Αφηρημένο

Περισσότερο από το 90% της θνησιμότητας του καρκίνου οφείλονται σε καρκίνο που έχει κάνει μετάσταση. Ως εκ τούτου, είναι σημαντικό να εντατικοποιηθεί η έρευνα για τον σχηματισμό μεταστάσεων και θεραπεία. Εδώ, περιγράφουμε για πρώτη φορά τη μετάσταση ικανότητα του ανθρώπινου τραχηλικού κυτταρική σειρά καρκίνου C33A σε αθυμικά γυμνά ποντίκια μετά από υποδόρια εμφύτευση των καρκινικών κυττάρων. Σε αυτό το μοντέλο, έχουμε καταδείξει μια σταθερή εξέλιξη της οσφυϊκής και νεφρικής λεμφαδένα μεταστάσεων κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του όγκου. Εκτός κυρίως συμβαίνουν λεμφικού μεταστάσεις, θα απεικονιστεί το σχηματισμό των αιματογενών μεταστάσεων χρησιμοποιώντας κόκκινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (RFP) κυττάρων που εκφράζουν C33A-RFP. RFP θετικά καρκινικά κύτταρα βρέθηκαν μεταναστεύουν στα αιμοφόρα αγγεία και σχηματίζουν μικρομεταστάσεων στους πνεύμονες των ποντικών που φέρουν όγκο. Στη συνέχεια, έθεσε ως στόχο να αναλύσει την επίδραση της ογκολυτική ιοθεραπείας στο μοντέλο C33A-RFP και απέδειξαν ένα αποτελεσματικό ιό διαμεσολαβούμενη μείωση του μεγέθους του όγκου και των μεταστατικών βάρος. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν το μοντέλο καρκίνου του τραχήλου της μήτρας C33A-RFP ως νέα πλατφόρμα για την ανάλυση μεταστάσεις καρκίνου, καθώς και για τη δοκιμή νέων θεραπευτικών επιλογών για την καταπολέμηση μεταστάσεων

Παράθεση:. Donat U, Rother J, Schäfer S, Hess M, Hartl Β, Kober C, et al. (2014) Χαρακτηρισμός της μετάστασης Σχηματισμός και ιοθεραπείας στην Ανθρώπινη C33A καρκίνο του τραχήλου μοντέλο. PLoS ONE 9 (6): e98533. doi: 10.1371 /journal.pone.0098533

Επιμέλεια: Hiroshi Miyazaki, Βιρτζίνια Πανεπιστήμιο της Κοινοπολιτείας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 6 Σεπ, 2013? Αποδεκτές: 5 Μάη 2014? Δημοσιεύθηκε: δεύτερης, Ιουνίου 2014

Copyright: © 2014 Donat et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το τμήμα Έρευνας και Ανάπτυξης της Genelux Corporation, San Diego, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής, και μια υπηρεσία υποτροφία για το Πανεπιστήμιο του Wuerzburg, στη Γερμανία χρηματοδοτήθηκε από Genelux Corp. UD και ΝΔ έλαβαν μεταδιδακτορικός υπότροφος. JR, CK, SS, και ΜΗ έλαβε μεταπτυχιακό υποτροφία από Genelux Corporation απονέμεται στο Πανεπιστήμιο του Βίρτσμπουργκ. AAS, JS, NGC και RJA είναι μισθωτοί της Genelux Corporation και έχουν οικονομικά συμφέροντα σε Genelux Corporation. BH είναι ένας μισθωτός του Genelux GmbH. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Τμήμα Έρευνας και Ανάπτυξης της Genelux Corporation, San Diego, ΗΠΑ, και μια υπηρεσία υποτροφία για το Πανεπιστήμιο του Wuerzburg, στη Γερμανία χρηματοδοτήθηκε από Genelux Corp. UD και ΝΔ έλαβαν μεταδιδακτορικός υπότροφος. JR, CK, SS και MH έλαβε μεταπτυχιακό υποτροφία από Genelux Corporation απονέμεται στο Πανεπιστήμιο του Βίρτσμπουργκ. AAS, JS, NGC και RJA είναι μισθωτοί της Genelux Corporation και έχουν οικονομικά συμφέροντα σε Genelux Corporation. BH είναι ένας μισθωτός του Genelux GmbH. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Επιπλέον, σε όλα τα ανταγωνιστικά συμφέροντα δήλωσε πριν από τους συγγραφείς προσθέτουν ότι όσοι δεν μεταβάλλουν την προσκόλλησή τους σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

μεταστατική εξάπλωση των όγκων είναι μια διαδικασία πολλαπλών σταδίων κατά την οποία τα κακοήθη κύτταρα διάδοση από τον πρωτογενή όγκο σε απομακρυσμένα όργανα [1]. καρκινικά κύτταρα μεταναστεύουν μέσω δύο κύριες οδούς: το λεμφικό σύστημα και την κυκλοφορία του αίματος. Κατά τη διάρκεια του λεμφικού μετάσταση, ένα κοινό χαρακτηριστικό για τα περισσότερα καρκινώματα, τα καρκινικά κύτταρα εγκαταλείψουν την αρχική θέση του όγκου και μεταναστεύουν μετά το διακανονισμό στην περιφερειακή λεμφαδένες σε μακρινά [2]. Η διάγνωση των μεταστάσεων λεμφαδένων είναι μείζονος σημασίας. Ακόμα κι αν, λεμφαδένων μεταστάσεων οι ίδιοι σπάνια απειλητική για τη ζωή που δείχνουν την κατάσταση της εξέλιξης του όγκου [3]. Οι περισσότεροι θάνατοι από καρκίνο οφείλονται στην ανάπτυξη των μεταστάσεων. Ως εκ τούτου, μια ευρύτερη κατανόηση της βιολογίας των μεταστάσεων είναι απαραίτητη. Τρεις μεγάλες πλατφόρμες χρησιμοποιούνται σήμερα για την ανάπτυξη

in vivo

μοντέλα μετάστασης. Αυτές περιλαμβάνουν χημική επαγωγή, σύμφωνα με την οποία οι καρκινογόνες ουσίες χορηγούνται για την επαγωγή ογκογένεση και τη μετάσταση, συγγενή και μεταμόσχευση ξενομοσχεύματος μοντέλα που περιλαμβάνουν τη μεταμόσχευση των κυττάρων του όγκου /ιστού εντός ποντικού ξενιστές και γενετικά μοντέλα ποντικών [4] – [5]. Εδώ, εργαζόμαστε με ένα ξενογενές μοντέλο αυθόρμητη μεταμόσχευση μετάσταση. Ένας αριθμός ξενογενούς μοντέλα μετάστασης έχουν δημιουργηθεί τα τελευταία χρόνια, για παράδειγμα, για προστάτη [6] – [8], του παχέος [9] – [10], του μαστού [11] – [12], γαστρικό [13] – [14] ή νεφρικών κυττάρων [15] καρκινωμάτων. Επιπλέον, υπάρχουν και ορισμένα μοντέλα του ιού των ανθρώπινων θηλωμάτων (HPV) που περιγράφεται θετικό καρκίνο του τραχήλου της μήτρας [16] – [18]

