Αφηρημένο

NSCLC (μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα) παρουσιάζει συχνά ανθεκτικότητα στη θεραπεία πακλιταξέλη. Ο εντοπισμός των στοιχείων που ρυθμίζουν απάντηση πακλιταξέλη θα προωθήσει προσπάθειες για να ξεπεραστεί αυτή η αντίσταση στη θεραπεία NSCLC. Χρησιμοποιώντας

in vitro

προσεγγίσεις, αποδείξαμε ότι η υπερέκφραση του microRNA miR-337-3p ευαισθητοποιεί τα κύτταρα NCI-H1155 στην πακλιταξέλη, και ότι miR-337-3p μιμούνται έχει μια γενική επίδραση στην απόκριση πακλιταξέλη σε NSCLC κυτταρικές σειρές, η οποία μπορεί να δώσει μία νέα στρατηγική ανοσοενισχυτικό προς paclitaxel στη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα. Με το συνδυασμό

in vitro

και

in silico

προσεγγίσεις, εντοπίσαμε

STAT3

και

RAP1A

ως άμεσοι στόχοι που διαμεσολαβούν την επίδραση του miR-337- 3p την ευαισθησία πακλιταξέλη. Περαιτέρω έρευνα έδειξε ότι το miR-337-3p μιμούνται ευαισθητοποιεί επίσης κύτταρα σε docetaxel, ένα άλλο μέλος της οικογένειας ταξανίου, και ότι τα επίπεδα STAT3 συσχετίστηκε σημαντικά με την αντίσταση ταξάνης στον καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικών σειρών, υποδηλώνοντας ότι η ενδογενής έκφραση STAT3 είναι ένας καθοριστικός παράγοντας της εγγενούς ταξανίου αντίσταση στον καρκίνο του πνεύμονα. Ο προσδιορισμός ενός miR-337-3p ως ρυθμιστής της κυτταρικής απόκρισης σε ταξάνες, και

STAT3

και

RAP1A

ως ρυθμιστικές στόχους που μεσολαβούν ότι η απάντηση, καθορίζει μια νέα κανονιστική οδό ρύθμιση ευαισθησίας πακλιταξέλη σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα, η οποία μπορεί να παρέχει νέες στρατηγικές ανοσοενισχυτικό μαζί με paclitaxel στη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα και μπορεί επίσης να παρέχει βιοδείκτες για την πρόβλεψη της απόκρισης paclitaxel σε NSCLC

Παράθεση:. Du L, Subauste MC, DeSevo C, Zhao Ζ, Baker Μ, Borkowski R, et al. (2012) miR-337-3p και στόχων του

STAT3

και

RAP1A

Modulate Ταξάνης Ευαισθησία σε μη-μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα. PLoS ONE 7 (6): e39167. doi: 10.1371 /journal.pone.0039167

Επιμέλεια: Sumitra Deb, Βιρτζίνια Πανεπιστήμιο της Κοινοπολιτείας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 6 Φλεβάρη, 2012? Αποδεκτές: 17 Μαΐου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 18 Ιουνίου του 2012

Copyright: © 2012 Du et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Υποστηρίζεται σε μέρει από καρκίνο του πνεύμονα SPORE P50 CA70907 (JD Minna), R01 CA129632 (Α Pertsemlidis) από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, και της ακαδημαϊκής αριστείας Grant EDUD-7824-021007-ΗΠΑ (Α Pertsemlidis) από την Sun Microsystems. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Το υλικό υπολογιστών υψηλών επιδόσεων που παρέχονται από την Ακαδημαϊκή Αριστεία Grant από την Sun Microsystems. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Η πακλιταξέλη είναι ένας παράγοντας μικροσωληνίσκων στόχευση αρχικά απομονώθηκε από την κωνοφόρων

Taxus brevifolia

– το δέντρο πουρνάρι έχει μια μακρά ιστορία των φαρμακευτικών χρήσεων [1] – και χρησιμοποιείται ευρέως για τη θεραπεία ανθρώπινων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του πνεύμονα. Για NSCLC, αντίσταση στην πακλιταξέλη είναι κοινό, με ποσοστά ανταπόκρισης που κυμαίνονται από 21% έως 24% [2], [3]. Μηχανισμοί για τέτοια αντίσταση περιλαμβάνουν υπερ-έκφραση της Ρ-γλυκοπρωτεΐνης, μεταβολές στην σύνθεση της τουμπουλίνης, και οι μεταλλάξεις σε β-τουμπουλίνης [4], [5], [6], [7]. Μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι μια μεγάλη ομάδα γονιδίων που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη που ανήκει σε ένα ευρύ φάσμα λειτουργικών κατηγοριών είναι δυνητικά εμπλέκονται στην ρύθμιση της αντίστασης paclitaxel στη θεραπεία του καρκίνου [8]. Ο εντοπισμός των μηχανισμών που ρυθμίζουν την έκφραση των βασικών γονιδίων που εμπλέκονται στην αντίσταση πακλιταξέλη θα προωθήσει προσπάθειες για να ξεπεραστεί αυτή η αντίσταση στη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα.

Είμαστε ενδιαφέρονται για την ενδεχόμενη εμπλοκή του microRNAs (miRNAs) στη ρύθμιση της απόκρισης paclitaxel σε θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα. miRNAs είναι σύντομες, 19 έως 23 νουκλεοτιδίων RNAs βρίσκονται σε πολλαπλούς οργανισμούς που ρυθμίζουν την έκφραση του γονιδίου σε μεγάλο βαθμό με τη μείωση των επιπέδων του αγγελιοφόρων RNA στόχου [9], [10] και έχει αποδειχθεί ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της ένα ευρύ φάσμα παθολογικών διαδικασιών, συμπεριλαμβανομένων παθογένεση του καρκίνου. επίπεδα miRNA μπορεί εύκολα να χειριστεί με τη χρήση συνθετικών μορίων RNA. Ένα χημικώς σταθεροποιημένη, μονόκλωνο μόριο RNA συμπληρωματικό σε ένα στόχο miRNA δρα ως ένας αναστολέας και μειώνει τα επίπεδα της ενδογενούς του miRNA. Αντιστρόφως, ένα μόριο RNA διπλής έλικας με ένα κλώνο πανομοιότυπη σε αλληλουχία με ένα ώριμο miRNA δρα ως μιμητικό της φυσικά απαντώμενης miRNA και αυξάνει την κυτταρική επίπεδα έκφρασης του. Αρκετές μελέτες έχουν διερευνήσει τα θεραπευτικά αποτελέσματα των μιμητικών και αναστολέων miRNA και απέδειξε το δυναμικό αυτών των τάξεων των ολιγονουκλεοτιδίων ως θεραπευτικών μέσων [11], [12], [13], [14], [15], [16].

