Αφηρημένο

Παρά τις πρόσφατες προόδους στην στοχευμένες θεραπείες, οι ασθενείς με παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα συνεχίζουν να έχουν κακή επιβίωση υπογραμμίζοντας την επείγουσα ανάγκη να ταυτοποίηση νέων θεραπευτικών στόχων. προηγούμενες έρευνες μας έχουν ενοχοποιηθεί υποδοχέα χημειοκινών CXCR4 και επιλεκτική CXCL12 συνδέτη της στην παθογένεση και την εξέλιξη της παγκρεατικής ενδοεπιθηλιακής νεοπλασίας και διηθητικό καρκίνο του παγκρέατος? ως εκ τούτου, CXCR4 είναι ένα υποσχόμενο στόχο για καταστολή της ανάπτυξης καρκίνου του παγκρέατος. Εδώ, συνδυάσαμε

in silico

διαρθρωτικές μοντελοποίηση του CXCR4 για τη διαλογή ενώσεων υποψήφιο αντι-CXCR4 με

in vitro

δοκιμασίες κυτταρικής σειράς και προσδιορίζονται NSC56612 από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου (NCI) Ανοικτό Χημική Repository Συλλογή ως αναστολέας ενεργοποιημένου CXCR4. Στη συνέχεια, προσδιορίζεται ότι NSC56612 είναι δομικά παρόμοια με την καθιερωμένη χλωροκίνη φάρμακα κατά της ελονοσίας και υδροξυχλωροκίνη. Αξιολογήσαμε αυτές οι ενώσεις σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα

in vitro

και παρατηρήθηκε ειδική ανταγωνισμός της CXCR4 μεσολάβηση σηματοδότηση και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Πρόσφατες

in vivo

θεραπευτικές εφαρμογές της χλωροκίνης σε παγκρεατικά μοντέλα ποντικού καρκίνου έχουν καταδείξει μειωμένη ανάπτυξη του όγκου και βελτιωμένη επιβίωση. Τα αποτελέσματά μας παρέχουν έτσι ένα μοριακό στόχο και βάση για περαιτέρω αξιολόγηση του χλωροκίνη και υδροξυχλωροκίνη σε καρκίνο του παγκρέατος. Ιστορικά ασφαλής στους ανθρώπους, χλωροκίνη και υδροξυχλωροκίνη φαίνεται να είναι πολλά υποσχόμενη παράγοντες για την ασφαλή και αποτελεσματική στόχευση CXCR4 σε ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος

Παράθεση:. Kim J, Yip MLR, Shen Χ, Li H, Hsin L-YC, Labarge S, et al. (2012) Στοιχεία της κατά της ελονοσίας Ενώσεις όπως νέους ανταγωνιστές να χημειοκινών CXCR4 υποδοχέα σε κύτταρα καρκίνου του παγκρέατος. PLoS ONE 7 (2): e31004. doi: 10.1371 /journal.pone.0031004

Επιμέλεια: Jingwu Xie, Indiana University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 29, Ιουνίου του 2011? Αποδεκτές: 30η Δεκεμβρίου 2011? Δημοσιεύθηκε: 3η Φεβρουαρίου του 2012

Copyright: © 2012 Kim et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει με επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου [P30 CA33572 να JK, MLRY και NV]? τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (NIH) [ΝΙΗ CA134637 να JK]? και η Αμερικανική Εταιρεία Καρκίνου (ACS) [ΕΓΓ-11-070-01-ΤΒΕ σε JK]. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία των περιεχομένων manuscript.The είναι αποκλειστικά την ευθύνη των συγγραφέων και δεν αντιπροσωπεύουν τις επίσημες απόψεις του Εθνικού Ινστιτούτου για τον Καρκίνο, ΝΙΗ ή ACS.

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του παγκρέατος αγωγό είναι μια ομοιόμορφα θανατηφόρα ασθένεια που συχνά διαγιγνώσκεται με μακρινή μετάσταση στο χρόνο. της αρχικής κλινικής εικόνας. Μη αναγνωρισμένες πρώιμο στάδιο της νόσου και μια ιδιαίτερα επεμβατική φαινότυπος είναι πρωτογενείς παράγοντες για την κακή πρόγνωση που σχετίζεται με τον καρκίνο του παγκρέατος και υπογραμμίζουν την επείγουσα ανάγκη για τον εντοπισμό μοριακοί στόχοι για την εξέλιξη της νόσου. Πρόσφατα, οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ χημειοκίνες και τους αντίστοιχους υποδοχείς τους έχουν εξεταστεί στην παθογένεση, εξέλιξη, και η μετάσταση του καρκίνου του παγκρέατος [1], [2], [3]. Αυτές οι μελέτες έχουν δείξει ότι οι ανταγωνιστές να χημειοκινικούς CXCR4 υποδοχέα μπορεί να καταργήσει την επεμβατική φαινότυπο του καρκίνου του παγκρέατος [4], [5], [6]. Παρά την αυξανόμενη απόδειξη της σημασίας των CXCR4 σε παγκρεατικού καρκίνου και άλλων κακοηθειών, ανταγωνιστές προς CXCR4 που είναι ασφαλείς και αποτελεσματικές για κλινική χρήση παραμένουν λείπει.

