Αφηρημένο

Ιστορικό

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει μειωμένα επίπεδα έκφρασης του let -7 στους όγκους των πνευμόνων. Αλλά λίγα είναι γνωστά για την έκφραση ή μηχανισμούς ας-7α στον καρκίνο του προστάτη. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε in vitro και in vivo προσεγγίσεις να ερευνήσει εάν E2F2 και CCND2 είναι άμεσοι στόχοι της ας-7α, και αν αφήσουμε-7α δρα ως καταστολέας των όγκων στον καρκίνο του προστάτη από τα κάτω ρύθμιση E2F2 και CCND2.

Μεθοδολογία /Principal

τα ευρήματα σε πραγματικό χρόνο RT-PCR κατέδειξε ότι μειωμένα επίπεδα ας-7α υπάρχουν σε εκτομή δείγματα καρκίνου του προστάτη και κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη. Ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός παρεμποδίστηκε σε κύτταρα PC3 και LNCaP κύτταρα μετά την επιμόλυνση με let-7α. Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου έδειξε ότι αφήνω-7α που προκαλείται διακοπή του κυτταρικού κύκλου στο /G1 φάση S. Μια δοκιμασία ρεπόρτερ διπλής λουσιφεράσης έδειξε ότι η 3’UTR του E2F2 και CCND2 ήταν άμεσα συνδεδεμένο με αφήσει-7α και κηλίδωση Western ανάλυση έδειξε περαιτέρω ότι αφήνω-7α κάτω-ρυθμίζεται η έκφραση E2F2 και CCND2. Τα μοντέλα μας ξενομόσχευμα καρκίνου του προστάτη επιβεβαίωσαν την ικανότητα της ας-7α να αναστέλλει την ανάπτυξη των όγκων του προστάτη in vivo.

Συμπεράσματα /Σημασία

Τα ευρήματα αυτά βοηθούν να διαλευκάνουν τις αντι-πολλαπλασιαστικές μηχανισμούς ας-7α στον καρκίνο του προστάτη. Ας-7a μπορεί επίσης να είναι νέα θεραπευτική υποψήφιος για τον καρκίνο του προστάτη δεδομένης της ικανότητάς του να επάγει αναστολή του κυτταρικού κύκλου και αναστέλλουν την ανάπτυξη των κυττάρων, ειδικά σε ορμόνες καρκίνο του προστάτη ανθεκτικού

Παράθεση:. Dong Q, Meng Ρ, Wang Τ , Qin W, Τσιν W, Wang F, et al. (2010) microRNA Ας-7α αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του προστάτη

In Vitro

και

In Vivo από

Στόχευση E2F2 και CCND2. PLoS ONE 5 (4): e10147. doi: 10.1371 /journal.pone.0010147

Επιμέλεια: Syed A. Αζίζ, Health Canada, Καναδάς

Ελήφθη: 9 Μάρ 2010? Αποδεκτές: 23 Μαρ 2010? Δημοσιεύθηκε: 14 του Απριλίου του 2010

Copyright: © 2010 Dong et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Πρόγραμμα βασικής Έρευνας της Κίνας, 2009CB521705? και το Ίδρυμα Φύση Επιστημών της Κίνας, 30672097. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, η συλλογή και ανάλυση δεδομένων, την απόφαση να δημοσιεύσει

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν αντικρουόμενα συμφέροντα

Εισαγωγή

τα microRNAs (miRNAs) είναι ενδογενή, μη-κωδικοποίησης μικρά RNAs 20-25 νουκλεοτίδια σε μήκος [1], τα οποία διαδραματίζουν σημαντικό ρυθμιστικό ρόλο μέσω της δωρεάν σύνδεσης του 3 ‘αμετάφραστες περιοχές (UTRs) του στόχου γονίδια. Δεσμευτική ως αποτέλεσμα την αποικοδόμηση του mRNA στόχου και την αναστολή της μετάφρασης [2]. Πολλές miRNAs συνδέονται με τον καρκίνο, και εμπλέκονται στην ανάπτυξη των κυττάρων, τη διαφοροποίηση, τον πολλαπλασιασμό, και κυτταρικό θάνατο [3]. Πολλές αναφορές έχουν δείξει ότι miRNAs μπορεί να είναι χρήσιμη για τη διάγνωση και τη θεραπεία [4] του καρκίνου. ας-7 εντοπίστηκε για πρώτη φορά σε

Caenorhabditis elegans

[5]. Είναι σχεδόν μη ανιχνεύσιμο στο εμβρυακό στάδιο της ανάπτυξης, αλλά γίνεται πιο άφθονη σε μεταγενέστερα στάδια της ανάπτυξης [6]. Προηγούμενη εργασία έχει δείξει μειωμένα επίπεδα έκφρασης του let-7 σε όγκους του πνεύμονα σε σύγκριση με φυσιολογικό ιστό πνεύμονα. ας-7 επιβραδύνει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό κατά τα κάτω ρύθμιση των ογκογονιδίων RAS /c-MYC και HMGA-2 στο μεταφραστικό επίπεδο [7], [8]. Οι ίδιες όγκου κατασταλτική λειτουργίες έχουν επίσης αναφερθεί για let-7 στον καρκίνο του παχέος εντέρου [9].