HSA-miR-337 (miR-337) είναι ένα ανθρώπινο miRNA τόπο που βρίσκεται στο χρωμόσωμα 14q32.2. miR-337-3p εκφράζεται έντονα σε κανονικούς αθανατοποιημένων ινοβλαστών εμβρυϊκού πνεύμονα (IMR-90), και ανιχνεύσιμη σε αθανατοποιημένα ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα (HBECs). Η έκφραση του miR-337-3p σε γραμμές καρκίνου των πνευμόνων, ωστόσο, είναι γενικά χαμηλότερη από ότι στα φυσιολογικά πνεύμονα επιθηλιακών κυτταρικών γραμμών (σχήμα S1). πρόβλεψη Target δείχνει ότι miR-337-3p ρυθμίζει δυνητικά την έκφραση πολλαπλών γονιδίων που έχουν ενοχοποιηθεί στην ογκογένεση. Βρήκαμε ότι miR-337-3p ευαισθητοποιεί καρκινικά κύτταρα πνεύμονα σε αγωγή με πακλιταξέλη, αλλά αναπάντεχα, δεν επηρεάζει σημαντικά τη βιωσιμότητα των κυττάρων και μόνο. Χρησιμοποιήσαμε την περαιτέρω

in vitro

και

in silico

προσεγγίσεις για τον καθορισμό των άμεσων στόχων του miR-337-3p που μεσολαβούν επίδρασή του στην ευαισθησία πακλιταξέλη. Έχουμε διερευνηθούν επίσης τη δυνητική σημασία των miR-337-3p μιμούνται και οι στόχοι της στον καθορισμό της ευαισθησίας πακλιταξέλη σε ένα μεγάλο πίνακα των κυτταρικών σειρών NSCLC, και προκαταρκτικά διερεύνησε τις δυνατότητες του miR-337-3p μιμούνται ως ανοσοενισχυτικό σε θεραπεία πακλιταξέλη

in vitro

σε κυτταρικές σειρές NSCLC.

Υλικά και Μέθοδοι

οι κυτταρικές σειρές

οι κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη ελήφθησαν από το Hamon Κέντρο Θεραπευτικής Ογκολογίας Έρευνας στο UT Southwestern Medical Center. Γραμμές που ξεκινούν με «NCI-Η» καθορίστηκαν στο National Cancer Institute [17], [18]. Γραμμές που ξεκινούν με «HCC» και HBECs έχουν καθοριστεί από την Hamon Κέντρο Θεραπευτικής Ογκολογίας Έρευνας στο UT Southwestern Medical Center [19]. Όλες οι κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα αναπτύχθηκαν σε μέσο RPMI-1640 (Life Technologies, Carlsbad, CA) συμπληρωμένο με 5% ορό εμβρύου μόσχου (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA). HBECs αναπτύχθηκαν σε μέσο GIBCO® KSFM συμπληρωμένο με εκχύλισμα βόειας υπόφυσης και του ανασυνδυασμένου επιδερμικού αυξητικού παράγοντα ανθρώπου (Life Technologies). Όλες οι κυτταρικές γραμμές ήταν DNA λήψη δακτυλικών αποτυπωμάτων χρησιμοποιώντας το GenePrint PowerPlex σύστημα 1.2 (Promega, Madison, WI) και επιβεβαιώθηκε κατά βιβλιοθήκες δακτυλικών αποτυπωμάτων διατηρείται από ATCC και το εργαστήριο Minna /Gazdar, και δοκιμάστηκαν για μόλυνση χρησιμοποιώντας το κιτ ανίχνευσης e-Myco Mycoplasma PCR (Boca Scientific , Boca Raton, FL).

προσδιορισμούς κυτταρικής βιωσιμότητας

ευαισθησία των κυτταρικών σειρών NSCLC στην πακλιταξέλη και δοκεταξέλη μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα τυποποιημένο πρωτόκολλο όπως περιγράφεται στο Zhou et al. [20]. Εν συντομία, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε μορφή 96 φρεατίων, με πακλιταξέλη προστίθενται σε διαφορετικές συγκεντρώσεις μετά από 24 ώρες, ακολουθούμενη από επώαση με φάρμακο για 96 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το One Solution CellTiter 96® Υδατικό Κυττάρου Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού (MTS, Promega). Η επίδραση του miR-337-3p και τους στόχους της, προσδιορίστηκαν με παροδική διαμόλυνση είτε miR-337-3p μιμούνται ή siRNA ολίγο στόχευση συγκεκριμένων γονιδίων. Σε γενικές γραμμές, τα κύτταρα αντίστροφης-επιμολύνθηκαν με τα υποδεικνυόμενα ολιγονουκλεοτίδια σε μορφή 96-φρεατίων και καλλιεργήθηκαν για 72 ώρες, ακολουθούμενη από επώαση με φάρμακα για επιπλέον 72 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το CellTiter 96® Υδατικό One Λύση Κυττάρου Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού (MTS, Promega) ή το CellTiter-Glo φθορισμού κυττάρων Βιωσιμότητας Δοκιμασία (ΑΤΡ, Promega).

