Αφηρημένο

Η εξάπλωση των καρκινικών κυττάρων του προστάτη στο μικροπεριβάλλον του μυελού των οστών και ανθεκτικό ευνουχισμό ανάπτυξη είναι βασικά βήματα στην εξέλιξη της νόσου και σημαντικές πηγές της νοσηρότητας. Ωστόσο, η βιολογική σημασία των μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων (MSCs) και του μυελού των οστών που προέρχονται εξωκυττάρια μήτρα (ΒΜ-ECM) σε αυτή τη διαδικασία δεν είναι πλήρως κατανοητός. Ως εκ τούτου, ιδρύθηκε μια

in vitro

μοντέλο μηχανικής ιστών του μυελού των οστών που ενσωματώνει hMSCs και BM-ECM για τη διευκόλυνση της μηχανιστικές μελέτες της επιβίωσης των κυττάρων καρκίνου του προστάτη σε ανδρογόνο εξαντληθεί τα μέσα ενημέρωσης ως απάντηση στην παρακρινείς παράγοντες και BM-ECM. hMSC που προέρχονται από παράγοντες παρακρινικές αυξημένη επιβίωση LNCaP κυττάρων, η οποία ήταν εν μέρει αποδίδεται στην IGFR και σηματοδότηση IL-6. Επιπλέον, BM-ECM αυξημένη LNCaP και την επιβίωση των κυττάρων MDA-PCA-2b σε συνθήκες ανδρογόνων εξαντλημένο, και προκαλείται από χημειοαντίσταση και μορφολογικές αλλαγές στο LNCaPs. Για να προσδιοριστεί η επίδραση της BM-ECM σε κυτταρική σηματοδότηση, εξετάστηκε η κατάσταση φωσφορυλίωσης του 46 κινασών. Αυξήσεις στη φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών οδού που σχετίζονται με ΜΑΡΚ καθώς και παρατεταμένης Akt φωσφορυλίωση παρατηρήθηκαν σε BM-ECM καλλιέργειες σε σύγκριση με καλλιέργειες που αναπτύσσονται σε πολυστυρένιο πλάσμα επεξεργασμένο. Blocking ΜΕΚ1 /2 ή η ΡΙ3Κ οδός οδήγησε σε σημαντική μείωση στην επιβίωση LNCaP όταν καλλιεργούνται σε BM-ECM σε συνθήκες ανδρογόνο εξαντληθεί. Η κλινική σημασία αυτών των παρατηρήσεων προσδιορίστηκε με ανάλυση φωσφορυλίωσης Erk στα ανθρώπινα οστά μεταστατικό καρκίνο του προστάτη σε σύγκριση με μη μεταστατικό καρκίνο του προστάτη, και αυξημένη φωσφορυλίωση παρατηρήθηκε στις μεταστατικές δείγματα. Εδώ περιγράφουμε ένα κατασκευασμένο μοντέλο του μυελού των οστών που μιμείται πολλά χαρακτηριστικά που παρατηρούνται σε ασθενείς και παρέχει μια πλατφόρμα για την μηχανιστική

in vitro μελέτες

Παράθεση:. Lescarbeau RM, SEIB FP, Prewitz Μ, Werner C , Kaplan DL (2012) Ιη Vitro Μοντέλο μετάστασης του καρκίνου των οστών Μυελού Μεσολαβεί προστάτη ευνουχισμός Resistant ανάπτυξη μέσω παρακρινούς και εξωκυτταρικών Matrix Factors. PLoS ONE 7 (8): e40372. doi: 10.1371 /journal.pone.0040372

Επιμέλεια: Subhash Gautam, Henry Ford Health System, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 11 του Απρίλη, 2012? Δεκτές: 7 Ιουνίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 1, Αυγούστου, 2012

Copyright: © Lescarbeau et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας P41 επιχορήγησης EB002520-05 (Tissue Engineering Resource Center) (DL Kaplan). FP SEIB υποστηρίζεται από μια υποτροφία Mildred Scheel Μεταδιδακτορικός από τη γερμανική Καρκίνο Aid. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Το μικροπεριβάλλον του μυελού των οστών παρέχει πολλά ερεθίσματα που επιτρέπουν την επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του προστάτη. Έχει πλέον καθιερωθεί ότι, ειδικότερα, των οστεοβλαστών εκκρίνονται παράγοντες επιτρέπουν ανδρογόνων ανεξάρτητη ανάπτυξη των μετάσταση του καρκίνου του προστάτη κύτταρα [1], [2]. Επιπλέον, μυελό οστών εξωκυτταρικής μήτρας (ΒΜ-ECM) εμπλέκεται στην εξέλιξη άλλων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του πολλαπλού μυελώματος, μέσω της ενεργοποίησης των οδών που σχετίζονται με την επιβίωση [3].

Λόγω της σημαντικής τροπισμό του καρκίνου του προστάτη για μυελό των οστών, πολυάριθμες

in vivo

μοντέλα έχουν αναπτυχθεί για τη μελέτη αυτής της αλληλεπίδρασης. Αυτές περιλαμβάνουν μοντέλα ποντικού ξενομοσχεύματος όπου τα καρκινικά κύτταρα εγχέονται ενδοκνημιακά [4], εξανθρωπισμένα μοντέλα ποντικού όπου τα ανθρώπινα οστά τοποθετείται υποδορίως και κατόπιν σπάρθηκε με κύτταρα καρκίνου προστάτη, υποδόρια εμφύτευση μηχανικής ιστών των οστών [5], και κοίλες ίνες που περιέχουν τόσο τον καρκίνο του προστάτη και οστών, όπως κύτταρα [6]. Αυτές

in vivo

μοντέλα, ωστόσο, είναι χαμηλή απόδοση και ενδεχομένως να υποφέρουν από ξενογονιδιακής αλληλεπιδράσεις. Για να ξεπεραστούν ορισμένα από αυτούς τους περιορισμούς, και να επιτρέψει τη βελτίωση μελέτες διαλογής μηχανιστική και υψηλής απόδοσης, οι ερευνητές χρησιμοποιούν

in vitro

μοντέλα κυτταρικής καλλιέργειας. Μόνο πρόσφατα έχει συμβατική επεξεργασία με πλάσμα πολυστυρένιο (PTP) καλλιέργεια ιστών υγιεινής αντικαταστάθηκαν από υποστρώματα καλλιέργειας που μιμούνται περισσότερο στενά την

in vivo

μικροπεριβάλλον του όγκου. Σε αυτές περιλαμβάνονται μοντέλα που σπουδάζουν παρακρινείς αλληλεπιδράσεις και, πρόσφατα, οι αλληλεπιδράσεις ECM [7], [8], [9]. Ωστόσο, καμία από αυτές τις μελέτες έχουν χρησιμοποιήσει τεχνητή μοντέλο ιστού του μυελού των οστών σε συνδυασμό με ανδρογόνο απεμπλουτισμένου media με το υπόδειγμα ανθεκτικών ευνουχισμό εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη

in vitro.