Στο silico

αναλύσεις των πιθανών στόχων ας-7α (www.targetscan.org andwww.microrna .org) αποκαλύπτουν ότι τόσο E2F2 και CCND2 είναι οι πιθανοί στόχοι ας-7α. E2F2 και CCND2 είναι ρυθμιστές του κυτταρικού κύκλου και ανώμαλη έκφραση από αυτούς μπορεί να οδηγήσει σε ανώμαλη κυτταρικό πολλαπλασιασμό. προκαταρκτικά πειράματα μας δείχνουν ότι τα επίπεδα της πρωτεΐνης τόσο E2F2 και CCND2 τα πάνω ρυθμισμένα στην κυτταρική σειρά καρκίνου προστάτη PC3. Λίγα είναι γνωστά για την έκφραση ή μηχανισμούς ας-7α στον καρκίνο του προστάτη. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε

in vitro

και

in vivo

προσεγγίσεις να ερευνήσει εάν E2F2 και CCND2 είναι άμεσοι στόχοι της ας-7α, και αν αφήσουμε-7α δρα ως καταστολέας των όγκων στον προστάτη καρκίνο από τα κάτω ρύθμιση E2F2 και CCND2.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Όλα τα δείγματα ελήφθησαν από ασθενείς που υπέγραψε ενημερωμένη συγκατάθεση για την έγκριση της χρήσης των ιστών τους για την έρευνα σκοπούς μετά την επέμβαση. Η κλινική παθολογικοί παράγοντες του 26 ασθενών είχαν έδειξε στον πίνακα S1. Η χρήση ανθρώπινων ιστών στη μελέτη αυτή εγκρίθηκε από το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review της τέταρτης Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο και ήταν σύμφωνη με τις κατευθυντήριες γραμμές τους (αριθ 2008039085). Όλα τα πειράματα με ζώα διεξήχθησαν σύμφωνα με το νόμο περί προστασίας των ζώων και εγκριθεί από Φροντίδας Ζώων και Χρήση Επιτροπή της Τέταρτης Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο. (Αριθμός έγκρισης 200,804,052,353).

καλλιέργεια κυττάρων και ιστών συλλογή

καρκινικές κυτταρικές σειρές ανθρώπινου προστάτη LNCap, DU145, PC3, και PrEC (προστάτη επιθηλιακά κύτταρα) και ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά κύτταρα HEK293A ελήφθησαν από American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 (Gibco) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό ορό-ορό και πενικιλίνη (100 U /ml). Οι καλλιέργειες διατηρήθηκαν υπό ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2 (Forma Scientific). Είκοσι έξι προσφάτως εκτομή δείγματα καρκίνου του προστάτη και των παρακείμενων μη οιδηματώδης δείγματα τους συλλέχθηκαν από το Τμήμα Ουρολογίας σε Xi’jing Hospital. Τα δείγματα καταψύχθηκαν αμέσως σε υγρό άζωτο και διατηρήθηκε εκεί μέχρι τη χρήση.

κατασκευή πλασμιδίου και την επιμόλυνση των κυττάρων

Ας-7a ενισχύθηκε και καθαρίστηκε με miRNA κιτ απομόνωσης (Invitrogen, Carlsbad, CA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. PCR εκκινητές για ας-7α ήταν:

5′-GAATTCTCACACAGGAAACCAGGA-3 ‘

(προς τα εμπρός) και

5′-CTGCAGTCAGGCATTTAAGTGACCG-3′

(αναστροφή). Ας-7α προϊόντα PCR κλωνοποιήθηκαν στο

Eco RI

/

Pst

Ι θέση κλωνοποίησης του πλασμιδίου pcDNA3 που περιέχει πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP) για να σχηματίσει το πλασμίδιο pcDNA3-ας-7α-GFP . διαμόλυνση των κυττάρων πραγματοποιήθηκε με Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα PC3 απλώθηκαν σε έξι φρεατίων και αναπτύχθηκαν χωρίς αντιβιοτικά σε 70-90% συρροή. Κάθε πηγάδι έλαβε 6 μΐ αντιδραστηρίου λιποφεκταμίνης περιέχει 3 μg πλασμιδίου DNA. Τρία πηγάδια έλαβαν pcDNA3-ας-7α-GFP πλασμίδιο ενώ τα άλλα φρεάτια έλαβαν το κενό φορέα, pcDNA3-GFP. G418 (400 μg /ml) προστέθηκε σε κύτταρα 24 ώρες μετά την επιμόλυνση. Μικτά κλώνοι υποβλήθηκαν σε διαλογή και καλλιεργήθηκαν για επιπλέον 4 εβδομάδες. PC3 κύτταρα επιμολυσμένα με let-7α ορίστηκαν ως PC3-ας-7α-GFP, ο αρνητικός έλεγχος (κύτταρα επιμολυσμένα με τον άδειο φορέα) ορίστηκε ως PC3-GFP. PC3 κύτταρα επιμολύνθηκαν επίσης με 30 ηΜ συνθετικών ας-7α (μιμείται), και συνθετικά αρνητικός miRNAs ελέγχου (NC). Τέλος, ένα συνθετικό ας-7α-αναστολέα ακολουθία και συνθετικά ας-7α-αναστολέα αρνητικού ελέγχου (αναστολέας NC). Ακολουθίες των συνθετικών HSA-ας-7α, αρνητικός έλεγχος, αναστολέας HSA-ας-7α και αναστολέα αρνητικού ελέγχου έδειξε Κείμενο S1.

Σύνολο εκχύλισης RNA και σε πραγματικό χρόνο RT-PCR

Για ας-7α, ολικό RNA εκχυλίστηκε από τα δείγματα με χρήση miRNeasy Mini Kit (Qiagen). cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας TaqMan Reverse microRNA Transcription Kit (Applied Biosystems). Real-time RT-PCR πραγματοποιήθηκε με κιτ TaqMan microRNA Δοκιμασία (Applied Biosystems). Το έναυσμα για την αφήνω-7α ήταν

5′-GAGGTAGTAGGTTGTATA-3 ‘.

