Abstract

Υπάρχουν αυξανόμενες ενδείξεις ότι η λειτουργική αλληλοπαρεμβολές μεταξύ GPCRs και EGFR συμβάλλει στην εξέλιξη της παχέος εντέρου, του πνεύμονα, του μαστού, των ωοθηκών, του προστάτη και όγκους κεφαλής και τραχήλου. Σε αυτή τη μελέτη, εκτελέσαμε πολλαπλές αναλύσεις της έκφρασης GPCR σε μία κυτταρική γραμμή gefitinib ανθεκτικά μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC), H1975, που φιλοξενεί μια μετάλλαξη L858R /Τ790Μ. Για τον προσδιορισμό της προφίλ έκφρασης του mRNA που κωδικοποιούν 384 GPCRs σε φυσιολογικό ανθρώπινο πνεύμονα ινοβλαστών (NHLF) και κύτταρα H1975, διεξήχθη μια ανάλυση μικροσυστοιχιών GPCR-ειδική. Μια θερμική χάρτης της μικροσυστοιχίας αποκάλυψε σημαντικές διαφορές στην έκφραση μεταξύ των κυττάρων GPCRs NHLF και H1975. Από τη λίστα έκφραση GPCR, επιλέξαμε κάποια αγωνιστές GPCR /ανταγωνιστή να διερευνήσει κατά πόσον οι αντίστοιχες συνδέτες θα μπορούσαν να επηρεάσουν την ανάπτυξη των H1975 κυττάρων. Μεταξύ αυτών, η θεραπεία με είτε ένα εκλεκτικό ανταγωνιστή των υποδοχέων Α2α αδενοσίνης, τα οποία ήταν ιδιαίτερα εκφράζονται σε H1975 κύτταρο και άλλο gefitinib-ανθεκτικά κύτταρα NSCLC, κύτταρα HCC827GR ή «μικρό παρεμβαλλόμενο RNA» (siRNA) που στοχεύουν υποδοχείς A2a αδενοσίνης παρήγαγε μια σημαντική μείωση στην κυτταρική βιωσιμότητα και των δύο κυττάρων H1975 και HCC827GR. Μεταξύ up-ρυθμίζονται GPCRs στην H1975 κύτταρα, GS-, στη γαστρεντερική και Gq-συζευγμένων GPCRs εκφράστηκαν σχεδόν εξίσου. Μεταξύ κάτω-ρυθμίζονται GPCRs, Gi-σε συνδυασμό GPCRs είχαν δεσπόζει εκφράζονται σε H1975 κύτταρα. Τα παρόντα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι πολυεπίπεδο λογομαχία μεταξύ GPCRs και EGFR μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην ενορχήστρωση μόρια κατάντη σηματοδότησης που εμπλέκονται στην ανάπτυξη του gefitinib ανθεκτικά NSCLC

Παράθεση:. Kuzumaki Ν, Suzuki Α, Ναρίτα Μ, Hosoya Τ, Nagasawa Α, Imai S, et al. (2012) Πολλαπλές αναλύσεις των G-πρωτεΐνη υποδοχέα (GPCR) Έκφραση στην ανάπτυξη Gefitinib-Αντίσταση στη μετατροπή της μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 7 (10): e44368. doi: 10.1371 /journal.pone.0044368

Επιμέλεια: Pan-Chyr Γιανγκ, Εθνικό Πανεπιστήμιο της Ταϊβάν Νοσοκομείο, Ταϊβάν

Ελήφθη: 10 Σεπ του 2011? Αποδεκτές: 2 Αυγούστου, 2012? Δημοσιεύθηκε: 29 Οκτωβρίου, 2012

Copyright: © 2012 Kuzumaki et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνο του πνεύμονα μη-μικρών κυττάρων (NSCLC) είναι η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο. Ενώ, η χημειοθεραπεία μπορεί να παρατείνει λίγο την επιβίωση σε ασθενείς με προχωρημένη νόσο, Είναι, επίσης, συνδέεται με κλινικά σημαντικές ανεπιθύμητες ενέργειες [1]. υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) είναι ένα σημαντικό στόχο της μοριακής αντι-NSCLC θεραπεία [2]. στόχοι Gefitinib η σχισμή ΑΤΡ στο EGFR κινάσης τυροσίνης, η οποία υπερεκφράζεται σε 40-80 τοις εκατό των NSCLC και πολλών άλλων μορφών καρκίνου επιθηλιακών [3]. σηματοδότηση EGFR πυροδοτείται από την σύνδεση του αυξητικούς παράγοντες, όπως EGF, που έχει σαν αποτέλεσμα είτε την διμερισμό των μορίων EGFR ή ετεροδιμερισμό με συναφείς υποδοχείς, όπως HER2. Η αυτοφωσφορυλίωση και η διαφωσφορυλίωση των EGFRs μέσω περιοχών τους κινάσης τυροσίνης στρατολογεί καθοδικούς τελεστές και ενεργοποιεί σήματα για τον πολλαπλασιασμό και την επιβίωση των κυττάρων-[4]. Οι μεταλλάξεις έχουν ταυτοποιηθεί στο γονίδιο EGFR σε δείγματα από ασθενείς με NSCLC που ανταποκρίνονται στους αναστολείς EGFR [5]. Αυτές οι μεταλλάξεις αποτελούνται από μικρές διαγραφές που επηρεάζουν τα αμινοξέα 746 έως 750 (delE746-A750) ή σημειακές μεταλλάξεις (συχνότερα λευκίνη αντικαθίσταται από αργινίνη στο κωδικόνιο 858 [L858R]) [6], [7], [8]. Αυτές οι μεταλλάξεις τροποποιούν κατάντη σηματοδότησης και αντιαποπτωτικών μηχανισμούς, και έτσι μεσολαβούν ογκογόνο επιδράσεις [9]. Και οι δύο από αυτές τις μεταλλάξεις κάνουν ο όγκος πιο ευαίσθητο σε ενώσεις που αναστέλλουν EGFR, πιθανότατα με την επανατοποθέτηση κρίσιμα υπολείμματα που περιβάλλουν την ΑΤΡ-δέσμευσης σχισμή της περιοχής κινάσης τυροσίνης του υποδοχέα, η οποία σταθεροποιεί τις αλληλεπιδράσεις τόσο με ΑΤΡ και ανταγωνιστικοί αναστολείς της [6] , [7]. Στην περίπτωσή μας, της αλληλουχίας του DNA του γονιδίου EGFR σε ένα δείγμα βιοψίας όγκου σε υποτροπή έδειξε ένα δεύτερο σημείο μετάλλαξης που άλλαξε θρεονίνη σε μεθειονίνη στην θέση 790 (Τ790Μ) των EGFR [5]. Η αποτελεσματικότητα του gefitinib είναι περιορισμένης διάρκειας, κυρίως λόγω της αντίστασης του φαρμάκου που παρέχεται από ένα δεύτερο σημείο μετάλλαξης.

