Αφηρημένο

Ιστορικό

Η λιποπρωτεΐνη χαμηλής πυκνότητας των υποδοχέων που συνδέονται με πρωτεΐνη-1 (LRP-1) είναι μια ενδοκυτταρική υποδοχέων μεσολάβηση της εκκαθάρισης των διαφόρων εξωκυτταρικών μορίων που εμπλέκονται στη διάδοση του καρκίνου κύτταρα. LRP-1 έτσι εμφανίζεται ως ένα ελκυστικό υποδοχέα για τη στόχευση του επεμβατική συμπεριφορά των κακοήθων κυττάρων. Ωστόσο, πρόσφατα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι LRP-1 μπορεί να διευκολύνει την ανάπτυξη και την ανάπτυξη των μεταστάσεων του καρκίνου in vivo, αλλά η ακριβής συμβολή του υποδοχέα κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου παραμένει να διευκρινιστεί. Η έλλειψη μηχανιστική γνώσεις σχετικά με την ενδοκυτταρική δίκτυα κατάντη της LRP-1 σηματοδότηση έχει εμποδίσει την κατανόηση της συμβολής της προς τον καρκίνο.

Μεθοδολογία Κύρια Ευρήματα /

Μέσα από μια σύντομη φουρκέτα RNA μεσολάβηση σίγηση προσέγγιση, ταυτοποιήσαμε LRP-1 ως κύριος ρυθμιστής της ERK και JNK σηματοδότησης σε ένα πλαίσιο των καρκινικών κυττάρων. πειράματα συν-ανοσοκατακρήμνισης αποκάλυψε ότι LRP-1 αποτελεί μια ενδοκυτταρική θέση σύνδεσης για συγκροτήματα ΜΑΡΚ περιέχουν. Με τη χρήση φαρμακολογικών παραγόντων, ουσιαστικά δραστική και κυρίαρχο-αρνητικό κινάσες, αποδείξαμε ότι LRP-1 διατηρεί κακοήθη κύτταρα σε ένα συγκολλητικό κατάσταση που είναι ευνοϊκή για την εισβολή, ενεργοποιώντας ERK και JNK αναστολής. Δείξαμε επίσης ότι η LRP-1-εξαρτώμενη ρύθμιση της ΜΑΡΚ σηματοδότησης διοργανώνει την κυτταροσκελετού αρχιτεκτονική και μεσολαβεί κόλλα συγκρότημα του κύκλου εργασιών στα καρκινικά κύτταρα. Επιπλέον, βρήκαμε ότι LRP-1 είναι δεμένοι με το δίκτυο ακτίνης και εστιακών θέσεων πρόσφυσης και ελέγχει ERK και JNK που στοχεύουν σε Ταλίν πλούσια δομές.

Συμπεράσματα

Εντοπίσαμε ERK και JNK ως οι κύριες μοριακές ρελέ με την οποία LRP-1 ρυθμίζει την εστιακή αποσυναρμολόγηση προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων να υποστηρίξει την εισβολή

Παράθεση:. Langlois Β, Perrot G, Schneider C, HENRIET P, Emonard η Martiny L, et al. (2010) LRP-1 προάγει τον καρκίνο εισβολή των κυττάρων με την υποστήριξη της ERK και η ανασταλτική JNK μονοπάτια σηματοδότησης. PLoS ONE 5 (7): e11584. doi: 10.1371 /journal.pone.0011584

Επιμέλεια: Bill Hooker, Calypte Biomedical Corporation, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 2η, Απριλίου του 2010? Αποδεκτές: 20 του Ιουνίου 2010? Δημοσιεύθηκε: 14 Ιουλ 2010

Copyright: © 2010 Langlois et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), La Ligue Nationale Contre le Καρκίνο (Comite de la Marne), CPER (Contrat de Projets Etat-Περιφέρεια) 2007-2013 και Fonds National pour la Santé ACI (Δράση Concertée ενθαρρυντικό) 2008 (Έργο Canceropole Μεγάλο-Est). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η λιποπρωτεΐνη χαμηλής πυκνότητας (LDL) υποδοχέων που συνδέονται με πρωτεΐνη-1 (LRP-1) είναι ένα πανταχού εκφραζόμενη ενδοκυτταρική υποδοχέα που ανήκει στην οικογένεια υποδοχέα LDL [1]. Πρώτα περιγράφεται ως υποδοχέας φορτίου που προκαλεί την πρόσληψη και λυσοσωματική αποικοδόμηση της α2-μακροσφαιρίνης [2], LRP-1 ακολούθως βρέθηκε να εμπλέκεται στην εσωτερίκευση των πάνω από 30 λειτουργικά και δομικά άσχετα εξωκυτταρικό συνδετήρες. Αυτές περιλαμβάνουν πρωτεάσες, συμπλέγματα πρωτεάσης-αναστολέα, μακρομοριακές πρωτεΐνες και αυξητικούς παράγοντες. Αρχικά συντίθεται ως ένας πρόδρομος 600 kDa, LRP-1 υφίσταται περαιτέρω επεξεργασία στην trans-Golgi με φουρίνη κονβερτάσης για έκφραση στην κυτταρική επιφάνεια στην ώριμη μορφή δύο αλυσίδων αποτελείται από ένα 515 kDa εξωκυτταρικό υπομονάδα (α-αλυσίδα), μη ομοιοπολικά συνδεδεμένο με ένα 85 kDa β-αλυσίδας που περιέχει την διαμεμβρανική περιοχή και την κυτταροπλασματική ουρά. Οι LRP-1 α-αλυσίδα λιμάνια τέσσερις συστάδες σύνδεσης συνδετήρα που εμπλέκονται στην ειδική αναγνώριση των εξωκυτταρικών συνδετήρων και τη συναρμολόγηση του πολυπρωτεϊνικό συμπλοκών στην επιφάνεια του κυττάρου. Η ενδοκυτταρική περιοχή του LRP-1 β-αλυσίδας μπορούσε να προσλάβει μόρια που εμπλέκονται στην ενδοκυτταρική μηχανήματα και κυτταροπλασματική ρυθμιστών των σηματοδοτικών οδών [3].