Chemokine CXCL12 (επίσης γνωστό ως στρωματικά προερχόμενο παράγοντα-1α, SDF- 1α) ενεργοποιεί πολλαπλά κατάντη οδούς τελεστή κατά τη δέσμευση του υποδοχέα του CXCR4 [7]. Η αλληλεπίδραση CXCL12-CXCR4 ρυθμίζει χημειοταξίας, προσκόλλησης, και η έκκριση αυξητικών παραγόντων μεταξύ πολλών γνωστών λειτουργιών του [8]. Λίγο μετά CXCR4 ταυτοποιήθηκε ως συν-υποδοχέας για τον ιό HIV-1 και HIV-2 [9], [10], το μικρό μόριο AMD3100 δικυκλαμικό ταυτοποιήθηκε ως ειδικός ανταγωνιστής CXCR4 [5]. AMD3100 τώρα έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως για να ερευνήσει και να ανακρίνουν CXCL12-CXCR4 αλληλεπιδράσεις [7]. Αν και AMD3100 παραμένει σε κλινική χρήση για την κινητοποίηση βλαστικών κυττάρων, η χρόνια χορήγηση του έχει συσχετισθεί με σημαντική καρδιοτοξικότητα [11]. Είναι ενδιαφέρον ότι, πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι εκτός από το ρόλο του ως ένας ανταγωνιστής προς CXCR4 σηματοδότησης, AMD3100 παραδόξως δεσμεύει και ενεργοποιεί τον υποδοχέα χημειοκίνης CXCR7 [12], [13].

Δεδομένου ότι τα τρέχοντα δεδομένα δείχνουν ότι AMD3100 μπορεί να μην είναι ασφαλής ή αποτελεσματική ως αντι-CXCR4 για θεραπευτικές εφαρμογές σε καρκίνο του παγκρέατος, ειδικοί ανταγωνιστές παραμένουν να προσδιοριστούν για το σκοπό αυτό. Σε αυτή την διεπιστημονική έρευνα, συνδυάσαμε

in silico

μοντελοποίηση της δομής CXCR4 με διαλογή υψηλής απόδοσης και

in vitro

δοκιμασίες στις παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές για την ταυτοποίηση νέων ανταγωνιστών να τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων CXCR4-προκαλούνται στα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Η μελέτη μας δείχνει ότι η ασφαλής και αποτελεσματική κατά της ελονοσίας χλωροκίνη ναρκωτικών και υδροξυχλωροκίνη είναι αποτελεσματικοί ανταγωνιστές CXCR4 που καταστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των παγκρεατικών κυττάρων καρκίνου.

Αποτελέσματα

Υπολογιστική Μοντελοποίηση της CXCR4

Η διαρθρωτικές σύνολο του υποδοχέα CXCR4 άγριου τύπου είχε προβλεφθεί με τη χρήση του

ab initio

μέθοδος πρόβλεψης δομής (MembStruk4.3) [14], [15]. Συγκρίναμε τη δέσμευση του μονο- και δικυκλαμικό ενώσεων να προβλεφθεί δομές μας με τα δεδομένα μεταλλαξιογονίας για την επικύρωση υπολογιστική προβλέψεις μας [16]. Οι προβλέψεις μας υποβλήθηκαν στο διαγωνισμό εκτίμηση δομή πρωτεΐνης (GPCRDOCK2010) πριν από τον χαρακτηρισμό της κρυσταλλικής δομής του CXCR4 [17]. Μια λεπτομερής σύγκριση της προβλεπόμενης σύνταξης με την κρυσταλλική δομή έχει επαληθεύσει την ακρίβεια των μοντέλων μας και έχει δημοσιευθεί αλλού (Σχήμα 1) [18].

