Αφηρημένο

σύμπλεγμα σιδήρου-θείου βιογένεση εκτελείται από διακριτά συστήματα συναρμολόγησης πρωτεΐνης. Τα θηλαστικά έχουν δύο συστήματα, το μιτοχονδριακό σύστημα Fe-S διάταξη cluster (ISC) και το κυτοσολικό σύστημα συναρμολόγησης (CIA), οι οποίοι είναι συνδεδεμένοι με έναν άγνωστο μηχανισμό. Τα ανθρώπινα μέλη της οικογένειας ΝΕΕΤ του 2Fe-2S πρωτεΐνες, θρεπτικά συστατικά στέρηση autophagy παράγοντα-1 (NAF-1) και mitoNEET (ΜΝΤ), βρίσκονται στη διεπαφή μεταξύ των μιτοχονδρίων και του κυτοσολίου. Αυτές οι πρωτεΐνες έχουν ενοχοποιηθεί στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, και μπορούν να μεταφέρουν 2Fe-2S συμπλέγματα τους σε ένα πρότυπο πρωτεΐνη απο-δέκτη. Εδώ αναφέρουμε το πρώτο φυσιολογικό 2Fe-2S δέκτη σύμπλεγμα και για τις δύο πρωτεΐνες NEET ως ανθρώπινα Anamorsin (επίσης γνωστό ως αναστολέας-1 κυτοκίνη επαγόμενη απόπτωση? CIAPIN-1). Anamorsin είναι μια πρωτεΐνη μεταφοράς ηλεκτρονίων που περιέχει δύο θέσεις σύμπλεγμα δέσμευσης σιδήρου-θείου που απαιτείται για τη συναρμολόγηση κυτοσολικό σύμπλεγμα Fe-S. Δείχνουμε, χρησιμοποιώντας φασματοσκοπία UV-Vis, ότι τόσο NAF-1 και μπορεί να μεταφέρει ΜΝΤ 2Fe-2S συμπλέγματα τους να απο-Anamorsin με δεύτερη σειρά σταθερές αναλογίας παρόμοιες με εκείνες των άλλων γνωστών ανθρώπινων πρωτεϊνών μεταφοράς 2Fe-2S. Μια άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ πρωτεϊνών των πρωτεϊνών ΝΕΕΤ με Αρο-Anamorsin ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας βιοστρώματος συμβολομετρία. Επιπλέον, ηλεκτροψεκασμού φασματομετρίας μάζας ολο-Anamorsin παρασκευάζονται με τη μεταφορά σύμπλεγμα δείχνει ότι λαμβάνει δύο 2Fe-2S συστάδες από τις ΕΑΕΚ. Προτείνουμε ότι MNT και NAF-1 μπορεί να παρέχει παράλληλα δρομολόγια που συνδέουν το μιτοχονδριακό σύστημα ISC και τη CIA. Οι 2Fe-2S συστάδες συναρμολογούνται στα μιτοχόνδρια που λαμβάνονται από πρωτεΐνες ΝΕΕΤ και όταν χρειάζεται μεταφέρθηκε στο Anamorsin, ενεργοποιώντας τη CIA

Παράθεση:. Lipper CH, Paddock ML, Onuchic JN, Mittler R, Nechushtai R, Τζένινγκς PA ( 2015) σχετικά με τον καρκίνο ΝΕΕΤ Πρωτεΐνες Μεταφορά 2Fe-2S Clusters σε Anamorsin, μια πρωτεΐνης που απαιτείται για Κυτοσολικά σιδήρου-θείου Cluster Βιογένεσις. PLoS ONE 10 (10): e0139699. doi: 10.1371 /journal.pone.0139699

Επιμέλεια: Yaakov Koby Levy, Weizmann Institute of Science, ΙΣΡΑΗΛ

Ελήφθη: May 14, 2015? Αποδεκτές: 15 Σεπτέμβρη 2015? Δημοσιεύθηκε: 8 Οκτωβρίου 2015