Η ποικιλομορφία των συνδετήρων του μπορεί να εξηγήσει γιατί LRP-1 έχει ταυτοποιηθεί ως ένας κρίσιμος παράγοντας σε διάφορες παθολογικές πλαίσια συμπεριλαμβανομένης της αρτηριοσκλήρυνσης και νευροεκφυλιστικές διαταραχές όπως η συχνότερα περιγράφεται [4], [5]. Ένας αυξανόμενος αριθμός των αποδείξεων ενίσχυσε το υποτιθέμενο ρόλο της LRP-1 σε κρίσιμο εκδηλώσεις κατά τη διάρκεια του καρκίνου εξέλιξη [6]. LRP-1 πράγματι αναφερθεί ότι μεσολαβούν την εκκαθάριση των διαφόρων μεταλλοπρωτεϊνασών μήτρας όπως ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-9 και ΜΜΡ-13 [7], [8], [9] και να ρυθμίζουν τον καταρράκτη ενεργοποίησης πλασμίνης με ενδοκύτωση των ιστών τύπος (tPA) ή τύπου ουροκινάσης (υΡΑ) ενεργοποιητές πλασμινογόνου [10], [11]. Θεωρώντας γνωστό λειτουργία του στον έλεγχο της πρωτεολύσεως μήτρας [12], LRP-1 προτάθηκε αρχικά ως νέο καταστολέας όγκου. Το ασθενές επίπεδο έκφρασης του LRP-1 παρατηρείται σε υψηλής ποιότητας ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα και ιστούς φάνηκε να υποστηρίξει μια τέτοια υπόθεση [13], [14]. Ωστόσο, η συνολική λειτουργία του LRP-1 σε καρκινογένεση φαίνεται να είναι πολύ πιο περίπλοκη από ό, τι η πρώτη σκέψη. Πρόσφατες μελέτες έχουν αναφέρει μια θετική συμβολή του LRP-1 με τη μετανάστευση και εισβολή εκδηλώσεις των διαφόρων τύπων κυττάρων [10], [15], [16], συμπεριλαμβανομένων κακοήθη κύτταρα όγκου [17], [18], [19], [20 ]. LRP-1 έκφραση επίσης αναφερθεί ότι είναι υποξία αποκρίνεται και να υποστηρίξει την μεταστατική διάδοση των ξενομοσχευμάτων όγκου ποντικού [21]. Επιπλέον, LRP-1 δείχθηκε να διατηρήσουν την μιτογόνο ή /και promigratory επιδράσεις πολλών διαλυτών παραγόντων που υπάρχουν στο περινεοπλαστικό περιβάλλον, στηρίζοντας έτσι μια προ-ογκογένεση ρόλος του υποδοχέα [15], [22], [23]. Δείξαμε πρόσφατα ότι LRP-1 συμβάλλει στην εισβολή καρκινικών κυττάρων με διακριτικά τον έλεγχο κόλλα συγκρότημα του κύκλου εργασιών [17]. Επομένως, φαίνεται ότι οι μηχανισμοί με τους οποίους εξέλιξη LRP-1 έλεγχοι όγκου δεν συνδέονται αποκλειστικά με ενδοκυτταρικό λειτουργία του.

Πέρα ενδοκυττάρωση, LRP-1 διακρίθηκε από την ικανότητά της να ενεργοποιεί την ενδοκυτταρική μονοπάτια σηματοδότησης που ρυθμίζουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση , τη μετανάστευση ή την επιβίωση [15], [24], [25], [26]. σύντομο ενδοκυτταροπλασματική περιοχή του (ICD) περιέχει δύο μοτίβα NPxY για φωσφορυλίωση από κινάσες τυροσίνης οι οποίες είναι τότε σε θέση να δεσμεύσει τον τομέα δέσμευσης φωσφοτυροσίνης-(ΡΤΒ) που περιέχει πρωτεΐνες. Ζύμης δύο-υβριδίων προσδιορισμούς και πρωτεομική ανάλυση αποκάλυψε ότι Shc (Src ομολογίας 2 τομείς που περιέχουν πρωτεΐνη), Fe65, DAB1 (άτομα με ειδικές ανάγκες 1), ΡΙ3Κ (φωσφατιδυλ-ινοσιτόλη 3-κινάση) ή PIP-4,5-κινάση (φωσφατιδυλ-ινοσιτόλη -4,5-κινάση) ομόλογο μπορεί να συσχετιστεί με το LRP-1-ICD [27], [28]. Έτσι, σε απόκριση σε εξωκυτταρικά ερεθίσματα, LRP-1 μπορεί να προσλάβει ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες ικρίωμα για να προκαλέσει κατάντη σηματοδότησης. LRP-1 έχει ταυτοποιηθεί ως εταίρος μοριακή σήμανση για τον υποδοχέα του αυξητικού παράγοντα από αιμοπετάλια (PDGFR), οδηγώντας σε μεταναστευτικών και πολλαπλασιαστικών σηματοδότηση και την ανάπτυξη αθηροσκληρωτικών βλαβών [4], [29]. Πιο πρόσφατα, η promigratory επίδραση του αναστολέα του ενεργοποιητή του πλασμινογόνου ΡΑΙ-1 φάνηκε να απαιτούν LRP-1-εξαρτώμενη ενεργοποίηση του JAK (Janus κινάση) /STAT (μετατροπέα σήματος και ενεργοποιητής μεταγραφής) μονοπάτι σηματοδότησης [30]. Επιπλέον, Ma και συνεργάτες ανέφεραν ότι LRP-1 θα μπορούσε να ρυθμίσει ποντικού μετανάστευση εμβρυϊκών ινοβλαστών με καταστολή της Rac1 και εξωκυτταρικά (ERK) οδών σήματος ρυθμίζεται κινάση [31].

Στον τομέα του καρκίνου, υπάρχει μια αξιοσημείωτη έλλειψη των γνώσεων σχετικά με ενδοκυτταρική σηματοδότηση κατάντη της LRP-1 και την κατανόηση της πιθανής συμβολής του στην εξέλιξη του καρκίνου. Στην παρούσα μελέτη, η οποία χαρακτηρίζεται τα ρελέ μοριακή σήμανση που εμπλέκονται στην LRP-1-διαμεσολαβούμενη διέγερση των καρκινικών κυττάρων εισβολής και προσδιόρισε το LRP-1 β-αλυσίδας ως κύρια περιοχή σύνδεσης για την εστιακή προσκόλληση (FA) εξαρτήματα και μιτογόνο ενεργοποιημένη πρωτεΐνη κινάσης (ΜΑΡΚ) που περιέχει συγκροτήματα.