Κατά τη διάρκεια της μελέτης του τραχήλου της μήτρας προσυμπτωματικό έλεγχο του καρκίνου (HPV θετικές και αρνητικές κυτταρικές σειρές HPV) για. ογκολυτική ιοθεραπείας αναλύθηκε η επίδραση του ιού της δαμαλίτιδας ογκολυτικού GLV-1h68 σε αυτές τις κυτταρικές σειρές. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι οι παρουσίες και ο αριθμός αντιγράφων του HPV DNA σε τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα δεν έχουν επίπτωση στη θεραπευτική αποτελεσματικότητα της GLV-1h68 (Πίνακας S1). Επιπλέον ανακαλύψαμε τον σχηματισμό μεταστάσεων λεμφαδένα μετά την υποδόρια εμφύτευση C33A ανθρώπινου τραχηλικού καρκινικά κύτταρα HPV-αρνητικά σε ανοσοκατεσταλμένους ποντικούς. Ως εκ τούτου, σε αυτή τη μελέτη, επικεντρώθηκε στην χαρακτηρισμό της ικανότητας μετάστασης αυτής της κυτταρικής γραμμής, η οποία δεν έχει περιγραφεί στην βιβλιογραφία μέχρι σήμερα. Αναλύσαμε το λεμφικό και το αιματογενή εξάπλωση των κυττάρων C33A-RFP σε γυμνά ποντίκια μετά από υποδόρια εμφύτευση των κυττάρων του όγκου, οπότε λεμφική κυκλοφορία αντιπροσώπευε την κύρια οδός μεταστάσεις καρκινικών κυττάρων. Επιπλέον, μια σταθερή εξέλιξη των μεταστάσεων λεμφαδένα σε συσχέτιση με την ανάπτυξη του όγκου καταδείχθηκε.

Επιπλέον, αναλύσαμε ογκολυτική ιοθεραπείας όγκων και των μεταστάσεων C33A ως νέου επιλογή θεραπείας. Oncolytic ιοί είναι σε θέση να αναπαράγουν επιλεκτικά στα καρκινικά κύτταρα, με αποτέλεσμα την καταστροφή του ιστού του όγκου, αλλά αφήνοντας υγιείς ιστούς αβλαβής [19]. Εδώ, εστιάσαμε στην μελέτη της επίδρασης που περιγράφηκαν προηγουμένως εξασθενημένο, ανασυνδυασμένο ιό δαμαλίτιδας GLV-1h68 [20] – [21]. Το θεραπευτικό αποτέλεσμα αυτού του ιού σε πρωτογενείς όγκους έχει δειχθεί για πολλούς καρκινώματα όπως καρκίνο του μαστού, του παγκρέατος ή του καρκίνου του προστάτη [21] – [23]. Επιπλέον, δείξαμε πρόσφατα ένα θεραπευτικό δυναμικό των GLV-1h68 στη θεραπεία του λεμφικού και αιματογενή μεταστάσεις που προέρχονται από τον προστάτη κυτταρική σειρά ανθρώπινου καρκινώματος PC-3 [22], υποδεικνύοντας ότι GLV-1h68 να είναι σε θέση να εξαλείψουν μεταστάσεις στο C33A-μοντέλο ως Λοιπόν. Πράγματι, εδώ έχουμε αποδειχθεί δραστική ιό μεσολάβηση μείωση των όγκων C33A-RFP και μεταστατικό φορτίο τους.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές

Το HPV-αρνητικό ανθρώπινο τραχήλου της μήτρας καρκινική κυτταρική σειρά C33A καλλιεργήθηκε σε ϋΜΕΜ υψηλής γλυκόζης (ΡΑΑ Laboratories, Cölbe, Γερμανία) συμπληρωμένο με 10% FCS (ΡΑΑ Laboratories, Cölbe, Γερμανία) και 1% διάλυμα γενταμυκίνη (ΡΑΑ Laboratories, Cölbe, Γερμανία). Η C33A κυτταρική σειρά παρασχέθηκε ευγενώς από τον Frank Stubenrauch, PhD (UKT, Πανεπιστήμιο του Tübingen? [24]). Αυθεντικότητα των κυττάρων C33A επαληθεύτηκε από την DSMZ GmbH (Leibniz Ινστιτούτο DSMZ-Γερμανική Συλλογή Μικροοργανισμών και Κυτταρικών Καλλιεργειών, Braunschweig, Γερμανία). κύτταρα C33A-RFP καλλιεργήθηκαν υπό τις ίδιες συνθήκες, εκτός από την προσθήκη 5 μg /mL βλαστισιδίνη. ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα νεφρού (293FT) ελήφθησαν από την Invitrogen GmbH (Καρλσρούη, Γερμανία) και καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% FCS και 2 mM Ε-γλουταμίνη (ΡΑΑ Laboratories, Cölbe, Γερμανία).

Δημιουργία κύτταρα C33A-RFP

Η αλληλουχία cDNA της κόκκινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (

mRFP1

) εισήχθη στο γονιδίωμα C33A κυττάρων με τη χρήση Βίρα Ισχύς λεντοϊών Kit Σύστημα έκφρασης (Invitrogen GmbH, Γερμανία) σύμφωνα με το τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η

mRFP1

-Κωδικοποίηση πλασμίδιο pCR-ΤΚ-SEL-mRFP παρέχονται από Q. Zhang (Genelux Corporation, San Diego) και χρησιμοποιείται για να δημιουργήσει το

mRFP1-

περιέχουν φορείς λεντοϊών όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25]. Ανίκανος αναδιπλασιασμού

mRFP1

-Κωδικοποίηση φακοϊούς παράχθηκαν σε 293FT κύτταρα με συν-επιμόλυνση των πλασμιδίων pLP1, pLP2, pLP /VSVG που παρέχουν βραδέος δομικές πρωτεΐνες και αναδιπλασιασμό και το πλασμίδιο έκφρασης pLenti6 /V5-DEST-mRFP χρησιμοποιώντας Lipofectamine ™ 2000. Μετά την μεταγωγή των κυττάρων C33A με mRFP-κωδικοποίηση φακοϊούς και βλαστισιδίνη (5 μg /mL) επιλογής, επιλέχθηκε ένα σταθερό RFP έκφραση C33A κλώνο.