Η

Η ανάπτυξη και η επιβίωση των κυττάρων καρκίνου του προστάτη σε ανδρογόνα εξαντλημένο συνθήκες έχει αποδοθεί σε μια ποικιλία μηχανισμών. Up-ρύθμιση του υποδοχέα ανδρογόνων επιτρέποντας αυξημένη ευαισθησία, οι μεταλλάξεις που επιτρέπουν αυξημένη ασυδοσία σε άλλα προσδέματα, όπως επίσης και intracrine σύνθεση των ανδρογόνων από τα κύτταρα καρκίνου του προστάτη να συμβάλει στην ανάπτυξη ανεξάρτητο από ανδρογόνα [10]. Άλλες μέθοδοι ανδρογόνων ανάπτυξη ανεξάρτητη περιλαμβάνουν την ενεργοποίηση των οδών μιτογονικής και παράγοντες μεταγραφής όπως ΜΑΡΚ, ΡΙ3Κ, STAT3, και β-κατενίνης [11], [12]. Η ενεργοποίηση αυτών των οδών επιτρέπει ανδρογόνο ανεξάρτητη ανάπτυξη ή την επιβίωση των κυττάρων μέσω συν-ενεργοποίηση του υποδοχέα ανδρογόνων.

Προηγούμενη

in vitro

μελέτες πρότειναν ότι μεμονωμένα συστατικά ECM μπορεί να δρουν ως συνδέτες για να επάγει κυτταρική σηματοδότηση μιτογόνος και την επιβίωση. Για παράδειγμα, ινονεκτίνη, η οποία είναι ένα συστατικό του ΒΜ-ECM, που προκαλείται από ΜΕΚ φωσφορυλίωση μέσω της FAK και Src [13]. Ομοίως, ιντεγκρίνης β1 και οι αλληλεπιδράσεις του IGF-1 R με τη μεσολάβηση ινονεκτίνη χημειοαντίσταση στον καρκίνο του προστάτη κυτταρική γραμμή DU145 [14]. Αυτές οι μελέτες δείχνουν ένα πιθανό ρόλο για συνδέτες BM-ECM ενεργοποιεί οδούς που σχετίζονται με ανδρογόνο ανεξάρτητη ανάπτυξη και την εξέλιξη της νόσου.

συγκαλλιέργειες των ανθρώπινων μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων (hMSCs) και κύτταρα καρκίνου του προστάτη επιτρέπει παρακρινική σηματοδότησης, διεγείρει οστεογένεση, και υποστηρίζει την επιβίωση του καρκίνου του προστάτη. Για πάνελ Α, Β, C ακατέργαστες τιμές ομαλοποιήθηκαν με την αρνητική ομάδα ελέγχου. (Α) hMSCs υπέστησαν αγωγή με φυσιολογικό μέσο ανάπτυξης, LNCaP ρυθμισμένα μέσα, PC3 ρυθμισμένα μέσα, ή οστεογονικές μέσων 14 ημέρες. Αυτά στη συνέχεια χρωματίστηκαν με ερυθρό αλιζαρίνης το οποίο στη συνέχεια εξάγεται και ποσοτικοποιείται για να προσδιοριστεί η εναπόθεση ασβεστίου. (Β) qRT-PCR για τους συγκεκριμένους μεταγραφές. Κάθε ομάδα καλλιεργήθηκε όπως περιγράφεται στο (Α), και στη συνέχεια εκχυλίζεται το RNA. (C) Έμμεση συν-καλλιέργειες ανθρώπινων στρωματικών κυττάρων μυελού με LNCaPs σε ανδρογόνο διαγράφεται μέσα παρουσία του αναστολέα IGFR AG1024, ή αναστολείς IL6, AG490 και αντι-IL6 mAb. Τα κύτταρα απλώθηκαν σε μέσο ανάπτυξης, αφήνονται να αναλάβουν επί 24 ώρες και εν συνεχεία αλλαγή σε ανδρογόνα εξαντλημένο μέσο αναστολέα συν. βιωσιμότητα LNCaP μετρήθηκε μετά από 7 ημέρες. (D) IL6 συγκεντρώσεις σε ρυθμισμένο μέσο καλλιέργειας. (Ε) IGF-1 σε συγκεντρώσεις ρυθμισμένα μέσα μετά από 48 ώρες από κάθε κυτταρικό τύπο καλλιεργήθηκαν μόνο. (* Ρ & lt? 0,05? ** Ρ & lt? 0,01? *** Ρ & lt? 0.001, η = 3, ± SEM).

Η

που προέρχονται από μυελό εξωκυτταρικής μήτρας (ΒΜ-ECM) Bone προστατεύει τον καρκίνο του προστάτη κυττάρων έναντι εξάντληση ανδρογόνων και η χημειοθεραπεία. Για πάνελ Α, Β, C ακατέργαστες τιμές ομαλοποιήθηκαν με την αρνητική ομάδα ελέγχου. (Α) Η ανάπτυξη των κυττάρων LNCaP πάροδο του χρόνου καλλιεργήθηκαν σε ανδρογόνο εξαντλημένο μέσα ενημέρωσης, όπως μετράται μέσω ΜΤΤ. Ίσοι αριθμοί από LNCaPs σπάρθηκαν σε BM-ECM ή PTP με Ν των 4 ανά ομάδα ανά χρονικό σημείο, και προσδιορίστηκαν για την κατάλληλη ημέρα. (Β) MDA-PCA-2bs απλώθηκαν και να μεταφέρονται σε ανδρογόνων διαγράφεται μέσα όπως περιγράφεται στο (Α) και η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε μετά από 4 ημέρες. MDA-PCA-2bs κύτταρα καλλιεργήθηκαν επίσης σε εμπορικές ECM. (C) Cell βιωσιμότητα των κυττάρων LNCaP μετά από 72 ώρες σε μέσο ανάπτυξης με 25 ηΜ docetaxel. (* Ρ & lt? 0,05? ** Ρ & lt? 0,01? *** Ρ & lt? 0.001, η = 3, εκτός όπως σημειώνεται στο (Α), ± SEM)