Η κυτταρομετρία ροής

Cells επιμολύνθηκαν με τα υποδεικνυόμενα ολιγονουκλεοτίδια σε πλάκες 6 φρεατίων για 48 ώρες, ακολουθούμενη από κατεργασία με είτε πακλιταξέλη ή φορέα για ένα επιπλέον 16 ώρες. Αμφότερες αποκολληθούν και συνδεδεμένα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν στις 1000 rpm για 5 λεπτά. Τα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά με 1Χ PBS (αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό) και στερεώνεται με 1Χ PBS που περιείχε 1 mM EDTA και 85% αιθανόλη στους 4 ° C. Μετά από 1 ώρα, τα κύτταρα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση στις 1400 rpm για 5 λεπτά στους 4 ° C. Τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 1Χ PBS, και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 50 μg /ml ιωδιούχου προπιδίου και 100 μg /ml RNase Α για 30 λεπτά στους 37 ° C. δεδομένα του κυτταρικού κύκλου συλλέχθηκαν σε Cytomics FC 500 κυτταρόμετρο ροής (Beckman Coulter, Brea, CA), με 20.000 γεγονότα που συλλέγονται ανά δείγμα. Τα δεδομένα αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ανάλυσης δεδομένων FlowJo, έκδοση 9.1 (TreeStar, Ashland, OR).

Ποσοτική RT-PCR (qRT-PCR)

έκφραση των miRNAs μετρήθηκε σε ένα ΑΒΙ PRISM 7900 Σύστημα ανίχνευσης αλληλουχίας, χρησιμοποιώντας TaqMan® microRNA δοκιμασίες (Life Technologies) με το RNA έκφραση RNU19 ως ένας εσωτερικός έλεγχος για ομαλοποίηση των RNA φόρτωσης. έκφραση mRNA μετρήθηκε χρησιμοποιώντας TaqMan® Gene Expression Δοκιμασίες με έκφραση GAPDH mRNA ως εσωτερικός έλεγχος. Ελήφθησαν χρόνοι κύκλου Threshold (C

t) και η σχετική έκφραση του γονιδίου υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο συγκριτικής χρόνο κύκλου.

κηλίδες Western

Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας ΝΡ-40 ρυθμιστικό διάλυμα. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία BCA Pierce (Thermo Fisher, Rockford, IL). Για την ηλεκτροφόρηση, ίσες ποσότητες κυτταρολύματος αναλύθηκαν με SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε Immun-Blot PVDF μεμβράνες (Bio-Rad, Hercules, CA). Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν και ανιχνεύθηκαν με τα ακόλουθα αντισώματα: αντι-RAP1A ή αντι-STAT3 (Cell Signaling Technology, Beverly, ΜΑ), ή αντίσωμα κατσίκας αντι-ακτίνης (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Τα δεσμευμένα αντισώματα ανιχνεύθηκαν με δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση (HRP) (Santa Cruz Biotechnology) και οπτικοποιήθηκαν με ενισχυμένη χημειοφωταύγειας (ECL) υπόστρωμα (Thermo Fisher). Σχετική αλλαγές στα επίπεδα πρωτεΐνης ποσοτικοποιείται με πυκνομετρία χρησιμοποιώντας το One λογισμικού Ποσότητα (Bio-Rad).

miRNA πρόβλεψη στόχο

Για την αναγνώριση των κανονιστικών στόχων του miR-337-3p, χρησιμοποιήσαμε το μέθοδος miRmate αναπτύχθηκε στο εργαστήριο μας όπως έχει περιγραφεί προηγουμένως [21]. Εν συντομία, η μέθοδος ανταμοιβές πλήρης συμπληρωματικότητα στις θέσεις 2-8 του miRNA (την περιοχή σπόρος), αναντιστοιχίες και ενθέσεις στο κεντρικό εξόγκωμα στις θέσεις 9-11 του miRNA, κάποια συμπληρωματικότητα στο άκρο 3 ‘, και ειδική σύνθεση ακολουθία στο θέσεις 1 (Α) και 9 (Α ή C) του miRNA, σύμφωνα με τα ευρήματα των Lewis et al. [22].

δοκιμασίες λουσιφεράσης δημοσιογράφος

Το τμήμα του άγριου τύπου (WT) 3’UTRs περιέχει τις προβλεπόμενες θέσεις στόχους του

RAP1A

(NM_002884) και

STAT3

(NM_003150) κλωνοποιήθηκαν προς τα κάτω του λουσιφεράσης cDNA σε pMIR-REPORT (Ambion, Austin, ΤΧ), ένα φορέα που περιέχει και τα δύο cDNAs λουσιφεράση και β-γαλακτοσιδάση υπό τον έλεγχο χωριστών συστημάτων προαγωγέα /τερματιστή θηλαστικού. Τα μεταλλαγμένα κατασκευάσματα (

RAP1A

MU και

STAT3

MU) με τη θέση 3 (το 2

ου νουκλεοτιδίων στην ακολουθία σπόρων στόχο) άλλαξε από G σε Α και τη θέση 1 (αμέσως 3 ‘στην αλληλουχία σπόρος) άλλαξε από Α σε U, έγιναν με την QuikChange τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση Kit (Stratagene, La Jolla, CA). Η δραστικότητα λουσιφεράσης και η δραστικότητα β-γαλακτοσιδάσης μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας το Σύστημα Δοκιμασίας Λουσιφεράσης και β-γαλακτοσιδάσης του συστήματος προσδιορισμού (Promega), αντίστοιχα.

έκφραση mRNA προφίλ

κύτταρα NCI-H1155 επιμολύνθηκαν με ΜΙΚ 337-3p μιμούνται ή αρνητικό μιμούνται τον έλεγχο. Ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας κιτ απομόνωσης mirVana ™ miRNA (Ambion), επισημαίνονται και υβριδοποιήθηκε σε HumanWG-6 V3 BeadChips έκφρασης (Illumina, San Diego, CA) χρησιμοποιώντας τυποποιημένα πρωτόκολλα. Διαφάνειες σαρώθηκαν σε Illumina BeadStation και εντάσεις σήματος συνοψίστηκαν χρησιμοποιώντας BeadStudio v3.3 (Illumina). Αφαίρεσης του φόντου και ποσοστημόριο εξομάλυνση διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο MBCB [23].