Η δραστικότητα της Akt, η οποία είναι επίσης γνωστή ως πρωτεΐνη κινάση Β (ΡΚΒ), διεγείρεται από διάφορους παράγοντες ανάπτυξης , και αυτό σερίνης-θρεονίνης κινάσης παίζει εξελικτικά συντηρημένη ρόλους σε πολλές κυτταρικές λειτουργίες, όπως η πρωτεϊνική σύνθεση και την ανάπτυξη των κυττάρων [10], [11]. Έχει αναφερθεί ότι αναστολέας του EGFR αλλάζει ισχυρή, παροδικές Akt φωσφορυλίωση σε ασθενή, παρατεταμένη Akt φωσφορυλίωση. Λόγω των χαρακτηριστικών του φίλτρου χαμηλής διέλευσης της οδού Akt, αυτό οδηγεί στην ισχυρότερη φωσφορυλίωση της S6, το οποίο είναι ένα μόριο κατάντη του Akt, από ότι απουσία του αναστολέα. Έτσι, αναστολείς του EGFR θα μπορούσε να ενεργήσει ως ένα κατάντη ενεργοποιητής του EGFR [12]. Στο σύνολό τους, τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι η διαδικασία της gefitinib αντοχής οδηγεί στην επιδείνωση των καρκινικών κυττάρων.

Ένα μεγάλο σώμα της στοιχεία δείχνουν ότι συζευγμένου με πρωτεΐνη υποδοχέων (GPCRs) διαδραματίζουν έναν κρίσιμο ρόλο στην ογκογένεση, και εμπλέκονται σε σημαντικά βήματα στην ανάπτυξη του καρκίνου από μετασχηματισμό, την ανάπτυξη και την επιβίωση σε μετάσταση. Ένας άλλος σημαντικός τρόπος που GPCRs συμβάλλουν στην ογκογένεση συνεπάγεται εντατική στιχομυθία με ένα κανονικό μονοπάτι. Υπάρχει σημαντική απόδειξη ότι οι αγωνιστές ορισμένων GPCRs, μέσω μιας διαδικασίας που ονομάζεται τρανσενεργοποίηση, μπορεί να ενεργοποιήσει τις κινάσες τυροσίνης υποδοχέα αυξητικού παράγοντα (RTKs) απουσία προστιθέμενου παράγοντα ανάπτυξης [13], [14], [15]. Αυτό είναι ένα σημαντικό μονοπάτι που συμβάλλει στην ενεργότητα προαγωγής της ανάπτυξης πολλών προσδεμάτων GPCR. Από την άλλη πλευρά, πρόσφατα ευρήματα έχουν δείξει ότι RTKs μετάγουν σήματα μέσω της χρήσης GPCR μόρια σηματοδότησης και RTK συνδετήρες οι ίδιοι μπορούν να μετενεργοποιούν GPCRs. Για να μεσολαβήσει επιβίωση του όγκου και του πολλαπλασιασμού, GPCRs μπορούν να αλληλεπιδράσουν με οδούς κατάντη σηματοδότησης EGFR, συμπεριλαμβανομένων φωσφατιδυλινοσιτόλη 3-κινάση (ΡΙ3Κ) /Akt, και Janus κινάση /μετατροπείς σήματος και ενεργοποιητές μεταγραφής (Jak /Stat3) οδών. Πράγματι, η λειτουργική στιχομυθία μεταξύ GPCRs και EGFR συμβάλλει στην εξέλιξη της παχέος εντέρου, του πνεύμονα, του μαστού, των ωοθηκών, του προστάτη και όγκους κεφαλής και τραχήλου [16], [17]. Έτσι, GPCR θα μπορούσε να είναι μια εξαιρετική τοποθεσία για το κλείδωμα ογκογόνο σήματα, τα οποία θα καθιστούσαν GPCR λειτουργίες στις οποίες μεσολαβεί ελπιδοφόρα θεραπευτικοί στόχοι στην ανάπτυξη φαρμάκων για την επίτευξη καινοτόμων παρέμβαση σε NSCLC. Στην παρούσα μελέτη, εκτελούνται πολλαπλές αναλύσεις της έκφρασης GPCR σε ένα gefitinib ανθεκτική κυτταρική γραμμή NSCLC, H1975.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

Το ανθρώπινο μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα γραμμών (NSCLC) HCC827, NCI-H1975 (H1975? American Type Culture Collection Co., MD, USA) και HCC827GR καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 HEPES Τροποποίηση (Sigma-Aldrich Co., ΜΟ, USA) με 10% βόειο εμβρυϊκό ορό (FBS? Invitrogen ™ Life Technologies Co., CA, USA) και 1% πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη (PS? Invitrogen ™ Life Technologies Co.). Κανονική ανθρώπινους ινοβλάστες πνεύμονα (NHLF? Lonza Inc., NJ, USA) καλλιεργήθηκαν σε βασικό μέσο ινοβλαστών με ινσουλίνη, rhFGF-Β, GA-1000 και FBS (όλα από την Takara Bio Inc., Tokyo, Japan). Όλα τα κύτταρα διατηρήθηκαν υπό υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2 στους 37 ° C.