στέλεχος του ιού

Το εξασθενημένο στέλεχος του ιού της ευλογιάς GLV- 1h68 περιγράφηκε προηγουμένως από τον Zhang

et al

. [21]. Τρεις κασέτες έκφρασης που κωδικοποιούν για το

Renilla

λουσιφεράσης-GFP πρωτεΐνη σύντηξης, β-γαλακτοσιδάση, ή β-γλυκουρονιδάση ανασυνδυάστηκαν στο

F14.5L

,

J2R

και

A56R

τόπους, αντίστοιχα, του γονιδιώματος του ιού LIVP γονική.

Ηθική δήλωση

Όλα τα ζώα φροντίδα και ο χειρισμός αυστηρά σύμφωνα με τις καλές πρακτικές των ζώων, όπως ορίζονται από την εθνική και οργανισμούς τοπικής καλή διαβίωση των ζώων (Οδηγός για τη Φροντίδα και Χρήση των πειραματόζωων που δημοσιεύθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας και το γερμανικό Animal Welfare Act «TierSchG»). Πειραματικά πρωτόκολλα εγκρίθηκαν από την κυβέρνηση του Unterfranken, Γερμανία (αριθμοί πρωτοκόλλου 55.2-2531.01-17 /08 και 55.2-2531.01-25 /12) ή /και η Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Χρήση (IACUC) της Explora BioLabs, που βρίσκεται στη Σαν Ντιέγκο Science Center (San Diego, USA) (αριθμοί πρωτοκόλλου: EB08-003? EB11-025).

εμφύτευση του όγκου και του ιού της διοίκησης

οι όγκοι που δημιουργούνται από την εμφύτευση 5 × 10

6 C33A-RFP κύτταρα σε 100 μL PBS υποδορίως στην λαγόνα τη δεξιά κοιλιακή 6-8 εβδομάδων θηλυκών αθυμικών γυμνών

Foxn1

nu

ποντικούς (Harlan Winkelmann GmbH, Borchen, Germany). Tumor και λεμφαδένα όγκος παρακολουθήθηκε σε δύο διαστάσεις χρησιμοποιώντας ένα ψηφιακό παχύμετρο και υπολογίζεται ως [(μήκος) χ (πλάτος)

2 × 0,52]. Ο όγκος του όγκου μετρήθηκε σε ζωντανούς ποντικούς, ενώ ο όγκος των λεμφαδένων μετρήθηκε

μεταθανάτια

, μετά το άνοιγμα της κοιλιάς. Ένας λεμφαδένας ορίστηκε να διευρυνθεί όταν η μέγιστη διάμετρος υπερέβη 3 mm. Για τη μελέτη της επίδρασης του ογκολυτικού ιοθεραπείας μια εφάπαξ δόση των 5 × 10

6 μονάδες σχηματισμού πλάκας (pfu) του GLV-1h68 σε 100 μL PBS εγχύθηκε ενδοφλεβίως (iv) σε ποντικούς που φέρουν όγκο C33A-RFP, αφού ο όγκος όγκος έφτασε 200-250 mm

3. Τα ποντίκια θυσιάστηκαν, σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές για την ευθανασία των τρωκτικών χρησιμοποιώντας διοξείδιο του άνθρακα.

φθορισμού απεικόνισης

Εικόνες των ποντικών που φέρουν όγκο C33A-RFP ελήφθησαν με το EX Σύστημα Απεικόνισης Maestro (δαγκάνα, Hopkinton , MA, USA). Ο φθορισμός απεικόνιση όγκων, τα νεφρά, τους πνεύμονες και τους λεμφαδένες των ποντικών που φέρουν όγκο C33A-RFP διεξήχθη με MZ16 FA Stereo-Μικροσκόπιο φθορισμού (Leica, Wetzlar, Germany). Για την απεικόνιση των ποντικών με το Σύστημα Απεικόνισης Maestro EX, τα ζώα αναισθητοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας 2-3% ισοφλουράνιο. Ψηφιακές εικόνες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με το Photoshop 7.0 (Adobe Systems, Mountain View, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής).

Η μέτρηση της έντασης φθορισμού

Η μέτρηση της έντασης φθορισμού του σήματος RFP στους λεμφαδένες και στους νεφρούς των C33A- RFP ποντίκια που φέρουν όγκους εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας ImageJ (https://rsbweb.nih.gov/ij). RGB-εικόνες του σήματος RFP των νεφρών και των λεμφαδένων μετατράπηκαν σε 8-bit γκρι κλίμακας με ένα εύρος ένταση από 0-255. Η ένταση του φθορισμού αντιπροσωπεύει τη μέση φωτεινότητα όλων των εικονοστοιχείων που σχετίζονται RFP.

Ανοσοϊστοχημεία

Για ιστολογία, όγκους, λεμφαδένες και τα νεφρά αποκόπηκαν και σταθεροποιήθηκαν για 16 ώρες σε 4% παραφορμαλδεϋδη /PBS, ρΗ 7.4. Παρασκευή 100 μm τομές και τις διαδικασίες επισήμανσης διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26] χρησιμοποιώντας το Leica VT1000 Vibratom (Leica, Heerbrugg, Ελβετία). Μετά την επισήμανση, τα τμήματα του ιστού τοποθετήθηκαν σε Mowiol 4-88 (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Γερμανία). Για την παρασκευή μm τομές δειγμάτων ιστού 10 κόπηκαν με κρυοστάτη 2800 Frigocut (Leica, Wetzlar, Germany). Μετά από αφυδάτωση σε 10% και 30% σακχαρόζη (Carl Roth, Karlsruhe, Germany) δείγματα εγκλείστηκαν σε Tissue-Tek O.C.T. (Sakura Finetek Ευρώπη B.V., Alphen aan den Rijn, Ολλανδία). Cryo-τομές φυλάχθηκαν στους -80 ° C και επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα για 1 ώρα. Μετά την πλύση με PBS, οι τομές χρωματίστηκαν για 1 ώρα με δευτερογενή αντισώματα και τελικά τοποθετούνται σε Mowiol 4-88.