Συσχέτιση της έκφρασης με 3’ΙΙΤΡ μοτίβο περιεχόμενο

Η συσχέτιση μεταξύ των μεταβολών στην έκφραση των γονιδίων που προκαλείται από miR-337-3p πάνω -έκφραση και μοτίβο περιεχόμενο 3’UTRs τους αναλύθηκε χρησιμοποιώντας sylamer (https://www.ebi.ac.uk/enright/sylamer), η οποία υπολογίζει σωρευτικές και υπεργεωμετρική σ αξίες που συνδέονται με τις μικρές εμφανίσεις λέξη σε ένα κατετάγη επ μεγαλύτερων ακολουθίες, σε αυτή την περίπτωση περιστατικών 7-μερών σε όλη τη σειρά των REFSEQ 3’UTRs, και με τη χρήση γραμμικής παλινδρόμησης όπως εφαρμόζεται στην miReduce [24], [25]. Για το τελευταίο, κάθε μοτίβο που περιλαμβάνονται στις 3’UTRs θεωρείται ότι συμβάλλει γραμμικά στη στάνη προφίλ της αλλαγής, και miReduce υπολογίζει επαναληπτικά τα μοτίβα που συμβάλλουν περισσότερο. Ο συντελεστής παλινδρόμησης για κάθε μοτίβο μπορεί να είναι θετική ή αρνητική, ανάλογα με το αν η αλληλεπίδραση οδηγεί σε μία καταστολή ή ενεργοποίηση της έκφρασης του γονιδίου-στόχου. Στην περίπτωση των υπερ-εκφράζει ένα miRNA, αναμένουμε οι μεταγραφές περιέχουν μοτίβα συμπληρωματική προς την αλληλουχία σπόρο microRNA να μειωθεί στην έκφραση, έτσι ώστε το μοτίβο θα έχει αρνητικό συντελεστή παλινδρόμησης.

αντίστροφης φάσης Protein Array (RPPA)

προϊόντα λύσης πρωτεΐνης παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας καυτό ρυθμιστικού λύσης (2% SDS? 0,06 Μ Tris-Cl, ρΗ 6.8? 5% γλυκερίνη) με αναστολείς πρωτεϊνάσης και φωσφατάσης (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ ? Santa Cruz Biotechnology) και β-μερκαπτοαιθανόλη προσφάτως πρόσθεσε. Τα προϊόντα λύσης μετουσιώθηκαν με βρασμό για 5 λεπτά με υπερκείμενα που λαμβάνεται με φυγοκέντρηση στις 13.000 rpm για 7 λεπτά στους 4 ° C. Πριν παράταξη σε αντικειμενοφόρες πλάκες, τα προϊόντα λύσης πρωτεΐνης διηθούνται μέσω πλακών ηθμού 96 φρεατίων με 25 μm μεμβράνες πόρου (Phenix Research Products, Candler, NC) για να απομακρυνθούν συσσωματώματα. Ίσες ποσότητες λύματα παρατάσσονται εις τριπλούν για ONCYTE® AVID

TM νιτροκυτταρίνη διαφάνειες ταινία (Γκρέις Bio-Labs, Bend, Oregon) χρησιμοποιώντας ένα SpotArray

TM24 σύστημα εκτύπωσης μικροσυστοιχιών (PerkinElmer, Waltham, ΜΑ) με 55-60 % υγρασία. Για ανοσο-χρώση, τα πλακίδια επωάστηκαν πρώτα σε RT σε ReBlot Plus ήπιο διάλυμα (EMD Millipore, Billerica, ΜΑ) για λιγότερο από 7 λεπτά για να χαλαρώσει τη δομή των πρωτεϊνών και στη συνέχεια πλένονται σε ρυθμιστικό ΤΒδ-Τ μετά επωάστηκαν σε ρυθμιστικό αποκλεισμού Pierce SEA BLOCK (Thermo Fisher), αποκλείστηκαν με αβιδίνη και βιοτίνη (Dako, Glostrup, Denmark), και επωάστηκαν είτε με STAT3 (EMD Millipore) ή pSTAT3 (S727, Cell Signaling Technology) αντίσωμα σε 4 ° C όλη τη νύκτα. Τα πλακίδια στη συνέχεια πλύθηκαν και επωάστηκαν με βιοτινυλιωμένα δευτερογενή αντισώματα (Vector Laboratories, Burlingame, CA) για 30 λεπτά που ακολουθείται από κηλίδωση με Qdot 655-στρεπταβιδίνης συζυγούς (Life Technologies) για 30 λεπτά. Διαφάνειες σαρώθηκαν με ProScanArray μικροσυστοιχιών Scanner (PerkinElmer). επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης ποσοτικά με τη χρήση του λογισμικού και κανονικοποιούνται για τις διαφορές στην πρωτεϊνική φόρτωση με SYPRO Ruby ™ (Life Technologies) σήματα πρωτεΐνη κηλίδα που επιτεύχθηκε σε ένα ξεχωριστό διαφάνεια τυπώνονται στην ίδια παρτίδα MicroVigene ™ (Vigene Tech, Carlisle, ΜΑ).

miRNA προφίλ έκφρασης των δειγμάτων όγκου

10-20 μm πάχους σειριακές τομές από 249 χειρουργικά δείγματα NSCLC (συμπεριλαμβανομένων 172 αδενοκαρκινώματα και 76 καρκινώματα πλακωδών κυττάρων) ελήφθησαν χρησιμοποιώντας κρυοστάτη Leica και ομογενοποιείται χρησιμοποιώντας ένα ομογενοποιητή Omni TH (Omni International, Kennesaw, GA). Ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο TRI (Life Technologies) και ποσοτικά με τη χρήση Nanodrop 1000 φασματοφωτόμετρο (Thermo Fisher). ποιότητα RNA καθορίστηκε σε Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA).