Δημιουργία του gefitinib ανθεκτική κυτταρική γραμμή, HCC827GR

HCC827 κύτταρα εκτέθηκαν σε 1 μΜ του gefitinib για 48 ώρες σε μέσο που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου. Αυτά στη συνέχεια πλύθηκαν και καλλιεργήθηκαν σε μέσο ελεύθερο φαρμάκου μέχρι επιζώντα κύτταρα ήταν 80% συρρέοντα. Αυτά τα κύτταρα στη συνέχεια επανα-εκτίθενται σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις του gefitinib (από 1 έως 5 μΜ). Τα κύτταρα τελικά σε θέση να αυξηθεί σε 5 μΜ gefitinib ελήφθησαν 1,5 μήνες μετά την αρχική έκθεση. Οι καθιερωμένες ανθεκτικά κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσο που περιείχε 1 μΜ gefitinib. Για όλες τις μελέτες in vitro, ανθεκτικά κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο χωρίς φάρμακο για τουλάχιστον 1 εβδομάδα για να εξαλείψει gefitinib. Οι Gefitinib-ανθεκτικά κύτταρα αναφέρονται ως HCC827GR

Αντιδραστήρια

Τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται στην παρούσα μελέτη ήταν gefitinib (Τορόντο Research Chemicals Inc., Καναδάς), [Arg

8]. – βασοπρεσίνη οξικό άλας (Sigma Chemical Co., St. Louis, ΜΟ, USA), αγγειοτενσίνη II (Sigma Chemical Co.), 2- (μεθυλθειο) 5′-τριφωσφορική αδενοσίνη ένυδρο άλας τετρανατρίου (Sigma Chemical Co.), beraprost νάτριο ( Toray Industries Inc., Tokyo, Japan), ένα-μεθυλ-5- (2-θειενυλομεθοξυ) -1 η-ινδολο-3-αιθαναμίνης μονοϋδροχλωρίδιο (BW723C86? Sigma Chemical Co.), 2-

σ

– ( 2-καρβοξυαιθυλ) φαιναιθυλαμινο-5′-Ν-αιθυλοκαρβοξαμιδοαδενοσίνη ένυδρο υδροχλωρίδιο (CGS- 21680? Sigma Chemical Co.), 7- (2-φαινυλαιθυλ) -5-αμινο-2- (2-φουρυλ) – πυραζολο- [4, 3-e] -1,2,4-τριαζολο [1,5-c] πυριμιδίνη. (SCH-58261? Sigma Chemical Co.)

Κυτταρική βιωσιμότητα δοκιμασία

Cells βιωσιμότητα προσδιορίστηκε από την 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλ-τετραζολίου (ΜΤΤ). Είκοσι μι του διαλύματος ΜΤΤ (5 mg /mL) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο του μέσου καλλιέργειας. Μετά από επώαση για άλλες 2 ώρες, το μέσο απομακρύνθηκε, και προστέθηκαν 100 μι DMSO για την επίλυση κρύσταλλοι φορμαζάνης. Η οπτική πυκνότητα μετρήθηκε με χρήση μιας συσκευής ανάγνωσης μικροπλάκας σε μήκος κύματος απορρόφησης 600 nm. Σε κάθε πείραμα, τρία αντίγραφα προετοιμάστηκαν για κάθε δείγμα. Το ποσοστό των ζωντανών κυττάρων προσδιορίστηκε με βάση τη διαφορά στην απορρόφηση μεταξύ των δειγμάτων και των ελέγχων.

GPCR TaqMan Array

Ένα εμπορικά διαθέσιμο TaqMan Array Ανθρωπίνων GPCR κάρτα (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA), η οποία μας επιτρέπει να ποσοτικοποιηθεί η έκφραση των mRNA που κωδικοποιούν GPCRs από 50 υποοικογένειες (343 υποδοχείς, μη συμπεριλαμβανομένου του παράγοντα οσμής, όσφρησης, γεύσης και υποδοχείς φερομόνης), χρησιμοποιήθηκε με RNA που εκχυλίζεται από τα κύτταρα NHLF και H1975. Ολικό RNA, που λαμβάνεται από κύτταρα NHLF και H1975, εκχυλίζεται χρησιμοποιώντας το mirVana ™ miRNA κιτ απομόνωσης (Applied Biosystems Inc.). Για την ανίχνευση αυτή, το cDNA παρασκευάζεται με ένα RNA υψηλής χωρητικότητας για κιτ cDNA (Applied Biosystems Inc.). Κάθε θύρα φορτώθηκε με cDNA (από 1,5 μα RNA) και TaqMan Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems Inc.) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η πλάκα αναλύθηκε χρησιμοποιώντας SDS2.3 και RQ Διευθυντής 1.2 λογισμικό που παρέχεται από την Applied Biosystems. χρόνοι του κύκλου ομαλοποιήθηκαν aaato γονιδίου καθαριότητας GAPDH. Μια συγκριτική προσέγγιση Ct χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση των σχετικών επιπέδων του mRNA χρησιμοποιώντας RQ 1.2 του λογισμικού. Σχετικά επίπεδα έκφρασης υπολογίστηκαν ως 2 × 10

5. Τα αποτελέσματα για κάθε GPCR εξετάστηκαν, και εάν το δείγμα είχε μια υπολογισμένη όριο κάτω από το 0,1, θεωρήθηκε να είναι μη ανιχνεύσιμη. Σε αυτές τις περιπτώσεις, για τους σκοπούς της επεξεργασίας δεδομένων, ο αριθμός κύκλος ορίστηκε σε 35,0.

παρασκεύασμα RNA και ημι-ποσοτική ανάλυση με αλυσιδωτή αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής-πολυμεράσης (RT-PCR)

Ολικό RNA σε NHLF, H1975, HCC827 και HCC827GR εκχυλίζεται χρησιμοποιώντας το σύστημα απομόνωσης SV Total RNA (Promega, Madison, WI) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το καθαρισμένο συνολικό RNA ποσοτικοποιήθηκε φασματοφωτομετρικά στα A260. Για την παρασκευή του πρώτου κλώνου cDNA, 1 μα RNA επωάστηκε σε 100 μL ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει 10 mM διθειοθρεϊτόλη, 2.5 mM MgCl

2, μείγμα dNTP, 200 U αντίστροφης μεταγραφάσης II (Invitrogen), και 0,1 mM ολιγο-dT12 -18 (Invitrogen). Κάθε γονίδιο ενισχύθηκε σε 50 μL του διαλύματος PCR που περιέχει 0.8 mM MgCl