Αντισώματα και αντιδραστήρια

Τα ενδοθηλιακά αιμοφόρα αγγεία βάφτηκαν με ένα μονοκλωνικό αντι-χάμστερ CD31 αντίσωμα (Chemicon International, Temecula, USA? MAB1398Z) και ενδοθηλιακή λεμφαγγεία με ένα αντίσωμα κουνελιού πολυκλωνικό αντι-LYVE-1 (Abcam, Cambridge, UK? ab14917). Οι πυρήνες Hoechst 33342-επισημασμένο (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Γερμανία). δευτερογενή αντισώματα DyLight488-συζευγμένο (γάιδαρος) ελήφθησαν από Jackson ImmunoResearch (Pennsylvania, USA). Πρωτογενής και δευτερογενής αντισώματα αραιώθηκαν σε PBS 1:100 /0.3% Triton-X-100

φθορισμού μικροσκοπία

Εικόνες όγκου, λεμφαδένα και τους νεφρούς τομές που έχουν ληφθεί με τις ακόλουθες μικροσκόπια.: ένα μικροσκόπιο στερεοφωνικό-φθορισμού MZ16 FA (Leica) εφοδιασμένο με μια ψηφιακή φωτογραφική μηχανή CCD και το 4,0 λογισμικού Leica IM1000 (1300 × 1030 pixel RGB-έγχρωμες εικόνες), ένα TCS SP2 AOBS συνεστιακό μικροσκόπιο λέιζερ (Leica) εφοδιασμένο με το λογισμικό LCS 2.16 ( 1024 × 1024 pixel RGB-έγχρωμες εικόνες) και μια Axiovert 200 Μ μικροσκόπιο (Zeiss) με Axiovision 4.5 λογισμικό (1388 × 1040 pixel εικόνες κλίμακας του γκρι), αντίστοιχα. Ψηφιακές εικόνες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με το Photoshop 7.0 (Adobe Systems, USA) και συγχωνεύονται για να δώσουν ψευδο-έγχρωμες εικόνες. Εικόνες κύτταρα εμβολιάζονται σε πλάκες 24 φρεατίων συλλήφθηκαν είτε με το μικροσκόπιο φθορισμού στερεο-MZ16 FA (Leica) είτε με τον Axiovert 200 Μ μικροσκόπιο (Zeiss).

Παρασκευή εναιωρήματα μονών κυττάρων και FACS ανάλυση

Για την παρασκευή αιωρήματα απλών κυττάρων των όγκων, οσφυϊκή και νεφρικής λεμφαδένες, τους πνεύμονες και τα νεφρά των C33A-RFP που φέρουν όγκο ιστοί ποντικοί ζυγίστηκαν, κιμά και επωάστηκαν χωριστά σε υψηλής γλυκόζης DMEM μέσα συμπληρωμένα με 2% FCS, 10.000 U /mL κολλαγενάση Ι (Sigma, Steinheim, Germany) και 5 MU /mL ϋΝάσης Ι (Calbiochem, Darmstadt, Germany) στους 37 ° C. ιστοί όγκου επωάστηκαν για 35 λεπτά, LN και RN ιστούς επί 30 λεπτά, τα νεφρά για 20 λεπτά και τους πνεύμονες για 15 λεπτά. Στη συνέχεια, οι ιστοί διήλθαν μέσω 70 μm φίλτρα νάιλον πλέγματος (BD Biosciences, Erembodegem, Belgium) και μεταφέρθηκε σε ϋΜΕΜ υψηλής γλυκόζης μέσα συμπληρωμένα με 2% FCS. Μετά από φυγοκέντρηση (1000 g, 10 min) σφαιρία επαναιωρήθηκαν σε 2χ όγκο PBS /2% FCS, σχετικά με το βάρος του ιστού. Μετέπειτα, 100 μL των αναστολών μόνο κυττάρου αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Accuri C6 Cytometer και λογισμικό ανάλυσης FACS CFlow έκδοση 1.0.227.4 (Accuri Κυτταρόμετρα, Inc. Ann Arbor, MI, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). Τα κύτταρα περιφραγμένη ανάλογα με το μέγεθός τους (FSC) και διακριτότητας (SSC). Επιπλέον, 100 μL των αιωρημάτων απλού κυττάρου σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων σε 1 × 10

-1 έως 1 χ 10

-4 αραιώσεις. Οι αραιώσεις παρασκευάστηκαν σε DMEM υψηλής γλυκόζης μέσο συμπληρωμένο με 10% FCS. Τρεις ημέρες μετά μέσων κυτταρικό εναιώρημα σπορά συμπληρώθηκε με 5 μg /mL βλαστισιδίνη, για την επιλογή κυττάρων C33A-RFP. πλύση των κυττάρων και την ανανέωση των μέσων ενημέρωσης διεξήχθησαν δύο φορές την εβδομάδα. Μετά από μία εβδομάδα βλαστισιδίνη επιλογή κυττάρων C33A-RFP στα τρυβλία 24 βάφτηκαν με κρυσταλλικό ιώδες για 3 ώρες, πλένεται και ξηραίνεται. Στη συνέχεια, οι αποικίες κυττάρων μετρήθηκαν.

Η στατιστική ανάλυση

t

δοκιμάσει ένα two-tailed Student χρησιμοποιήθηκε για τη στατιστική ανάλυση.

P

τιμές των ≤0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. Οι αστερίσκοι δείχνουν μία σημαντική διαφορά μεταξύ των πειραματικών ομάδων. (* Υποδηλώνει p ≤ 0,05? ** Υποδεικνύει p≤0.01? *** Υποδεικνύει p≤0.001)

Αποτελέσματα

κινητική ανάπτυξη του υποδόριου C33A- RFP όγκους και μεταστάσεις λεμφαδένα σχηματισμός

Μια παρατηρήθηκε διεύρυνση της οσφυϊκής και νεφρικών λεμφαδένων σε ποντικούς που φέρουν όγκο C33A έδειξε την παρουσία μετάσταση καρκινικών κυττάρων. Για να ενεργοποιήσετε την απεικόνιση των μεταστατικών C33A κύτταρο εξάπλωση, την αλληλουχία cDNA του κόκκινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (

mRFP1

) εισήχθη στο γονιδίωμα C33A κυττάρου. Έκφραση του RFP σε κύτταρα C33A επιβεβαιώθηκε με μικροσκοπία φθορισμού (Σχ. 1α). Ακολούθως, 5 × 10