Η

προερχόμενα από τον μυελό των οστών εξωκυτταρικής μήτρας. (BM-ECM) προκαλεί συμπλέγματος, όπως αύξηση των LNCaPs που αντιστέκεται εξάντληση των ανδρογόνων. LNCaPs σπάρθηκαν σε BM-ECM και PTP όπως περιγράφεται λεπτομερώς στο σχήμα 2Α. μικρογραφήματα σάρωσης ηλεκτρονίων από 7 ημέρες οι καλλιέργειες στο (Α) φυσιολογική μέσα ανάπτυξης και (Β) ανδρογόνων απεμπλουτισμένο media. (C) Ανώτερο σάρωσης μεγέθυνση ηλεκτρονική μικρογραφία LNCaP (μαύρο αστερίσκο) κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε BM-ECM (λευκό αστερίσκο). (Δ) Η κυκλικότητα της LNCaPs σε PTP σε ανδρογόνων εξαντληθεί και μέσο ανάπτυξης και LNCaPs σε BM-ECM στο ανδρογόνων εξαντλημένο μέσο ποσοτικά από τις εικόνες ηλεκτρονικής μικροσκοπίας σάρωσης μετά από 7 ημέρες στην καλλιέργεια (* P & lt? 0,05? ** P & lt? 0,01? * ** Ρ & lt?. 0.001, ± SEM)

Η

Η έκφραση της ανβ3 ιντεγκρίνης επί κυττάρων LNCaP μεσολαβεί πρόσφυση σε μυελό οστών εξωκυτταρικής μήτρας (ΒΜ-ECM). (Α) έκφραση κυτταρικής επιφάνειας της ανβ3 ιντεγκρίνης όπως μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής. (Β) Αντι-ανβ3 ιντεγκρίνης μειωμένη κυτταρική πρόσφυση σε BM-ECM. Πρώτες τιμές ομαλοποιήθηκαν με την ομάδα IgG ελέγχου. (N = 3, * Ρ & lt? 0,05? ** Ρ & lt? 0,01? *** Ρ & lt? 0.001, ± SEM).

Η

Διαφορικό φωσφο-πρωτεομική των κυττάρων LNCaP καλλιεργήθηκαν σε εξωκυτταρικό προερχόμενα από μυελό των οστών μήτρα (BM-ECM). (Α) Ιεραρχική ομαδοποίηση αποκαλύπτει LNCaPs σε BM-ECM στο ανδρογόνων εξαντληθεί μέσα ενημέρωσης συγκεντρωμένα πιο στενά με LNCaPs καλλιεργήθηκαν σε PTP σε μέσο ανάπτυξης (Β) Διαφορικές φωσφορυλίωση LNCaPs σε BM-ECM στο ανδρογόνων εξαντληθεί μέσα ενημέρωσης έναντι LNCaPs σε PTP σε ανδρογόνων εξαντληθεί μέσα μαζικής ενημέρωσης. (C) Διαφορικό φωσφορυλίωση LNCaPs σε PTP σε ανδρογόνων εξαντληθεί μέσα ενημέρωσης έναντι LNCaPs σε PTP σε μέσο ανάπτυξης. (D) Διαφορική φωσφορυλίωση LNCaPs επί ΒΜ-ECM σε ανδρογόνων εξαντλημένο μέσων έναντι LNCaPs για PTP σε μέσο ανάπτυξης.

Η

που προέρχονται από μυελό εξωκυτταρικής μήτρας (ΒΜ-ECM) Bone επάγει απόκλιση σηματοδότηση σε κύτταρα LNCaP ότι μεσολαβεί κυτταρική επιβίωση. Σχήμα πάνελ C, D, E πρώτες τιμές ομαλοποιήθηκαν με την αρνητική ομάδα ελέγχου. (Α) Western στύπωμα της LNCaPs δείχνει αυξημένη φωσφο-Erk1 /2 και φωσφο-p90RSK σε απόκριση σε BM-ECM. (Β) Επίδραση της PI3K, LY294002, ή ΜΕΚ1 /2, U0126, αναστολείς για LNCaPs καλλιεργήθηκαν σε BM-ECM. Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε ίσες πυκνότητες σε BM-ECM ή PTP σε μέσο ανάπτυξης και μετά από 24 ώρες για να ενεργοποιηθεί ανδρογόνων εξαντλημένο media ± αναστολέων. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε μετά από 7 ημέρες (η = 3). (C) Σχετική απόπτωση όπως μετρήθηκε με τη χρήση μίας ανιχνεύσεως αφυδρογονάσης της 6-φωσφορικής γλυκόζης μετά από 72 ώρες. Σαφής γραμμή υποδεικνύει μέσων ανάπτυξης, μαύρες μπάρες ανδρογόνων εξαντληθεί μέσα ενημέρωσης. Λυμένα κύτταρα ένα θετικό μάρτυρα (n = 8). (D) LNCaPs καλλιεργήθηκαν σε PTP έμμεσα με ανθρώπινα στρωματικά κύτταρα μυελού, επί ΒΜ-ECM, ή και στις δύο συνθήκες, ενώ ταυτόχρονα σε ανδρογόνων εξαντλημένο μέσα ενημέρωσης. Σχετική βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε μετά από 7 ημέρες (η = 3, εκτός όπως σημειώνεται στο (D), * Ρ & lt? 0,05? ** Ρ & lt? 0,01? *** Ρ & lt? 0.001, ± SEM). (Ε) Οι μειώσεις των φωσφο-Erk1 /2 σε LNCaP κύτταρα σε BM-ECM όταν έλαβαν θεραπεία με U0126 και LY294002.

Η

Η χρώση για φωσφορυλίωσης Erk σε μικροσυστοιχίες ιστού από δείγματα πρωτογενούς όγκου, και των οστών μεταστατικό δείγματα (Α) Εκπρόσωπος τομές ιστών χρωματίστηκαν για p-Erk από δείγματα πρωτογενούς όγκου του προστάτη. Δείγμα VI περιείχε το μόνο σημαντική θετική χρώση σε δείγματα πρωτογενούς προστάτη. τμήματα (Β) ιστού βάφονται για p-Erk από τα οστά δείγματα μεταστατικό καρκίνο του προστάτη (κλίμακα μπαρ είναι 200 ​​μm).

Η

Η μέση βαθμολογία καταγράφεται για κάθε ομάδα που λαμβάνεται από δύο τυφλές ερευνητές (μαύροι κύκλοι). Χρώση σε τομές μετάσταση οστού είναι σημαντική και για τις δύο τομές φυσιολογικού ιστού και πρωτογενούς όγκου (η = 8 για τον φυσιολογικό ιστό του προστάτη, η = 72 για πρωτογενή όγκο, και η μετάσταση η = 4 οστό, *** Ρ & lt? 0.001, ± std dev.. ).