Αποτελέσματα

Αναγνώριση LRP-1 ως ρυθμιστής της ΜΑΡΚ μονοπατιών σηματοδότησης στο πλαίσιο των καρκινικών κυττάρων

Για να αξιολογηθεί ο ρόλος της LRP- 1 στη ρύθμιση της ενδοκυτταρικής μεταγωγής σήματος, χρησιμοποιήσαμε ένα προηγουμένως επικυρωμένη μέθοδο για τη δημιουργία shLRP-1 κλωνικά κύτταρα που υπερεκφράζουν σταθερώς μια συγκεκριμένη αλληλουχία φουρκέτα κατευθύνονται εναντίον LRP-1 [17]. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1, παρατηρήσαμε μια -90% προς τα κάτω ρύθμιση έκφρασης ενδογενούς LRP-1 σε shLRP-1 κύτταρα σε σύγκριση με κύτταρα shCTRL, τόσο σε mRNA (Σχ. 1Α) και τα επίπεδα της πρωτεΐνης (Εικ. 1Β). Ως εκ τούτου, αναλύθηκαν τα αποτελέσματα της LRP1 αποσιώπησης για την ενεργοποίηση αρκετών δυνητικές οδούς LRP-1-ρυθμιζόμενη σηματοδότηση. Οι καταστάσεις ενεργοποίηση των δύο μεγάλων ΜΑΡΚ, δηλαδή, ΕΚΚ-1/2 και SAPK /JNK (στρες-ενεργοποιημένης κινάσης πρωτεΐνης /c-Jun Ν-τελική κινάση), για πρώτη φορά εξετάστηκαν (Εικ. 1 C). Βρήκαμε ότι το επίπεδο της φωσφορυλιωμένης ΕΚΚ-1/2 ήταν επιλεκτικά μειώθηκε σε κύτταρα LRP1-σιγήσει και μία αύξηση στην φωσφορυλίωση JNK-1/2/3 ανιχνεύθηκε κατόπιν LRP-1 σίγηση. Ωστόσο, τα επίπεδα φωσφορυλίωσης της Akt και p38 ΜΑΡΚ δεν μεταβλήθηκε σημαντικά σε LRP-1-ανεπαρκή καρκινωμάτων. Αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι LRP-1 μπορεί να δρα ως ένα ενδοκυτταρικό διαμορφωτή σηματοδότησης, ενεργοποιώντας ERK και αναστέλλοντας οδούς σηματοδότησης JNK.

(Α) Ολικά RNAs καθαρίστηκαν από FTC133 ελέγχου κλωνική κυτταρική σειρά (shCTRL) ή κλωνική κύτταρα που σταθερώς υπερεκφράζουν Τα siRNAs για LRP-1 (shLRP-1). Το μετεγγραφικό επίπεδο της LRP-1 αξιολογήθηκε με RT-PCR. β-ακτίνη εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος κανονικοποίηση. (Β) Ολόκληρα-κυτταρικά εκχυλίσματα από κάθε κυτταρική γραμμή υποβλήθηκαν σε Ανάλυση ανοσοκηλιδώσεως με αντι LRP-1-αντίσωμα β-αλυσίδας (5A6). β-ακτίνης αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε για ομαλοποίηση. (Γ) shCTRL και shLRP-1 κλωνικά κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες σε επιφάνειες επικαλυμμένες με ζελατίνη εντός 10% FBS μέσο που περιέχει. εκχυλίσματα ολόκληρων κυττάρων ανοσοστυπώθηκαν με τη χρήση φωσφο-ΕΚΚ, φωσφο-ΙΝΚ, φωσφο-Ακί και αντισώματα φωσφο-ρ38. Αντισώματα προς ERK, JNK, ρ38 και β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκαν για να διασφαλιστεί η ίση φόρτωση και για την κανονικοποίηση. Η γέλη και ανοσοστυπώματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών πειραμάτων ξεχωριστή. Αριθμοί υπό την πηκτή και immunolots υποδεικνύουν τις φορές επαγωγές με comparaison με κύτταρα shCTRL.

Η

LRP-1 μεσολαβεί στην ενεργοποίηση του ορού που προκαλείται από ΕΚΚ-1/2 και συστατική αναστολή της JNK-1/2 /3

το LRP-1-μεσολαβούμενη ρύθμιση της ενδοκυτταρικής σηματοδότησης μπορεί είτε να εξαρτάται από την σύνδεση των εξωκυτταρικών συνδετήρων ή σχετικά με την πρόσληψη της ενδοκυτταρικής ικριωμάτων. Εκτιμήσαμε LRP-1-μεσολαβούμενη ρύθμιση τόσο της ERK (Σχ. 2Α έως 2D) και οδοί JNK (Εικ. 2Ε να 2Η) σε απόκριση προς διέγερση του ορού και την επικάλυψη ζελατίνης. Το LRP-1-διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση της φωσφορυλίωσης ERK-1/2 παρατηρήθηκε μόνο με την παρουσία του ορού (σχ. 2Α και 2Β vs 2C και 2D). Σε αντίθεση, η ενεργοποίηση των ΙΝΚ-1/2/3 σε LRP-1-σιγήσει κυττάρων δεν εξαρτάται από την παρουσία του ορού (Εικ. 2Ε να 2Η). Σε αμφότερες τις περιπτώσεις, η ρύθμιση της ΜΑΡΚ με LRP-1 δεν επηρεάστηκε από επικάλυψη ζελατίνης (Σχ. 2Α, 2C, 2Ε και 2G). Κατά συνέπεια, η υποδοχέας LRP-1 πυροδοτεί την εξωκυττάρια-εξαρτώμενη από συνδετήρα ενεργοποίηση της ERK-1/2 και δρα ως συστατική αναστολέας του μονοπατιού ΙΝΚ.

shCTRL και shLRP-1 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλαστικό ή ΖΕΛΑΤΙΝΗ- επικαλυμμένα πιάτα για 24 ώρες απουσία ή παρουσία FBS. εκχυλίσματα ολόκληρων κυττάρων υποβλήθηκαν σε ανάλυση Western κηλίδας για να μελετήσει την ενεργοποίηση της ERK (Α-Δ) και JNK (Ε-Η) απουσία ή παρουσία FBS. Τα αντίστοιχα ποσοστά ενεργοποίηση της ERK (Β, D) και JNK (F, H) προσδιορίστηκαν ως αναλογίες ένταση της φωσφο-πρωτεΐνης να αντιστοιχεί παν-πρωτεΐνης και εκφράζονται σε σχετικές μονάδες +/- SD, με τιμή 1 που δέχθηκε να shCTRL κύτταρα. NS, μη σημαντικό? *,

P

& lt?. 0.05

Η

LRP-1 αποτελεί ένα χώρο υποδοχής για την Src, ERK και συγκροτήματα JNK που περιέχουν

Η LRP-1 C-τερματικό άκρο μπορεί να αλληλεπιδράσει με τα μόρια ικρίωμα που εμπλέκονται στην μεταγωγή σήματος [28]. Πειράματα Συνανοσοκατακρήμνιση πραγματοποιήθηκαν για να ελεγχθεί αν η ενδοκυτταρική περιοχή του LRP-1 είναι σε θέση να προσλάβει στόχων που εμπλέκονται στη ρύθμιση της ERK και JNK οδών σηματοδότησης σε ένα πλαίσιο των καρκινικών κυττάρων. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3, ήμασταν σε θέση να επιτυχώς ανοσοκαταβυθίζουν LRP-1 β-αλυσίδα με ένα αντίσωμα που εγείρεται κατά του εξωκυττάριου LRP-1 α-αλυσίδας. Αμφότερες ERK και JNK κινάσες συν-ανοσοκατακρημνίστηκαν με LRP-1 β-αλυσίδας. Εξετάσαμε επίσης την κατάσταση φωσφορυλίωσης αυτών των κινασών. Φωσφορυλιωμένες μορφές της ERK-1/2 βρέθηκαν συνδέονται με LRP-1, όπου φωσφορυλιωμένη JNK δεν ήταν. . Src, κινάση γνωστό να ενεργοποιηθεί κατάντη του μιτογόνου και μήτρα υποδοχείς, ανιχνεύθηκε επίσης σε σύμπλοκα LRP-1 που περιέχει β-αλυσίδα