6 κύτταρα C33A-RFP ήταν υποδορίως (s.c.) εμφυτεύθηκαν στο δεξί πλευρό γυμνών ποντικών. Κάθε εβδομάδα μέχρι και 49 ημέρες μετά την εμφύτευση έξι έως επτά C33A-RFP εξετάστηκαν τα ποντίκια που φέρουν όγκο. Ως μέρος αυτών αναλύσεων όγκους των όγκων, οσφυϊκή (LN1, LN2) και νεφρού (RN1, RN2) μετρήθηκαν λεμφαδένες (εικ. 1 b + c) και φθορισμού απεικόνιση όγκων και μεταστάσεων λεμφαδένα διεξήχθη (Σχ. 1 d) . Δείξαμε μια σταθερή αύξηση του όγκου του όγκου από εβδομάδα σε εβδομάδα μετά την εμφύτευση των κυττάρων C33A-RFP. Ταυτόχρονα, οι όγκοι των οσφυϊκών και νεφρικών λεμφογαγγλίων αυξάνονταν καθώς, υποδεικνύοντας μια πιθανή διαδικασία κύτταρο όγκου αποικισμός με αποτέλεσμα διαστολή λέμφου όγκο κόμβο. απεικόνιση φθορισμού επιβεβαίωσε σήματα RFP στα διόγκωση των λεμφαδένων, αποδεικνύοντας μεταστάσεις C33A-RFP. Αξίζει να σημειωθεί ότι ο όγκος των LN1, η οσφυϊκή λεμφαδένας που βρίσκεται πλησιέστερα στον πρωτογενή όγκο C33A-RFP, αυξανόταν πρώτη και μεγαλύτερη, όπως θα αναμενόταν για την περιφερειακή μεταστάσεων λεμφαδένα.

Οι όγκοι και οι λεμφαδένες των έξι έως επτά ποντίκια ανά χρονικό σημείο αναλύθηκαν (7 και 21 dpti: n = 7? 14, 28, 35 και 49 dpti: n = 6). φωτεινό οπτικό πεδίο (BF), RFP και να επικαλύψει τις εικόνες των C33A-RFP κύτταρα, γραμμή κλίμακας αντιπροσωπεύει 100 μm. καμπύλη β Ώρα της ανάπτυξης του όγκου C33A-RFP. γ Όγκος των οσφυϊκών και των νεφρικών λεμφογαγγλίων την πάροδο του χρόνου. δ Αντιπροσωπευτικές εικόνες των όγκων (άνω σειρά) και η αντίστοιχη λεμφαδένες (κάτω σειρά) των ποντικών που φέρουν όγκο C33A-RFP στις υποδεικνυόμενες ημέρες μετά την εμφύτευση των κυττάρων του όγκου. Εικόνες των όγκων (Τ) ελήφθησαν ζωντανών ποντικιών, χρησιμοποιώντας την Maestro EX Σύστημα Απεικόνισης. Απεικόνιση της οσφυϊκής (LN1, LN2) και νεφρικές (RN1, RN2) μεταστάσεις στους λεμφαδένες στην κοιλιά των ποντικών που φέρουν όγκο διεξήχθη

μεταθανάτια

, μετά το άνοιγμα της κοιλιάς και την αφαίρεση οργάνων. Κλίμακα μπάρες αντιπροσωπεύουν 2 mm. ε Ποσοστό όλων των λεμφαδένων θετικά για RFP πάροδο του χρόνου. στ Ποσοστό LN1, LN2, RN1 και RN2, αντίστοιχα, θετική για RFP ανά χρονικό σημείο.

Η

Επιπλέον, απεικόνιση φθορισμού κατά τη χρονική πορεία 49 ημερών αποκάλυψε μια σταθερή αύξηση του ποσού των λεμφαδένων θετικό για RFP μετά την εμφύτευση των κυττάρων του όγκου, ξεκινώντας με 21% RFP θετικούς λεμφαδένες την ημέρα 7. το ποσό αυξήθηκε σε 88% λεμφαδένες θετικά για έκφραση RFP στο τέλος του πειράματος (Σχ. 1ε). Επιπλέον, το ποσοστό των θετικών RFP LN1, LN2, RN1 και RN2 αναλύθηκε ανά χρονικό σημείο. Την ημέρα 7 μετά την εμφύτευση 86% όλων των εντοπιστεί LN1s ήταν θετικά για RFP, ενώ κανένα σήμα RFP ήταν ανιχνεύσιμη σε LN2, RN1 ή RN2 οδηγούν στην υπόθεση ότι μεταστατικό αποικιοποίηση με κύτταρα C33A-RFP εμφανίζεται για πρώτη φορά στο περιφερειακό LN1 λεμφαδένων. Δεκατέσσερις ημέρες εμφύτευση κυττάρων μετα όγκου (dpti) όλα ανιχνεύονται LN1s (100%) και το 50% των RN1s ήταν θετικά για RFP, υποδεικνύοντας ότι μετά μετάσταση να LN1 τα κύτταρα C33A-RFP εξαπλωθεί στο επόμενο τοπικό λεμφαδένα (νεφρική λεμφαδένας RN1) . Μεταστάσεις C33A-RFP κύτταρα σε LN2 και RN2 παρατηρήθηκε μόνο την ημέρα 28 μετά την εμφύτευση (Εικ. 1f). Στο σύνολό τους, δείξαμε μία συνεχή εξέλιξη της μετάστασης των οσφυϊκών και νεφρικής λεμφαδένες που συμπίπτει με την ανάπτυξη του όγκου C33A-RFP από εβδομάδα σε εβδομάδα μετά s.c. εμφύτευση των κυττάρων του όγκου.

κύτταρα C33A-RFP όγκου μεταστάσεις μέσω τόσο του λεμφικού και τα αιματογενή διαδρομές

Κατά τη διάρκεια μικροσκοπικές μελέτες μας ανίχνευσε την παρουσία κυττάρων C33A-RFP στην λεμφικών αγγείων που συνδέουν οσφυϊκή και νεφρικής λεμφαδενικές μεταστάσεις σε C33A-RFP που φέρουν όγκο ποντικών, καταδεικνύοντας έτσι τις λεμφαγγεία ως οδός δευτερογενούς μετάσταση σε αυτό το μοντέλο (Σχ. 2α, β) .Επιπλέον, κυκλοφορούντα κύτταρα C33A-RFP ανιχνεύθηκαν επίσης σε ερυθροκύτταρα που περιέχουν τα αιμοφόρα αγγεία που βρίσκονται δίπλα να LN-RN-συνδετικό λεμφαγγεία, αντανακλώντας την αιματογενή διαδρομή των μεταστατικών μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων (Εικ. 2γ). Αξίζει να σημειωθεί ότι, η απεικόνιση φθορισμού αποκάλυψε σήματα RFP στους πνεύμονες των ποντικών που φέρουν όγκο C33A-RFP που συνήθως είναι το πρώτο όργανο για να κάνει μετάσταση σε περίπτωση μεταστατική εξάπλωση μέσω του αιματογενής οδού. Μέχρι την ημέρα εμφύτευσης 28 δοκάρια των καρκινικών κυττάρων δεν πνεύμονα βρέθηκε να είναι θετικό για RFP, ενώ την ημέρα 35 τρεις από τις έξι και κατά την ημέρα 49 πέντε από τους έξι πνεύμονες ελέγχθηκαν θετικά για κηλίδες RFP (Εικ. 2d).