η

Εδώ παρουσιάζουμε μια

in vitro

πλατφόρμα, η οποία επιτρέπει την αποτελεσματική και ακριβή εξέταση της μικροπεριβάλλον του όγκου του μυελού των οστών, με ιδιαίτερη έμφαση στην BM-ECMs. Χρησιμοποιήσαμε αυτό το σύστημα για την εξέταση της απόκρισης των κυττάρων καρκίνου του προστάτη και ήταν σε θέση να εντοπίζεται πολυάριθμους παράγοντες που συνέβαλαν στην εξέλιξη της νόσου, συμπεριλαμβανομένων των ανδρογόνων ανάπτυξη ανεξάρτητη και χημειοαντίσταση. Οι εντοπίστηκαν παράγοντες που περιλαμβάνονται IGF1 και IL6 σηματοδότησης παρακρινείς, και ενεργοποίηση της οδού ΜΑΡΚ μέσω BM-ECM σηματοδότησης.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια και υπόστρωμα BM-ECM

LNCaP, PC3, και τα κύτταρα MDA-PCA-2b αγοράστηκαν πρόσφατα από την ATCC (Manassas, VA), το οποίο επικυρώνει κυτταρικές σειρές χρησιμοποιώντας ανάλυση STR. αναρρόφησης μυελού των οστών Ολόκληρο ελήφθησαν από την Lonza (Basel, Switzerland), και ανθρώπινα στρωματικά κύτταρα μυελού απομονώθηκαν και χαρακτηρίστηκαν όπως περιγράφεται λεπτομερώς αλλού [15]. Μετά την απομόνωση, hMSCs καλλιεργήθηκαν σε DMEM συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), 1% πενικιλλίνη στρεπτομυκίνη, 0,1 mM μη απαραίτητα αμινοξέα, και 1 ng /ml βασικό αυξητικό παράγοντα ινοβλαστών. LNCaP και PC3 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% FBS, και 1% πενικιλλίνη στρεπτομυκίνη. Ενώ τα κύτταρα MDA-PCA-2b ήταν αναπτύχθηκαν σε μέσο BRFF-HPC1 (Athena ES, Baltimore, MD) συμπληρωμένο με 20% FBS χωρίς πενικιλλίνη στρεπτομυκίνη. Για μελέτες που περιλαμβάνουν ανδρογόνων εξαντληθεί μέσα μαζικής ενημέρωσης, ερυθρό φαινόλης ελεύθερη βάση media χρησιμοποιήθηκε με 10% απογυμνωμένο από ξυλάνθρακα FBS. Έμμεση συν-καλλιέργειες χρησιμοποιούνται 1 μm μέγεθος πόρου ενθέματα transwell (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) με έναν τύπο κυττάρων σπάρθηκαν επί πλάκας καλλιέργειας ιστού και άλλο ένα στο ένθετο κυτταρικής καλλιέργειας. μελέτες έμμεση συν-καλλιέργεια χρησιμοποιείται μια αναλογία 1:01 μέσων από τους δύο τύπους κυττάρων που παρουσιάζουν ενδιαφέρον. Σε ανδρογόνων απεμπλουτισμένο μελέτες παρασκευάστηκαν και οι δύο τύποι μέσων όπως περιγράφεται παραπάνω. Οι κυτταρικές καλλιέργειες διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2. Το οστό που προέρχονται από μυελό ECM δημιουργήθηκε όπως περιγράφεται λεπτομερώς αλλού [16]. Εκτός εάν σημειώνεται αλλιώς όλα τα αντιδραστήρια καλλιέργειας κυττάρων αποκτήθηκαν από την Invitrogen (Carlsbad, CA).

ανδρογόνων μελέτες απεμπλουτισμένου ανάπτυξη

Για ανεξάρτητες μελέτες ανάπτυξης /επιβίωσης των ανδρογόνων, του καρκίνου του προστάτη κύτταρα σπάρθηκαν στα 5,000 κύτταρα /cm

2 σε μέσο ανάπτυξης είτε PTP ή BM-ECM. Μελέτες συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων MDA-PCA-2b, πλάκες ελέγχου PTP επίσης επικαλυμμένα πρώτα με ένα ιδιόκτητο μήτρα προσκόλλησης κυττάρου που περιέχει ινωδονεκτίνη, το κολλαγόνο και αλβουμίνη (Αθηνά ES, Βαλτιμόρη, MD) που διευκολύνουν την προσκόλληση των κυττάρων. Τα κύτταρα αφέθηκαν να προσκολληθούν για 24 ώρες, μετά τις οποίες οι καλλιέργειες πλύθηκαν με PBS, και να μεταφέρονται σε ανδρογόνων εξαντλημένο μέσα ενημέρωσης. LNCaP κύτταρα επί ΒΜ-ECM ή PTP προσδιορίστηκαν όπως περιγράφεται παρακάτω στα αντίστοιχα χρονικά σημεία τους για να ολοκληρωθεί η καμπύλη ανάπτυξης, ή το μέσο αντικαταστάθηκε. κύτταρα MDA-PCA-2b ήταν καλλιέργεια για 4 ημέρες, τα μέσα άλλαξαν σε 2 ημέρες, και οι σχετικοί αριθμοί των κυττάρων αξιολογήθηκε μέσω 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλτετραζόλιο (ΜΤΤ, Invitrogen ) στο τέλος της περιόδου καλλιέργειας ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η εγκυρότητα της δοκιμασίας ΜΤΤ επιβεβαιώθηκε από τη σύγκριση με χειροκίνητη καταμέτρηση και ποσοτικός προσδιορισμός του DNA (Εικ. S1 Α, S1B). αξίες ΜΤΤ κανονικοποιήθηκαν με τον αρνητικό μάρτυρα ο οποίος αυθαίρετα οριστεί στην τιμή του ενός.

Ιντεγκρίνης αποκλεισμού πείραμα

Αναστολή LNCaP κύτταρα προ-επωάστηκαν με ένα μονοκλωνικό αντίσωμα αποκλεισμού κατά της ανβ3 (20 μg /ml), ο κλώνος 23C6 (eBioscience, San Diego, CA), ή IgG ελέγχου ισοτύπου για 30 λεπτά και στη συνέχεια σπέρνονται σε BM-ECM. Μετά από 12 ώρες, το μέσο αναρροφήθηκε και τα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά με PBS. Ο σχετικός αριθμός των κυττάρων μετρήθηκε στη συνέχεια χρησιμοποιώντας μια ΜΤΤ δοκιμασία όπως περιγράφεται παραπάνω.

μελέτες θεραπείας Docetaxel

Ο καρκίνος του προστάτη κύτταρα σπάρθηκαν σε PTP ή BM-ECM όπως περιγράφεται λεπτομερώς παραπάνω και αφέθηκαν να αναρρώσουν για 24 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και αντικαταστάθηκε με μέσο ανάπτυξης συμπληρωμένο με 25 ηΜ ντοσεταξέλη ή όχημα μόνο. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε θεραπεία για 72 ώρες και η σχετική βιωσιμότητα των κυττάρων στη συνέχεια μετρήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία ΜΤΤ, η οποία κανονικοποιήθηκε όπως στις προηγούμενες δοκιμασίες ΜΤΤ.

