Αφηρημένο

Dickkopf-1 (DKK1) είναι ένας αναστολέας του /της β-κατενίνης μονοπάτι σηματοδότησης Wnt. Ωστόσο, ο ρόλος του DKK1 στην εξέλιξη της μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) δεν είναι πλήρως κατανοητός. Σε αυτή τη μελέτη, η RT-PCR και στυπώματος Western χρησιμοποιήθηκαν για να εξεταστεί η έκφραση της DKK1 σε ένα πάνελ από δέκα ανθρώπινες κυτταρικές σειρές NSCLC και ιστών NSCLC. έκφραση DKK1 ήταν ιδιαίτερα μετενεργοποίησε στη μεγάλη πλειοψηφία αυτών των γραμμών καρκίνου. Η έκφραση του DKK1 ρυθμίζεται αυξητικά στις δύο mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης σε ιστούς NSCLC σε σύγκριση με τα γειτονικά φυσιολογικούς ιστούς των πνευμόνων. Ανοσοϊστοχημεία και ανοσοφθορισμού αποκάλυψε ότι DKK1 κατανεμήθηκε κυρίως στο κυτταρόπλασμα και στις δύο ιστούς καρκινώματος και κυτταρικές σειρές. έκφραση πρωτεΐνης DKK1 αξιολογήθηκε επίσης σε τομές παραφίνης από 102 ασθενείς με NSCLC από ανοσοϊστοχημεία, και 65 (63,73%) όγκοι ήταν DKK1 θετικές. Σχετική ανάλυση έδειξε σημαντική σχέση μεταξύ DKK1 θετική μετάσταση έκφρασης και λεμφαδένα (

P

606439(60.9%)25(39.1%)0.5780.2940 ≥603826 (68,4%) 12 (31,6%) GenderMale8151 (63,0%) 30 (37,0%) 0.0990.4820 Female2114 (66,7%) 7 (33,3%) DifferentiationWell3221 (65,6%) 11 (34,4%) 0.0640.8003

*

Moderate4327 (62,8%) 16 (37,2%) Poor2717 (63,0%) 10 (37,0%) TT1117 (63,6%) 4 (36,4%) 0.12130.7276

**

T23623(63.9%)13(36.1%)T31824(66.7%)12(33.3%)T41911(57.9%)8(42.1%)N(Metastasis)Positive(N1+N2)5447(87.0%)7(13.0%)26.9760.0000 Αρνητικό (N0) 4818 (37,5%) 30 (62,5%) Πίνακας 1. Συσχέτιση μεταξύ DKK1 και διάφορα κλινικοπαθολογικών παραμέτρων

*

Καλά ομάδα εναντίον μέτρια?

**

Τ3 εναντίον Τ4.

CSV Λήψη CSV

Είμαστε δίπλα παρατηρηθεί η έκφραση της DKK1 σε χειρουργικά ιστούς NSCLC και συμφωνημένα φυσιολογικούς ιστούς. Μεταξύ 10 περιπτώσεις NSCLC, 7 έδειξαν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω έκφραση του mRNA σε DKK1 καρκινικό ιστό σε σύγκριση με το αντίστοιχο φυσιολογικό ιστό (Εικόνα 2Β). αποτελέσματα κηλίδος Western έδειξαν την ίδια τάση σε επίπεδο πρωτεΐνης DKK1 (Σχήμα 2C).