Για την ανάλυση microRNA, τα δείγματα σημαίνονται με τη χρήση του miRNA Πλήρης Σήμανση και Hyb Kit και υβριδοποιήθηκε σε Agilent Ανθρωπίνων miRNA μικροσυστοιχιών έκδοση 3 μάρκες (Agilent Technologies), η οποία περιέχει ανιχνευτές για 866 ανθρώπινων και 89 ιογενής microRNAs του ανθρώπου βάσει της miRBase v12.0 (https://microrna.sanger.ac.uk). Οι υβριδισμοί πραγματοποιήθηκαν σε θαλάμους από ανοξείδωτο χάλυβα SureHyb (G2534A) στους 55 ° C για 22 ώρες, μετά τις οποίες συστοιχίες πλύθηκαν και σαρώνονται χρησιμοποιώντας ένα Agilent DNA Microarray Scanner (Agilent Technologies). τα επίπεδα έκφρασης των miRNAs εξήχθησαν με τη χρήση του λογισμικού Feature Extraction (Agilent Technologies) και υποβάλλονται σε επεξεργασία με το βιομεταβιβαστή [26] πακέτο AgiMicroRna να διορθώσει για το φόντο, αφαιρέστε τον έλεγχο και un-ανιχνεύσιμες ακολουθίες, και ποσοστημόριο εξομαλύνει και να συνοψίσει τα δεδομένα.

Αποτελέσματα

η υπερέκφραση του miR-337-3p ευαισθητοποιεί τα κύτταρα NCI-H1155 στην πακλιταξέλη και ενισχύει την πακλιταξέλη που προκαλείται G

2 /M σύλληψη

για να εξεταστεί η επίδραση της ΜΙΚ 337-3p στην ευαισθησία στην πακλιταξέλη στον καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα, χρησιμοποιήσαμε miR-337-3p μιμούνται (Dharmacon) για να αυξηθεί miR-337-3p επίπεδα σε κύτταρα ΝΟΙ-H1155, μια κυτταρική γραμμή καρκίνου του πνεύμονα που χαρακτηρίζεται ως μετρίως ανθεκτικό σε πακλιταξέλη σε προηγούμενο μελέτη [8]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, miR-337-3p υπερ-έκφραση ευαισθητοποιεί σημαντικά τα κύτταρα σε αγωγή πακλιταξέλη, μειώνοντας την IC

50 – που ορίζεται ως η συγκέντρωση η οποία οδηγεί σε μείωση κατά 50% της βιωσιμότητας των κυττάρων – από 27.27 ηΜ (95% CI 25,97 – 28,90) με ολίγο ελέγχου 14.60 nM (95% CI 14,08 – 15,15) με miR-337-3p μιμούνται (p & lt? 0,0001). Στη συνέχεια εξετάσαμε τη δόση-εξάρτηση του αποτελέσματος του miR-337-3p την ευαισθησία πακλιταξέλη και η βιωσιμότητα των κυττάρων με επιμόλυνση κυττάρων NCI-H1155 με διαφορετικές συγκεντρώσεις είτε miR-337-3p μιμούνται ή ελέγχου ολίγο ακολουθούμενη από κατεργασία με είτε 16 ηΜ paclitaxel ή φορέα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Β, miR-337-3p μιμούνται ευαισθητοποιεί σημαντικά τα κύτταρα σε πακλιταξέλη σε σχέση με το ολίγο ελέγχου σε συγκεντρώσεις τόσο χαμηλές όσο 0.5 ηΜ (p = 0,0168), αλλά δεν μειώνει σημαντικά την βιωσιμότητα των κυττάρων εν απουσία πακλιταξέλης σε συγκεντρώσεις ακόμη και τόσο υψηλές όσο 200 ηΜ. Για να αξιολογηθεί περαιτέρω η ρύθμιση της απόκρισης paclitaxel από miR-337-3p, εξετάσαμε την επίδραση της miR-337-3p αδρανοποίηση την ευαισθησία πακλιταξέλη σε H1155 κυττάρων. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 1Γ, αδρανοποίηση του miR-337-3p με αναστολέα miR-337-3p μειώνει σημαντικά την απόκριση του H1155 να αγωγή με πακλιταξέλη, με σχετική βιωσιμότητα των κυττάρων αυξάνεται κατά 17,81 ± 5,31% (ρ & lt? 0,0001), σε σχέση με τον έλεγχο oligos.

(Α) δοσο-εξαρτώμενο αποτέλεσμα της πακλιταξέλης στη βιωσιμότητα των κυττάρων παρουσία ή απουσία του miR-337-3p μιμούνται. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό MTS. (*, Ρ & lt? 0,05? **, Ρ & lt? 0,01? ***, Ρ & lt? 0,001? Ns, μη σημαντική) (Β) Η βιωσιμότητα των κυττάρων ως συνάρτηση της συγκέντρωσης ολίγο παρουσία ή απουσία του paclitaxel. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό συγκέντρωσης ΑΤΡ. (Γ) η επίδραση των miR-337-3p νοκ ντάουν με αναστολέα miR-337-3p (50 nm) σε ευαισθησία πακλιταξέλη σε H1155 κυττάρων. Ορατή είναι η σχετική βιωσιμότητα των κυττάρων υπό την παρουσία 16 ηΜ paclitaxel κανονικοποιούνται για τον έλεγχο oligos. (****, Ρ & lt? 0,0001) (D) Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου ως συνάρτηση του miR-337-3p υπερέκφραση και πακλιταξέλη θεραπεία. Το κλάσμα των κυττάρων σε G

1, S και G

2 φάσεις εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας τη ρεαλιστική μοντέλο Watson, με την αναλογία G

2 έως G

1 κλάσματα για κύτταρα επεξεργασμένα πακλιταξέλη κανονικοποιούνται με εκείνο παρατηρήθηκε για τις συνθήκες ελέγχου (R = [G

2 /G

1]

paclitaxel /[G

2 /G

1]

φορέα).

Η

Ταξάνες δεσμεύονται στον β υπομονάδα της τουμπουλίνης και αναστέλλουν τις κανονικές δυναμική των μικροσωληνίσκων αποσυναρμολόγηση, που οδηγεί σε σταθεροποιημένο μικροσωληνίσκους και παρατεταμένη σύλληψη των κυττάρων στο G

2 /M φάση του κυτταρικού κύκλου και τελικά σε κυτταρικό θάνατο [27 ], [28]. Συγκρίναμε την επίδραση της miR-337-3p υπερ-έκφραση επί του κυτταρικού κύκλου, με ή χωρίς αγωγή με πακλιταξέλη, σε ένα χρονικό σημείο (16 ώρες) πριν από την επαγόμενη από την πακλιταξέλη σημαντική απόπτωση. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1ϋ, με την παρουσία του paclitaxel, miR-337-3p μιμούνται επάγει μια δραματική G

2 /M σύλληψη, με μία κανονικοποιημένη G

2 /G

1 αναλογία R = 4,38, σε σχέση με το R = 2,48 για τον ολίγο ελέγχου, R = 2,34 για miR-337-5p μιμούνται, και R = 2,31 για mock επιμόλυνση, ενώ miR-337-3p δεν επηρεάζει τη διανομή του κυτταρικού κύκλου σε απουσία του paclitaxel.