α μετανάστευση των κυττάρων C33A-RFP σε ένα λεμφικό αγγείο που συνδέει LN1 και RN1 42 dpti. Κλίμακα μπάρες αντιπροσωπεύουν 2 mm. β LYVE-1 χρώση των 100 μm διατομών του τμήματος μεταξύ LN1 και RN1. Κλίμακα μπάρες αντιπροσωπεύουν 200 μm. γ μετανάστευση των κυττάρων C33A-RFP σε λεμφαδένες (γεμάτο βέλος) και σε ένα ερυθροκυττάρων που περιέχουν αιμοφόρων αγγείων (ανοιχτό βέλος) 32 dpti. Ράβδοι κλίμακας αντιπροσωπεύουν 2 mm (αριστερά) και 500 μm (δεξιά). σήματα δ RFP στους πνεύμονες των ποντικών που φέρουν όγκο C33A-RFP. Πάνω: αντιπροσωπευτική εικόνα του πνεύμονα 42 dpti. μπαρ κλίμακας αντιπροσωπεύει 2 mm. Παρακάτω: ποσοστό των πνευμόνων ήταν θετικοί για RFP σημεία πάροδο του χρόνου. Εξετάστηκαν Πνεύμονες από έξι έως επτά ποντίκια ανά χρονικό σημείο (7 και 21 dpti: n = 7? 14, 28, 35 και 49 dpti: n = 6)

Η

Συνοψίζοντας, αποδεικνύεται σαφώς. ότι τα κύτταρα C33A-RFP χρησιμοποιείτε το λεμφικό καθώς και οι αιματογενής διαδρομές για μεταστατική εξάπλωση σε sc εμφυτεύονται φέρουν όγκο γυμνά ποντίκια.

Επιπλέον, παρατηρήσαμε μια συσσώρευση του σήματος RFP στα νεφρά των ποντικών αυτών με απεικόνιση φθορισμού κατά τη διάρκεια της χρονικής πορείας της 49 ημέρες (Εικ. 3). Η ιστολογική ανάλυση των όγκων, LNs και αριθμών RΕΝ ποντικούς που φέρουν όγκο 31 dpti αποκάλυψε μια οργανωμένη δομή RFP κυττάρων που εκφράζουν C33A σε όγκους και μεταστάσεις λεμφαδένων, η οποία δεν ήταν αληθές για RFP στα νεφρά (Εικ. 4α). Επιπλέον, δείξαμε ότι τα σήματα νεφρική RFP βρίσκονταν κυρίως στον φλοιό και CD31 σημασμένα αιμοφόρα αγγεία στον μυελό και τη λεκάνη των νεφρών (σχ. 4β). Εικόνες νεφρικό φλοιό με μεγαλύτερη μεγέθυνση αποκάλυψε συσσώρευση RFP σε νεφρώνες, οπότε RFP φάνηκε να βρίσκεται σε κύτταρα ανεξάρτητα σε μοτίβα spot-σαν (Εικ. 4γ). Δεν μικρομεταστάσεων παρατηρήθηκαν στα νεφρά. Ως εκ τούτου, υποθέτουμε ότι το ισχυρό σήμα RFP σε νεφρούς ποντικών που φέρουν όγκο C33A-RFP μπορεί να προκαλείται από την εναπόθεση του RFP σε νεφρικό φλοιό, μετά το φιλτράρισμα του αίματος σε νεφρώνες. Σε αντίθεση με αυτό που παρατηρήθηκε στα νεφρά, μικρομεταστάσεις ανιχνεύθηκαν σε πνεύμονες των C33A-RFP ποντίκια που φέρουν όγκο 42 dpti (Εικ. 4d αριστερά). Επιπλέον, απλά κύτταρα C33A-RFP βρέθηκαν σε αιμοφόρα αγγεία των πνευμόνων καθώς και θραύσματα RFP παρόμοιες με εκείνες που παρατηρήθηκαν στο νεφρικό φλοιό των νεφρών (σχ. 4d δεξιά).

Έξι έως επτά ποντίκια αναλύθηκαν ανά χρονικό σημείο (7 και 21 dpti: n = 7? 14, 28 και 35 dpti: n = 6). Ένας εκπρόσωπος εικόνες του σήματος RFP στα νεφρά. Άνω σειρά: επικάλυψη των φωτεινό οπτικό πεδίο και RFP εικόνες. Κάτω σειρά: εικόνες του σήματος RFP. Κλίμακα μπάρες αντιπροσωπεύουν 2 mm. β μέση ένταση φθορισμού του σήματος RFP σε νεφρούς ποντικών που φέρουν όγκο C33A-RFP την πάροδο του χρόνου.

Η

Πυρήνες σε α, β και γ βάφτηκαν με βαφή Hoechst. μια επικαλύψεις του φωτεινό οπτικό πεδίο, RFP και Hoechst εικόνες των 10 μm τομές ενός όγκου, LN, RN και τα νεφρά 31 dpti. Κλίμακα μπάρες αντιπροσωπεύουν 50 μm. β Εικόνες 100 μm τομές ενός νεφρού 31 dpti, χρωματίστηκαν με αντι-CD31 αντίσωμα και βαφή Hoechst. μπαρ κλίμακας αντιπροσωπεύει 2 mm. γ 10 μm τμήμα του νεφρού βάφονται με βαφή Hoechst. Δεξιά: ομοεστιακό εικόνα. Ράβδοι κλίμακας αντιπροσωπεύουν 100 μm (αριστερά) και 10 μm (δεξιά). δ CD31 και Hoechst χρώση των 100 μm τμήματα του πνεύμονα 42 dpti. Γεμιστά βέλος: σε ένα αιμοφόρο αγγείο που μεταναστεύουν κυττάρων C33A-RFP? άδειο βέλος: RFP θετική θραύσματα. Ράβδοι κλίμακας αντιπροσωπεύουν 250 μm (αριστερά) και 50 μm (δεξιά). Όλες οι εικόνες είναι αντιπροσωπευτικά παραδείγματα.