2, μείγμα dNTP, και DNA πολυμεράση με συντίθενται εναρκτήρες του ανθρώπινου υποδοχέα A2a (νόημα: GGCTGCCCCTACACATCATCAACT, αντινόημα: TGGGCCAGGGGGTCATCT) και GPR87 (έννοια: 5′- CTCTAAAGGGGTAAGGGAGA -3 ‘, αντινόημα: 5′-TGGGTTCAGCATAGGTTATT-3’). Τα δείγματα θερμάνθηκαν στους 95 ° C για 1 λεπτό, 55 ° C για 2 λεπτά, και 72 ° C για 3 λεπτά. Η τελική επώαση στους 72 ° C για 7 λεπτά. Το μίγμα τρέχουν σε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 2% με τις υποδεικνυόμενες δείκτες και εκκινητές για το εσωτερικό πρότυπο αφυδρογονάση γλυκεραλδεΰδης-3-φωσφορικής. Η πηκτή αγαρόζης κηλιδώθηκε με βρωμιούχο αιθίδιο και φωτογραφήθηκε με υπεριώδη ακτινοβολία. Η ένταση των ζωνών αναλύθηκε και ημι-ποσοτικά με τη βοήθεια υπολογιστή πυκνομετρία χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ.

Η προετοιμασία των δειγμάτων και κηλίδωση Western

Τα κύτταρα διαλυτοποιήθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει 20 mM Tris-HCl (ρΗ 7 0.4), 0.3% (β /ο) Triton, 3 mM MgCl

2, 1 Μ σακχαρόζη, 5 mM α-ΜΕ, και 1/1000 αναστολέας πρωτεάσης για 15 λεπτά. Τα κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση σε 2350 g για 10 λεπτά στους 4 ° C και το υπερκείμενο διατηρήθηκε ως το κλάσμα κυτταρολύματος για κηλίδωση Western. Ένα κλάσμα του δείγματος αραιώθηκε με ίσο όγκο 2 χ ρυθμιστικού διαλύματος δείγματος ηλεκτροφόρησης (Protein Gel Loading Dye-2X, Amresco, Solon, ΟΗ) που περιέχει 2% δωδεκυλοθειικό νάτριο (SDS) και 10% γλυκερόλη με 0,2 Μ διθειοθρεϊτόλη. Πρωτεΐνες (7 μί /λωρίδα) διαχωρίστηκαν με μέγεθος επί γέλης SDS-πολυακρυλαμιδίου βαθμίδος 4-20% και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης σε ρυθμιστικό Tris-γλυκίνης που περιέχει 25 mM Tris και 192 mM γλυκίνης. Για την ανίχνευση ανοσοκηλίδος, μεμβράνες αποκλείστηκαν σε Tris-ρυθμισμένο αλατούχο διάλυμα (TBS) που περιέχει 1% άπαχο γάλα (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) που περιέχει 0.1% Tween 20 (Research Biochemicals, Inc., ΜΑ, USA) για 1 h σε θερμοκρασία δωματίου με ανάδευση. Η μεμβράνη επωάστηκε με πρωτογενές αντίσωμα αραιωμένο σε TBS [1:1000 GPR87 (Abcam, Cambridge UK), 1:200,000 αφυδρογονάση 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης (GAPDH? Chemicon International Inc., Temecula, CA, USA)] που περιέχει 1% άπαχο αποξηραμένο γάλα με 0,1% Tween 20 όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Η μεμβράνη πλύθηκε σε TBS που περιέχει 0.05% Tween 20 (TTBS), και στη συνέχεια επωάστηκαν για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου με υπεροξειδάση αρμορακίας συζευγμένη με IgG αίγας αντι-κουνελιού (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AL, USA) σε αραίωση 1 :10,000 σε TBS που περιέχει 1% άπαχο γάλα σε σκόνη που περιέχει 0.1% Tween 20. Μετά από αυτή την επώαση, οι μεμβράνες πλύθηκαν σε TTBS. Το σύμπλοκο υπεροξειδάσης αντιγόνου-αντισώματος τελικά ανιχνεύθηκε με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (Pierce, Rockford, IL, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και οπτικοποιήθηκαν με έκθεση σε Amersham Hyperfilm (Amersham Life Sciences, Arlington Heights, IL, USA).

«μικρό παρεμβαλλόμενο RNA» (siRNA) επιμόλυνση

H1975 και τα κύτταρα HCC827GR επιμολύνονται με εμπορικά διαθέσιμο «μικρό παρεμβαλλόμενο RNA» (siRNA) στοχεύει υποδοχείς αδενοσίνης A2a (NIPPON EGT CO., Toyama, Ιαπωνία) μετά από αντίστροφη μέθοδο επιμόλυνσης. Η αντίστοιχη αλληλουχία-στόχο mRNA του υποδοχέα αδενοσίνης A2a για την siRNA ήταν ως ακολούθως: 5′- ACAGCAACCTGCAGAACGT-3 ‘, (αριθμός πρόσβασης: NM_000675.4). Εν συντομία, η αδενοσίνη ειδική γονιδιακή siRNA A2a υποδοχέα αραιώθηκαν σε Opti-ΜΕΜ (Invitorogen) και αναμιγνύεται με RNAimax (Invitorogen) προ-αραιωμένο σε Ορίί-ΜΕΜ. Μετά από 20 λεπτά επώασης σε θερμοκρασία δωματίου, τα σύμπλοκα προστέθηκαν στο 96 φρεατίων. Μετά από αυτό, τα κύτταρα (5 × 10

3 κύτταρα) σπάρθηκαν σε αυτή την υποδοχή. Μετά από 3 ημέρες καλλιέργειας, η βιωσιμότητα των κυττάρων ανιχνεύθηκε με δοκιμασία ΜΤΤ.

Στατιστική Ανάλυση

Όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± S.E.M. Η στατιστική σημαντικότητα των διαφορών μεταξύ των ομάδων εκτιμήθηκε με μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) που ακολουθείται από τη δοκιμασία πολλαπλής σύγκρισης Bonferroni /Dunn. Η στατιστική σημαντικότητα των διαφορών μεταξύ των δύο ομάδων εκτιμήθηκε με Μαθητή

t-test

.