Copyright: © 2015 Lipper et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση: το έργο υποστηρίχθηκε από ΝΙΗ GM101467 απονέμεται σε PAJ, το Ίδρυμα Ισραήλ Επιστήμη – ISF 865/13 απονέμεται σε RN, και τα κονδύλια από το Πανεπιστήμιο της Βόρειας Τέξας. Κολλέγιο των Τεχνών και των Επιστημών απονέμεται σε RM. Εργασία στο Κέντρο για τη Θεωρητική Φυσική Βιολογική χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Επιστημών (Επιχορηγήσεις ΦΥΣ-1427654 και MCB-1214457) και από την πρόληψη του καρκίνου και Ερευνητικό Ινστιτούτο του Τέξας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

σιδήρου-θείου (Fe-S) σμήνη είναι αρχαία συμπαράγοντες που βρέθηκαν σε πρωτεΐνες από όλα τα βασίλεια της ζωής. Πρωτεΐνες που περιέχουν συμπλέγματα θείο σίδηρο εκτελούν πολλές κρίσιμες λειτουργίες, συμπεριλαμβανομένων της μεταφοράς των ηλεκτρονίων σε οξειδωτικό μεταβολισμό, φωτοσύνθεση, μεταβολισμό νουκλεοτιδίων, σύνθεση συμπαράγοντες πρωτεΐνης, και είναι ζωτικής σημασίας για την αντιγραφή του DNA και επιδιόρθωση του DNA [1, 2]. Βιοσύνθεση των clusters Fe-S προκύπτει από πολύπλοκα συστήματα συναρμολόγησης πρωτεϊνών που περιλαμβάνουν πρωτεΐνες ικρίωμα, συνοδοί, πρωτεΐνες μεταφοράς ηλεκτρονίων και desulfurases κυστεΐνη [3]. Στα θηλαστικά υπάρχουν δύο ξεχωριστές σειρές Fe-S μηχανήματα συναρμολόγησης συμπλέγματος: το σύστημα των μιτοχονδρίων συναρμολόγηση του συμπλέγματος θείου σιδήρου (ISC) και το σύστημα το σύνολο του κυτταροπλάσματος συμπλέγματος θείου σιδήρου (CIA). Η CIA προμηθεύει συστάδες Fe-S για κυτοσολικές και πυρηνικές πρωτεΐνες, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που εμπλέκονται στην αντιγραφή και επιδιόρθωση του DNA [4]. Το μιτοχονδριακό σύστημα ISC έχει αναφερθεί ότι είναι απαραίτητο για την ενεργοποίηση του κυτοσολικού συστήματος [5, 6]. Ωστόσο, η ακριβής φύση της σχέσης μεταξύ των δύο συστημάτων παραμένει άγνωστη. Υπάρχουν πολλές ανθρώπινες ασθένειες που σχετίζονται με ελαττώματα στο Fe-S βιογένεση, συμπεριλαμβανομένων αταξία του Friedreich, σιδηροβλαστική αναιμία, σύνδρομο πολλαπλής μιτοχονδριακές δυσλειτουργίες, και τον καρκίνο [3, 7].

Οι πρωτεΐνες του ανθρώπινου ΝΕΕΤ είναι ένα πρόσφατα ανακαλύφθηκε νέα κατηγορία της 2Fe-2S πρωτεϊνών. Αυτοί είναι οι μόνοι γνωστοί πρωτεΐνες σιδήρου-θείου εντοπισμένη στην ή κοντά στην εξωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη που είναι στη διεπαφή μεταξύ των μιτοχονδρίων και κυτοσόλιο. Το καλύτερο που χαρακτηρίζεται από αυτά είναι mitoNEET (MNT, CISD1) και θρεπτικά συστατικά στέρηση αυτοφαγία παράγοντα-1 (ΝΑΡ-1, miner1, Έριδα, CISD2) (αναθεωρηθούν [8]). ΜΝΤ βρίσκεται στην εξωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη-(OMM) και NAF-1 στο ενδοπλασματικό δίκτυο (ER) και της μιτοχονδριακής μεμβράνης που σχετίζεται (ΜΑΜ) του ER [9-11]. NAF-1 στο ΜΑΜ είναι στενά συνδεδεμένο με το OMM μέσω του συμπλόκου του με ΙΡ