Η

Στο σύνολό τους, ιστολογικές αναλύσεις έδειξαν μια σαφή, οργανωμένη δομή του RFP κυττάρων που εκφράζουν C33A σε όγκους και μεταστάσεις στους λεμφαδένες, ενώ το σήμα RFP στα νεφρά φαινόταν να είναι κυρίως το αποτέλεσμα απόθεσης πρωτεΐνης και όχι μόνο από μετάσταση RFP θετικά καρκινικά κύτταρα. RFP σήμα σε πνεύμονες φαινόταν να προκληθεί από τα δύο, μετάσταση και εγκαταστάθηκαν κύτταρα C33A-RFP και εναπόθεση RFP.

Ανίχνευση των βιώσιμων κυττάρων C33A-RFP σε όγκους, LNs, αριθμών RΕΝ, τους πνεύμονες και τα νεφρά ποντικών που φέρουν όγκο

Για να διερευνηθεί περαιτέρω κατά πόσον το σήμα RFP σε όγκους, LNs, αριθμών RΕΝ, τους πνεύμονες και τα νεφρά των ποντικών που έφεραν C33A-RFP όγκου προέκυψε από βιώσιμα κύτταρα C33A, αιωρήματα μονών κυττάρων των ιστών αυτών των 5 ποντικών 49 dpti ετοιμάστηκαν και αναλύθηκαν με FACS. Βρήκαμε ότι το 83% των κυττάρων σε εναιωρήματα κυττάρου όγκου ήταν θετικά για RFP, 42% σε LN, 32% σε RN, 11% στον πνεύμονα και 18% σε εναιωρήματα νεφρό (Σχ. 5α). Ως εκ τούτου, RFP θετικά καρκινικά κύτταρα ήταν ανιχνεύσιμα σε όλους τους ιστούς του αναλύθηκαν ποντικούς που φέρουν όγκο C33A-RFP.

Οι ιστοί όλων των 5 ποντικών αναλύθηκαν (η = 5). α Ποσό RFP θετικό (RFP +) και αρνητικό κύτταρα (RFP-) σε αιωρήματα απλών κυττάρων του όγκου, LN, RN, του πνεύμονα και των νεφρών. 10.000 συμβάντα αναλύθηκαν με FACS. β Ανάπτυξη διαφορετικές αραιώσεις (10

-1-10

-4) του C33A-RFP εναιωρήματα μονών κυττάρων σε φρεάτια πλακών 24 φρεατίων μετά από μία εβδομάδα βλαστισιδίνη επιλογής. Αριστερά εικόνα: η κατανάλωση των μέσων ενημέρωσης σε φρεάτια που περιέχουν 2 ημερών μέσα ενημέρωσης. Δεξιά εικόνα: φρεάτια μετά από χρώση με κρυσταλλικό ιώδες. Αριθμοί γ του σχηματισμού αποικιών κυττάρων C33A-RFP ανά γραμμάριο όγκου, LN, RN, του πνεύμονα και του νεφρού, αντίστοιχα. αποικίες κυττάρων μετρήθηκαν για κάθε όργανο μετά blasticidin επιλογής και κρυστάλλινα χρώση ιώδες.

Η

Για να προσδιορίσετε πόσα από αυτά τα RFP θετικών κυττάρων ήταν όντως βιώσιμα κύτταρα όγκου, πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία βλαστισιδίνη επιλογή. Μετά από μία εβδομάδα βλαστισιδίνη κατανάλωσης μέσων επιλογής (υποδεικνύεται από την αλλαγή του χρώματος του ερυθρού της φαινόλης από κόκκινο σε κίτρινο) συσχετίζεται με την ποσότητα των βιώσιμων κυττάρων (Σχ. 5β, αριστερά). Κρύσταλλο χρώση βιολετί έδειξε επιπλέον ότι ο όγκος, LN και RN αναστολές περιείχε περισσότερα βιώσιμα κύτταρα C33A-RFP από πνεύμονα και των νεφρών αναστολές (Σχ. 5β, δεξιά). Παρατηρήθηκαν μόνο λίγες θετικές αποικίες κυττάρων C33A-RFP σε φρεάτια των πνευμόνων και των νεφρών εναιωρήματα σε 10

-1 αραιώσεις, ενώ RFP θετικά κύτταρα παρατηρήθηκαν σε όλες τις αραιώσεις του όγκου, LN και RN εναιωρήματα.

στη συνέχεια, οι χρωματισμένες αποικίες κυττάρων C33A-RFP μετρήθηκαν στις κατάλληλες αραιώσεις και ο αριθμός των C33A-RFP κυττάρων σχηματισμού αποικίας ανά γραμμάριο ιστού προσδιορίστηκε για όγκους, μεταστάσεις και οργάνων. Αποδείχθηκε ότι 8,6 × 10

6 (± 2,9 × 10

6) κύτταρα C33A-RFP σχηματισμού αποικιών ανιχνεύθηκαν ανά ιστό του όγκου γραμμάριο, 1.7 × 10

7 (± 5,9 × 10

6 ) σε LN και 1,5 × 10

7 (± 1,7 × 10

7) στην RN. Σε αντίθεση με αυτό μόνο 4,8 × 10

3 (± 9,7 × 10

3) που σχηματίζουν αποικία κυττάρων C33A-RFP ανιχνεύθηκε σε πνεύμονες και 8,1 × 10

3 (± 1,7 × 10

4) στα νεφρά (Εικ. 5c).

Έτσι, έδειξαν σημαντική μικρότερη ποσότητα βιώσιμων κυττάρων C33A-RFP σε πνεύμονες και τα νεφρά από ό, τι σε όγκους και μεταστάσεις λεμφαδένων ποντικών που φέρουν όγκο, αποκαλύπτοντας ότι C33A-RFP μεταστάσεις σχηματισμός λαμβάνει χώρα κυρίως μέσω του λεμφικού διαδρομή.