Αποτελέσματα

Επίδραση του αναστολέα gefitinib τυροσινικής κινάσης στην ανάπτυξη των μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του καρκινικά κύτταρα πνεύμονα (NSCLC)

η προσθήκη του gefitinib αναστολέα τυροσινικής κινάσης (0.0001 μΜ-1 μΜ) για να HCC827 κύτταρα, τα οποία έχουν ταξινομηθεί ως gefitinib ευαίσθητη NSCLC κυτταρική γραμμή [5], για 2 ημέρες παράγονται μια εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση μείωση στην ανάπτυξη των κυττάρων του όγκου (Σχήμα 1α-i, ρ & lt? 0.001 vs. ομάδα μη-θεραπείας). Σε αντίθεση, η προσθήκη του gefitinib (0.0001 μΜ-1 μΜ) για 2 ημέρες δεν επηρέασε την ανάπτυξη των κυττάρων H1975 (Σχήμα 1α-ΙΙ).

HCC827 (α) ή H1975 (β) τα κύτταρα επωάστηκαν για 2 ημέρες με gefitinib, και στη συνέχεια η κυτταρική βιωσιμότητα μετρήθηκε (*** ρ & lt? 0.001 έναντι μη κατεργασμένων ομάδα).

η

διαφορετική έκφραση των GPCRs μεταξύ NHLF και H1975 κύτταρα

στο προφίλ της έκφρασης του mRNA που κωδικοποιεί 384 GPCRs στην NHLF και H1975 κυττάρων, ένα TaqMan GPCR-ειδική ανάλυση μικροσυστοιχιών εκτελέστηκε (Σχήματα 2, 3, Σχήματα S1-1, S1-2, S1-3 για τον κατάλογο των γονιδίων GPCR σε η συστοιχία). Το διάγραμμα διασποράς έδειξε ότι υπήρχαν πολλά περισσότερα up-ρυθμίζονται GPCRs από κάτω-ρυθμίζονται GPCRs στην H1975 κυττάρων σε σύγκριση με NHLF. Μια θερμική χάρτη της μικροσυστοιχιών αποκάλυψε σημαντικές διαφορές στην έκφραση των GPCRs μεταξύ των κυττάρων NHLF και H1975 (Σχήματα 2, 3).

έκφραση του Ανθρώπου GPCR αναλύθηκε με μικροσυστοιχίες.

Η

κάθε GPCR εμφανίζεται ως ενιαία γραμμή που βασίζεται στις αξίες τους Ct και χρωματική κωδικοποίηση παρουσιάζεται παρακάτω, με μια κλίση από πράσινο (αρνητικές και χαμηλότερες τιμές Ct) σε κόκκινο (θετικές και υψηλότερες τιμές Ct).

η

Αλλαγές στους δείκτες έκφραση Οα υπομονάδες (Gs, Gi και Gq) σε H1975 κύτταρα

τα πρότυπα έκφρασης των υπομονάδων Οα μεταξύ των ανάντη ή προς τα κάτω-ρυθμίζονται GPCRs των H1975 κυττάρων σε σύγκριση με NHLF είχαν ανατεθεί στην ακόλουθη ομάδες: τα επάνω ρυθμισμένη Gs-συζευγμένου GPCR (Πίνακας 1-α), τα επάνω ρυθμισμένη Gi-συζευγμένου GPCR (Πίνακας 1-b), τα επάνω ρυθμισμένη Gq-συζευγμένου GPCR (Πίνακας 1-c), ρυθμίζεται προς τα κάτω Gs-συζευγμένο GPCR (Πίνακας 2-α), ρυθμίζεται προς τα κάτω Gi-συζευγμένου GPCR (Πίνακας 2-b) και ρυθμισμένα προς τα κάτω Gq-συζευγμένου GPCR (Πίνακας 2-c).

Η

Το mRNA και πρωτεΐνη εκφράσεις της GRP87, η οποία ήταν η πλέον ρυθμίζονται GPCR που βρέθηκαν στη συστοιχία GPCR, ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα σε H1975 κύτταρα σε σύγκριση με εκείνα σε κύτταρα NHLF (Σχήμα 4α: ρ & lt? 0,01 έναντι NHLF, Σχήμα 4β: p & lt ? 0.001 έναντι NHLF)

(α) Άνω: Εκπρόσωπος RT-PCR για τα mRNA της GPR87 και GAPDH, ένα εσωτερικό πρότυπο, σε κάθε τύπο κυττάρου.. Κάτω: Η ένταση των ζωνών προσδιορίστηκε ημι-ποσοτικά χρησιμοποιώντας ImageJ. Οι τιμές για GPR87 mRNA κανονικοποιήθηκαν από την τιμή για GAPDH mRNA. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τον μέσο όρο με S.E.M. 3 ανεξάρτητα δείγματα (*** p & lt? 0.001 έναντι NHLF). (Β) Άνω: Εκπρόσωπος Western blots του GPR87 Κάτω: Εκπρόσωπος Western blots των GPR87 σε μεμβρανώδη κλάσματα των κυττάρων H1975. Κάθε στήλη αντιπροσωπεύει το μέσο με S.E.M. 3 ανεξάρτητων δειγμάτων (** ρ & lt? 0.001 έναντι μη κατεργασμένων ομάδα).

Η

Μεταξύ πάνω ρυθμισμένα GPCRs σε H1975 κύτταρα, GS-, στη γαστρεντερική και Gq-συζευγμένων GPCRs εκφράστηκαν σχεδόν εξίσου . Μεταξύ ρυθμισμένα προς τα κάτω GPCRs, Gi-συζευγμένο GPCRs έχουν επικρατούντα εκφράζονται σε H1975 κύτταρα (Σχήμα 5)

Το ποσοστό των πρότυπο έκφρασης του Οα υπομονάδας. (Gs: κόκκινο, Gi: μπλε και Gq: πράσινο) στην ανάντη ή προς τα κάτω ρυθμισμένα GPCRs του H1975 κυττάρων σε σύγκριση με NHLF δείχνεται.