3R, το οποίο είναι άμεσα προσαρτημένο στο VDAC πρωτεΐνη OMM πόρου από grp75 [9, 12]. Αυτές οι πρωτεΐνες NEET εμπλέκεται σε διάφορες ανθρώπινες ασθένειες, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου, του διαβήτη, κυστική ίνωση, σύνδρομο Wolfram 2, νευροεκφυλισμός και μυϊκή ατροφία [8, 13-18]. κρυσταλλικές δομές δείχνουν ότι τόσο MNT και NAF-1 είναι ομοδιμερή με κάθε protomer συντονιστικό ένα σύμπλεγμα 2Fe-2S με μια ασυνήθιστη 3Cys: συντονισμός 1His [19, 20]. Η ασυνήθιστη συστάδα συντονισμός Fe-S με τρεις συνδέτες Cys και ένα μη-Cys συνδέτης έχει βρεθεί σε πρωτεΐνες μεταφοράς σύμπλεγμα Fe-S [21]. Έχουμε αποδείξει την ικανότητα των πρωτεϊνών ΝΕΕΤ να μεταφέρει 2Fe-2S συμπλέγματα τους να απο-φερρεδοξίνη, το χρυσό πρότυπο πρωτεϊνών που χρησιμοποιούνται για πειράματα μεταφοράς συμπλέγματος Fe-S [22, 23].

Η υποκυτταρική εντόπιση της ΝΕΕΤ πρωτεΐνες στη διεπιφάνεια του κυτοσολίου και τα μιτοχόνδρια, καθώς και η λειτουργία μεταφοράς σύμπλεγμα τους, μας οδήγησε να διερευνήσει κατά πόσον συνδέουν το μιτοχονδριακό σύστημα ISC στο σύστημα CIA. Το κυτοσολικό 2Fe-2S πρωτεΐνη Anamorsin (επίσης γνωστή ως αναστολέας-1 κυτοκίνη επαγόμενη απόπτωση? CIAPIN-1) είναι μια πρωτεΐνη μεταφοράς ηλεκτρονίων που απαιτείται για την έγκαιρη βήμα της συναρμολόγησης συμπλέγματος Fe-S από το σύστημα CIA [24-26]. Σε αυτή τη μελέτη έχουμε εντοπίσει Anamorsin ως η πρώτη γνωστή άμεση φυσιολογικές 2Fe-2S συμπλέγματος αποδέκτη τόσο για MNT και NAF-1. Παρόμοια με τα προηγούμενα ευρήματά μας με φερρεδοξίνη, η μεταβίβαση πραγματοποιείται μόνο όταν το σύμπλεγμα είναι στα οξειδωμένα [2Fe-2S]

2+ κράτος και αναστέλλεται από μετάλλαξη του συνδετήρα του να Cys. Ο ρυθμός μεταφοράς συμπλέγματος να Anamorsin από MNT ή NAF-1 είναι συγκρίσιμα με εκείνα από άλλες γνωστές ανθρώπινες πρωτεΐνες μεταφοράς συμπλέγματος 2Fe-2S. Δείχνουμε, χρησιμοποιώντας συμβολομετρία βιοστρώματος, ότι και οι δύο ΕΑΕΚ σχηματίσουν μια άμεση αλληλεπίδραση πρωτεΐνης-πρωτεΐνης με Anamorsin. Επιπλέον, αναφέρουμε ότι ΝΕΕΤ πρωτεΐνες μεταφέρει άμεσα 2Fe-2S clusters σε δύο τοποθεσίες συμπλέγματος δέσμευσης Anamorsin επιτρέποντας την πλήρη ανασύσταση της ολο-Anamorsin. Επειδή ολο-Anamorsin απαιτείται για τη βιοσύνθεση των συστάδων Fe-S από το σύστημα της CIA, 2Fe-2S μεταφορά cluster για να απο-Anamorsin υποδηλώνει ότι οι πρωτεΐνες ΝΕΕΤ έχουν ουσιαστικό ρόλο στη ρύθμιση /ενεργοποίηση του συνέρχεσθαι συμπλέγματος από το σύστημα της CIA.