Για E2F2 και CCND2, συνολική RNA εκχύλιση και σε πραγματικό χρόνο RT-PCR πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του κιτ SYBR® πιο πράσινη ™ δύο σταδίων (Invitrogen, Carlsbad, CA). Εκκινητές PCR για E2F2 ήταν:

5′-GAGCTCACTCAGACCCCAAG-3 ‘

(προς τα εμπρός) και

5′-AACAGGCTGAAGCCAAAAGA-3′

(αναστροφή). Εκκινητές PCR για CCND2 ήταν:

5′-AAGAATTCCTCCTCAATAGCCTGCAGCAGTA-3 ‘

(προς τα εμπρός) και

5′-GCGGGATATCGACCTGTGAGAATTCGAT-3′

(αναστροφή). Όλα τα πρωτόκολλα διεξήχθησαν σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή. Το επίπεδο έκφρασης των let7a ομαλοποιήθηκε σε RNU6B. Το επίπεδο έκφρασης του E2F2 και CCND2 ομαλοποιήθηκαν για GAPDH. Real-time RT-PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση 7500 σύστημα πραγματικού χρόνου RT-PCR (Applied Biosystems). PCR διεξήχθη υπό τις ακόλουθες συνθήκες: 50 ° C για 2 λεπτά, 95 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 50 κύκλους στους 95 ° C για 15 s, και 60 ° C για 1 λεπτό. Κάθε δείγμα εις τριπλούν.

ΜΤΤ Δοκιμασία

κύτταρα PC3 και LNCaP κύτταρα επιμολυσμένα με είτε NC ή αφήστε-7α (μιμείται), ή NC αναστολέα και ας-7α αναστολέα απλώθηκαν σε 96 -Καλά πλάκες σε 1 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο. Βιώσιμα κύτταρα μετρήθηκαν 1, 2, 3, 4, και 5 ημέρες μετά την επιμετάλλωση. Μετά την επώαση με 3- (4, 5-διμεθυλοθειαζολυλ-2) -2, βρωμιούχο 5-διφαινυλτετραζόλιο (ΜΤΤ), τα κύτταρα λύθηκαν σε 150 μΐ 100% διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) και UV-ορατή απορρόφηση μετρήθηκε στα 490 nm με τη χρήση ο αναγνώστης πλάκας 96-φρεατίων. Κάθε δείγμα εις τριπλούν.

μαλακό άγαρ

δοκιμασία

Σε συντομία, 2 ml 0.5% agar προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο ενός 12 φρεατίων. Πωλείται PC3-ας-7α-GFP και τα κύτταρα PC3-GFP αναμίχθηκαν με το εναιώρημα topagarose (τελική συγκέντρωση 0,3%), και στη συνέχεια τα κύτταρα επιστρώθηκαν επί του υποστρώματος αγαρόζης 0,5%. Ο αριθμός των εστιών & gt? 100 μm μετρήθηκαν μετά από 18 ημέρες. Κάθε πείραμα διεξήχθη εις τριπλούν.

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

κύτταρα PC3 και LNCaP κύτταρα επιμολυσμένα με είτε NC ή αφήστε-7α (μιμείται), ή αναστολέας NC ή ας-7α αναστολέα συλλέχθηκαν 72 h μετά την επιμόλυνση, πλύθηκε με ψυχρό αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) και σταθεροποιήθηκαν σε 1 ml 70% αιθανόλης. Μετά από ολονύκτια επώαση στους 4 ° C σε αιθανόλη, τα κύτταρα πλύθηκαν σε PBS και αιωρήθηκαν σε 500 μΙ ιωδιούχου propidine (ΡΙ) 30 λεπτά πριν από την κυτταρομετρία ροής. Πληθυσμοί σε G0-G1, S και G2 φάση-M μετρήθηκαν με κυτταρομετρία ροής (EPICS XL, Coulter, Miami FL) και τα δεδομένα αναλύθηκαν με τη χρήση Multicycle-DNA Cycle κυττάρων αναλύονται Λογισμικού. Η μέτρηση πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν.

Dual-λουσιφεράσης δοκιμασία ρεπόρτερ

Για να διερευνηθεί αν η έκφραση E2F2 και CCND2 ρυθμίζονταν από ας-7α, μια δοκιμασία διπλής λουσιφεράσης εκτελέστηκε. Το 3′-UTR του CCND2 και E2F2 ενισχύθηκαν με PCR, αντίστοιχα. Ενίσχυση της CCND2 χρησιμοποιούνται τα ακόλουθα εναύσματα:

5′-GAATTCATGAGTTCTTCGTACTGG-3 ‘

(προς τα εμπρός) και

5′-GATATCCCATCATGAT GAGGATAC-3′

(αναστροφή). Τα προϊόντα της PCR ήταν 398 bp και περιείχε δύο θέσεις πρόσδεσης για το let-7. Το μεταλλαγμένο 3′-UTR του CCND2 συντέθηκε μετά σημειακές μεταλλάξεις έγιναν σε διάφορες βάσεις εντός των θέσεων δέσμευσης αυτών των PCR προϊόντων. Ενίσχυση του 3′-UTR του E2F2 χρησιμοποίησε τις ακόλουθες αλληλουχίες εκκινητή:

5′-GAATTCCTCTTCGACTCCTACGAC-3 ‘

(προς τα εμπρός) και 5

‘ – GATATCTGTGCTTCTT GGTACGTCG-3 ‘

(αντίστροφο). Τα προϊόντα της PCR ήταν 415 bp και περιείχε δύο θέσεις πρόσδεσης για ας-7α. Μεταλλαγμένα 3′-UTR του E2F2 συντέθηκαν μετά από αρκετές σημειακές μεταλλάξεις έγιναν στις θέσεις δέσμευσης των προϊόντων της PCR. Μετά την πέψη περιορισμού, ενισχυμένα γονίδια κλωνοποιήθηκαν στις αντίστοιχες θέσεις μίας ανακατασκευασμένης φορέα έκφρασης pGL3. Ο φορέας ελέγχου ρΡΙ_-ΤΚ που εκφράζουν λουσιφεράση της Renilla (Promega) χρησιμοποιήθηκε για ομαλοποίηση του αριθμού κυττάρων και την αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης. Συμμετασκευές συνθετικών ας-7α αλληλουχία (μιμητικά) και NC, ή ας-7α αναστολέα και αναστολέα NC πραγματοποιήθηκαν επίσης σε ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά κύτταρα HEK293A χρησιμοποιώντας lipofectamine 2000 (Invitrogen). δραστηριότητα πυγολαμπίδας και Renilla λουσιφεράσης προσδιορίστηκε με Διπλό σύστημα προσδιορισμού Pikkagene λουσιφεράσης (Toyo-Β-Net)

κηλίδωση Western ανάλυση

Τα ακόλουθα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν για western αποτύπωση:. ποντικού αντι-E2F2 ( 1:200 αραίωση, Santa Cruz Biotech)? ποντικού αντι-cdk4 και ποντικού αντι-κυκλίνης D2 (1:300 αραίωση? BD Biosciences, San Jose, CA)? ποντικού αντι-K-RAS (1:300 αραίωση? Cell Signaling Technology, Beverly, ΜΑ)? κουνελιού αντι-β-ακτίνης (1:4000 αραίωσης, Sigma). Είκοσι πέντε μικρογραμμάρια των δειγμάτων καρκίνου του προστάτη και πρωτεΐνη παρακείμενες μη οιδηματώδης δειγμάτων τους, καθώς και PC3-ας-7α-GFP και πρωτεΐνη PC3-GFP υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε 10% μινιπηκτές SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε Hybond C μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (Amersham Life Science, Buckinghamshire, Ηνωμένο Βασίλειο). Μετά από επώαση με πρωτογενή αντισώματα στους 4 ° C όλη τη νύχτα, οι μεμβράνες της νιτροκυτταρίνης πλύθηκαν τρεις φορές με αλατόνερο ρυθμισμένο με Tris Tween-20 (TBST) και στη συνέχεια επωάστηκαν με fluorecein ισοθειοκυανική (FITC), συζευγμένης, κατσίκα αντι-ποντικού ή κατσίκας αντι-κουνελιού IgG (1:500 αραίωση, Sigma) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από πλύση με TBST, τα στυπώματα εμφανίσθηκαν με τη χρήση του συστήματος Οδύσσεια υπερύθρων απεικόνισης (LI-COR Bioscience, Lincoln, Nebraska USA). Κάθε δοκιμασία επαναλήφθηκε τρεις φορές.

Ογκογονικότητα

Πέντε γυμνοί ποντικοί εγχύθηκαν υποδορίως με ~ 1 × 10

6 PC3-ας-7α-GFP ή κύτταρα PC3-GFP σε ένα ενιαίο θέση της πλάτης. Το βάρος του όγκου και του βάρους του ποντικού μετρήθηκαν κατά το χρόνο της θυσίας (4 εβδομάδες μετά την ένεση). Κηλίδωση Western διεξήχθη για να διερευνηθεί αν E2F2 και CCND2 ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω σε μοντέλο ξενομοσχεύματος γυμνού ποντικού. αιωρήματα όγκου υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης και κηλίδωση Western έγινε σύμφωνα με τις διαδικασίες που περιγράφονται παραπάνω.

Στατιστική ανάλυση

Οι διαφορές μεταξύ κάθε ομάδας προσδιορίζεται με τη δοκιμή Τ ή Mann-Whitney

U

δοκιμή με τη χρήση του στατιστικού SPSS πακέτο λογισμικού (SPSS Inc, Chicago) (

σ

& lt? 0,05 θεωρήθηκε ως σημαντική).

Αποτελέσματα

Ας-7α κάτω ρυθμίζονται σε εκτομή δείγματα καρκίνου του προστάτη και στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη

σε πραγματικό χρόνο RT-PCR αποκάλυψε ότι τα επίπεδα έκφρασης ας-7a μειώθηκαν κατά ~43% σε εκτομή δείγματα ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη σε σύγκριση με το γειτονικό μη -cancerous δείγματα. Οι κυτταρικές γραμμές καρκίνου του προστάτη LNCap εκφράζονται μόνο ~ 70% ως ας-7α από τα φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα του προστάτη PrEC. Επιπλέον, το ποσό της έκφρασης let-7 στα κύτταρα PC3 και DU-145 ήταν περίπου 50% αυτού που παρατηρείται στην PrEC. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι ας-7a μειώνεται σε καρκίνο του προστάτη, περιλαμβανομένης της ανδρογόνο-ανεξάρτητων καρκίνων PC3 (Εικ. 1, *

ρ

& lt? 0,05? **

ρ

& lt? 0,01) .

σε πραγματικό χρόνο RT-PCR δείχνουν ότι η σχετική έκφραση ας-7a σε είκοσι έξι δείγματα καρκίνου του προστάτη, και σε καρκινικές κυτταρικές σειρές προστάτη LNCap, PC3, DU-145 είναι υψηλότερη από ότι σε γειτονικό τους μη-καρκινικές δειγμάτων και η κανονική επιθηλιακών κυττάρων προστάτη PrEC. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως επί τοις εκατό της μέσης σήματα σε ιστούς και κύτταρα από τρεις ανεξάρτητες μετρήσεις. RNU6B μετρήθηκε παράλληλα και χρησιμοποιείται για την κανονικοποίηση του επιπέδου έκφρασης ας-7α σε κάθε πείραμα. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέσο και οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν την SEM. (*

p & lt?