Επίδραση των DKK1 υπερέκφραση για τη μετανάστευση και την εισβολή στο 95C

Για να ελέγξετε το βιολογικό ρόλο των DKK1 σε NSCLC κυττάρων, εμείς εξέτασε το αποτέλεσμα της υπερέκφρασης της DKK1 για τη μετανάστευση των κυττάρων και την ικανότητα εισβολής στην κυτταρική γραμμή 95C που έχουν πραγματικά ένα πολύ χαμηλό επίπεδο του ενδογενούς DKK1. Ευκαρυωτικός φορέας έκφρασης pCMV-Tag-2b-DKK1 κατασκευάστηκε για να υπερεκφράζεται το γονίδιο DKK1. Μία σημαντική αύξηση στα επίπεδα τόσο της πρωτεΐνης και του mRNA DKK1 παρατηρήθηκε σε 95C κυτταρική σειρά επιμολύνθηκαν με ρΟΜν-Tag-2b-DKK1 σύγκριση με μάρτυρα αναφοράς και αρνητικό μάρτυρα (Σχήμα 3. Α). Στη συνέχεια, ΜΤΤ δοκιμασία αποκάλυψε ότι η υπερέκφραση του DKK1 δεν μετέβαλλε την ικανότητα πολλαπλασιασμού των κυττάρων (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ωστόσο, η ικανότητα μετανάστευσης προήχθη στη δοκιμασία επούλωσης πληγών (Σχήμα 3. Β, C). Boyden θάλαμο χρησιμοποιήθηκε για να δοκιμαστεί η διεισδυτικότητα, 95C κύτταρο μεταμολύνθηκαν είτε με pCMV-Tag-2b-DKK1 ή pCMV-Tag-2b, και κενό ομάδα ελέγχου προστέθηκε αντιδραστήριο επιμόλυνσης χωρίς πλασμίδιο. Μετά την επιμόλυνση 18 ώρες, τα κύτταρα επανασπάρθηκαν στην κορυφή του ενθέτου. Κύτταρα που εισέβαλαν μέσω του φράγματος και έφθασε στην άλλη πλευρά του ενθέματος θάλαμο καταγράφηκαν μετά 48h επώασης. Boyden αποτελέσματα θάλαμος έδειξαν ότι τα κύτταρα που διαβιβάστηκε μέσω της μεμβράνης στην ομάδα pCMV-Tag-2b-DKK1 ήταν μεγαλύτερη από τις άλλες δύο ομάδες (Σχήμα 3. D). Αυτές οι παρατηρήσεις έδειξαν ότι η υπερέκφραση της DKK1 μπορεί να προωθήσει σημαντικά την ικανότητα εισβολής των 95C κυττάρων (Σχήμα 3. Ε).

(Α) RT-PCR και ανάλυση κηλίδας Western της έκφρασης DKK1. επίπεδο DKK1 σε 95C κύτταρο επιμολυσμένα με pCMV-Tag-2b-DKK1 είναι σημαντικά υψηλότερη από ότι σε pCMV-Tag-2b και κενό ομάδα ελέγχου. (Β) Οι τραυματίες και θεραπευτικές 95C κύτταρα. (Γ) Μέτρηση της απόστασης μετανάστευσης (*

P

& lt? 0,05). (Δ) Η ικανότητα εισβολής των 95C επιμολυσμένα με pCMV-Tag-2b-DKK1 ήταν σημαντικά αυξημένη. (Ε) Ο αριθμός των κυττάρων που μεταναστεύουν μέσω των Matrigel επικαλυμμένα φίλτρα στατιστική αναλύθηκε. Οι δοκιμασίες έγιναν εις τριπλούν φρεάτια (*

P

& lt? 0,01).

Η

Νοκ ντάουν της ενδογενούς DKK1 από siRNA μείωση της μετανάστευσης και της εισβολής στο LTEP-Α-2

Είμαστε ανέλυσε τις επιπτώσεις της DKK1 νοκ ντάουν για τη μετανάστευση και την εισβολή στην LTEP-a-2 κυτταρική σειρά . Για να προσδιοριστεί η αποτελεσματικότητα knockdown του shRNA, το επίπεδο DKK1expression σε LTEP-α-2 κυτταρικές σειρές εξετάστηκε τόσο από RT-PCR και στυπώματος Western. Το ειδικό siRNA μείωσε αποτελεσματικά την ενδογενή έκφραση του DKK1 στα κύτταρα που επιμολύνθηκαν με pSilencer-DKK1 σύγκριση με τα κύτταρα που επιμολύνθηκαν με τον φορέα pSilencer-NC (Σχήμα 4. Α).

(Α) RT- PCR και ανάλυση στυπώματος Western της έκφρασης DKK1. επίπεδο DKK1 σε LTEP-a-2 κυττάρων επιμολυσμένων με pSilencer-DKK1 είναι σημαντικά χαμηλότερη από ότι σε pSilencer-NC και κενό ομάδα ελέγχου. (Β) Οι τραυματίες και την επούλωση των κυττάρων LTEP-α-2. (Γ) Μέτρηση της απόστασης μετανάστευσης (*

P

& lt? 0,05). (Δ) Η ικανότητα εισβολή LTEP-a-2 επιμολυσμένα με pSilencer-DKK1 σημαντικά κατασταλεί. (Ε) Ο αριθμός των κυττάρων που μεταναστεύουν μέσω των Matrigel επικαλυμμένα φίλτρα στατιστική αναλύθηκε. Οι δοκιμασίες έγιναν εις τριπλούν φρεάτια (*

P

& lt? 0,01).