Πειραματικές Διαδικασίες

Έκφραση και καθαρισμός πρωτεϊνών

Οι διαλυτές περιοχές του NAF-1 (υπολείμματα 57-135) και mNT (υπολείμματα 33 έως 108) εκφράστηκαν και καθαρίστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19, 23]. Οι καθαρισμένες πρωτεΐνες ΝΕΕΤ περιέχουν ≥ 98% πληρότητα συμπλέγματος. Το ανθρώπινο cDNA που κωδικοποιεί Anamorsin πλασμίδιο (Abgent) ενισχύθηκε με PCR και υποκλωνοποιείται σε ρΕΤ28-Α (+) φορέα (Novagen) μεταξύ των θέσεων περιορισμού NdeI και XhoI. Ο φορέας προσθέτει μια 6x-tag του και μία θέση διάσπασης θρομβίνης στο Ν-τελικό άκρο του γονιδίου. BL-21 κωδικονίου Plus (DE3) RIL (Stratagene) μετασχηματίστηκαν με το ρΕΤ28-α (+) – Anamorsin κατασκεύασμα. Οι καλλιέργειες αναπτύχθηκαν σε LB μέσα που περιέχουν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [27]. 750 μΜ ΡεΟ

3 προστέθηκαν στην καλλιέργεια 30 λεπτά πριν από την επαγωγή με IPTG. Τα κύτταρα σφαιροποιήθηκαν με φυγοκέντρηση και επαναιωρήθηκαν σε 20 mM Tris-HCl ρΗ 8,0, 250 mM NaCl, 5 mM ιμιδαζόλη. Τα επαναιωρημένα κύτταρα λύθηκαν χρησιμοποιώντας έναν ομογενοποιητή EmulsiFlex-C5 (Avestin) και φυγοκεντρήθηκε. Το υπερκείμενο που περιέχει του-tagged Anamorsin συνδέθηκε προς Νί-ΝΤΑ αγαρόζης (Qiagen) ρητίνη, πλύθηκε με το ρυθμιστικό επαναιώρησης και εκλούστηκε με το ίδιο ρυθμιστικό με 300 mM ιμιδαζόλη. Εκλούεται Anamorsin αραιώθηκε σε 25 mM Tris-HCl ρΗ 7.1 που περιείχε 5 mM DTT και καθαρίστηκε περαιτέρω χρησιμοποιώντας μια HiTrap Q ΗΡ στήλη ανταλλαγής ανιόντων 5 ml (GE Healthcare). Η πρωτεΐνη εκλούστηκε με μια βαθμίδωση 150-500 mM NaCl σε 25 mM Tris-HCl ρΗ 7,1 και 5 mM DTT. Για Αρο-Anamorsin, το σύμπλεγμα 2Fe-2S απομακρύνθηκε με τη μέθοδο που περιγράφεται από τους Kennedy και Beinert [28]. Τα μονά μεταλλάγματα θέση σύμπλεγμα Anamorsin (C1 και C2) σχεδιάστηκαν με αντικατάσταση κάθε ένα από τα προσδέματα σύμπλεγμα 4Cys με Ser με τοπο-κατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση.

κινητική μεταφοράς φασματοσκοπία απορρόφησης UV-Vis

Απορρόφηση φάσματα καταγράφηκε από 300-800 nm σε ένα φασματοφωτόμετρο Cary 50 (Varian) με μία μονάδα ελέγχου θερμοκρασίας ρυθμισμένο στους 37 ° C χρησιμοποιώντας ένα μήκος διαδρομής 1 cm κυψελίδα. Τα φάσματα ελήφθησαν υπό αερόβιες συνθήκες, εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά. Η αναλογία της απορρόφησης στα 423 nm (χαρακτηριστικό της συστάδας (s) 2Fe-2S της Anamorsin) σε 458 nm (ΝΕΕΤ 2Fe-2S σύμπλεγμα κορυφή υπογραφή) παρακολουθήθηκε ως εξέλιξη της μεταφοράς συμπλέγματος. Η έκταση της αντίδρασης μεταφοράς συμπλέγματος προσδιορίζεται και σχεδιάζεται περιγράφηκε προηγουμένως [23] χρησιμοποιώντας την εξίσωση: Μεταφορά Πρόοδος (%) = (R

obs-R

αρχική) /(R

τελικό-R

αρχική) x100%, όπου R

αρχική είναι η αναλογία απορρόφησης 423/458 nm σε χρόνο 0, R

obs είναι η αναλογία 423/458 nm σε μια δεδομένη στιγμή, και R

τελική είναι το IS η αναλογία 423/458 nm για την πλήρη μεταφορά. R

αρχικό για μεταφορά από NAF-1 και MNT είναι 0,78. R

αρχικές τιμές για μεταφορά από NAF-1 H114C μεταλλαγμένων και MNT H87C μεταλλαγμένα είναι 0,93 και 0,90 αντίστοιχα. Η αναλογία απορρόφησης 423/458 nm καθαρισμένου ολο-Anamorsin, C1 και C2 μεταλλαγμένο μεταλλαγμένο (1.04, 1.03, 0.99 αντίστοιχα) χρησιμοποιήθηκαν ως τιμές για την πλήρη μεταφορά (R