Ανοσοκαταβυθίσεις του LRP-1 που περιέχουν σύμπλοκα (IP: LRP-1 -α) διεξήχθησαν με τη χρήση αντι-LRP-1 α-αλυσίδας (8G1) αντισώματα και τα ανοσοσυμπλέγματα ανοσοστυπώθηκαν (IB) με τη χρήση 8G1, αντι-LRP-1 β-αλυσίδας (5A6), αντι-ΕΚΚ-1/2 , αντι-φωσφο-ΕΚΚ-1/2, αντι-ΙΝΚ-1/2/3, αντι-φωσφο-ΙΝΚ-1/2/3 και αντι-Src αντισώματα. Η μη ειδική IgGs χρησιμοποιήθηκαν ως ένας αρνητικός έλεγχος της ανοσοκατακρήμνισης.

Η

LRP-1-εξαρτώμενη ενεργοποίηση ERK συμβάλλει στην κυτταρική εισβολή καρκίνωμα

περιγράφηκε πρόσφατα ένα ρόλο κλειδί για LRP-1 σε όγκο εξέλιξη [17]. Πράγματι, όπως φαίνεται στο Σχ. 4Α, LRP-1-ανεπαρκή κύτταρα εμφάνισαν μια διπλάσια μείωση επεμβατική ικανότητα, σε σύγκριση με τον έλεγχο κλωνικά κύτταρα. Ως εκ τούτου, ερευνήθηκε κατά πόσον το LRP-1-εξαρτώμενη ενεργοποίηση της ERK μπορούσε να συμβάλει στην κυτταρική καρκίνωμα εισβολής. Πρώτον, τα κύτταρα ελέγχου υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με U0126, ένας εκλεκτικός αναστολέας της ΜΕΚ-1/2 (ΜΑΡΚ ERK κινάση-1/2) ή διαμολυσμένα με κυρίαρχο-αρνητικό μετάλλαγμα της ΜΕΚ-1. Η αποτελεσματικότητα της ERK-1/2 αναστολή υπό αυτές τις συνθήκες μπορεί να φανεί στο Σχ. 4Β. Καμία αλλαγή στην φωσφορυλίωση JNK ανιχνεύθηκε μετά την αναστολή της ERK (Εικ. S1). κύτταρο ελέγχου εισβολή ανεστάλη κατά την επεξεργασία U0126 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (εικ. 4c και 4d). Επιπλέον, τα κύτταρα shCTRL υπερεκφράζουν μια κινάση-νεκρή μορφή ΜΕΚ-1 έδειξαν μειωμένη επεμβατική ιδιότητες (Εικ. 4C και 4D). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ενότητα σηματοδότηση ERK ενεργοποιείται κατά τη διάρκεια των κυττάρων καρκίνωμα εισβολής. Δεύτερον, για να διασώσει τον ενεργοποιημένο μονοπάτι ERK σε LRP-1-σιγήσει κύτταρα, μια συστατικώς δραστικό ERK-2 υπερεκφράστηκε. Η κατάσταση ενεργοποίησης του ERK-1/2 αξιολογήθηκε με ανοσοαποτύπωση (Εικ. 4Ε). Όπως φαίνεται στο Σχ. 4F και 4G, η ικανότητα της LRP-1-ανεπαρκή κύτταρα να εισβάλουν αποκαταστάθηκε μερικώς όταν ERK-2 υπερεκφράστηκε. Δεδομένου ότι η τυροσίνη-κινάση Src θα μπορούσε δυνητικά να ενεργοποιήσει ERK σηματοδότησης καθοδικά του LRP-1 (Εικ. 3), η κυτταρική εισβολή ποσοτικοποιήθηκε με την παρουσία ενός αναστολέα κινάσης Src. Ωστόσο, η αναστολή της Src δεν επηρέασε τις επεμβατικές ικανότητες των δύο κυττάρων shCTRL και shLRP-1 (Εικ. 4Η), αποκλείοντας έτσι τη συμβολή της κινάσης Src να LRP-1-μεσολαβητική ενεργοποίηση ERK κατά τη διάρκεια της κυτταρικής καρκίνωμα εισβολής.

εισβολής σε Matrigel δοκιμασία διεξήχθη για κύτταρα καρκινώματος shCTRL και shLRP-1 σε βασικές συνθήκες (Α), μετά τη ρύθμιση της δραστηριότητας ΕΚΚ σε shCTRL (Β-D) και shLRP-1 κύτταρα (Ε-G) ή με την παρουσία του αναστολέα Src ( Η). (C, D) Η ικανότητα των κυττάρων να εισβάλουν shCTRL matrigel ποσοτικοποιήθηκε μετά αναστολή της δραστηριότητας ΕΚΚ χρησιμοποιώντας κατεργασία U0126 (10 ή 25 μΜ) ή την έκφραση ενός μεταλλαγμένου κινάσης-νεκρό για ΜΕΚ-1 (dn-ΜΕΚ). (F, G) Οι επεμβατικές ιδιότητες των κυττάρων shLRP-1 εξετάστηκαν μετά από μια συστατική ενεργοποίηση της ERK-2 (γα-ΕΚΚ). Η αποτελεσματικότητα της αναστολής ERK σε shCTRL (Β) και την ενεργοποίηση ERK σε κύτταρα shLRP-1 (Ε) ελέγχθηκε με τη χρήση φωσφο-ΕΚΚ, ERK και β-ακτίνη αντισώματα. Αντι-ΗΑ χρησιμοποιείται για τον έλεγχο του επιπέδου έκφρασης του υπερεκφρασμένης ΗΑ-tagged πρωτεΐνες. (H) εισβολή των καρκινικών κυττάρων μετρήθηκε μετά από αναστολή της Src-εξαρτώμενη δραστικότητα με χρήση 10 μΜ του Src αναστολέα κινάσης Ι (Src ΙΝΗ). Αντιπροσωπευτικά εικόνες εμφανίζονται για κάθε συνθήκη (D, G). Τα αποτελέσματα ελήφθησαν από τρία ξεχωριστά πειράματα κάθε πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Η διήθηση προσδιορίστηκε με μέτρηση των κυττάρων σε οκτώ τυχαία μικροσκοπικά πεδία ανά φρεάτιο. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέσο +/- SD μετά από κανονικοποίηση σε σχέση με όχημα, δηλαδή, DMSO για θεραπείες φαρμάκου ή λιποφεκταμίνης (λιπο) για επιμόλυνση. NS, οι διαφορές με το αντίστοιχο του ελέγχου δεν ήταν σημαντικές. *,