δοκιμασίες ELISA

Για να συλλέξει δείγματα ρυθμισμένων μέσων κάθε κυτταρικού τύπου σπάρθηκε σε PTP και συν-καλλιέργειες διεξάγονται χρησιμοποιώντας Transwell ένθετα με ανθρώπινα στρωματικά κύτταρα μυελού για PTP και LNCaP κύτταρα εμβολιάζονται στα ένθετα. Προσαρμοσμένα μέσα από κάθε ομάδα απομακρύνθηκε κάθε 48 ώρες και αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο. Τόσο IL6 και κιτ IGF-1 ELISA διεξήχθησαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (eBioscience και R &? D Systems, αντίστοιχα). Το πείραμα διεξήχθη εις τριπλούν και η μέση τιμή που υπολογίζεται.

Προσδιορισμός απόπτωσης

LNCaPs σπάρθηκαν στα 2500 κύτταρα /cm

2 σε μία πλάκα 24 φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν για 24 ώρες πριν το μέσο άλλαξε σε είτε μέσα ανάπτυξης, ανδρογόνο εξαντλημένο μέσα, ή ανδρογόνων εξαντλημένο μέσα συμπληρωμένα με Ι Υ294002 (EMD Chemicals, Gibbstown, NJ). Μετά από 72 ώρες μέσα συλλέχθηκαν από κάθε φρεάτιο και προσδιορίστηκαν για απόπτωση χρησιμοποιώντας δοκιμασία 6-φωσφορικής γλυκόζης (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. 0,25% Triton Χ-100 συμπληρώθηκε με τη θετική ομάδα ελέγχου, πριν από την αφαίρεση του μέσου. Το πείραμα διεξήχθη με η = 8 και ο μέσος όρος των. Μετρημένες τιμές φθορισμού ομαλοποιήθηκαν με τον αρνητικό μάρτυρα που είχε οριστεί στην τιμή του ενός.

ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης

LNCaP κύτταρα σπάρθηκαν σε PTP ή BM-ECM, όπως περιγράφεται παραπάνω. Στις 4 ημέρες σε Μεγέθυνση- ή ανδρογόνων εξαντλημένα μέσα, τερματίστηκαν οι καλλιέργειες, πλύθηκαν με PBS, μονιμοποιήθηκαν με 2% γλουταραλδεϋδη και προετοιμάζονται για επιμετάλλωση πλατίνα-παλλάδιο, όπως περιγράφεται αλλού [17]. Τα δείγματα οπτικοποιήθηκαν με ένα Zeiss Supra 55VP εκπομπής πεδίου ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης.

κηλίδος Western και συστοιχίες πρωτεΐνη αντίστροφης φάσης

LNCaP κύτταρα σπάρθηκαν σε μέσο ανάπτυξης για PTP και ΒΜ-ECM και αφέθηκαν να ανανήψουν για 24 ώρες. Όπως αναφέρεται, το μέσο καλλιέργειας είτε αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο ανάπτυξης ή ανδρογόνων εξαντληθεί μέσα και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 72 ώρες. Στη συνέχεια, μέσα απομακρύνθηκαν, τα κύτταρα πλύθηκαν με παγωμένο PBS και συλλέχθηκαν με ένα ξέστρο κυττάρων. Τα κύτταρα σφαιροποιήθηκαν στους 4 ° C και λύθηκαν με κοκτέιλ ρυθμιστικό RIPA (Roche, Βασιλεία, Ελβετία) που περιείχε αναστολείς πρωτεάσης και φωσφατάσης (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) στους 4 ° C Η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη προσδιορίστηκε με την δοκιμασία πρωτεΐνης δικιγχονινικού οξέος ( Pierce Biotechnology) και 5 μg κυτταρικής πρωτεΐνης ήταν μειωμένη και αναλύθηκαν με κηλίδωση Western ανά λωρίδα. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με αλβουμίνη βόειου ορού και ανιχνεύθηκαν με ένα κοκτέιλ αντισωμάτων έναντι φωσφο-p90RSK (Ser380), φωσφο-Akt (Ser473), φωσφο-ρ44 /42 (Thr202 /Tyr204), φωσφο-S6 (Ser235 /236), φωσφο -Erk1 /2 (Thr202 /Tyr204), και eIF4E (Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ) χρησιμοποιώντας ένα ολονύκτια επώαση στους 4 ° C και μία αραίωση 1:400 αντίσωμα. Σύνολο ERK προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα ρ44 /42 ΜΑΡΚ ειδικό αντίσωμα (Cell Signaling Technology) σε αραίωση 1:2000. Για τους πίνακες αντίστροφης πρωτεΐνη φάση, σε συνολικά 150 μg του LNCaP λύματος προσδιορίστηκε με τη χρήση της φωσφο-κινάσης κιτ ανθρώπινης πρωτεώματος Profiler (R &? D Systems, Minneapolis, ΜΝ). Σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή

Η κυτταρομετρία ροής

κύτταρα LNCaP θρυψινοποιήθηκαν και περιδινήθηκαν σε ένα σφαιρίδιο (1200 rpm, 10 λεπτά). Τα κύτταρα κατόπιν επαναιωρήθηκαν σε μία PBS που περιέχει το αντίσωμα ανβ3, LM609 κλώνος, (Millipore, Billerica, ΜΑ) σε αραίωση 1:300 και επωάστηκαν στους 4 ° C για 30 λεπτά. Τα κύτταρα στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν σε 4% φορμαλίνη, και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής (FACSCaliber, BD Biosciences). Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το Flow-jo λογισμικού (Δέντρο αστέρων Inc., Ashland, OR).