τελικό). Για τις αντιδράσεις μεταφοράς, απο-Anamorsin προ-επωάστηκε με 2,5 mM DTT επί 60 λεπτά για να εξασφαλιστεί η μείωση των ομάδων θειόλης κυστεΐνης της. Οι κινητικές μετρήσεις διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας ισομοριακές συγκεντρώσεις του ΝΑΡ-1 ή MNT να απο-Anamorsin (μία NEET με δύο σύμπλεγμα 2Fe-2S ανά Anamorsin) σε 50 mM Bis-Tris ρΗ 7.0, 100 mM NaCl, 2.5 mM DTT εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά αναφέρεται. Η απο-Anamorsin και DTT προεπωάστηκαν για 60 λεπτά πριν από την προσθήκη του ΝΕΕΤ πρωτεΐνης.

βιοστρώματος συμβολομετρία

κινητική της αλληλεπίδρασης Αρο-Anamorsin με NAF-1 ή ΜΝΤ μετρήθηκε σε ένα οκτάδα μέσο Red96 (ForteBio). Apo-Anamorsin βιοτινυλιώθηκε με επώαση για 30 λεπτά με EZ-Link Σουλφο-ΝΗδ-ΕΟ-βιοτίνη (Thermo Scientific) σε 2: 1 μοριακή αναλογία του αντιδραστηρίου βιοτινυλίωσης προς πρωτεΐνη στη συνέχεια ανταλλαγή ρυθμιστικού χρησιμοποιώντας μία στήλη PD10 αφαλάτωσης (GE Healthcare) σε 50 mM bis-tris, 100 mM NaCl, 0,1% Tween 20, 0,5 mg /ml BSA, 5 mM DTT, ρΗ 7.0. 3.5 μΜ βιοτινυλιωμένο Anamorsin ακινητοποιήθηκε σε βιοαισθητήρες στρεπταβιδίνη (ForteBio). Τα φορτωμένα βιοαισθητήρες εξισορροπήθηκαν στο ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα χωρίς DTT. Σύλλογος μετρήθηκε πάνω από 900 δευτερόλεπτα. Το σωματείο καθορίζεται από την μετατόπιση του μήκους κύματος (nm). Μετά ένωση, διάστασης προσδιορίστηκε με μεταφορά του άκρου βιοαισθητήρα να buffer χωρίς NEET πρωτεΐνης για μια περίοδο 1800 δευτερόλεπτα. Έλεγχοι για μη ειδική δέσμευση για κάθε συγκέντρωση NEET έτρεξαν χωρίς φόρτωση με το βιοαισθητήρα και αφαιρούνται από τα αντίστοιχα δεδομένα σύνδεσης. Τα δεδομένα ταιριάζουν σε ένα 1: 1 μοντέλο για δέσμευση με Αρο-Anamorsin και ένα 2: μοντέλο ετερογενής συνδετήρα 1 για δέσμευση σε ολο-Anamorsin χρησιμοποιώντας το λογισμικό οκτάδας. Τα δεδομένα απεικονίζονται με τη χρήση Kaleidagraph (Synergy Software).

Προετοιμασία Anamorsin μεταφορά μετα-cluster για φασματομετρία μάζας και βιοστρώματος συμβολομετρία

25 μΜ apo-Anamorsin σε 50 mM Δις-Τρις ρΗ 7,0 και 100 mM NaCl προ-επωάστηκε με 2,5 mM DTT επί 60 λεπτά. 27,5 μΜ NAF-1 προστέθηκε στη συνέχεια και το μίγμα της αντίδρασης επωάστηκε σε ένα τροχιακό αναδευτήρα στους 37 ° C για 3,5 ώρες. Μετά την αντίδραση ολο-Anamorsin καθαρίστηκε από NAF-1 χρησιμοποιώντας μια στήλη ανταλλαγής ανιόντων 1 ml HiTrap Q ΗΡ. Η πρωτεΐνη εκλούστηκε με μια βαθμίδωση 150-500 mM NaCl σε 25 mM Tris-HCl ρΗ 7.5. Δείγματα για φασματομετρία μάζας ήταν ρυθμιστικό ανταλλάσσεται σε 10 mM οξικό αμμώνιο ρΗ 7.5 ρυθμιστικό χρησιμοποιώντας Quick Spin στήλες Πρωτεΐνης (Roche).