η

Επιδράσεις ενός εκλεκτικού αγωνιστή ή ανταγωνιστή GPCR επί της ανάπτυξης των κυττάρων H1975 gefitinib ανθεκτικά

από το κατάλογος έκφραση GPCR, επιλέχθηκαν μερικά εμπορικά διαθέσιμο GPCR αγωνιστή /ανταγωνιστή να διερευνήσει κατά πόσον οι αντίστοιχοι συνδέτες επηρέασε την ανάπτυξη των H1975 κυττάρων (Εικόνα S2). Μια Α2α υποδοχέα αδενοσίνης (CGS-21680), ένα υποδοχέα που μοιάζει με 1 αγωνιστής της αγγειοτασίνης II (αγγειοτενσίνη II) και ένα πουρινεργικών υποδοχέων Ρ2Υ συζευγμένοι με πρωτεΐνη 2 αγωνιστή (2- (μεθυλοθειο) 5′-τριφωσφορική αδενοσίνη ένυδρο τετρανατρίου άλατος), η οποία ήταν όλοι οι αγωνιστές του πάνω ρυθμισμένα GPCRs στη λίστα μικροσυστοιχία, δεν είχε καμία επίδραση στην ανάπτυξη των κυττάρων του όγκου. Παρομοίως, η ανάπτυξη των κυττάρων δεν επηρεάστηκε από την προσταγλανδίνη Ι

2 υποδοχέα (ΙΡ) αγωνιστή (beraprost νάτριο), ένας αγωνιστής 5-υδροξυτρυπταμίνης υποδοχέα 2Β (BW723C86) και ένα αγωνιστή αργινίνη αγγειοπιεσίνη 1Α υποδοχέα ([Arg

8] -vasopressin οξικό άλας), τα οποία όλα ταξινομούνται ως «κάτω-ρυθμίζονται GPCRs». Σε αντίθεση, η προσθήκη του επιλεκτικού ανταγωνιστή υποδοχέα αδενοσίνης A2a SCH-58261 (10 ηΜ-10 μΜ) για 7 ημέρες (Σχήμα 6α) παρήγαγε μία εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση μείωση στην κυτταρική ανάπτυξη H1975 (ρ & lt? 0,01, ρ & lt? 0.001 vs. μη ομάδα που έλαβε αγωγή)

(α) H1975 κύτταρα επωάστηκαν για 7 ημέρες με τον εκλεκτικό ανταγωνιστή του υποδοχέα αδενοσίνης A2a SCH-58261 (10 ηΜ-10 μΜ), και στη συνέχεια η κυτταρική βιωσιμότητα μετρήθηκε (** ρ & lt?. 0.01 , *** ρ & lt? 0.001 έναντι μη κατεργασμένων ομάδα). (Β) Η θεραπεία με siRNA που στοχεύει αδενοσίνης A2a υποδοχείς να H1975 κυττάρων για 3 ημέρες μείωσε σημαντικά την κυτταρική βιωσιμότητα των κυττάρων H1975 (** ρ & lt? 0,01 vs. ομάδα χωρίς θεραπεία).

Η

επόμενο εκτελείται για να την μεταγωγή siRNA που στοχεύει υποδοχείς αδενοσίνης A2a σε H1975 κυττάρων. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν για την ανίχνευση του επιπέδου αδενοσίνης mRNA του υποδοχέα A2a ημι-ποσοτικά με RT-PCR σε 72 ώρες μετά την επιμόλυνση. Η έκφραση του υποδοχέα A2a αδενοσίνης σε παρουσία siRNA που στοχεύει αδενοσίνης A2a υποδοχείς ήταν κάτω ρυθμισμένα κατά 90% σε σύγκριση με μη-θεραπείας (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Υπό τις συνθήκες αυτές, η αγωγή με siRNA που στοχεύουν υποδοχείς A2a αδενοσίνης παρήγαγε μία σημαντική μείωση στην ανάπτυξη των κυττάρων H1975 (Εικόνα 6β: ρ & lt? 0.001 έναντι μη κατεργασμένων ομάδα).

Ο ρόλος των υποδοχέων A2a αδενοσίνης στην ανάπτυξη του gefitinib ανθεκτικών HCC827GR κύτταρα

για να επιβεβαιώσετε τη λειτουργία της αδενοσίνης υποδοχέων Α2α για gefiitnib αντοχή σε NSCLC, δημιουργήσαμε anaother gefitinib-ανθεκτικά κύτταρα HCC827GR εκθέτοντας HCC827 κύτταρα σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις του gefitinib για 1,5 μήνα. Σύμφωνα με μια ανάλυση της αλληλουχίας, τα κύτταρα HCC827GR είχε δεύτερη μετάλλαξη σημείο, λόγω προκαλείται αντίσταση κατά κύριο λόγο τα ναρκωτικά, 2369 C & gt? T στο EGFR εξόνιο 20-21, η οποία οδήγησε στην μεταβάσεις Thr790Met (Σχήμα 7α-i). Ως εκ τούτου, η προσθήκη του gefitinib (0,01 μΜ-1 μΜ) για 2 ημέρες δεν επηρέασε την ανάπτυξη των κυττάρων HCC827GR (Σχήμα 7α-ΙΙ). Η έκφραση του mRNA του υποδοχέα A2a αδενοσίνης αυξήθηκε δραματικά σε κύτταρα HCC827GR σύγκριση με HCC827 και NHLF κύτταρα (Σχήμα 7b, ρ & lt? 0.001 vs. NHLF). Υπό αυτές τις συνθήκες, ο εκλεκτικός ανταγωνιστής υποδοχέα αδενοσίνης A2a SCH-58261 (10 ηΜ-1 μΜ) για 7 ημέρες παρήγαγε μία εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση μείωση στην κυτταρική ανάπτυξη HCC827GR (Σχήμα 7γ, ρ & lt? 0,05, ρ & lt? 0,001 ομάδα έναντι μη κατεργασμένων ). Επιπλέον, η θεραπεία με siRNA που στοχεύει υποδοχείς αδενοσίνης A2a παρήγαγε επίσης μία σημαντική μείωση στην ανάπτυξη των κυττάρων HCC827GR (Σχήμα 7δ: ρ & lt? Vs. ομάδα μη επεξεργασμένα 0,001).

