείχνει τις σχετικές εντάσεις κάθε ζεύγος βάσεων μετά αλληλουχίας Sanger τόσο στη γονιδιωματική και cDNA που προέρχονται από τις κυτταρικές σειρές. Β) Απεικόνιση της θέσης της μετάλλαξης σε πρωτεϊνικό επίπεδο RasGAP. δεδομένα C) έκφραση RASA1 που προέρχονται από όλες τις κυτταρικές σειρές στην κυτταρική σειρά Broad Ινστιτούτο Καρκίνου Εγκυκλοπαίδεια. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν μέση τιμή.

Η

Είναι ενδιαφέρον ότι, αλληλούχιση του cDNA σε κυτταρικές γραμμές DLD1 και DKO4 έδειξαν ότι η κυτταρική γραμμή DLD1 είχε χάσει σχεδόν εντελώς την έκφραση του μεταλλαγμένου γονιδίου, που εκφράζουν μόνο το άγριου τύπου, ενώ η DKO4 κυτταρική γραμμή διατηρείται το 50% καθενός από τα άγριου τύπου και μεταλλαγμένων

RASA1

γονίδιο προϊόντος (Σχήμα 2Α).

Ψάξαμε για την παρουσία της μετάλλαξης C2330T σε πρωτοπαθή όγκο και μεταστάσεις ιστούς από ασθενείς CRC, αλλά δεν ήταν σε θέση να προσδιορίσει αυτή την μετάλλαξη σε κάποιο από τα δείγματα μας. Ωστόσο, ήμασταν σε θέση να βρείτε αυτό το μετάλλαξη σε τρεις κυτταρικές σειρές από την γραμμή κυττάρων Broad Institute του καρκίνου Εγκυκλοπαίδεια (https://www.broadinstitute.org/ccle) [41]: οι κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου HRT18 και HCT15, καθώς και το ουροποιητικό καρκίνος οδού κυτταρική γραμμή 639 V. Αυτό σημαίνει ότι αν και η μετάλλαξη είναι σπάνιο, είναι παρούσα σε ορισμένους τύπους καρκίνου. Αυτή η μετάλλαξη είναι, επίσης, δεν βρίσκονται στο ανθρώπινο δεδομένων SNP, υπονοώντας ότι δεν βρίσκεται στο σύνολο του πληθυσμού.

Για να διερευνήσει περαιτέρω την υπόθεση μας είναι ότι το μεταλλαγμένο

RASA1

μεταγραφή είναι ασταθής και, ενδεχομένως, υποβαθμισμένη, συγκρίναμε τα επίπεδα έκφρασης του mRNA της

RASA1

στις τρεις κυτταρικές γραμμές που περιέχουν την μετάλλαξη C2330T στο υπόλοιπο των καρκινικών κυτταρικών σειρών στο Γραμμή κυττάρων Εγκυκλοπαίδεια. Αυτές οι τρεις κυτταρικές σειρές εκφράζουν σημαντικά μικρότερη

RASA1

από την πλειονότητα των άλλων καρκινικών κυτταρικών σειρών στη βάση δεδομένων (Σχήμα 2C). Αν και δεν είναι πειστικά, αυτό φαίνεται να δείχνουν ότι αυτή η περικοπή μετάλλαξη θα μπορούσε να οδηγήσει σε μειωμένη γονιδιακή έκφραση του mRNA.

Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν διάφορα επίπεδα ρύθμισης της RasGAP, όλοι πιθανώς ως αποτέλεσμα της απώλειας των ενεργών KRAS σε DKO4. Πρώτον, η πλήρης έλλειψη μεταλλαγμένου mRNA p120RasGAP στην κυτταρική γραμμή DLD1 όπως ανιχνεύεται με αλληλούχιση υποδηλώνει ότι είτε το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο δεν μεταγράφεται σε mRNA σε αυτή την κυτταρική γραμμή, ή ότι το μεταλλαγμένο mRNA είναι πολύ ασταθής και αποδομείται αμέσως μετά να μεταγράφεται. Είναι ενδιαφέρον ότι, αν και η μεταλλαγμένη mRNA ήταν παρόν στο DKO4 κυτταρική γραμμή, η μείωση κατά 50% της συνολικής

RASA1

επίπεδα mRNA όπως ανιχνεύεται από πραγματικό χρόνο qPCR υποδεικνύουν ότι αυτό το μετάλλαγμα το mRNA αποικοδομείται επίσης, αλλά πιθανόν όχι τόσο γρήγορα ή τόσο αποτελεσματικά όσο σε DLD1

σε όλα, φαίνεται ότι η απώλεια των ενεργών KRAS σε DKO4 μειώνει την πίεση επί του κυττάρου για να σταθεροποιηθεί έκφραση RasGAP τόσο σε επίπεδο mRNA και πρωτεΐνης.? Ωστόσο, ο μηχανισμός με τον οποίο τα επίπεδα της πρωτεΐνης του RasGAP ρυθμίζονται σε αυτές τις κυτταρικές σειρές σε ακόμη άγνωστη.