Καταπολέμηση μεταστάσεις στο μοντέλο C33A-RFP

Μόλις, μεταστατική εξάπλωση των κυττάρων C33A-RFP σε άτριχα ποντίκια μετά από sc εμφύτευση των κυττάρων του όγκου χαρακτηρίστηκε, στόχος μας ήταν να αναλυθεί η δυνατότητα ενός ογκολυτικού ιοθεραπείας ως νέο θεραπευτική επιλογή για τους όγκους C33A-RFP και μεταστάσεις. Πρόσφατα, έχει δειχθεί, ότι η ογκολυτική ιός δαμαλίτιδας GLV-1h68 είναι ένα αποτελεσματικό μέσο για την καταπολέμηση αιματογενή καθώς και λεμφικού μεταστάσεις στο μοντέλο ανθρώπινου προστάτη του καρκίνου PC-3 [22], [27]. Με βάση αυτό, GLV-1h68 φαίνεται να είναι μια πολλά υποσχόμενη υποψήφιος για την εξάλειψη των μεταστάσεων C33A-RFP. Αρχικά, 12 C33A-RFP ποντίκια που φέρουν όγκο ενέθηκαν 11 dpti με 5 × 10

6 μονάδες (pfu) που σχηματίζουν πλάκα του GLV-1h68 ή PBS ως έλεγχο, αντίστοιχα. Ήδη από το 14 ημέρες μετά ιού /PBS όγκος εγχύσεως (dpi) όγκου στην ομάδα που έλαβε αγωγή GLV-1h68 άρχισε να μειώνεται. Από 18 dpi σε στατιστικά σημαντική μείωση του όγκου των όγκων C33A-RFP επιτεύχθηκε λόγω της θεραπείας του ιού σε σύγκριση με το PBS αγωγή όγκων ελέγχου (Εικ. 6α). Οι όγκοι των όγκων μειώνεται το αρχικό μέγεθος. Οι ιστολογικές αναλύσεις των όγκων του ιού θεραπεία και ελέγχου 21 dpi αποκάλυψε μια μαζική εξάπλωση του GLV-1h68 σε όγκους της ομάδας του ιού, που συνδέεται με μια χαμηλότερη ένταση φθορισμού του RFP και Hoechst, υποδεικνύοντας ιός μεσολάβηση, έντονη νέκρωση του ιστού του όγκου (Σχ. 6β ). Επιπλέον, ο όγκος των οσφυϊκών και νεφρικών λεμφαδένων στην ομάδα PBS ήταν σημαντικά υψηλότερες σε σύγκριση με εκείνες στην αγωγή του ιού ομάδα 21 dpi, υποδεικνύοντας μία ανασταλτική επίδραση του GLV-1h68 (Σχ. 6γ) μεταστάσεων. Σε περαιτέρω αναλύσεις, λεμφαδένες θετικά για C33A-RFP προσδιορίστηκαν με μικροσκοπία φθορισμού. Αποδείχθηκε ότι 16 από τις 22 διόγκωση των λεμφαδένων (72,3%) ήταν θετικά για RFP στην ομάδα PBS, ενώ μόνο 1 από τα 15 διόγκωση των λεμφαδένων (6,7%) ήταν θετικοί για RFP στην ομάδα που λάμβανε GLV-1h68 ( Εικ. 6d), καταδεικνύοντας τον ιό μεσολάβηση θεραπευτικό αποτέλεσμα επί του σχηματισμού μετάστασης λεμφαδένα. Επιπλέον, μικροσκοπική ανάλυση των οσφυϊκών τμημάτων μετάσταση λεμφαδένα έδειξε ότι ούτε RFP ούτε ιός που κωδικοποιείται GFP είναι ανιχνεύσιμη 21 ημέρες μετά την ένεση του ιού. Σε αντίθεση με αυτό, ένα ισχυρό σήμα RFP ανιχνεύθηκε σε λεμφαδένες του PBS αγωγή C33A-RFP ποντικών που φέρουν όγκο. Τελικά, RFP στα νεφρά και πνεύμονες των C33A-RFP που φέρουν όγκο ποντικών αναλύθηκε μικροσκοπικά και συγκρίθηκε σε PBS και ομάδες που έλαβαν ιό. Σε αμφότερες τις περιπτώσεις η δραστική μείωση του RFP παρατηρήθηκε λόγω της θεραπείας του ιού (Σχ. 6F, g).

καμπύλη Χρόνος ανάπτυξης όγκου C33A-RFP σε 12 ποντικούς μετά την χορήγηση του ιού δαμαλίτιδας ογκολυτικού GLV-1h68 και PBS, αντίστοιχα (η = 6). Αναλύσεις των όγκων C33A-RFP και μεταστάσεων σε β-g έγιναν 32 dpti και 21 ημέρες μετά τη χορήγηση GLV-1h68 ή PBS (dpi). Έξι ποντικοί εξετάστηκαν ανά ομάδα (n = 6). β Αριστερά: C33A-RFP που φέρουν όγκο ποντικών 21 dpi. Δεξιά: 100 μm τμήματα της PBS και ενός όγκου αντιμετωπίζονται GLV-1h68. Οι πυρήνες βάφτηκαν με βαφή Hoechst, GFP εκφράζεται από GLV-1h68 και RFP από κύτταρα C33A. γ Όγκος των οσφυϊκών και νεφρικής λεμφαδένες και d ποσοστό RFP θετικών λεμφαδένων σε PBS και GLV-1h68 αγωγή ποντικούς που φέρουν όγκο C33A-RFP (αριστερά). Δεξιά: Εικόνες των οσφυϊκών και των νεφρικών λεμφογαγγλίων σε PBS και GLV-1h68 ποντίκια που έλαβαν θεραπεία. e 100 μm τομές ενός PBS (αριστερά) και ένα GLV-1h68 (δεξιά) που έλαβαν θεραπεία μετάστασης οσφυϊκή λεμφαδένων. στ Αριστερά: Ποσοστό των νεφρών θετικά για RFP σε PBS και GLV-1h68 ποντίκια με αγωγή. Δεξιά: Εικόνες από τα νεφρά στην ομάδα PBS και του ιού. ζ Ποσοστό των πνευμόνων θετικά για RFP σε PBS και η ομάδα GLV-1h68. Όλες οι εικόνες είναι αντιπροσωπευτικά παραδείγματα. Όλες οι ράβδοι κλίμακας παριστούν 2 mm.

Η

Συνολικά, δείξαμε ένα αποτελεσματικό ιό διαμεσολαβούμενη μείωση του μεγέθους του όγκου και των μεταστατικών φορτίο σε ποντίκια που φέρουν όγκο C33A-RFP 21 dpi.

Συζήτηση

από μεταστατική εξάπλωση των καρκινωμάτων αποτελεί την κύρια αιτία θανάτου που σχετίζονται με τον καρκίνο, υπάρχει επείγουσα ανάγκη να ενταθεί η έρευνα εστιάζει στον τομέα της μετάστασης των όγκων.