ηλεκτροψεκασμού ιονισμού φασματομετρία μάζας

δείγματα Anamorsin σε 10 mM οξικό αμμώνιο ρΗ 7.5 με μία συγκέντρωση ~ 1 mg /ml αραιώθηκαν 100 φορές σε 50% μεθανόλη με 0,5% οξικό οξύ και εγχέεται μέσα σε ένα σύστημα τριπλού τετραπόλου Quattro Ultima (Waters). Τα φάσματα αποκτήθηκαν με τρόπο θετικού ιόντος με ένα εύρος m /z 500-2000. Μάζα αποσυνέλιξης πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του εργαλείου MassEnt1 στο πακέτο λογισμικού MassLynx.

Αποτελέσματα

NAF-1 ή MNT μπορεί να μεταφέρει οξειδώνεται συμπλέγματα τους 2Fe-2S για να απο-Anamorsin

Anamorsin έχει δύο θέσεις δέσμευσης 2Fe-2S, το καθένα με σιδηρορεδοξίνης-σαν 4-Cys σύμπλεγμα απολίνωση που διαφέρει από εκείνη των ΕΑΕΚ (3Cys: 1His). Αυτή η διαφορά στην πρόσδεση δίνει μια UV-Vis φάσμα απορρόφησης που είναι διαφορετική από εκείνη των πρωτεϊνών ΝΕΕΤ, κυρίως στην περιοχή 400-500 nm. Στην περιοχή αυτή έχει Anamorsin κορυφές απορρόφησης στα 423 και 458 nm, ενώ και οι δύο NAF-1 και ΜΝΤ έχουν μόνο μια κορυφή στα 458 nm (Σχήμα 1). Θα προσδιορίζεται η μοριακή συντελεστή απόσβεσης της κορυφής του συμπλέγματος Anamorsin 2Fe-2S στα 458 nm να είναι 5800 Μ