Τα παραπάνω αποτελέσματα δείχνουν ότι το miR-337-3p ρυθμίζει την ευαισθησία πακλιταξέλη σε κύτταρα NCI-H1155 από ειδικά την ενίσχυση των κυττάρων σύλληψη στο G

2 /M φάση του κυτταρικού κύκλου, χωρίς να επηρεάζει σημαντικά την επιβίωση των κυττάρων και μόνο. ​​

ανάλυση της σειράς Expression αναφέρει ότι πολλά από τα προβλεπόμενα στόχους του miR-337-3p τα κάτω-ρυθμίζονται σε επίπεδο mRNA από miR-337-3p υπερέκφραση

για να αναζητήσετε εκτενώς για τον στόχο γονίδια που διαμεσολαβούν την επίδραση του miR-337-3p την ευαισθησία paclitaxel κυττάρων NCI-H1155, έχουμε προφίλ γονιδιακής έκφρασης με μικροσυστοιχιών για τον εντοπισμό μεταγραφές που ρυθμίζονται προς τα κάτω από miR-337-3p υπερ-έκφραση, αφού αυξανόμενες ενδείξεις δείχνουν ότι miRNAs ρυθμίζουν την έκφραση του γονιδίου-στόχου μέσω της μείωσης των επιπέδων του mRNA [29]. Το μέγεθος του miR-337-3p υπερ-έκφραση (Σχήμα 2Α) είναι συγκρίσιμη με τις διαφορές στην ενδογενή έκφραση που παρατηρείται σε διάφορους ιστούς και μεταξύ IMR-90 ινοβλαστών εμβρύου πνεύμονα και HBECs (Σχήμα S1). Δεδομένου ότι οι περισσότεροι πρόσφατες μελέτες υποστηρίζουν τέλεια συμπληρωματικότητα μεταξύ 7-μερή στην περιοχή σπόρου (που καλύπτει τις θέσεις 1-8) μιας ώριμης miRNA με αλληλουχίες στο 3’UTR της μεταγραφής mRNA ως καθοριστικό παράγοντα της αλληλεπίδρασης μεταξύ ενός miRNA και ενός γονιδίου στόχου [30], [31], αξιολογήσαμε τη συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης και το περιεχόμενο μοτίβο μεταγραφών mRNA με βάση την εμφάνιση του 7-μερή σε 3’UTRs τους. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Β, σημαντικά περισσότερο από τα 1211 γονίδια που περιέχουν το 7-μερές UAUAGGA συμπληρωματική προς την miR-337-3p αλληλουχία σπόρος – βάσεις 2-8, θεωρείται ότι είναι η ισχυρότερη καθοριστικός παράγοντας της miRNA: αλληλεπίδρασης στόχου – μείωση της έκφρασης από αύξηση (p = 1,37 × 10

-2), μεταξύ των οποίων 32 γονίδια μειώνουν ≥2 φορές και μόνο το 3 γονίδια που αυξάνουν ≥2 φορές (Σχήμα 2D). Σε αντίθεση, κατά προσέγγιση ίσους αριθμούς των 19.262 γονιδίων που δεν περιέχει την μείωση 7-μερές και αύξηση στην έκφραση. Επιπλέον, τα στοιχεία 2Γ και 2Δ δείχνουν ότι μεταξύ των 16.384 7-Mer μοτίβα που εμφανίζονται στα 3’UTRs των μεταγραφών ανθρώπινης mRNA, αρκετές υπερεκπροσωπούνται στα 3’UTRs των γονιδίων που μειώθηκε σε κύτταρα παροδικά επιμολυσμένα με miR-337-3p μιμούνται σε σχέση προς ένα αρνητικό μιμητικό ελέγχου (Σχήμα 2C), με μόνο 10 μοτίβα που δείχνει μια σημαντική αρνητική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης του mRNA και η παρουσία τους σε 3’UTRs (Σχήμα 2D). 5 από τα μοτίβα αντιστοιχούν στην περιοχή σπόρο ενός γνωστού miRNA (MIR-337-3p), εκ των οποίων 1 μοτίβο που αντιστοιχεί στις βάσεις 2-8 και 4 αντιστοιχούν στις θέσεις 1-7 και 2-7, σύμφωνα με τις πρόσφατες εργασίες όσον αφορά την περιοχή των σπόρων αγώνες [30], [31]. Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε ότι ένα μοτίβο (GUAGGAA) περιέχει ένα G: U ζεύγη βάσεων στη θέση 7, γεγονός που υποδηλώνει ότι οι καθοριστικοί παράγοντες των στόχων miRNA μπορεί να περιλαμβάνουν μη-Watson: Crick συμπληρωματικότητα. Εικόνα 2Ε δείχνει ότι, αν και πολλά από τα γονίδια-στόχους που προσδιορίζονται από τις 5 μοτίβα επικαλύπτονται, τα επιπλέον 4 μοτίβα προσδιορίσει μοναδικά στόχους. Συνολικά, τα παραπάνω αποτελέσματα δείχνουν ότι ένας σημαντικός αριθμός γονιδίων που περιέχουν πιθανές θέσεις miR-337-3p στόχος είναι κάτω-ρυθμίζονται από miR-337-3p σε επίπεδο mRNA και την ανάδειξη της αξίας μιας συνολικής αναζήτηση για τους στόχους των miRNAs με βάση 7- mer συμπληρωματικότητα στην περιοχή του σπόρου.