0.01, **

p & lt?

0,01? Έλεγχος Mann-Whitney-U).

Η

Ας-7α αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων

in vitro

και προκαλεί διακοπή του κυτταρικού κύκλου στη G0-G1 φάση

Μετά την επιμόλυνση, το επίπεδο έκφρασης της αφήνω-7a σε PC3-ας-7α-GFP ήταν ~ 300% υψηλότερο σε σχέση με PC3-GFP με πραγματικού χρόνου RT-PCR? Μία δεκαπλάσια αύξηση στην έκφραση του ας-7α παρατηρήθηκε σε κύτταρα PC3 επιμολυσμένα με let-7α (μιμείται) έναντι εκείνων που επιμολύνθηκαν με NC (Σχήμα 2Α,

ρ

& lt?. 0.01). Αυτό έδειξε ότι επιμόλυνσης κατάλληλα διεξαχθεί. ανάλυση σχηματισμός αποικίας έδειξε ότι η ικανότητα σχηματισμού αποικιών των κυττάρων PC3-ας-7α-GFP είναι -40% μικρότερη από εκείνη των κυττάρων ελέγχου (Σχήμα 2Β,

ρ & lt?.

0,01). καμπύλες ανάπτυξης ΜΤΤ έδειξαν ότι από τη δεύτερη ημέρα, η επιβίωση των ας-7α επιμολυσμένα κύτταρα PC3 και LNCaP κύτταρα είναι σημαντικά μικρότερη από εκείνη του αρνητικού μάρτυρα, και η επιβίωση των ας-7α αναστολέα επιμολυσμένα κύτταρα PC3 και LNCaP κύτταρα είναι σημαντικά περισσότερο από ότι της NC αναστολέα επιμολυσμένα κύτταρα (Σχήμα 2C,

p & lt?.

0.05). Η κυτταρομετρία ροής έδειξε ότι το ποσοστό των ας-7α επιμολυσμένα κύτταρα PC3 και LNCaP κύτταρα στη G0-G1 φάση ήταν -30% (PC3) και 16% (LNCaP) υψηλότερη από εκείνη του αρνητικού μάρτυρα, η οποία παράλληλα με ~ 50% ( PC3) και 20% (LNCaP) μείωση στη φάση S. το ποσοστό των ας-7α αναστολέα επιμολυσμένα κύτταρα PC3 και LNCaP κύτταρα στη G0-G1 φάση ήταν ~ 23% (PC3) και 19% (LNCaP) μικρότερη από εκείνη του NC αναστολέα επιμολυσμένα κύτταρα, τα οποία παράλληλα με ~ 33% (PC3 ) και 25% (LNCaP) αύξηση στη φάση S (Σχήμα 2D, *

σ

& lt?. 0,05? **

σ

& lt? 0,01). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι αφήνω-7α αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό PC3 επάγοντας διακοπή του κυτταρικού κύκλου στην G1 /S φάσης.

(A) Σχετική έκφραση ας-7a σε κύτταρα PC3 επιμολυσμένα με pcDNA3-GFP, pcDNA3-γράμ- 7α-GFP, NC, και αφήστε-7α (μιμείται). RNU6B μετρήθηκε παράλληλα και χρησιμοποιείται για την κανονικοποίηση του επιπέδου έκφρασης ας-7α σε κάθε πείραμα. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέσες τιμές από τρία ξεχωριστά πειράματα και οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν την SEM. (**

σ

& lt? 0,01? Mann-Whitney-

U

δοκιμή). (Β) PC3-ας-7α-GFP και τα κύτταρα PC3-GFP καλλιεργήθηκαν σε μέσο που περιέχει μαλακό άγαρ και επωάζονται για 18 d. Μετρήθηκαν 100 μm? Ο αριθμός των εστιών & gt. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέσες τιμές από τρία ξεχωριστά πειράματα και οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν την SEM. (*

σ

& lt? 0,01? Mann-Whitney-

U

δοκιμή). (Γ) Η βιωσιμότητα των κυττάρων PC3 και LNCaP κύτταρα, τα οποία μορφομετατρέπονται με ας-7α, NC ή αναστολέα ας-7α, αναστολέας NC μετρήθηκε με προσδιορισμούς ΜΤΤ αντίστοιχα. UV-ορατή απορρόφηση μετρήθηκε στα 490 nm. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέσες τιμές από τρία ξεχωριστά πειράματα και οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν την SEM. (*

σ

& lt? 0,05? Τεστ Τ Αξιόπιστες-δείγμα). (Δ) Ανάλυση του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα PC3 μετά επιμολυσμένα με NC και αφήστε-7α (μιμείται) ή αναστολέα NC και αφήστε-7α αναστολέα, καθώς και ανάλυση του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα LNCaP μετά επιμολυσμένα με NC και αφήστε-7α (μιμητικά ) ή αναστολέα NC και ο αναστολέας ας-7α. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέσες τιμές από τρία ξεχωριστά πειράματα και οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν την SEM. (*

σ

& lt? 0,05, **

σ

& lt? 0,01? Mann-Whitney-

U

δοκιμή).