Το μικρό μόριο που ονομάζεται «1κ» τοποθετείται στην προβλεπόμενη δεσμευτική τοποθεσία. Η μέση τετραγωνική ρίζα απόκλισης των προβλεπόμενων και των κρυσταλλικών δομών είναι 2,5 Α, γεγονός που καταδεικνύει την ευθυγράμμιση της προβλεπόμενης μας μοντέλου με την καθιερωμένη κρυσταλλική δομή. Κατά συνέπεια, η προβλεπόμενη τοποθεσία της θέσης πρόσδεσης του μικρού μορίου «1κ» ταιριάζει με την κρυσταλλική δομή. Το μικρό μόριο «1κ» απεικονίζεται σαν μικρές σφαίρες.

Η

Έχουμε τη διενέργεια του ελέγχου εικονικού συνδέτη (VLS) του (NCI) Ανοικτό Χημική Συλλογή Αποθετήριο του Εθνικού Ινστιτούτου Καρκίνου για 3 διαφορετικές προβλέψει διαμορφώσεις του CXCR4. Στη συνέχεια, οι υποψήφιες μικρά μόρια διηθούνται με βάση την εγγύτητά τους με τα υπολείμματα που παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανταγωνιστής δέσμευσης, δηλαδή: D92 (TM2), H121 (ΤΜ3), D171 (ΤΜ4), E262 (ΤΜ6) και E288 (ΤΜ7) [ ,,,0],19], [20]. Περίπου το 90% των μικρών μορίων αποκλείστηκαν σε αυτό το βήμα.

ενέργειες δέσμευσης των μικρών μορίων Στη συνέχεια υπολογίστηκαν και η κορυφή 10% των μικρών μορίων με τα χαμηλότερα ενέργειες δέσμευσης διατηρήθηκαν. Οι χημικές δομές στο top 10% των επισκέψεων κυμαίνονταν από πολυ-αρωματικές δομές δακτυλίου σε κατασκευές με μεγαλύτερες αλυσίδες αλκυλίου. Το πρωταρχικό κριτήριο για περαιτέρω επιλογή ήταν η αλληλεπίδραση των υποψήφιων μορίων με τα υπολείμματα που είναι γνωστό ότι είναι σημαντικά για τη σύνδεση ανταγωνιστή [16]. Αυτά τα μόρια στη συνέχεια εξετάζονται για την πρωτεΐνη-συνδέτη επαφές και 50 υποψήφιων μικρών μορίων επιλέχθηκαν από περίπου 350.000 μόρια για την πειραματική δοκιμή.

NSC56612 και συναφείς ενώσεις αναστέλλουν τον υποδοχέα CXCR4-σηματοδότηση μέσω

Από τις 50 υποψήφιες ενώσεις από VLS, ήμασταν σε θέση να προμηθευτεί 32 από το NCI για την πειραματική δοκιμή. Η διαλογή των 32 ενώσεων πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία Tango που δοκιμάζει την αναστολή της CXCL12 μεσολάβηση πρόσληψη β-αρρεστίνης με το καρβοξυτελικό άκρο της CXCR4. Αυτή η δοκιμασία προσδιορίζεται μία ένωση hit που κατέστειλε την πρόσληψη β-αρρεστίνης και τις χημικές δομές αυτής της ένωσης NSC56612 φαίνεται στο Σχήμα 2. Πραγματοποιήσαμε περαιτέρω μια γκάμα άμεσης σύνδεσης συνδετήρα, δευτερεύον αγγελιοφόρος ροή ασβεστίου, και κατάντη προσδιορισμούς χημειοταξίας που προκαλείται από τον CXCR4 /άξονα CXCL12 να επαληθεύσει ότι οι ενώσεις αυτές έχουν άμεση στόχευση CXCR4. NSC56612 χρησιμοποιήθηκε ως εκμαγείο για την ταυτοποίηση ενώσεων με παρόμοιες χημικές δομές. Αυτό οδήγησε στην ταυτοποίηση τριών άλλων ενώσεων που είναι αντι-ελονοσίας παράγοντες:. Χλωροκίνη, υδροξυχλωροκίνη, και quinacrine (Σχήμα 2)

(Α) NCI ένωση NSC56612, (Β) χλωροκίνη, (C) υδροξυχλωροκίνη, και (D) κινακρίνη.

η

Σχήμα 3Α δείχνει την καμπύλη εξάρτηση από τη συγκέντρωση της άμεσης αναστολής της επισημανθεί διά φθορισμού CXCL12 σύνδεσης από NSC56612, χλωροκίνη, υδροξυχλωροκίνη, και κινακρίνη. Πειράματα ανταγωνιστικής σύνδεσης έδειξαν ότι αυτές οι ενώσεις άμεσα αναστέλλουν σύνδεση του CXCL12 να CXCR4 με χαμηλό μικρο-μοριακή συγγένεια. Η δοκιμασία στην οποία β-αρρεστίνης-2 πρόσληψη διαμεσολαβείται από CXCL12 αξιολογείται επίσης έδειξαν αναστολή από αυτές τις τρεις ενώσεις με χαμηλό μικρο-μοριακή αποτελεσματικότητα (Σχήμα 3Β). Σχήμα 3Β δείχνει επίσης αναστολή από AMD3100, ένας ανταγωνιστής CXCR4.