(a-i) Ανάλυση αλληλουχίας σε HCC827GR κύτταρο. Μία απλή αλλαγή νουκλεοτιδίου C & gt? Τ (EGFR εξόνιο 20) στο DNA, η οποία δημιουργεί μια αλλαγή εσφαλμένου νοήματος στην αλληλουχία πρωτεΐνης η οποία αντικαθιστά ένα θρεονίνης με ένα κατάλοιπο μεθειονίνης. (Α-ΙΙ) κύτταρα HCC827GR επωάστηκαν με gefitinib για 2 ημέρες, και στη συνέχεια μετρήθηκε η βιωσιμότητα των κυττάρων. (Β) Άνω: Αντιπροσωπευτικά RT-PCR για mRNAs της αδενοσίνης A2a υποδοχέα (ADORA2a) και GAPDH, ένα εσωτερικό πρότυπο, σε κάθε τύπο κυττάρου. Κάτω: Η ένταση των ζωνών προσδιορίστηκε ημι-ποσοτικά χρησιμοποιώντας ImageJ. Οι τιμές για ADORA2a mRNA κανονικοποιήθηκαν από την τιμή για GAPDH mRNA. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τον μέσο όρο με S.E.M. 3 ανεξάρτητα δείγματα (*** p & lt? 0.001 έναντι NHLF). (Γ) κύτταρα HCC827GR επωάστηκαν για 7 ημέρες με τον εκλεκτικό ανταγωνιστή του υποδοχέα αδενοσίνης A2a SCH-58261 (10 ηΜ-10 μΜ), και στη συνέχεια μετρήθηκε η βιωσιμότητα των κυττάρων (* ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt? 0,01 έναντι μη κατεργασμένων ομάδα). (Δ) Κατεργασία με siRNA που στοχεύει υποδοχείς αδενοσίνης A2a να HCC827GR κυττάρων για 3 ημέρες μείωσε σημαντικά κυτταρική βιωσιμότητα των κυττάρων HCC827GR (*** ρ & lt? 0.001 έναντι μη κατεργασμένων ομάδα).

Η

Συζήτηση

GPCRs έχουν παραδοσιακά συσχετιστεί με πολλές από τις λειτουργίες των διαφοροποιημένων, μετα-μιτωτικά κύτταρα. Από την άλλη πλευρά, GPCRs εκφράζονται επίσης σε πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα και συμβάλλουν στην εμβρυογένεση, την αναδιαμόρφωση των ιστών και την επισκευή, φλεγμονή, αγγειογένεση, φυσιολογική ανάπτυξη των κυττάρων και του καρκίνου.

Μεταξύ αυτών, πρωτεάση-ενεργοποιημένοι υποδοχείς (PARs), χημειοκίνη οι υποδοχείς και υποδοχείς για βιο-δραστικά λιπίδια όπως LPA και σφιγγοσίνης-1-φωσφορικής (S1P) έχουν ενοχοποιηθεί σε ανώμαλο κυτταρικό πολλαπλασιασμό σε ευρεία ποικιλία καρκινικών κυττάρων. Επιπλέον, νευροπεπτίδια όπως ενδοθηλίνης, βραδυκινίνη, νευρομεντίνη Β, χολοκυστοκινίνης και της αγγειοτασίνης II ενεργοποιούν συγγενές GPCRs τους να διεγείρουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε διάφορους τύπους κυττάρων, και παίζουν κρίσιμο ρόλο σε πολλές επιθετικές ανθρώπινους καρκίνους, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του πνεύμονα μικρών κυττάρων (SCLC), καρκίνο του παγκρέατος, της κεφαλής και του καρκινώματος των πλακωδών κυττάρων του τραχήλου (HNSCC), και του καρκίνου του προστάτη [18], [19]. Ωστόσο, υπήρξαν λίγες αναφορές σχετικά με τον κρίσιμο ρόλο των GPCRs στα κύτταρα NSCLC gefitinib ανθεκτικά, όπως H1975 κυττάρων. Μία καλύτερη κατανόηση του ρόλου των GPCRs στον NSCLC μπορεί να προέλθει από πολλαπλές αναλύσεις για προφίλ έκφρασης των γονιδίων. μελέτες μικροσυστοιχίας είναι πιθανόν να είναι χρήσιμα εργαλεία για το σκοπό αυτό. Ως εκ τούτου, πραγματοποιήσαμε μια ανάλυση μικροσυστοιχιών GPCR για κύτταρα H1975 gefitinib ανθεκτικά σε σύγκριση με φυσιολογικά ανθρώπινα κύτταρα ινοβλαστών πνεύμονος. Με προφίλ της έκφρασης του mRNA που κωδικοποιούν GPCRs, βρήκαμε ένα μεγάλο αριθμό GPCRs υπερεκφράζεται σε H1975 κύτταρα. Έχει αναγνωρισθεί ότι πολλές GPCRs που υπερεκφράζεται σε διάφορους τύπους καρκίνου προάγουν την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων όταν ενεργοποιείται από ιστικά συνδετήρες. Μεταξύ των GPCRs, GRP87 εισήχθη ως το πιο up-ρυθμίζονται GPCR στην παρούσα σειρά GPCR. Μετά από αυτή τη σειρά, θα επικυρωθεί το επάνω ρυθμισμένη έκφραση των GRP87 mRNA και της πρωτεΐνης του χρησιμοποιώντας RT-PCR και κηλίδωση Western, σε σύγκριση με εκείνες που παρατηρούνται σε κύτταρα NHLF. Σε H1975 κυττάρων, GS-, στη γαστρεντερική και Gq-συζευγμένων GPCRs ήταν υπερεκφράζεται σε σχεδόν στον ίδιο βαθμό, ενώ κάποιοι Gi-σε συνδυασμό GPCRs ήταν κάτω-ρυθμίζονται H1975 κύτταρα.