Η

Ας 7α στόχους 3’UTR του E2F2 και CCND2

Σχήμα 3Α δείχνει τις αλληλουχίες των 3 ‘UTRs του E2F2 και CCND2 που αντιπροσωπεύουν τις θέσεις πρόσδεσης για το αφήνω-7α. Οι αντίστοιχες αλληλουχίες των μεταλλαγμένων 3 ‘UTRs του E2F2 και CCND2 δείχνονται επίσης. Καμία μείωση της δραστηριότητας της λουσιφεράσης παρατηρήθηκε σε κύτταρα επιμολυσμένα με HEK293A ας-7α (μιμείται) και οι μεταλλαγμένες CCND2 ή E2F2. Αλλά μείωση μεγαλύτερη από 30% της δραστικότητας λουσιφεράσης παρατηρήθηκε με άγριου τύπου CCND2 και μείωση -50% της δραστικότητας λουσιφεράσης παρατηρήθηκε με άγριου τύπου E2F2 (Σχήμα 3Β, **

ρ

& lt?. 0.01). Σε σύγκριση με αναστολέα NC, δεν υπάρχει σημαντική διαφορά στη δραστικότητα λουσιφεράσης όταν τα κύτταρα HEK293A επιμολύνθηκαν με τον αναστολέα ας-7α και άγριου τύπου CCND2 ή E2F2 (Σχ. 3C). Αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν ότι E2F2 και CCND2 είναι άμεσοι στόχοι της ας-7α και ενδογενή ας-7a σε HEK293A δεν έχει καμία ανάμειξη με την εμπειρία μας.

(Α) θέσεων δέσμευσης στο E2F2 και CCND2 για ας-7α με την αντίστοιχη μεταλλαγμένες αλληλουχίες E2F2 και CCND2. (Β) Σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης των κυττάρων ανθρώπινου εμβρυϊκού νεφρού HEK293A μετά από επιμόλυνση με NC ή ας-7α (μιμείται) και στη συνέχεια, επίσης συν-επιμολύνθηκαν με φορέα αναφοράς pRL-ΤΚ, ή ο φορέας έκφρασης που περιέχει είτε pGL3 WT-CCND2-3’UTR ή mut-CCND2-3’UTR ή WT-E2F2-3’UTR ή mut-E2F2-3’UTR. (C) Σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης των κυττάρων ανθρώπινου εμβρυϊκού νεφρού HEK293A μετά από επιμόλυνση με αναστολέα NC ή ας-7α αναστολέα και επίσης συν-επιμολυσμένα με τον φορέα ελέγχου pRL-ΤΚ, ή τον φορέα έκφρασης που περιέχει είτε pGL3 WT-CCND2-3’UTR ή WT-E2F2-3’UTR. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέσες τιμές από τρία ξεχωριστά πειράματα και οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν την SEM. (**

σ

& lt? 0,01? Mann-Whitney-

U

δοκιμή).

Η

Ας-7α αναστέλλει την έκφραση του E2F2, CCND2

σε πραγματικό χρόνο RT-PCR δείχνει ότι το mRNA σχετική έκφραση E2F2 και CCND2 στον προστάτη καρκινικούς ιστούς και σε LNCaP, PC3 και DU-145 κύτταρα είναι προς τα πάνω ρυθμισμένα σε σύγκριση με παρακείμενες μη-καρκινικές δειγμάτων τους και τα κύτταρα PrEC (Σχ. 4Α, Β, *

σ

& lt? 0,05? **

σ

& lt? 0,01). Αλλά σε σύγκριση με PrEC, η έκφραση του mRNA της E2F2 και CCND2 ρυθμίζονται προς τα κάτω μετά από επιμολυσμένα με αφήσει-7α στο PC3 και LNCaP κύτταρα (Σχήμα 4C, D, *

σ

& lt?. 0,05? **

σ

& lt? 0,01). Western blotting αποτελέσματα έδειξαν καμία μεταβολή της έκφρασης πρωτεΐνης CDK4 μεταξύ ιστών καρκίνου του προστάτη και των παρακείμενων μη ογκογόνους ιστούς τους ή μεταξύ PC3-ας-7α-GFP κύτταρα και τα κύτταρα PC3-GFP, τα επίπεδα έκφρασης του E2F2, CCND2 αυξήθηκε σε προστάτη καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με παρακείμενες μη ογκογόνους ιστούς τους, αλλά τα επίπεδα έκφρασης του E2F2, CCND2, και k-ras μειωθεί δραματικά σε κύτταρα PC3-ας-7α-GFP σε σύγκριση με εκείνη σε κύτταρα PC3-GFP (Σχ. 4Ε). K-RAS, μία προηγουμένως καθορισμένο μοριακό στόχο του ας-7a [7] χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος για τα πειράματα αυτά. Αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν ότι η 7α ας-κάτω-ρύθμιση της έκφρασης του mRNA του E2F2 και CCND2 και καταστέλλουν πρωτεΐνη μετάφραση από αυτά.

(Α) σε πραγματικό χρόνο RT-PCR δείχνουν ότι σχετικό επίπεδο έκφρασης σε προστάτη E2F2 καρκινικούς ιστούς και LNCaP, PC3 και DU-145 κύτταρα είναι πολύ υψηλότερο από ό, τι σε γειτονικές μη καρκινικά δείγματα και τα κύτταρα PrEC (*

σ

& lt? 0,05, **

σ

& lt? 0,01 ? Mann-Whitney-

U

δοκιμή). (Β) σε πραγματικό χρόνο RT-PCR δείχνουν ότι σχετικό επίπεδο έκφρασης CCND2 σε προστάτη καρκινικούς ιστούς και LNCaP, PC3 και DU-145 κύτταρα είναι πολύ υψηλότερο από ό, τι σε παρακείμενες μη καρκινική δειγμάτων τους και τα κύτταρα PrEC (*

p

& lt? 0,05? Mann-Whitney-

U

δοκιμή). (C) σε πραγματικό χρόνο RT-PCR δείχνουν ότι το σχετικό επίπεδο έκφρασης E2F2 σε LNCaP και PC3 κύτταρα είναι λιγότερο από ό, τι στα κύτταρα PrEC μετά επιμολυσμένα με αφήσει-7α (*