Η

Knockdown ενδογενούς DKK1 με siRNA δεν επηρέασε LTEP-Α-2 πολλαπλασιασμού (δεδομένα δεν παρουσιάζονται), αλλά κατασταλεί σημαντικά την ικανότητα της μετανάστευσης στην πληγή δοκιμασία επούλωσης. Ο ρυθμός μετανάστευσης των κυττάρων pSilencer-DKK1 στην επούλωση τραυμάτων ήταν σημαντικά χαμηλότερη μετά από 48 ώρες την επιμόλυνση από εκείνη του pSilencer-NC και κενό ομάδα ελέγχου (Σχήμα 4. Β, C). Όταν καλλιεργούνται σε Boyden θάλαμο, ο αριθμός των κυττάρων που μετανάστευσαν μέσω των Matrigel επικαλυμμένα πορώδη φίλτρα ήταν σημαντικά μειωμένη σε DKK1 knockdown κυττάρων pSilencer-DKK1 σύγκριση με pSilencer-NC και κενό ομάδα ελέγχου (Σχήμα 4. D, E).

η υπερέκφραση του DKK1 αλλοιωμένη έκφραση γονιδίων που σχετίζονται

για τη διερεύνηση του μηχανισμού της DKK1 στην πρόοδο του καρκίνου του πνεύμονα, σε πραγματικό χρόνο PCR διεξήχθη για να ανιχνευθεί η επίδραση της υπερέκφρασης DKK1 για την έκφραση της σχετικής γονιδίων που εμπλέκονται στην καρκινογένεση. Η υπερέκφραση του DKK1 δεν μετέβαλε την έκφραση των συγγενικών πρωτεϊνών κυτταρικού κύκλου cyclinD1 και σχετίζονται με την απόπτωση πρωτεΐνες Bcl-2 και του κουτιού. Akt-1 που συνδέεται με μονοπάτι σηματοδότησης ήταν ελάχιστα ρυθμίζεται αυξητικά στην κυτταρική 95C επιμολυσμένα με pCMV-Tag2b-DKK1. Η έκφραση της ΜΜΡ2 και VEGFC στο κελί 95C επιμολυσμένα με pCMV-Tag2b-DKK1 αυξήθηκε 7,78 φορές και 2,13 φορές σε σχέση με τον έλεγχο 95C κύτταρα αντίστοιχα (Πίνακας S2).

Συζήτηση

Η οικογένεια των ανθρώπινων πρωτεϊνών DKK αποτελείται από DKK1, DKK-2, DKK-3, DKK-4 και μια μοναδική DKK3 σχετίζεται πρωτεΐνη, που οροθετείται Soggy [17]. DKK1, που κωδικοποιεί μια εκκρινόμενη πρωτεΐνη, είναι ένας ανταγωνιστής της σηματοδότησης /β-κατενίνης Wnt που εμπλέκεται εις την πρόοδον των όγκων [13,18-22]. DKK1 εκφράζεται σε πολυάριθμες ανθρώπινους καρκίνους? θα μπορούσε να παίξει ποικίλες βιολογικές ρόλους σε καρκινικά κύτταρα, ανάλογα με τον τύπο του κυττάρου που εμπλέκονται. DKK1 είναι ρυθμισμένη προς τα πάνω σε ορισμένα είδη ανθρώπινων όγκων συμπεριλαμβανομένων των NSCLC, ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα, καρκίνο του παγκρέατος [12,14,19,23]. Φάνηκε ότι DKK1 ίσως παίζουν σημαντικό ρόλο κατά τη διάρκεια της εξέλιξης αυτών των τύπων όγκων, αλλά οι βιολογικές επιδράσεις των DKK1 σε NSCLC δεν έχουν αποσαφηνισθεί. Σε αυτή τη μελέτη, επιβεβαιώσαμε ότι DKK1 εκφράζεται σε ένα πάνελ κυτταρικών γραμμών NSCLC. Immunoflouresence έδειξε ότι DKK1 έκφραση υποκυτταρική τοποθεσία ήταν ως επί το πλείστον κατανεμημένες στην κυτταρόπλασμα των κυττάρων NSCLC. Η μελέτη IHC της έκφρασης DKK1 σε 102 NSCLC δείγματα τμήματα αποκάλυψε ότι η θετική έκφραση της DKK1 συσχετίζεται με μετάσταση στους λεμφαδένες? θα μπορούσε να είναι ένας προγνωστικός δείκτης της μετάστασης του καρκίνου. Όσον αφορά την πρόγνωση, θετική έκφραση της πρωτεΐνης DKK1 συσχετίζονται με μελαγχολική επιβίωσης 5 ετών. DKK1 ρυθμίζεται αυξητικά σε NSCLC ιστούς σε σύγκριση με τα συμφωνημένα φυσιολογικούς ιστούς. Έτσι, είναι πιθανό ότι DKK1 εμπλέκεται στην εξέλιξη της NSCLC.