Alazarin κόκκινο λεκέ και ποσοτικοποίηση

Για την εκτίμηση οστεογονική διαφοροποίηση των hMSCs σε απάντηση στον καρκίνο του προστάτη κύτταρο ρυθμισμένα μέσα, LNCaPs και ανθρώπινα στρωματικά κύτταρα μυελού ή PC3s και ανθρώπινα στρωματικά κύτταρα μυελού έμμεσα συν-καλλιεργούνται σε μια αναλογία 1:01 του αντίστοιχου μέσου εκτύπωσης. Σε 14 ημέρες συν-καλλιέργειας, η στοιβάδα MSC σταθεροποιήθηκε με 4% φορμόλη και επωάζεται με ένα κόκκινο υδατικό διάλυμα 1% αλιζαρίνη (ρΗ 4.2) (Sigma-Aldrich) για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, τα δείγματα πλύθηκαν με νερό για να απομακρυνθεί η μη δεσμευμένη χρωστική και στη συνέχεια απεικονίζεται με μικροσκοπία φωτός. Για το ερυθρό της αλιζαρίνης ποσοτικοποίησης 10% οξικό οξύ προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο, επωάστηκαν για 30 λεπτά, απομακρύνθηκε από κάθε φρεάτιο, και εξουδετερώθηκε με 10% υδροξείδιο του αμμωνίου. Τέλος, η απορρόφηση των δειγμάτων μετρήθηκε στα 405 nm χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο. Οι τιμές απορρόφησης κανονικοποιήθηκαν με τον αρνητικό μάρτυρα ο οποίος ρυθμίζεται σε μία τιμή του ενός.

Σηματοδοσίας μελέτες αναστολής

Για τις έμμεσες κύτταρα συν-καλλιέργειες σπάρθηκαν σε μέσο ανάπτυξης και μετά από 24 ώρες το μέσο αντικατασταθεί με ένα μείγμα 1:01 των LNCaP και hMSC ανδρογόνων εξαντληθεί μέσα ενημέρωσης. Αυτό το μέσο συμπληρώθηκε με LY294002 σε συγκέντρωση 5 μΜ ή U0126 (EMD Chemicals) στα 100 ηΜ. AG1024 και AG490 (EMD Chemicals) επίσης συμπληρώθηκαν στα ανδρογόνα εξαντλημένο μέσα ενημέρωσης του hMSCs και LNCaPs σε έμμεσες συν-καλλιέργειας σε συγκέντρωση 1 μΜ και 50 μΜ, αντίστοιχα. Το αντι-ανθρώπινο μονοκλωνικό αντίσωμα IL6 (eBioscience) συμπληρώθηκε εντός του μέσου σε συγκέντρωση 20 μg /ml ενώ LNCaPs ήταν έμμεσα συν-καλλιεργήθηκαν με ανθρώπινα στρωματικά κύτταρα μυελού. Οι συγκεντρώσεις εργασίας αναστολέων μικρών μορίων προσδιορίστηκαν από καμπύλες δόσης-απόκρισης της μόνος LNCaPs σε καλλιέργεια (σχ. S2). Η επιβίωση των κυττάρων προσδιορίστηκε με τη δοκιμασία ΜΤΤ όπως περιγράφεται λεπτομερώς παραπάνω μετά από 7 ημέρες. τιμές ΜΤΤ κανονικοποιήθηκαν με τον αρνητικό μάρτυρα ο οποίος ρυθμίζεται σε μία τιμή του ενός.

ποσοτική πραγματικού χρόνου αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (RT-PCR)

Το ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας στήλες σίλικα RNeasy (Qiagen , Valencia, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, και 200 ​​ng RNA μεταγράφηκε αντίστροφα από κάθε δείγμα (iScript, Bio-Rad, Hercules CA). Τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων στόχων ποσοτικοποιήθηκαν με RT-PCR χρησιμοποιώντας Brilliant II Fast κύριο μείγμα QPCR (Aglient Technologies, Santa Clara CA) και να επικυρώνονται εκκινητές (TaqMan, Applied Biosystems, Carlsbad CA). Η σχετική έκφραση των γονιδίων στόχων υπολογίστηκε με βάση τις C

τιμές Τ, και αυτά ομαλοποιήθηκαν με εκείνη του γονιδίου γλυκεραλδεΰδης housekeeping 3-φωσφορική αφυδρογονάση χρησιμοποιώντας το

-ΔΔCT μέθοδος υποθέτοντας 100% απόδοση PCR 2 [18] .

Phospho-Erk ανοσοϊστοχημεία

μικροσυστοιχίες προστάτη ιστού που περιέχει τμήματα του φυσιολογικού ιστού προστάτη, πρωτογενών όγκων του προστάτη, και οστικού ιστού μεταστατικού προστατικού ελήφθησαν από US Biomax (Rockville, MD). Ένα μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι του T185 Erk1 /2 phosphosites, Y187, Τ202, και Y204 ελήφθη από Abcam (Cambridge, ΜΑ), ο κλώνος ΜΑΡΚ-ΥΤ. Η χρώση διεξήχθη από το εργαστήριο Tufts Medical Center Ιστολογία εξής βελτιστοποίηση της αραίωσης αντισώματος και αποκλεισμού επί βελτιστοποιήσεις διαφάνειες κομμένα από το ίδιο μπλοκ ιστού όπως τα πειραματικά δείγματα. μικροσκόπιο φωτεινού διεξήχθη με τη χρήση μικροσκοπίου Leica Microsystems DM IL (Buffalo Grove, IL), με μια φωτογραφική μηχανή Leica Microsystems DFC420, και Leica Microsystems Εφαρμογή λογισμικού Σουίτα V3.5 χωρίς αλλοιώσεις στις πρώτες εικόνες. Τα τμήματα βαθμολογήθηκαν από δύο τυφλές ερευνητές, χρησιμοποιώντας την κλίμακα Dako (0,1 +, 2 + 3 +), όπου τελική βαθμολογία για κάθε τμήμα στη συνέχεια μέσο όρο από κοινού [19]. Ένας ένας τρόπος δοκιμής ANOVA χρησιμοποιήθηκε με δοκιμή post hoc Bonferroni κατά το διάστημα εμπιστοσύνης 95% για να προσδιοριστεί η σημασία.

υπολογισμούς IC50

LNCaP κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων σε 18000 κύτταρα /cm

2. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις αναστολέα και σχετικής επιβίωσης μετράται με μια δοκιμασία ΜΤΤ μετά από 3 ημέρες. Οι συγκεντρώσεις IC50 προσδιορίστηκαν με βάση το ήμισυ της απόστασης μεταξύ των μέγιστων και ελάχιστων τιμών επιβίωσης κατά μήκος της καμπύλης απόκρισης δόσης. Η μέση λήφθηκε από 12 αντίγραφα ανά συγκέντρωση.