σ

& lt? 0,05, ** em

σ

& lt? 0,01? Mann-Whitney-

U

δοκιμή). (D) σε πραγματικό χρόνο RT-PCR δείχνουν ότι το σχετικό επίπεδο έκφρασης CCND2 σε LNCaP και PC3 κύτταρα είναι λιγότερο από ό, τι στα κύτταρα PrEC μετά επιμολυσμένα με αφήσει-7α (*

σ

& lt? 0,05? Mann-Whitney-

U

δοκιμή). Όλες οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέσο από τρία ξεχωριστά πειράματα και οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν την SEM. GAPDH μετρήθηκε παράλληλα και χρησιμοποιείται για την κανονικοποίηση των επιπέδων έκφρασης του E2F2 και CCND2 σε κάθε πείραμα. (Ε) κηλίδωση Western δείχνουν ότι καμία αλλαγή της έκφρασης CDK4 μεταξύ ιστών καρκίνου του προστάτη και των παρακείμενων μη-καρκινικές δειγμάτων τους, ή μεταξύ των PC3-ας-7α-GFP κύτταρα και κύτταρα PC3-GFP. Τα επίπεδα έκφρασης του E2F2 και CCND2 είναι υψηλότερη σε ιστούς καρκίνου του προστάτη από ό, τι σε παρακείμενες μη καρκινικά δείγματα τους. Μετά από επιμολυσμένα με αφήσει-7α, τα επίπεδα έκφρασης του E2F2, CCND2, και k-ras μειώθηκε δραματικά σε κύτταρα PC3-ας-7α-GFP σε σύγκριση με εκείνη στα κύτταρα PC3-GFP. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ο έλεγχος φόρτωσης.

Η

Ας-7α αναστέλλει την ανάπτυξη όγκων σε γυμνό μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντίκια

Γυμνά ποντίκια που έφεραν PC3-ας-7α-GFP ή ξενομοσχευμάτων PC3-GFP θυσιάστηκαν 4 εβδομάδες μετά τον ενοφθαλμισμό. Οι όγκοι αποκόπηκαν και μετρήθηκαν (Εικ. 5Α). Κηλίδωση Western έδειξε ότι τα επίπεδα έκφρασης του E2F2 και CCND2 μειωθεί δραματικά σε όγκους PC3-ας-7α-GFP σε σύγκριση με όγκους PC3-GFP (Σχ. 5Β). Το βάρος των όγκων PC3-ας-7α-GFP ήταν περίπου 80% ελαφρύτερο από ό, τι οι όγκοι PC3-GFP (Σχήμα 5C,

σ

& lt?. 0.01). Επιπλέον, η αναλογία του βάρους του όγκου /βάρους σώματος σε ποντίκια που φέρουν όγκους PC3-ας-7α-GFP ήταν μόνο ~ 6% του δείκτη από ποντίκια που φέρουν όγκους PC3-GFP (Σχήμα 5D,

ρ

& lt.? 0.01), η οποία παρέχει ισχυρά αποδεικτικά στοιχεία ότι αφήνω-7α μπορεί να αναστείλει την ανάπτυξη του όγκου

in vivo

.

(Α) φωτογραφία εκτομή όγκων 4 εβδομάδες μετά την εμφύτευση. Η άνω σειρά δείχνει όγκοι αποκόπηκαν από ποντικούς που έχουν εγχυθεί με κύτταρα PC3-GFP. Το χαμηλότερο είναι όγκοι αποκόπηκαν από ποντικούς που έχουν εγχυθεί με κύτταρα PC3-ας-7α-GFP. Από τα ποντίκια που ενέθηκαν με PC3 κύτταρα-ας-7α-GFP, κανένας όγκος ανιχνεύθηκε σε ένα ποντίκι και ένα ποντίκι πέθανε 2 ημέρες μετά την ένεση. (Β) Κηλίδωση Western έδειξε ότι η έκφραση του E2F2 και CCND2 μειωθεί δραματικά σε όγκους με εκτομή από ποντίκια PC3-ας-7α-GFP-όγκο-Bearin σε σύγκριση με εκείνους με όγκους PC3-GFP. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος. (Γ) Το βάρος του όγκου και αναλογία (Δ) του βάρους του όγκου /βάρους σώματος προσδιορίστηκαν όταν θυσιάστηκαν τα ποντίκια. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέσο και οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν την SEM. (**

σ

& lt? 0,01? Mann-Whitney-

U

δοκιμή).

Η

Συζήτηση

Η αδυναμία ενός κυττάρου να ρυθμίζουν την ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό είναι ένα ιδιαίτερο χαρακτηριστικό του καρκίνου. Ως κρίσιμη μορίων στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, E2F πρωτεΐνες είναι κατάντη καταρράκτες σηματοδότησης παράγοντα ανάπτυξης. Επηρεάζουν την ανάπτυξη των κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό μέσω της ικανότητάς τους να ρυθμίζουν γονίδια που εμπλέκονται στη κυτταρικού κύκλου εξέλιξης [10], [11]. E2F2 είναι ένα μέλος της E2F οικογένειας παραγόντων μεταγραφής, και να έχει καλά χαρακτηρισμένη ως ρυθμιστής της μετάβασης G1 στην S-φάση [12]. Προηγούμενες εκθέσεις δείχνουν ότι E2F2 έχει ισχυρή ογκογόνο ικανότητα και μπορεί να προωθήσει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Οι κυτταρικές σειρές επιμολύνθηκαν με E2F2 πολλαπλασιάζονται στο διπλάσιο του ποσοστού των κυττάρων ελέγχου [13]. Για τη σωστή εξέλιξη διαμέσου του κυτταρικού κύκλου, δραστικότητα φωσφορυλίωσης των εξαρτώμενων από κυκλίνη κινάσης (Cdk) είναι απαραίτητη. Οι CCNDs εκφράζονται στην πρώιμη G1 φάση και δεσμεύουν CDK4 και CDK6 [14]. Η ενεργοποίηση αυτών των κινασών οδηγεί σε φωσφορυλίωση των άλλων ρυθμιστικών αρχών κρίσιμων κυτταρικού κύκλου όπως η pRb. pRb τότε ενεργοποιεί E2Fs και επιτρέπει την είσοδο S-φάσης. Συνεπώς, παρεκκλίνουσα έκφραση CCND2 και E2F2 θα οδηγήσει σε ανώμαλη κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Η υπερέκφραση του CCND2 αναφέρθηκε σε κοκκιώδη όγκους των ωοθηκών κυττάρου, του καρκίνου του στομάχου και του καρκίνου του παχέος εντέρου [15] – [17]. Ομοίως, προς τα πάνω ρύθμιση του E2F2 βρέθηκε σε αστροκυτώματα διαφορετικών τάξεων [18].