Η ενεργοποίηση των υποδοχέων Α2α έχει αναφερθεί να οδηγήσει σε ανοσοκατασταλτική δράση, η οποία μειώνει την αντι-καρκινική ανοσία και έτσι ενθαρρύνει την ανάπτυξη του όγκου. Σε μελέτες συμπεριφοράς, έχει προταθεί ότι A2a ανταγωνιστές θα πρέπει να προστεθεί ανοσοθεραπευτικών πρωτοκόλλων για τον καρκίνο για να ενισχύσει την ανοσοθεραπεία όγκου. Αυτές οι ενώσεις έχουν ήδη δειχθεί ότι είναι ασφαλής σε δοκιμές με ανταγωνιστές A2a στη θεραπεία της νόσου του Parkinson [20]. Στην παρούσα μελέτη, διερευνήσαμε κατά πόσον η συγκεκριμένη αγωνιστές /ανταγωνιστές οι οποίοι δρουν επί GPCRs που ρυθμίζονται πάνω-κάτω ή-ρυθμίζεται H1975 κύτταρα θα μπορούσαν να επηρεάσουν την ανάπτυξη των H1975 κυττάρων. Μεταξύ των GPCRs που παρατίθενται, ένας εκλεκτικός ανταγωνιστής του υποδοχέα A2a αδενοσίνης, η οποία ήταν μια από τις εμπορικά διαθέσιμες συνδετήρες για GPCRs υπερεκφράζεται σε H1975 κύτταρα, παρήγαγε μια δοσο-εξαρτώμενη μείωση στην βιωσιμότητα των κυττάρων H1975. Παρόμοια με τον ανταγωνιστή, η θεραπεία με siRNA που στοχεύει αδενοσίνης A2a υποδοχείς παρήγαγε μία σημαντική μείωση στην βιωσιμότητα των κυττάρων H1975. Για την περαιτέρω διερεύνηση του ρόλου της αδενοσίνης A2a υποδοχείς σε gefiitnib-αντίσταση σε NSCLC, δημιουργήσαμε ένα άλλο gefitinib ανθεκτικά κλώνος εκθέτοντας gefitinib σε κύτταρα NSCLC gefitinib ευαίσθητα, HCC827 κύτταρα. Όπως H1975 κυττάρων, η έκφραση του mRNA του υποδοχέα A2a αδενοσίνης αυξήθηκε δραματικά σε κύτταρα HCC827GR geftinib ανθεκτικά σε σύγκριση με κύτταρα HCC827 και NHLF. Υπό τις συνθήκες αυτές, η αγωγή με είτε την επιλεκτική ανταγωνιστής υποδοχέα αδενοσίνης A2a ή siRNA που στοχεύει αδενοσίνης A2a υποδοχείς παρήγαγε μία σημαντική μείωση στην ανάπτυξη των κυττάρων HCC827GR. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι, αν και περαιτέρω

in vivo μελέτες

απαιτούνται ακόμη, την ικανότητα να παρεμβαίνει με τους υποδοχείς αδενοσίνης A2a μπορούν να παρέχουν μοναδικές ευκαιρίες για την πρόληψη και τη θεραπεία του NSCLC. Από την άλλη πλευρά, εκλεκτικοί αγωνιστές για τον υποδοχέα A2a αδενοσίνης, η αγγειοτενσίνη II που ομοιάζουν με υποδοχέα 1, πουρινεργικών υποδοχέα Ρ2Υ συζευγμένοι με πρωτεΐνη 2, προσταγλανδίνης Ι

2 υποδοχέα (ΙΡ), 5-υδροξυτρυπταμίνη 2Β υποδοχέα και υποδοχέα αγγειοπιεσίνης αργινίνη 1Α είχε καμία επίδραση στη βιωσιμότητα H1975 κύτταρο, το οποίο αντανακλά τις σύνθετες λειτουργίες των GPCRs που εκφράζονται σε αυτά τα κύτταρα. Πολλές από τις συνδετήρες ή αναστολείς για GPCRs που ήταν πάνω ή προς τα κάτω ρυθμισμένα σε H1975 κύτταρα δεν ήταν διαθέσιμα για την παρούσα μελέτη. Για παράδειγμα, θεωρείται ότι GPR87, η οποία ήταν η μεγαλύτερη υπερεκφραζόμενο GPCR σε H1975 κύτταρα, παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην εξαρτώμενη από ρ53 επιβίωση των καρκινικών κυττάρων που εκτίθενται σε βλάβη του DNA [21]. Ωστόσο, ο ειδικός συνδέτης και ανταγωνιστής του δεν έχουν ακόμη ταυτοποιηθεί. Δεδομένου ότι δεν υπάρχει καμία αμφιβολία ότι οι GPCRs μπορούν να είναι βασικοί παράγοντες στη ρύθμιση των διαφόρων παθοφυσιολογικών αποκρίσεων, συμπεριλαμβανομένης της ανάπτυξης και εξέλιξης του καρκίνου, είναι πιθανό ότι οι προσεγγίσεις που περιλαμβάνουν παρέμβαση RNA θα μας επιτρέψει να κατανοήσουμε καλύτερα τις εξειδικευμένες λειτουργίες των GPCRs εκφράζονται σε gefitinib ανθεκτικά NSCLC κυττάρων.

Συμπερασματικά, αποδείξαμε ότι ένας μεγάλος αριθμός από GPCRs ρυθμίστηκαν προς τα πάνω, ενώ μερικά έχουν ρυθμισμένα προς τα κάτω μέσω λειτουργικής αλληλοπαρεμβολές μεταξύ EGFR κατάντη και GPCR μεταγραφή στην ανάπτυξη του gefitinib αντοχής σε NSCLC.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Λίστα συμβόλων γονιδίου GPCR σε μικροσυστοιχιών. TaqMan Array Ανθρωπίνων GPCR κάρτα η οποία μας επιτρέπει να ποσοτικοποιηθεί η έκφραση των mRNAs που κωδικοποιούν GPCRs από 50 υποοικογένειες (343 υποδοχείς, μη συμπεριλαμβανομένου του οσφρητικών, όσφρησης, γεύσης και υποδοχείς φερομόνης), χρησιμοποιήθηκε

doi:. 10.1371 /journal.pone .0044368.s001

(PDF)

Εικόνα S2.

Επιδράσεις διαφόρων αγωνιστών GPCR επί της ανάπτυξης H1975 κυττάρων. κύτταρα H1975 επωάστηκαν για 2 ημέρες με κάθε συνδέτη GPCR (1, 10 μΜ) και δοκιμασία ΜΤΤ στη συνέχεια διεξήχθη. Τα δεδομένα βιωσιμότητας κυττάρων αντιπροσωπεύει τη μέση με S.E.M. 5 ανεξάρτητα δείγματα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0044368.s002

(PDF)