Εκκαθάριση των κυττάρων καταμέτρηση

Ίσες αριθμούς των κυττάρων LNCaP απλώθηκαν σε PTP και BM-ECM σε μια πλάκα 24 φρεατίων σε 2.500 κύτταρα /cm

2, 5.000 κύτταρα /cm

2, και 7.500 κύτταρα /cm

2, όπως καθορίζεται μέσω μετρώντας με ένα αιμοκυτταρόμετρο. Επιπλέον, η αύξηση των συγκεντρώσεων των κυττάρων LNCaP παρασκευάστηκαν και μια μέτρηση που λαμβάνεται από κάθε δείγμα για ΜΤΤ (Invitrogen, Carlsbad, CA) και δοκιμασίες ποσοτικοποίησης DNA χρησιμοποιώντας PicoGreen (Invitrogen, Carlsbad, CA) για τη δημιουργία μιας πρότυπης καμπύλης. Μετά από 24 ώρες καλλιέργειας σε ανδρογόνων εξαντληθεί μέσα μαζικής ενημέρωσης, τα κύτταρα στο Πρόγραμμα Προϋπηρεσιακής Κατάρτισης και BM-ECM αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ποσοτικό προσδιορισμό του DNA, ΜΤΤ, και χειροκίνητη καταμέτρηση μέσω πυρηνικής χρώσης και απεικόνισης. πυρήνες κυττάρων χρωματίστηκαν με Hoechst 33258, πλύθηκαν με PBS, και απεικονίζεται στο 20x χρησιμοποιώντας ένα Leica DM IL ανεστραμμένο μικροσκόπιο. Πέντε αντιπροσωπευτικές εικόνες ελήφθησαν ανά φρεάτιο και ο αριθμός των πυρήνων μετρήθηκαν με το χέρι. Αυτός ο αριθμός των πυρήνων κατά μέσο όρο και πολλαπλασιάζεται με το εμβαδόν επιφανείας ενός μόνο φρεάτιο μιας πλάκας 24 φρεατίων (2 εκατ

2) πάνω από την περιοχή του οπτικού πεδίου σε 20x να προσδιοριστεί ο αριθμός των κυττάρων ανά φρεάτιο, και ο μέσος όρος όλων των βιολογικών επαναλήψεις λαμβάνονται (n = 4).

η ανάλυση των δεδομένων

η στατιστική ανάλυση ολοκληρώθηκε χρησιμοποιώντας Graphpad Prism 5. Σημασία έχει προσπελαστεί χρησιμοποιώντας αταίριαστο ένα tailed t-τεστ στο εμπιστοσύνης 95% διάστημα, ή ένας τρόπος ANOVA με δοκιμή πολλαπλής σύγκρισης του Dunnett, επίσης στο διάστημα εμπιστοσύνης 95%, εκτός εάν σημειώνεται διαφορετικά (* Ρ & lt? 0,05? ** Ρ & lt? 0,01? *** Ρ & lt? 0.001). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SEM, εκτός αν σημειώνεται διαφορετικά. ανάλυση κυκλικότητα εικόνα ολοκληρώθηκε με τη χρήση ImageJ και πρότεινε κατωφλίου ρυθμίσεις. Αυξανόμενες τιμές στην κλίμακα κυκλικότητα δείχνουν όλο και περισσότερο κυκλικό κύτταρα. δεδομένων των μικροσυστοιχιών πρωτεϊνών σαρώθηκαν ως αρχείο εικόνας και του ολοκληρωμένου έντασης των εικονοστοιχείων για κάθε σημείο μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ImageJ. Ο μέσος όρος των διπλών ελήφθη, τα δεδομένα μέση στο κέντρο, και ιεραρχική ανάλυση ομαδοποίησης εκτελέστηκε. πρωτεΐνη φωσφορυλίωσης διαφορικού μεταξύ των ομάδων εκφράστηκε ως η διαφορά των δύο μετρήσεων διαιρείται με τον πληθυσμό τυπική απόκλιση.

Αποτελέσματα

παρακρινείς αλληλεπιδράσεις των hMSCs και LNCaPs προώθηση οστεογόνο διαφοροποίηση των hMSCs και ανδρογόνων ανεξάρτητη επιβίωση του LNCaPs

Για να κατανοήσουμε καλύτερα τη σηματοδότηση παρακρινής μεταξύ hMSCs και τον καρκίνο του προστάτη κύτταρα, χρησιμοποιήσαμε την έμμεση συν-καλλιέργειες LNCaPs και hMSCs. LNCaPs επάγουν οστεογονική διαφοροποίηση των hMSCs (Εικ. 1Α, 1Β) τα οποία έμοιαζαν με την ενεργοποίηση των οστεοβλαστών δει συχνά σε ασθενείς με καρκίνο του προστάτη [20]. Επιπλέον, η επιβίωση των κυττάρων LNCaP σε hMSC συν-καλλιέργειες ήταν σημαντικά αυξημένη πάνω μονοτυπικό καλλιεργειών LNCaP σε ανδρογόνο εξαντλημένο μέσο (Εικ. 1 C). Να ανακρίνει αυτά τα αποτελέσματα, IL6 σηματοδότηση αναστέλλεται με ένα μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-IL6 ή, AG490, ένα μικρό μόριο αναστολέα της κινάσης Jak2, ανάντη ενεργοποιητής του Stat3. Αυτές οι θεραπείες μείωσαν σημαντικά τη βιωσιμότητα των LNCaPs σε σύγκριση με την ανεμπόδιστη ομάδα συν-καλλιέργεια σε ανδρογόνων εξαντλημένο συνθήκες (Εικ. 1 C). Σημειώνοντας ότι η μείωση στην βιωσιμότητα δεν ήταν στο επίπεδο του LNCaPs καλλιεργήθηκαν μόνο, ελέγξαμε επίσης την επίδραση του AG1024, ενός αναστολέα IGFR. Αυτό το φάρμακο επίσης μείωσε σημαντικά τη βιωσιμότητα των κυττάρων LNCaP έμμεσα συν-καλλιεργήθηκαν με ανθρώπινα στρωματικά κύτταρα μυελού. Αυτοί οι αναστολείς μόνο του δεν ήταν κυτταροτοξικά για τα κύτταρα (Σχ. S2). Τέλος, η έκφραση του IL6 πάροδο του χρόνου επιβεβαιώθηκε μέσω ELISA από hMSCs ρυθμισμένα μέσα με διαφορετικές συνθήκες (Εικ. 1ϋ). Αξίζει να σημειωθεί ότι, hMSCs που είχε προ-διαφοροποιηθούν προς την κατεύθυνση μιας οστεογονικής linage είχαν σταθερά υψηλότερα ποσοστά της έκφρασης IL-6. Θεωρώντας LNCaPs επάγουν ανθρώπινα στρωματικά κύτταρα μυελού να υποστούν οστεογονική διαφοροποίηση, αυτή μπορεί να είναι μία πηγή αύξησης IL6 συνδετών επίπεδα. Επιπλέον, τα επίπεδα IGF-1 μετρήθηκαν σε ρυθμισμένα μέσα με μία δοκιμασία ELISA. Δεν υπάρχει χρόνος ποικίλες επιδράσεις παρατηρήθηκαν, ωστόσο σημαντική σταθερή απελευθέρωση κατάσταση των hMSCs παρατηρήθηκε σε σύγκριση με PC3 και LNCaP κύτταρα (Εικ. 1 Ε).