P

& lt?. 0.05

Η

Η αναστολή της JNK που προκαλείται από LRP-1 διατηρεί κακοήθων κυττάρων εισβολής

Επίσης, εξετάσαμε σε ποιο βαθμό LRP- 1-μεσολαβούμενη αναστολή της οδού της JNK θα μπορούσε να υποστηρίξει την εισβολή των κυττάρων καρκινώματος. ΙΝΚ1 και ΜΚΚ-7 (ΜΑΡΚ κινάση-7) ήταν ως εκ τούτου συν-εκφράζονται σε κύτταρα shCTRL (Εικ. 5Α). Εισβολή των κυττάρων shCTRL μειώθηκε κατά 25%, όταν υπερεκφράζουν άγριου τύπου JNK (Σχ. 5Β και 5C), υποδεικνύοντας ότι η αναστολή JNK απαιτείται για την προώθηση της εισβολής. Στη συνέχεια, χρησιμοποιήσαμε το επιλεκτικό SP600125 αναστολέα JNK και ένα κυρίαρχο-αρνητικό μετάλλαγμα της JNK να ανακτήσει την αναστολή JNK σε LRP-1-ανεπαρκή καρκινώματα (Σχ. 5D). Εμείς δεν τήρησε καμία σημαντική διαφοροποίηση της φωσφορυλίωσης της ERK υπό αυτές τις συνθήκες (Εικ. S1). Είναι ενδιαφέρον ότι, η ασθενής ικανότητα της LRP-1-σιγήσει κυττάρων να εισβάλουν αυξήθηκε σημαντικά κάτω JNK αναστολής (Σχ. 5Ε και 5F). Τα αποτελέσματα αυτά υποστηρίζουν την ιδέα ότι η αναστολή της JNK σηματοδότησης οδό διαμεσολαβείται από LRP-1 συμβάλλει στην κυτταρική καρκίνωμα εισβολής.

προσδιορισμοί κυττάρων εισβολής διεξήχθησαν με shCTRL (B, C) και τα κύτταρα 1 shLRP-( E, F) μετά από ρύθμιση της δραστικότητας JNK (A, D). (B, C) κύτταρα ShCTRL επιμολύνθηκαν με φορέα έκφρασης που κωδικοποιεί για άγριου-τύπου ΜΚΚ-7 /ΙΝΚ-1 πριν ποσοτικοποιήθηκε κύτταρο εισβολή. (Ε, F) Οι επεμβατική ιδιότητες του LRP-1-σιγήσει κύτταρα μετρήθηκαν μετά τη θεραπεία SP600125 (5 ή 10 μΜ) ή η επιμόλυνση από έναν κυρίαρχο-αρνητικό μετάλλαγμα της JNK-1 (dn-JNK). JNK ενεργοποίησης σε shCTRL (Α) και η αναστολή JNK σε κύτταρα shLRP-1 (Δ) εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας φωσφο-ΙΝΚ, JNK και β-ακτίνη αντισώματα. Αντι-ΗΑ και αντι-FLAG χρησιμοποιήθηκαν για να ελέγχουν την έκφραση υπερεκφράζεται πρωτεΐνες με ετικέτα. Αντιπροσωπευτικά εικόνες εμφανίζονται για κάθε συνθήκη (C, F). Τα αποτελέσματα ελήφθησαν από τρία ξεχωριστά πειράματα κάθε πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Η διήθηση προσδιορίστηκε με μέτρηση των κυττάρων σε οκτώ τυχαία μικροσκοπικά πεδία ανά φρεάτιο. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέσο +/- SD μετά από κανονικοποίηση σε σχέση με όχημα, δηλαδή, DMSO για θεραπείες φαρμάκου ή λιποφεκταμίνης (λιπο) για επιμολύνσεις. *,

P

& lt?. 0.05

Η

Η LRP-1-μεσολάβηση ρύθμιση των ΜΑΡΚ ελέγχει την προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων

Πρόσφατα αναφέρθηκε ότι LRP-1 φίμωση απομείωση σοβαρά την εισβολή των κακοήθων κυττάρων διαδοχικά σε μια ισχυρή μεταβολή του κυττάρου-matrix αλληλεπίδρασης turn-πάνω. Ως εκ τούτου, η υπόθεση ότι LRP-1-εξαρτώμενη έλεγχο και των δύο οδών ERK και JNK συμβάλλει στην ρυθμίζουν την αλληλεπίδραση κυττάρου-μήτρας για την υποστήριξη διεισδυτικότητα. Όπως αναμενόταν, shLRP-1 κύτταρα, στα οποία είναι μειωμένη δραστηριότητα ΕΚΚ, εμφανίζεται ένα επιταχυνόμενο ρυθμό σύνδεσης προς ζελατίνης επικαλυμμένες επιφάνειες, σε σύγκριση με τον έλεγχο κλωνικά κύτταρα (Σχ. 6Α). Επιπλέον, η υπερέκφραση μιας κινάσης-ανενεργό ΜΕΚ-1 μετάλλαγμα σε κύτταρα shCTRL οδήγησε σε αυξημένο ποσοστό πρόσφυσης (Σχ. 6Β), ενώ συστατικώς δραστικές ERK-2 μείωσε την ικανότητα του LRP-1 ελλειμματικά κύτταρα να προσκολληθούν (Εικ. 6C). Πράγματι, μετά από 60 λεπτά της προσκόλλησης, προσκολλημένα κύτταρα αυξήθηκαν 2-φορές πάνω αναστολή της ERK παθολογικής οδού (Εικ. 6Β). Ταυτόχρονα προσάρτησης, το ποσοστό των προσκολλημένο LRP-1-σιγήσει κύτταρα μειώθηκε κατά 2 φορές υπό ενεργοποίηση ERK (Σχ. 6Β και 6C). Ομοίως, η υπερέκφραση του άγριου τύπου ΜΚΚ-7 /ΙΝΚ-1 σε κύτταρα ελέγχου οδήγησε σε μια 2-πλάσια βελτιωμένη πρόσφυση μετά από 60 λεπτά (Σχ. 7Α). Επιπλέον, το αυξημένο ποσοστό συνημμένο παρατηρείται σε LRP-1 ελλειμματικών κυττάρων που αντιστράφηκε με έκφραση μιας δεσπόζουσας-αρνητική μορφή της JNK-1 (Σχ. 7Β). Τα δεδομένα αυτά υποστηρίζουν την ιδέα ότι η LRP-1 διατηρεί κακοήθη κύτταρα σε ένα ενδιάμεσο συγκολλητικό κατάσταση που είναι ευνοϊκές για την εισβολή μέσα από την ενεργοποίηση της ERK και αναστολή JNK.