(Α) εξαρτάται από τη συγκέντρωση αναστολή της σημασμένο με φθορισμό CXCL12 (60 nM) σύνδεση με snap-tagged υποδοχέα CXCR4 στα κύτταρα ΗΕΚ293 από NSC56612, χλωροκίνη και υδροξυχλωροκίνη. Οι ημιμέγιστη αποτελεσματικές συγκεντρώσεις (ΕΚ

50), οι τιμές στις οποίες μέγιστη CXCL12-CXCR4 πρόσδεση αναστέλλεται κατά 50%, για AMD3100, NSC56612, χλωροκίνη και υδροξυχλωροκίνη είναι 60,0 ηΜ, 5.5 μΜ, 6.1 μΜ και 9.8 μΜ , αντίστοιχα. Αυτές οι καμπύλες είναι αντιπροσωπευτικά δεδομένα από 3 πειράματα που εκτελέστηκαν εις διπλούν. (Β) Η δοσοεξαρτώμενη αναστολή της β-αρρεστίνης-2-προκαλούμενη δραστικότητα βήτα-λακταμάσης CXCL12 που προκαλείται σε μηχανική δοκιμασία Tango δια προκατεργασίας με AMD 3100, NSC56612, χλωροκίνη, υδροξυχλωροκίνη και. δεδομένα εκπομπής σε 460/530 ορίστηκε ως η αναλογία απόκρισης. Αυτές οι καμπύλες είναι αντιπροσωπευτικά δεδομένα από 3 πειράματα που εκτελέστηκαν εις διπλούν. (Γ) Η δοσοεξαρτώμενη αναστολή της CXCL12 επαγόμενης ενδοκυτταρικής ροής ασβεστίου από την AMD 3100, NSC56612, χλωροκίνη, υδροξυχλωροκίνη. Η CXCR4 μεσολάβηση εισροή ασβεστίου μετρήθηκε σε 1 μΜ AMD3100 και δύο διαφορετικές συγκεντρώσεις (100 μΜ και 200 ​​μΜ) των τριών ενώσεων σε Molt-4 κύτταρα. AMD 3100, NSC56612, χλωροκίνη, υδροξυχλωροκίνη και έδειξε 50 με 60% αναστολή της CXCL12 που προκαλείται εισροή ασβεστίου. Αυτές οι καμπύλες είναι αντιπροσωπευτικά δεδομένα από 3 πειράματα που εκτελέστηκαν εις διπλούν. (D) Αναστολή της επαγόμενης CXCL12-Jurkat κυτταρικής μετανάστευσης από AMD3100 (100 ηΜ), NSC56612 (100 μΜ), χλωροκίνη (100 μΜ), και υδροξυχλωροκίνη (100 μΜ). Και οι τέσσερις ενώσεις έδειξαν 40% έως 50% μείωση σε CXCL12-επαγόμενη μετανάστευση των κυττάρων. Το σχήμα δείχνει τα δεδομένα από 4 πειράματα που εκτελέστηκαν εις διπλούν. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν ± μία SD. Student t-test:. * Cary, NC). Οι σχετικές αναλογίες των CXCL12-CXCR4 σύνδεση ελήφθησαν από τη διαίρεση του σήματος του δέκτη (665 nm) από το σήμα δότη (620 nm) και πολλαπλασιάζοντας την τιμή αυτή κατά 10.000.

CXCR4 Πρόσληψη β-αρρεστίνης

η ενεργοποίηση των CXCL12-CXCR4 άξονα έχει ως αποτέλεσμα την πρόσληψη του β-αρρεστίνης-2 στο καρβοξυ άκρο του CXCR4 [50]. Για να επαληθεύσετε την αναστολή των β-αρρεστίνης-2 πρόσληψη των υποψηφίων CXCR4 ανταγωνιστές, χρησιμοποιήσαμε μια δοκιμασία εμπορικής CXCR4 (Tango? Invitrogen, Carlsbad, CA) [51], [52]. Εν συντομία, τα τροποποιημένα κύτταρα (3 χ 10

4) σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων και επωάζονται όλη τη νύκτα. DMSO ή ανταγωνιστές προστέθηκαν στα κύτταρα για 30 λεπτά. Τότε CXCL12 (60 ηΜ) προστέθηκε και τα κύτταρα επωάστηκαν για 5 ώρες.