(Α) Τα επίπεδα έκφρασης του miR-337-3p μετά από 72 ώρες επιμόλυνση των κυττάρων NCI-H1155 με 50 nM miR-337-3p μιμούνται όπως μετράται από qRT-PCR. (Β) Ιστόγραμμα των μεταβολών στο επίπεδο έκφρασης του mRNA ως συνάρτηση του miR-337-3p υπερ-έκφραση. Οι μπάρες σε μαύρο δείχνουν σχετικές συχνότητες των παρατηρούμενων log

2 αλλαγές φορές για όλα τα γονίδια, ενώ οι ράβδοι με κόκκινο χρώμα δείχνουν την κατανομή των γονιδίων με 3’UTRs που περιέχουν τουλάχιστον ένα 7-μερές που αντιστοιχεί στο miR-337-3p σπόρων περιοχή. (Γ) Το οικόπεδο τοπίο σημασία για την 7-μερή σε όλες γονίδια, ταξινομημένα με αλλαγή στην έκφραση, από την πιο μειώθηκε σε πιο αυξημένες, δείχνοντας 7-μερή που είναι εντόνως εμπλουτισμένο σε 3’UTRs γονιδίων που μειώνονται στην έκφραση. (Δ) Η συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του mRNA και το περιεχόμενο μοτίβο 3’UTRs προκαλείται από miR-337-3p υπερ-έκφραση. Ορατή είναι: (1) το μοτίβο 7-μερές, τονίζεται για να δείξει συμπληρωματικότητα ως προς miR-337-3p, (2) ο συντελεστής παλινδρόμησης, (3) την τιμή ρ, (4) τον αριθμό των γονιδίων που περιέχουν το μοτίβο, (5 ) η miRNA στην οποία αντιστοιχεί ο μοτίβο, με τις θέσεις νουκλεοτιδίων πλήρως συμπληρωματικά προς τις αλληλουχίες που επισημαίνονται στη στήλη 1 δείχνεται εντός παρενθέσεων, και ο αριθμός των γονιδίων που (6) μείωση της έκφρασης ή (7) αύξηση στην έκφραση κατά ≥2 φορές . Στη στήλη 6, ο αριθμός των γονιδίων που περιέχουν την αναγραφόμενη μοτίβο, αλλά δεν περιέχουν την κανονική miR-337-3p αλληλουχίας στόχου σπόρων, δίνεται σε παρένθεση. διάγραμμα (Ε) Αναλογική Venn δείχνει τη σχέση μεταξύ των γονιδίων που μειώνουν ≥2 φορές σε έκφραση και περιέχουν ένα ή περισσότερα από τα πέντε 7-μερή που αντιστοιχούν στις ώριμες miR-337-3p αλληλουχίες.

Η

STAT3

και

RAP1A

είναι οι άμεσοι στόχοι που διαμεσολαβούν την επίδραση του miR-337-3p την ευαισθησία πακλιταξέλη

Μεταξύ των γονιδίων κάτω-ρυθμίζονται από miR-337-3p ,

RAP1A

και

STAT3

, τα οποία είναι ρυθμισμένα προς τα κάτω κατά 60% και 63% κατά miR-337-3p υπερ-έκφραση, αντίστοιχα, και οι δύο προβλέπεται να είναι άμεσοι στόχοι του ΜΙΚ 337-3p (Σχήμα 3Α) και δυνητικά εμπλέκονται στη ρύθμιση της ευαισθησίας paclitaxel. Για την επικύρωση αυτών των αλληλεπιδράσεων, κατασκευάσαμε φορείς αναφοράς λουσιφεράσης που περιέχουν τα αγρίου τύπου 3’UTRs του

STAT3

και

RAP1A

και οι αντίστοιχες 3’UTRs ελέγχου με μεταλλάξεις στο πρώτο και τρίτο νουκλεοτίδια του στόχου αλληλουχίες θέσης (Σχήμα 3Α), το οποίο έχει αποδειχθεί ότι είναι κρίσιμη σε διατάραξη miRNA: αλληλεπιδράσεις στόχου [22]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Β, miR-337-3p υπερ-έκφραση μειώθηκε σημαντικά δραστικότητα λουσιφεράσης σε κύτταρα που εκφράζουν τα 3’UTRs άγριου τύπου σε σύγκριση με απουσία 3’UTR ή μεταλλαγμένες 3’UTRs, αποδεικνύοντας ότι miR-337-3p αλληλεπιδρά άμεσα με συγκεκριμένες περιοχές στις 3’UTRs του

STAT3

και

RAP1A

. Η Εικόνα 3C δείχνει ότι η επίδραση του miR-337-3p στα επίπεδα έκφρασης του mRNA των δύο γονιδίων συνδέεται με ρύθμιση προς τα κάτω των ενδογενών επιπέδων έκφρασης πρωτεΐνης σε κύτταρα H1155. Εξετάσαμε περαιτέρω την επίδραση του miR-337-3p υπερέκφραση στα επίπεδα STAT3 και RAP1A σε H1993, μια κυτταρική γραμμή NSCLC που ορίζεται ως πακλιταξέλη ανθεκτικό, με απροσδιόριστο IC

50. Όπως και με H1155 κύτταρα, miR-337-3p επίσης ρυθμίζει προς τα κάτω τα επίπεδα STAT3 και RAP1A σε mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης σε H1993 κύτταρα, όπως φαίνεται στο Σχήμα 3D. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το miR-337-3p έχει μια γενική ρυθμιστική επίδραση στην STAT3 και έκφραση RAP1A στα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα.