(Α) shCTRL (λευκά κουτιά) και shLRP-1 (γκρι κουτιά κύτταρα) σπάρθηκαν πάνω σε πλάκες επικαλυμμένες με ζελατίνη και τα μη προσκολλημένα κύτταρα απορρίφθηκαν μετά από 30, 60 ή 90 λεπτά. Οι ανιχνεύσεις προσφύσεως πραγματοποιήθηκαν επίσης με κύτταρα που υπερεκφράζουν shCTRL μία μεταλλαγμένη κινάση-νεκρή για ΜΕΚ-1 (dn-ΜΕΚ) (Β) και shLRP-1 που υπερεκφράζουν ένα συστατικώς δραστικό ERK-2 (γα-ΕΚΚ) (C). Για κάθε συνθήκη, τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ποσοστά του αντίστοιχου ελέγχου προσκολλημένων κυττάρων σε 90 λεπτά. Κάθε τιμή είναι ο μέσος όρος +/- SD για τέσσερα χωριστά πειράματα, με κάθε πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. *,

P

& lt?. 0.05

Η

shCTRL (λευκά κουτιά) και κύτταρα shLRP-1 (γκρι πλαίσια) σπάρθηκαν πάνω σε πλάκες επικαλυμμένες με ζελατίνη και τα μη προσκολλημένα κύτταρα απορρίφθηκαν μετά από 30, 60 ή 90 λεπτά. ανιχνεύσεις προσφύσεως πραγματοποιήθηκαν με κύτταρα που υπερεκφράζουν shCTRL άγριου τύπου ΜΚΚ-7 /JNK1 (Α) και shLRP-1 που υπερεκφράζουν κυρίαρχο αρνητικό μετάλλαγμα της JNK-1 (dn-ΙΝΚ) (Β) κινάσες. Για κάθε συνθήκη, τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ποσοστά του αντίστοιχου ελέγχου προσκολλημένων κυττάρων σε 90 λεπτά. Κάθε τιμή είναι ο μέσος όρος +/- SD για τέσσερα χωριστά πειράματα, με κάθε πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. *,

P

& lt?. 0.05

Η

Το δίκτυο ακτίνης του fast-εισβάλλουν καρκινώματα διασώζεται σε LRP-1-σιγήσει κυττάρων μετά την επανενεργοποίηση του ΕΚΚ ή την αναστολή της υπερδραστηριοποιημένο JNK

Θα διερευνηθεί περαιτέρω αν η LRP-1-εξαρτώμενη ρύθμιση της ΜΑΡΚ σηματοδότησης θα μπορούσε να ενορχηστρώσει ο συντονισμός της δυναμικής της ακτίνης και την πρόσφυση κατά τη διάρκεια κακοηθών κυττάρων εισβολής. Ως εκ τούτου αναλύσαμε την κυτταρική κατανομή των ινιδικών ακτίνης μετά τη διαφοροποίηση της ERK και JNK δραστηριότητες (Εικ. 8). Προσκολλημένα κύτταρα ελέγχου εμφανίζεται ένα πολωμένο μορφολογία με ύπαρξη φιλοποδίων κυττάρων και κυρίως φλοιική κατανεμημένο δίκτυο ακτίνης (Εικ. 8Α). Σε έντονη αντίθεση, LRP-1-φίμωση που προκαλείται απλωνόταν μορφολογία με ίνες πολλές άγχος, εξέχουσα εγκάρσια νημάτων και μια αναπτυγμένη διακλαδισμένης δίκτυο ακτίνης (Εικ. 8F). Η αναστολή της ERK σηματοδότησης σε καρκινικά κύτταρα μάρτυρες με επεξεργασία U0126 (Σχ. 8Β vs 8Α) ή ένα κυρίαρχο-αρνητικό μορφή ΜΕΚ-1 (Σχ. 8D vs 8C) που επάγεται δραστικές μορφολογικές αλλαγές παρόμοιες με αυτές που λαμβάνονται στο πλαίσιο LRP-1 σίγηση. Το ίδιο αποτέλεσμα παρατηρήθηκε μετά από την έκφραση του άγριου τύπου ΜΚΚ-7 /ΙΝΚ-1 σε κύτταρα καρκινώματος ελέγχου (Σχ. 8Ε vs 8C). Σε LRP-1-σιγήσει κυττάρων, η αναστολή της σηματοδότησης JNK με SP600125 (Σχ. 8G vs 8F) ή υπερέκφραση της κινάσης-ανενεργών JNK-1 (Σχ. 8J vs 8Η) αποκατέστησε την μεσεγχυματικά-όπως μορφολογία κυττάρων καρκινώματος άγριου τύπου. Επιπλέον, συστατικώς δραστικό ERK-2 (Σχ. 8I vs 8Η) ήταν αρκετή για να αντιστρέψει την εφαπλώνω μορφολογία που προκλήθηκε από την αποσιώπηση του LRP-1. Αυτά τα αποτελέσματα κατέδειξαν ότι LRP-1 σίγηση επάγει σημαντικές αναδιατάξεις κυτταροσκελετού της ακτίνης που συνδέονται άμεσα με την αναστολή της ERK και JNK υπερενεργοποίηση.

shCTRL κύτταρα (Α-Ε) και shLRP-1 (F-J) σπάρθηκαν πάνω σε επικαλυμμένες με ζελατίνη πλάκες για 120 λεπτά. ERK ή JNK δραστηριότητες διαμορφώνονται. Κύτταρα ελέγχου υποβλήθηκαν σε αγωγή με 25 μΜ U0126 (Β) ή επιμολυσμένα με ένα μεταλλαγμένο κινάσης νεκρός για ΜΕΚ-1 (dn-ΜΕΚ) (D) να αναστέλλουν την ενεργοποίηση μονοπατιού και JNK ERK-εξαρτώμενη ελήφθη με υπερέκφραση αμφοτέρων των άγριου τύπου ΜΚΚ-7 και JNK-1 (E). Για LRP-1 ελλειμματικών κυττάρων, η αναστολή της οδού της JNK επετεύχθη με τη χρήση της θεραπείας SP600125 (10 μΜ) (G) ή υπερέκφραση ενός κυρίαρχη-αρνητική μορφή της JNK-1 (J), ενώ η επανενεργοποίηση του μονοπατιού ERK λήφθηκε με χρησιμοποιώντας έναν φορέα έκφρασης για ιδιοσυστατικά ενεργού ERK-2 (Ι). DMSO (A, F) χρησίμευσε ως έλεγχος για φαρμακευτικές θεραπείες (B, G) και Lipofectamine (C, H) χρησίμευσε ως έλεγχος για δοκιμασίες μορφομετατροπής (D, Ε, Ι, J). Τα κύτταρα χρωματίστηκαν για ακτίνη νημάτων (κόκκινο) και οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με DAPI (μπλε). Οι εικόνες είναι αντιπροσωπευτικές τουλάχιστον τρία ξεχωριστά σύνολα των πολιτισμών. Μπαρ, 20 μm.