DKK1 είναι μία εκκρινόμενη πρωτεΐνη που περιέχει μια αλληλουχία πεπτιδίου σήματος και δύο πλούσιες σε κυστεΐνη περιοχές και λειτουργεί ως αρνητικός ρυθμιστής της σηματοδότησης Wnt [6, 7]. Επιπλέον, DKK1 αναφέρθηκε ότι είναι ένας προς τα κάτω στόχος του β-κατενίνης /παράγοντας Τ-κυττάρων και συμμετέχει σε μια αρνητική αλληλεπίδραση στη σηματοδότηση Wnt σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου [24,25]. Μελέτες έχουν δείξει ότι η υπερέκφραση της DKK1 συσχετίστηκε με κακή πρόγνωση [14,19,21], ενώ λίγα είναι γνωστά για τη λειτουργία της DKK1 σε NSCLC. Να μελετήσει περαιτέρω τις βιολογικές επιδράσεις της DKK1 σε ivtro, πρώτον, έχουμε διαπιστώσει ότι η υπερέκφραση της DKK1 προωθεί τη μετανάστευση και την εισβολή στο ανθρώπινο NSCLC κυτταρική γραμμή 95C. Εν τω μεταξύ, η υπερέκφραση του DKK1 ρυθμίζεται προς τα πάνω την έκφραση που σχετίζονται με μετάσταση πρωτεΐνες, αλλά η λεπτομερής μηχανισμός πρέπει να είναι περαιτέρω μελέτη. Επιπλέον, με τη χρήση ευκαρυωτικών έκφραση DKK1 shRNA, δείξαμε ότι νοκ ντάουν της DKK1 καταστέλλει τη μετανάστευση και την εισβολή της κυτταρικής σειράς NSCLC αποτελέσματα LTEP-α-2.Η δείχνουν ότι DKK1 θα μπορούσε να έχει θετικό ρόλο στην εξέλιξη του NSCLC, αλλά ο μηχανισμός που εμπλέκεται στην εισβολή χρειάζεται περαιτέρω μελέτη.

Ωστόσο, μερικές μελέτες έχουν αναφέρει ότι DKK1 καταστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων και τη μετανάστευση [16,26], η οποία προτείνει ότι μπορεί να υπάρχουν και άλλοι ρόλοι DKK1 στη σηματοδότηση /β-κατενίνης Wnt. DKK1 θα μπορούσαν να παίξουν ποικίλες βιολογικές ρόλους σε διαφορετικό τύπο των καρκινικών κυττάρων. Μια αναδρομική ανάλυση της έκφρασης DKK1 έδειξε ότι DKK1 μεταβλήθηκε κατά τη διάρκεια του προστάτη εξέλιξη [27]. Μέχρι στιγμής, έχουν μόνο λίγες μελέτες έχουν αναφερθεί σχετικά με τους ρόλους των DKK1 στο NSCLC, εστιάζοντας κυρίως τις τιμές διάγνωση και πρόγνωση [12,21,28-30]. Ο ρόλος της DKK1 στο NSCLC, ο μηχανισμός της λειτουργίας και κλινικές πτυχές χρειάζονται περαιτέρω μελέτες.

Εν κατακλείδι, αν και η λεπτομερής λειτουργία των DKK1 σε εξέλιξη NSCLC δεν είναι καλά διευκρίνισε, τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν τις πιθανές ρόλους DKK1 στην προώθηση της μετανάστευσης και της εισβολής ανάπτυξης σε κυτταρικές σειρές NSCLC, και ότι θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως ένα μυθιστόρημα θεραπευτικός στόχος για NSCLC.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Σχήμα S1.

ελεύθερη νόσου επιβίωση καμπύλη ταξινομούνται σύμφωνα με την έκφραση DKK1 για όλους τους ασθενείς απεικονίζονται με μεθόδους Kaplan-Meier.

doi: 10.1371 /journal.pone.0084944.s001

(ΔΕΘ)

Πίνακα S1. ακολουθία

εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για πραγματικού χρόνου PCR.

doi: 10.1371 /journal.pone.0084944.s002

(DOC)

Πίνακας S2.

differencial έκφραση γονιδίων σε 95C επιμολυσμένα με pCMV-Tag2b-DKK1 σχέση με 95C επιμολυσμένα με pCMV-Tag2b.

doi: 10.1371 /journal.pone.0084944.s003

(DOC)