BM-ECM προάγει την επιβίωση των κυττάρων LNCaP στα ανδρογόνα εξαντληθεί μέσα ενημέρωσης και χημειοαντίσταση

Εκτός από διαλυτά παρακρινή σήματα, υποθέσαμε ότι μυελό οστών σαν ECM μπορεί να παίζει ρόλο στην επιβίωση των εξαρτώμενων από ανδρογόνα καρκίνου του προστάτη κύτταρα. Μια απο-κυτταρωμένο στρώμα προήλθε από πρωτεΐνες ECM που εκκρίνονται από ανθρώπινα στρωματικά κύτταρα μυελού [16]. Μετά από μία εβδομάδα καλλιέργειας σε ανδρογόνων στερούνται μέσων υπήρξε σημαντική αύξηση στον αριθμό των βιώσιμων κυττάρων σε BM-ECM συγκριτικά με κύτταρα σε ανδρογόνα εξαντλημένο μέσων σε ΡΤΡ (Εικ. 2Α). Ο μηχανισμός αυτής της επίδρασης επιβεβαιώθηκε σε μια δεύτερη κυτταρική σειρά ανδρογόνο-εξαρτώμενη, δηλαδή τα κύτταρα MDA-PCA-2b (Σχ. 2Β). Τα MDA-PCA-2b κύτταρα συνήθως καλλιεργούνται σε εμπορικώς διαθέσιμα ECM για να υποστηρίξει την κυτταρική προσκόλληση και την ανάπτυξη. Ωστόσο, αυτό το υπόστρωμα ECM δεν υποστηρίζουν την ανάπτυξη των κυττάρων MDA-PCa-2b σε ανδρογόνων απεμπλουτισμένου συνθήκες δείχνει την επίδραση είναι ειδική για τα συστατικά BM-ECM ή της δομής (Εικ. 2Β). Στη συνέχεια, θα εξεταστεί κατά πόσον BM-ECM θα μπορούσε να προσδώσει χημειοαντίσταση χρησιμοποιώντας μέσο ανάπτυξης συμπληρωμένο με docetaxel. BM-ECM κύτταρα που καλλιεργήθηκαν LNCaP παρουσίασαν σημαντική αύξηση στην επιβίωση των κυττάρων σε σύγκριση με ΡΤΡ καλλιέργειες (Σχ. 2C). Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι τα συστατικά του BM-ECM παίζουν ρόλο στον προσδιορισμό της επιβίωσης σε απάντηση στέρησης ανδρογόνων και docetaxel θεραπεία.

BM-ECM μεταβάλλει μορφολογία LNCaP

Για να παρέχει μια καλύτερη κατανόηση των το BM-ECM και LNCaP αλληλοπαρεμβολών, αναλύσαμε τη μορφολογία των κυττάρων με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης. LNCaPs μπορούσε να παρατηρηθεί συνδέονται με ίνες ECM και μήτρας (Σχ. 3Α, 3Β, και 3C). LNCaP κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ανδρογόνο εξαντλημένο media είχαν σημαντική αύξηση της επιμήκυνσης όπως ποσοτικοποιούνται ακόλουθη απεικόνιση SEM μετά από 4 ημέρες (σχ. 3Β). Ωστόσο, αυτή η μορφολογική αλλαγή εμποδίστηκε από την εμφάνιση όταν τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ανδρογόνων εξαντλημένα μέσα ενημέρωσης σχετικά με ΒΜ-ECM. Σε αυτή την κατάσταση τα κύτταρα φάνηκε να μεγαλώνουν σε ομάδες με αποτέλεσμα τη σημαντική αύξηση των μετριέται κυκλικότητα (Εικ. 3D).

Αποκλεισμός ανβ3 ιντεγκρίνης όρια προσκόλληση σε BM-ECM

Στη συνέχεια, επιδιώξαμε να εξεταστεί ο ρόλος του συμπλόκου ανβ3 ιντεγκρίνης για BM-ECM συνημμένο, επειδή αυτό το συγκρότημα ιντεγκρίνης έχει εμπλακεί στην προσκόλληση ECM και μετέπειτα μετάσταση μυελού των οστών [21]. Η κυτταρομετρία ροής έδειξε την επισήμανση της κυτταρικής επιφάνειας για ανβ3 ιντεγκρίνη (Σχ. 4Α). Για τον προσδιορισμό λειτουργική σημασία, αιωρούμενα κύτταρα επωάστηκαν με ένα αντίσωμα μπλοκαρίσματος κατά της ανβ3 ιντεγκρίνης ή ισοτυπικού ελέγχου και προσκόλλησης κυττάρου σε BM-ECM μετρήθηκε στη συνέχεια. Μία σημαντική μείωση στην προσκόλληση των κυττάρων μετρήθηκε, υποδηλώνοντας ότι η ανβ3 ιντεγκρίνης σε αυτή την περίπτωση παίζει ρόλο στη μεσολάβηση προσκόλληση σε BM-ECM (Εικ. 4Β).

Επίδραση της ΒΜ-ECM επί ΜΑΡΚ και ΡΙ3Κ μονοπάτια σηματοδότησης

για να προσδιοριστεί ο μηχανισμός που μεσολαβούν την απάντηση των LNCaPs σε BM-ECM εξετάσαμε τη σχετική κατάσταση φωσφορυλίωσης των 46 πρωτεϊνών από πολλαπλές οδούς, χρησιμοποιώντας μια αντίστροφη πρωτεΐνη φάση μικροσυστοιχιών. Όταν έγινε ιεραρχική ανάλυση ομαδοποίησης, LNCaPs σε BM-ECM στο ανδρογόνων εξαντληθεί μέσα ενημέρωσης συγκεντρωμένα πιο στενά με LNCaPs σε μέσο ανάπτυξης για PTP (Εικ. 5Α). Διαφορική φωσφορυλίωση στη συνέχεια αξιολογήθηκε μεταξύ LNCaPs σε BM-ECM στο ανδρογόνων εξαντληθεί μέσα ενημέρωσης και LNCaPs σε PTP σε ανδρογόνων εξαντληθεί μέσα μαζικής ενημέρωσης, και πολλές πρωτεΐνες φαίνεται να είναι διαφορικά φωσφορυλιωμένη (Εικ. 5Β). Ωστόσο, όταν εξετάσαμε επίσης διαφορές μεταξύ φωσφορυλίωση LNCaPs επί ΡΤΡ σε μέσο ανάπτυξης έναντι ανδρογόνων εξαντλημένο media αρκετές πρωτεΐνες ρυθμιστούν με παρόμοιο τρόπο (σχ. 5C).