Η

LRP-1-εξαρτώμενη ενεργοποίηση της ERK και αναστολή της JNK είναι απαραίτητη για την FA αποσυναρμολόγηση σε ταχέως εισβάλλουν καρκινώματα

Λαμβάνοντας υπόψη τον αντίκτυπο της LRP-1 αποσιώπηση επί των συγκολλητικών και μορφολογικές ιδιότητες των καρκινικών κυττάρων (Σχ. 6, 7 και 8), διερευνήσαμε κατά πόσον η LRP-1-μεσολαβούμενη έλεγχος του ΜΑΡΚ είναι απαραίτητη για FA στροφή-over. Έτσι, η κυτταρική κατανομή της εστιακής συμπλοκών αναλύθηκε σε shCTRL και shLRP-1 κύτταρα μετά απόκλιση ενεργοποίηση των ΕΚΚ και JNK οδών (Εικ. 9Α έως 9J). LRP-1-σίγησης οδήγησε σε συσσώρευση πολλών και εξαιρετικά δομημένη εστιακά σύμπλοκα στην κυτταρική περιφέρεια (Εικ. 9F vs 9Α). Παρεμβολή με ενεργοποίηση ERK σε κύτταρα ελέγχου με U0126 (Σχ. 9Β vs 9Α) ή μιας κινάσης-αδρανής μορφή ΜΕΚ-1 (Σχ. 9Δ vs 9C) αύξησε τον αριθμό και το μέγεθος των εστιακές επαφές ταλίνη περιέχουν στον ίδιο βαθμό όπως παρατηρείται στην LRP-1-σιγήσει κύτταρα (Εικ. 9F). Επομένως, η υπερέκφραση του άγριου τύπου ΜΚΚ-7 /ΙΝΚ-1 σε LRP-1 κύτταρα που εκφράζουν τον έλεγχο διέγειρε την συσσώρευση των δομών περιφερικών προσκόλλησης ταλίνη περιέχει (Σχ. 9Ε vs 9C). Αντίθετα, ο αριθμός των ταλίνη πλούσια δομές μειώθηκε δραστικά σε κύτταρα LRP-1-σιγήσει με τη χρήση ενός επιλεκτικού αναστολέα JNK (Σχ. 9G vs 9F) ή έκφραση ενός κυρίαρχο-αρνητικό JNK-1 μετάλλαγμα (Εικ. 9J vs 9Η ). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν όταν ένα συστατικώς δραστικό ERK-2 εκφράστηκε σε LRP-1 ελλειμματικά κύτταρα (Σχ. 9Ι vs 9Η). Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι η ενεργοποίηση JNK ή την αναστολή της ERK σε LRP-1 ελλειμματικών κυττάρων θα μπορούσε να αποκαταστήσει την αρχική κατανομή των συμπλοκών πρόσφυσης. Το ποσοστό των κυττάρων που είναι θετικά για FA ακολούθως ποσοτικοποιείται, όπως ήδη περιγράφηκε [17]. Όπως φαίνεται στο Σχ. 9K και 9L, ο αριθμός των LRP-1-καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν θετικές για συγκροτήματα προσκόλληση ταλίνη πλούσια αυξήθηκε κατά περίπου 1,4 φορές κατά την αναστολή του ERK (U0126 και dn-ΜΕΚ) και κατά 1,7 φορές υπό ενεργοποίηση JNK (ΜΚΚ-7 /JNK-1). Αντίθετα, η αύξηση του αριθμού των εστιακών επαφών προκαλείται από την LRP-1 σίγηση αντιστράφηκε εν μέρει από την ενεργοποίηση ERK (γα-ΕΚΚ) ή η αναστολή της JNK (SP600125 και dn-JNK). Κατά συνέπεια, LRP-1 φαίνεται ως κύρια μεσολαβητής διαταραχής προσκόλλησης μέσω της ρύθμισης των οδών σηματοδότησης ERK και JNK.

κύτταρα (Α-ϋ) shCTRL (Α-Ε) και shLRP-1 (F-J) σπάρθηκαν πάνω σε πλάκες επικαλυμμένες με ζελατίνη για 120 λεπτά. μονοπάτι σηματοδότησης ERK αναστάλθηκε σε κύτταρα shCTRL χρησιμοποιώντας 25 μΜ U0126 (Β) ή μια κινάση-νεκρή ΜΕΚ-1 μετάλλαγμα (dn-ΜΕΚ) (D) και ενεργοποιηθεί σε shLRP-1 κύτταρα από ένα συστατική ενεργοποίηση της ERK-2 (ca -ERK) (Ι). Ο φορέας ΜΚΚ-7 /JNK1 χρησιμοποιήθηκε για να προκαλέσει την ενεργοποίηση JNK σε κύτταρα shCTRL (Ε), ενώ JNK αναστολή σε LRP-1 ελλειμματικών κυττάρων που ελήφθη με τη χρήση ενός SP600125 10 μΜ (G) ή ένα νεκρό-κινάσης για JNK-1 ( dn-JNK) (J). DMSO (A, F) χρησίμευσε ως έλεγχος για φαρμακευτικές θεραπείες (B, G) και Lipofectamine (C, H) χρησίμευσε ως έλεγχος για επιμολύνσεις (D, Ε, Ι, J). Τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν για ταλίνη (πράσινο) και οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με DAPI (μπλε). Οι εικόνες είναι αντιπροσωπευτικές τουλάχιστον τρία ξεχωριστά σύνολα των πολιτισμών. Μπαρ, 20 μm. (K, L). Το ποσοστό των κυττάρων που είναι θετικά για τοπικές συμφύσεις ποσοτικοποιήθηκε μετά την διαμόρφωση της ERK και JNK δραστηριότητες με τη χρήση επιλεκτικής φαρμακευτικές αγωγές (Κ) ή το κατασκεύασμα υποδεικνυόμενη ΜΑΡΚ (L). Για κάθε συνθήκη, τριακόσια κύτταρα από τρία ξεχωριστά πειράματα αξιολογήθηκαν. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν σε ποσοστό, σε σύγκριση με κύτταρα shCTRL αντιμετωπίζονται από DMSO (Κ) ή Lipofectamine (L). *,

P

& lt?. 0.05

Η

LRP-1 συνδέεται με κυτταροσκελετού και FA στοιχεία και ελέγχει την πρόσληψη ενεργό ΜΑΡΚ εστιακής συγκροτήματα