(Α) miR-337-3p και προέβλεψε την αλληλεπίδρασή του με τις περιοχές στόχου στο

RAP1A

και

STAT3

. Παρουσιάζονται οι δομές και αλληλουχίες του miRNA: αλληλεπιδράσεις στόχος για miR-337-3p και οι 3’UTRs του

RAP1A

και

STAT3

, και την προβλεπόμενη ελεύθερη ενέργεια της υβριδοποίησης. Η ακολουθία σπόρος επισημαίνονται με κόκκινο χρώμα. Οι βάσεις μεταβάλλονται με κατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση υπογραμμισμένες. δοκιμασία ανταποκριτή (Β) λουσιφεράσης. κύτταρα NCI-H1155 συν-επιμολύνθηκαν με τα υποδεικνυόμενα ολιγονουκλεοτίδια και τους φορείς αναφοράς λουσιφεράσης. Λουσιφεράση και β-γαλακτοσιδάσης μετρήθηκαν μετά από 72 ώρες, με δραστικότητα λουσιφεράσης ομαλοποιήθηκε για δραστικότητα β-γαλακτοσιδάσης. (Γ) έκφραση του

RAP1A

και

STAT3

επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης μετά από 72 ώρες από την επιμόλυνση των κυττάρων NCI-H1155 είτε με 50 ηΜ miR-337-3p, 25 ηΜ siRNA που κατευθύνεται έναντι κάθε των γονιδίων ή αρνητικός ολίγο ελέγχου. Που παρουσιάζονται είναι μέσος όρος των αποτελεσμάτων qRT-PCR τριών ανεξάρτητων επιμολύνσεων και αντιπροσωπευτικές εικόνες κηλίδας Western και ποσοτικοποίηση των εντάσεων μπάντας. (D)

RAP1A

και

STAT3

mRNA και η έκφραση της πρωτεΐνης σε κύτταρα NCI-H1993. *, P & lt? 0,05? **, P & lt? 0,01? *** P & lt?. 0.001

Η

Για να αξιολογηθεί κατά πόσον

STAT3

και

RAP1A

διαμεσολαβούν την επίδραση του miR-337-3p την ευαισθησία πακλιταξέλη, εμείς γκρέμισε κάθε γονίδιο ξεχωριστά και τα δύο μαζί. Το Σχήμα 4Α δείχνει ότι η εξουδετέρωση του

STAT3

και

RAP1A

αύξησε την ευαισθησία των κυττάρων NCI-H1155 στη θεραπεία paclitaxel σε σύγκριση με ολιγονουκλεοτίδια ελέγχου, αλλά δεν επηρέασε σημαντικά την επιβίωση των κυττάρων εν απουσία του paclitaxel . Ο συνδυασμός των δύο siRNAs στο μισό η συγκέντρωση οδηγεί σε μεγαλύτερη μείωση στην βιωσιμότητα των κυττάρων από ό, τι παρατηρήθηκε με είτε μόνο του siRNA (p = 0,017 για

RAP1A

και p = 0,041 για

STAT3

), γεγονός που υποδηλώνει ότι η συνδυασμένη knockdown έχει συνεργιστική επίδραση στην απόκριση paclitaxel (Σχήμα 4Β). Επιπλέον, το Σχήμα 4C δείχνει ότι η εξουδετέρωση του

STAT3

ή

RAP1A

ενισχύει σημαντικά την G

2 /M σύλληψης πακλιταξέλη θεραπεία σε σύγκριση με ολίγο ελέγχου, με τα τυποποιημένα G

2 /G

1 αναλογίες R = 3,02 και Κ = 3,70, αντίστοιχα, σε σχέση με το R = 1,93 για τους ελέγχους και συγκρίσιμα με R = 4,37 για επιμόλυνση με το miR-337-3p μιμούνται.

( Α) Επίδραση της εξουδετέρωσης του

RAP1A

και

STAT3

έκφρασης με siRNA στη βιωσιμότητα των κυττάρων υπό την παρουσία και απουσία του paclitaxel. Εμφανίζονται με κόκκινο χρώμα είναι η βιωσιμότητα των κυττάρων σε 16 nM πακλιταξέλη κανονικοποιούνται για τη βιωσιμότητα σε φορέα ως συνάρτηση αυξανόμενων συγκεντρώσεων των siRNAs ενάντια

RAP1A

ή

STAT3

. Φαίνεται στο μαύρο είναι η κυτταρική βιωσιμότητα σε απουσία του paclitaxel. (Β) Επίδραση των συνδυασμένων νοκ ντάουν του

RAP1A

και

STAT3

την ευαισθησία πακλιταξέλη. Ορατή είναι η σχετική βιωσιμότητα κυττάρου παρουσία 16 ηΜ paclitaxel κανονικοποιημένη για τον έλεγχο oligos. (Γ) εξόντωση STAT3 και RAP1A ενισχύει paclitaxel επαγόμενη G

2 /M συλλήψεως, όπως μετράται με κυτταρομετρία ροής. Η αναλογία (R) του G

2 έως G

1 κλάσματα που επάγεται από την αγωγή με πακλιταξέλη προσδιορίστηκε όπως παραπάνω. (D) Cell βιωσιμότητα ως συνάρτηση της συγκέντρωσης ολιγο (MIR-337-3p μιμούνται ή αρνητικό μιμούνται έλεγχος) με την παρουσία κύστη-. *, Ρ & lt?. 0.05

Η

Αύξηση απόδειξη υποστηρίζει την εφαρμογή αναστολέων STAT3, όπως κύστη-, ως θεραπευτικοί παράγοντες στη θεραπεία διαφόρων καρκίνων. Συνεπώς δοκιμάστηκε το αποτέλεσμα του miR-337-3p υπερ-έκφραση για την απόκριση των κυττάρων NCI-H1155 στη θεραπεία με κύστη-, η κυτταροτοξικότητα του οποίου βασίζεται τουλάχιστον εν μέρει επί της αναστολής της δραστικότητας STAT3 [32], [33]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4D, miR-337-3p μιμούνται ευαισθητοποιεί τα κύτταρα να κύστη-, μειώνοντας το IC

50 από 1,14 μΜ (95% CI 01.03 – 01.28) στο 0,37 μΜ (95% CI 0,33 – 0,42) (p & lt? 0,0001), υποδεικνύοντας ότι η στόχευση τόσο

STAT3

έκφρασης με miR-337-3p μιμούνται και STAT3 ενεργοποίηση με κύστη- έχει συνεργιστική επίδραση στην επιβίωση των καρκινικών κυττάρων, και υποδηλώνει ότι το miR-337-3p μπορεί επίσης να χρησιμεύσει ως ανοσοενισχυτικό σε αναστολείς STAT3.

miR-337-3p ευαισθητοποιεί τις δύο κυτταρικές σειρές πακλιταξέλη-ευαίσθητη και πακλιταξέλη-ανθεκτικά, καθώς και εκείνων που προέρχονται από διαφορετικές ιστολογικές υποτύπους

για να δοκιμαστεί η γενικότητα της επίδρασης της