Κανονισμός της έκφρασης RasGAP mRNA από μεταλλαγμένα KRAS

Για να αποσαφηνιστεί ο ρόλος ότι η απώλεια των μεταλλαγμένων

KRAS

σε DKO4 παίζει στην έκφραση της RasGAP, είμαστε σταθερά υπερεκφράζεται η pBABEpuro (PBP) άδειο φορέα, τον φορέα που περιέχει πλήρους μήκους άγριου τύπου

KRAS

, ή φορέα που περιέχει το

KRAS

με σημειακές μεταλλάξεις στο κωδικόνιο 12 (G12V ή G12D) ή κωδικόνιο 13 (G13D), σε κύτταρα DKO4. Υποθέσαμε ότι η μετάλλαξη G13D θα έχει τη μεγαλύτερη επίδραση στη σταθεροποίηση και τη διάσωση RasGAP έκφραση σε DKO4, λόγω αυτής της μετάλλαξης είναι αυτό που αρχικά εμφανίστηκαν σε αυτή την κυτταρική σειρά. Ωστόσο, μετά από επανειλημμένες προσπάθειες, ήμασταν μόνο σε θέση να υπερεκφράζουν το

KRAS

G12V μεταλλαγμένο γονίδιο σε αυτή την κυτταρική σειρά (Εικόνα 3Α). Η υπερέκφραση του G12V συνοδεύτηκε από μια συνολική αύξηση της GTP-KRAS, όπως αναμενόταν (Σχήμα 3C). Είναι ενδιαφέρον, παροδική διαμόλυνση αυτών των κατασκευασμάτων έδειξε ότι KRAS ήταν σε θέση να υπερεκφράζεται μέχρι και 7 ημέρες μετά την επιμόλυνση με όλους τους μεταλλάκτες, υποδεικνύοντας ότι η μακροπρόθεσμη έκφραση KRAS κατασκευασμάτων πλην G12V δεν διατηρήθηκαν σε DKO4. Η υπερέκφραση του

KRAS

G12V προκάλεσε σημαντική αύξηση στο

RASA1

mRNA? Ωστόσο, αυτή η αύξηση δεν παρατηρήθηκε στο επίπεδο της πρωτεΐνης (Σχήμα 3, B & amp? C). Είναι ενδιαφέρον ότι, αν και δεν θα μπορούσε να ανιχνεύσει οποιαδήποτε

KRAS

υπερέκφραση με το μεταλλαγμένο G13D, εξακολουθούμε να σημειωθεί μια μικρή αύξηση στο

RASA1

έκφραση του mRNA, αν και δεν ήταν σημαντική (p-value = 0,074).

Άγρια τύπου (WT) ή μεταλλαγμένου KRAS ήταν υπερεκφράζεται σε κύτταρα DKO4. mRNA εκχυλίστηκε από τα κύτταρα και να ποσοτικοποιηθούν με τη χρήση RT-qPCR να μετρήσει KRAS (Α) ή RASA1 (Β). Γ) Western στύπωμα δείχνει τα επίπεδα αυτών των πρωτεϊνών, μαζί με την κατάσταση ενεργοποίησης του KRAS. Συσχέτιση του mRNA (D) και η έκφραση πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας ανάλυση πυκνομετρίας των κηλίδωση Western (Ε) του KRAS και RASA1 μετά knockdown του KRAS χρησιμοποιώντας 11 διαφορετικά Τα siRNAs. Για πρωτεΐνης συσχέτιση, εξαιρέθηκαν ακραίες τιμές πάνω από 3 τυπικές αποκλίσεις από τη μέση τιμή. Όλα ποσοτικοποίηση είναι σε σχέση με κενό φορέα. Η στατιστική ανάλυση της έκφρασης χρησιμοποιώντας unpaired t-test, *** p & lt? 0.001, * ρ & lt? 0,05

Η

Για να διερευνήσουν περαιτέρω το ρόλο του ενεργού KRAS στην έκφραση RasGAP, έχουμε παροδικά επιμολυσμένα κύτταρα DLD1 με 11. ξεχωριστές Τα siRNAs ενάντια

KRAS

. Βρήκαμε μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ της ποσότητας του

KRAS

νοκ ντάουν και η μείωση του

RASA1

έκφραση του mRNA σε σύγκριση με τον μη ειδικό έλεγχο shRNA (Σχήμα 3D). Ωστόσο, οι αλλαγές αυτές δεν παρατηρήθηκαν στο επίπεδο πρωτεΐνης (Σχήμα 3Ε). Για να εξασφαλιστεί ότι KRAS shRNA knockdown προκάλεσε οποιεσδήποτε σημαντικές αλλαγές σε μη ειδικά γονίδια, Σχήμα S1A δείχνει επίπεδα των δύο γονιδίων housekeeping που δεν επηρεάζονται από την knockdown. Το Σχήμα S1B δείχνει τις κηλίδες Western από το οποίο προήλθε το Σχήμα 3Ε.

Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η απώλεια των ενεργών KRAS έπαιξε μερική ρόλο στην σταθερότητα ή /και την έκφραση του

RASA1

mRNA, αν και επιπλέον μηχανισμοί υπάρχουν που ρυθμίζουν την έκφραση της πρωτεΐνης σε αυτή την κυτταρική γραμμή.

RasGAP υπερέκφραση διασώσεις RasGAP δραστηριότητα

για να διαπιστώσετε εάν κάποια από τις φαινοτύπων που αποδίδονται σε απώλεια των ενεργών KRAS στο ισογονιδιακές κύτταρο DLD1 γραμμές θα μπορούσε να εξηγηθεί από την απώλεια της πρωτεϊνικής έκφρασης RasGAP, υπερεκφράσαμε RasGAP στην DKO4 κυτταρική σειρά (Εικόνα 4Α). Παρά την ικανότητά μας να πάρουν & gt?. 100 φορές υπερέκφραση του mRNA της RasGAP στην κυτταρική σειρά DKO4, τα προκύπτοντα επίπεδα πρωτεΐνης ήταν παρόμοια με ενδογενή έκφραση σε κύτταρα DLD1 (Εικόνα 4D)

Α) mRNA έκφραση του RasGAP μετά υπερέκφραση σε κύτταρα DKO4 σύγκριση με τον έλεγχο φορέα GFP. Β) ανάλυση NMR σε πραγματικό χρόνο της δραστηριότητας RasGAP, δείχνοντας σημαίνει ρυθμός υδρόλυσης GTP (Β) και δραστηριότητα GAP πάροδο του χρόνου (C). Κάθε καμπύλη στο (C) προέρχεται από ένα μοναδικό αντιπροσωπευτικό πείραμα. Οι ράβδοι σφάλματος στο (Β) υποδηλώνουν πρότυπο σφάλμα της μέσης τιμής (SEM). δοκιμασία δραστηριότητας D) RAS που δείχνει τα επίπεδα των ενεργών KRAS μετά RasGAP υπερέκφραση. Οι αριθμοί υποδηλώνουν τις τιμές πυκνότητας από αυτήν την κηλίδα, η οποία είναι αντιπροσωπευτικά τριών βιολογικών επαναλήψεις. Ε) RhoGAP ανοσοκατακρημνίσθηκε από κυτταρικές σειρές, υποβλήθηκαν σε κηλίδωση Western, τότε ερωτάται για το σύνολο φωσφοτυροσίνης, RasGAP και RhoGAP.

Η

Για να καθοριστεί εάν η υπερέκφραση του RasGAP είχε καμία επίδραση στη δραστηριότητα KRAS, μία δοκιμασία δραστηριότητα RAS διεξήχθη, χρησιμοποιώντας σφαιρίδια αγαρόζης Raf-RBD-συνδεδεμένο να ανοσοκαθιζάνει ενεργός KRAS (Εικόνα 4D). Όπως έχει δειχθεί προηγουμένως [40], KRAS συνολικά ήταν λιγότερο δραστική στα κύτταρα DKO4 σε σύγκριση με τα κύτταρα DLD1. Είδαμε μια μικρή αλλά σημαντική μείωση στη δραστηριότητα KRAS στα κύτταρα DKO4 μετά

RasGAP

υπερέκφραση, υποδεικνύοντας ότι RasGAP είναι σε θέση να ρυθμίζουν την άγριου τύπου KRAS σε DKO4. Για την περαιτέρω αποσαφήνιση του ρόλου της RasGAP σε αυτά τα κύτταρα, χρησιμοποιήσαμε μια δοκιμασία σε πραγματικό χρόνο NMR για να καθορίζουν δραστηριότητα RasGAP. Βρήκαμε ότι τα επίπεδα δραστηριότητας RasGAP ήταν σύμφωνη με την έκφραση της πρωτεΐνης RasGAP (Σχήμα 4, B & amp? C). Εκχυλίσματα κυττάρων DLD1 επιταχύνθηκε RAS GTP υδρόλυση ~ 1.8 φορές, ενώ DKO4 εκχυλίσματα, ταιριάζουν για τη συνολική περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη προκάλεσε μια μέτρια 1,2 φορές αύξηση του ρυθμού υδρόλυσης. Αυτά τα αποτελέσματα ήταν σύμφωνα με την παρουσία της βασικής δραστηριότητας από άλλες RasGAPs. RasGAP υπερέκφραση σε DKO4 έθεσε αυτό το ρυθμό πίσω στο ~ 1.8 φορές.