Για να διευκρινιστεί ο μοριακός μηχανισμός με τον οποίο LRP-1 ελέγχει το FA δυναμική και κυτταροσκελετική οργάνωση μέσω της ρύθμισης ΜΑΡΚ, προσδιορισμοί ανοσοκαθίζησης διεξήχθησαν (Εικ. 10). Τα δεδομένα που παρουσιάζονται στην Εικόνα 10Α αποκάλυψε ότι α-ακτινίνης, ταλίνη και παξιλλίνης αλληλεπιδρούν με το LRP-1 β-αλυσίδας σε κύτταρα καρκινώματος ταχείας εισβολής. Είναι ενδιαφέρον, ανιχνεύσαμε επίσης τη σύνδεση μεταξύ LRP-1 και δραστικό φωσφο-SHP-2 (SH2 περιοχή-περιέχει πρωτεΐνη φωσφατάσης τυροσίνης-2), ΡΡ2Α (σερίνη /θρεονίνη πρωτεΐνη 2Α φωσφατάση), και ΡΑΚ (ρ-21 ενεργοποιημένη κινάση) η οποία αποτελούν βασικούς ρυθμιστές της ΜΑΡΚ σηματοδότησης. Άλλες μοριακές ρελέ, όπως Ras και ΜΕΚ βρέθηκαν επίσης συνδέονται με LRP-1-ICD (Εικ. S2). Η σύνθεση των συμπλοκών ταλίνη περιέχουν στη συνέχεια αναλύθηκε σε LRP-1-σιγήσει κυττάρων σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου όγκου (Σχ. 10Β). Όπως ήταν αναμενόμενο, μια αυξημένη ποσότητα ταλίνη παρατηρήθηκε σε LRP-1-ανεπαρκή κύτταρα. Επιπλέον, η ποσότητα του παξιλλίνη σε σύμπλοκα ταλίνη περιείχε ειδικά μεταβληθεί υπό LRP-1 ενώ η σίγηση α-ακτινίνη δεν ήταν. Είναι ενδιαφέρον ότι οι ενεργές μορφές της ERK ανιχνεύτηκαν κυρίως σε σύμπλοκα ταλίνη περιέχον LRP-1-εκφράζοντα κύτταρα. Επιπλέον, παρατηρήσαμε μια ισχυρή συσσώρευση φωσφο-ΙΝΚ σε αυτά τα σύμπλοκα υπό LRP-1 σιγαστήρα.

shCTRL και shLRP-1 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε επιφάνειες επικαλυμμένες με ζελατίνη και τα εκχυλίσματα ολόκληρων κυττάρων χρησιμοποιήθηκαν για να διεξάγουν πειράματα ανοσοκαταβύθισης (IP). (Α) Ανοσοκαταβύθιση του LRP-1 που περιέχουν σύμπλοκα διεξήχθη με χρήση των μονοκλωνικών αντισωμάτων αντι-LRP-1 (8G1). Ανοσοσύμπλοκα συνέχεια ανοσοστυπώθηκαν (IB) με χρήση ειδικών αντισωμάτων για LRP-1 β-αλυσίδα, α-ακτινίνη, η ταλίνη, παξιλλίνης, φωσφο-SHP-2, ΡΡ2Α και ΡΑΚ. (Β) Talin περιέχουν σύμπλοκα ανοσοκαταβυθίστηκαν και αναλύθηκαν με Western blot με-χρησιμοποιώντας αντι-ταλίνη, αντι-φωσφο-ΕΚΚ, αντι-φωσφο-ΙΝΚ, αντι-α-ακτινίνη και αντι-παξιλλίνη αντισώματα. Η μη ειδική IgGs χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικός έλεγχος από προσδιορισμούς ανοσοκαθίζησης.

Η

Συζήτηση

Λαμβάνοντας υπόψη την έλλειψη μοριακού γνώσεων σχετικά με LRP-1 στο πεδίο του καρκίνου, διερευνήσαμε την ενδοκυτταρική σηματοδότηση που συνδέει δίκτυο LRP-1 στην επιθετική συμπεριφορά των καρκινικών κυττάρων. Τα αποτελέσματά μας τόνισε ότι LRP-1 διατηρεί κακοήθη κύτταρα σε ένα συγκολλητικό κατάσταση ευνοϊκή για την εισβολή ελέγχοντας ERK και JNK οδών που εξαρτώνται.

Αρχικά απέδειξαν ότι LRP-1 έκφρασης σε κύτταρα καρκινώματος προκαλεί την ενεργοποίηση του ορού με τη μεσολάβηση ERK και είναι υπεύθυνη για τη συστατική αναστολή της JNK. Σύμφωνα με τα αποτελέσματά μας, προηγούμενες μελέτες έχουν αναφέρει μειωμένη φωσφορυλίωση του ERK-1/2 σε LRP-1-ανεπαρκή μη καρκινικών κυττάρων [15], [32]. Από την άλλη πλευρά, Ma και οι συνεργάτες ανέφεραν ότι LRP-1 θα μπορούσε να καταστέλλει την ενεργοποίηση ERK για τον έλεγχο της κινητικότητας των κυττάρων [31]. Σε κύτταρα ινοσαρκώματος ΗΤ1080, Webb και συνεργάτες έδειξαν ότι η ανεπάρκεια LRP-1 οδήγησε σε αυξημένο επίπεδο φωσφορυλιωμένης ERK που διεγείρει την κυτταρική μετανάστευση και εισβολή [33]. Σε αυτές τις μελέτες, η ενεργοποίηση του ΕΚΚ LRP-1-ανεπαρκή κύτταρα απαιτούσε την έκφραση του uPAR, υποδοχέα υΡΑ, το οποίο δεσμεύει την υαλονηκτίνη. Τα αποτελέσματα αυτά φαίνεται να είναι ιδιαίτερα υαλονηκτίνη εξαρτώμενη από το uPAR-βιτρονεκτίνη αλληλεπίδραση είναι γνωστό να είναι επαρκής για την κίνηση προς τα κάτω αλλαγές στη μετανάστευση των κυττάρων και την μεταγωγή σήματος [34]. Η ικανότητα του LRP-1 να μεσολαβεί στην πρόσληψη ενδοκυτταρική του υΡΑΚ και ρυθμίζουν προς τα κάτω την ποσότητα κυτταρικής επιφάνειας του υΡΑ: uPAR σύμπλοκο συχνά προκαλείται για να εξηγήσει τον έλεγχο της ενεργοποίησης ERK με LRP-1 [31], [33], [35 ]. Ωστόσο, shRNA μεσολάβηση knock-down του LRP-1 δεν επηρέασε το επίπεδο της επιφάνειας των κυττάρων του υΡΑΚ στο μοντέλο μας [17]. Αν και ERK ενεργοποίηση αναφέρθηκε ως απάντηση στην δέσμευση συνδέτη σε LRP-1 [15], [19], [32], [36], μια σαφής εικόνα των υποκείμενων μηχανισμών εξακολουθεί να απουσιάζει.