miRNAs ρυθμίζουν μετα-μεταγραφικά γονιδιακή έκφραση μέσω δέσμευσης με την 3’UTR των mRNA στόχου. Η δέσμευση οδηγεί στην υποβάθμιση των mRNA στόχου και μειωμένη μετάφραση των πρωτεϊνών στόχων. δραστηριότητα miRNA επηρεάζει επίσης την έκφραση των γονιδίων που είναι κατάντι του άμεσοι στόχοι και μπορεί να οδηγήσει σε αλλαγές στην παγκόσμια προφίλ έκφρασης πρωτεΐνης. Ως εκ τούτου, miRNAs δυνητικά παίζουν ένα κρίσιμο ρόλο στην εξέλιξη του καρκίνου στον άνθρωπο. Ένα μεγάλο μέρος των αποδείξεων υποστηρίζει ότι παρεκκλίνουσα έκφραση miRNAs εμφανίζεται σε διάφορους τύπους καρκίνου στον άνθρωπο, και σε διάφορα στάδια της εξέλιξης του καρκίνου [19], [20]. ας-7 έχει αναφερθεί ότι δρα ως καταστολέας όγκων σε ορισμένους τύπους καρκίνου, όπως του πνεύμονα και του παχέος εντέρου [9], [21] – [23], και ότι μειωμένα επίπεδα έκφρασης ας-7 συσχετίζεται με φτωχή κλινική πρόγνωση [ ,,,0],24].

Αν και αυτή η συσχέτιση μεταξύ ας-7 έκφρασης και η ασθένεια είναι ισχυρότερη στον πνευμονικό ιστό, όπου ας-7 έκφραση είναι υψηλή, η μελέτη μας διαπιστώνει ότι ας-7 προκαλεί ανωμαλίες του κυτταρικού κύκλου σε καρκίνο του προστάτη κυτταρική γραμμή Λοιπόν. Βρήκαμε ότι το επίπεδο έκφρασης ας-7a ρυθμίζεται προς τα κάτω δραματικά σε γραμμές καρκίνου προστάτη ιστών και κυττάρων. Τα επίπεδα πρωτεΐνης και η έκφραση του mRNA του E2F2 και CCND2 είναι ρυθμισμένα προς τα κάτω σε PC3 και LNCaP κυττάρων μετά από επιμόλυνση με ας-7α. Τα μοντέλα μας ξενομόσχευμα καρκίνου του προστάτη επιβεβαιώνουν, επίσης, μας

in vitro

αποτελέσματα και δείχνουν ότι αφήνω-7α έχει την ικανότητα να αναστέλλει την ανάπτυξη των όγκων του προστάτη

in vivo

. δοκιμασία ρεπόρτερ διπλής λουσιφεράσης μας επαλήθευσε ότι E2F2 και CCND2 είναι άμεσοι στόχοι της ας-7α. Επίσης, άλλα γονίδια που σχετίζονται με τη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου έχουν αναφερθεί να κατασταλεί άμεσα ή έμμεσα από ας-7. Αυτά περιλαμβάνουν CDC34, το οποίο προωθεί την αποδόμηση του εξαρτώμενη από κυκλίνη κινάση (ΟϋΚ) 1Β αναστολέα και CCNA2, το οποίο προωθεί G1-S και μεταβάσεις φάσης G2-M [25]. ίδρυσή μας επεκτείνει την οικογένεια ας-7 στόχους, καθώς και τον προσδιορισμό των μοριακών οδών που επηρεάζονται στον καρκίνο θα μπορούσε περαιτέρω να αποκαλύψει τους μηχανισμούς με τους οποίους ας-7α αναστέλλει την κυτταρική διαίρεση. Αν και πολλά είναι ακόμα να μάθει σχετικά με το ρόλο της αφήνω-7α του προστάτη ογκογένεση του καρκίνου, ας-7α μας προσφέρει ένα νέο τρόπο θεραπείας του καρκίνου του προστάτη μέσω της ικανότητάς του να επάγουν αναστολή του κυτταρικού κύκλου και αναστέλλοντας την ανάπτυξη των κυττάρων.

Συμπληρωματικές πληροφορίες

πίνακα S1.

Κλινική παθολογικοί παράγοντες από τους 26 ασθενείς που χρησιμοποιούνται σήμερα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0010147.s001

(0,08 MB DOC)

Κείμενο S1.

Ακολουθίες των συνθετικών HSA-ας-7α, αρνητικός έλεγχος, HSA-ας-7α αναστολέα και αρνητικό μάρτυρα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0010147.s002

(0,02 MB DOC)

Ευχαριστίες

θα θέλαμε να αναγνωρίσουμε Lijie ίδιος για την εξαιρετική βοήθεια συντακτικής και διορατικές προτάσεις.