-1 εκατοστά

-1 ανά σύμπλεγμα, ενώ εκείνη των ΝΕΕΤ είναι 5000 Μ

-1 εκατοστά

-1 ανά σύμπλεγμα [29]. Χρησιμοποιούμε την αναλογία των 423 nm έως 458 nm για την παρακολούθηση της μεταφοράς των 2Fe-2S συστάδες από MNT ή NAF-1 για να απο-Anamorsin. Όπως συμβαίνει μεταφορά αναμένουμε η κορυφή 423 nm να αυξάνεται, και έτσι μια αύξηση στην αναλογία 423/458. Σε αντίθεση απώλεια του συμπλέγματος προς λύση θα οδηγούσε σε πλήρη απώλεια της ορατής απορρόφησης στην περιοχή 400-800 nm [19]. Για την παρασκευή της πρωτεΐνης για μελέτες μεταφοράς σύμπλεγμα 2Fe-2S, οι ελεύθερες κυστεΐνες της αρο-Anamorsin μειωμένη με προ-επώαση με DTT για 60 λεπτά για να εξασφαλιστεί ότι είναι έτοιμες για απολίνωση συμπλέγματος. Η πρώτη σάρωση κατά την έναρξη της μεταφοράς δείχνει μία οξειδωμένη φάσμα NEET, γεγονός που δείχνει ότι το μεγαλύτερο μέρος της DTT οξειδώνεται. Μειωμένη DTT θα μειώσει τις συστάδες ΝΕΕΤ [30], η οποία αναστέλλει τη μεταφορά [23]. Στη συνέχεια, NAF-1 ή ΜΝΤ προστέθηκε σε προ-μειωμένη Αρο-Anamorsin και η αντίδραση μεταφοράς σύμπλεγμα παρακολουθήθηκε με UV-Vis φασματοφωτομετρία. Η στοιχειομετρία της NAF-1 ή MNT να απο-Anamorsin επιλέχθηκε για να παρέχει ένα σύμπλεγμα 2Fe-2S ανά Anamorsin όπως είχε αρχικά αναφερθεί ότι τόσο συμπλέγματος θέσεις δέσμευσης δεν θα μπορούσε να ανασυσταθεί ταυτόχρονα [24, 27]. Κάτω από οξειδωτικές συνθήκες έσοδα μεταφορά από τόσο NAF-1 και MNT χωρίς απώλεια των συνεργατικών σχηματισμών σε λύση και τα δεδομένα είναι καλά ταιριάζει σε ένα ενιαίο εκθετική φάση (Σχήμα 2). NAF-1 μεταφορά προχώρησε στην ολοκλήρωση, ενώ MNT μεταφέρεται ~ 80% των συστάδων του δείχνει αποτελεσματική μεταφορά είτε από ΝΕΕΤ πρωτεΐνη για να Anamorsin. Σαρώνει σε επιλεγμένα χρονικά σημεία μπορεί να δει κανείς στο S1 Εικ. Μειωμένη DTT έχει δειχθεί σε ορισμένες περιπτώσεις ότι προκαλούν μεταφορά σύμπλεγμα [31]. Για να ελεγχθεί αν αυτή ήταν η περίπτωση για ΝΕΕΤ-Anamorsin, DTT απομακρύνθηκε από apo-Anamorsin ακόλουθη επώαση 60 λεπτών με αυτόν τον παράγοντα. Η DTT δωρεάν apo-Anamorsin είναι άμεσα σε θέση να λάβει τις συστάδες NEET (S2 ​​σχήμα). Αυτό δείχνει ότι ΝΕΕΤ-Anamorsin μεταφορά του συμπλέγματος είναι ένα μόνο πρωτεΐνη-μεσολάβηση εκδήλωση.

Α. (Top) κρυσταλλικές δομές MNT (κωδικός ΠΠ: 2QH7,), NAF-1 (κωδικός ΠΠ: 3FNV)? (Μέση) cluster ΝΕΕΤ 2Fe-2S με 3-Cys: συντονισμός 1His? φάσματα (Κάτω) Απορρόφηση των 25 μΜ MNT και NAF-1. δομή Β (Top) Κρύσταλλο του Ν-τερματικό πεδίο του Anamorsin (κωδικός ΠΣΠ: 2YUI) με ένα προστιθέμενο σχηματική της μη δομημένων συμπλέγματος 2Fe-2S πεδίο σύνδεσης? cluster (Μέση) Εκπρόσωπος Anamorsin 2Fe-2S με συντονισμό 4-Cys (από φερρεδοξίνη, κωδικός ΠΣΠ: 1RFK)? (Κάτω) Απορρόφηση φάσμα των 43 μΜ Anamorsin απομονωθεί από

E

.

coli

.

Η

Η αντίδραση μεταφοράς συμπλέγματος 2F-2S παρακολουθήθηκε με φασματοσκοπία απορρόφησης UV-Vis. Η πρόοδος της μεταφοράς απεικονίστηκε γραφικά έναντι του χρόνου. μεταφορά Cluster από NAF-1 (Α) και MNT (Β) προς απο-Anamorsin συμβαίνει μόνο όταν το σύμπλεγμα 2Fe-2S οξειδώνεται και όχι όταν ανάγεται με 10 mM διθειονικό νάτριο. Αντικατάσταση του συντονιστικού κατάλοιπο του με Cys (H114C για NAF-1 και H87C για MNT) αναστέλλει, αλλά δεν καταργεί τη μεταφορά. Όλα τα ίχνη φαίνεται ελήφθησαν με 25 μΜ NAF-1 ή ΜΝΤ (50 μΜ 2Fe-2S συστάδες) και 50 μΜ απο-Anamorsin σε 50 mM bis tris, 100 mM NaCl, 2.5 mM DTT, ρΗ 7,0 στους 37 ° C.

έχουμε δοκιμαστεί περαιτέρω εάν η μεταφορά του συμπλέγματος 2Fe-2S από τις πρωτεΐνες ΝΕΕΤ να απο-Anamorsin εξαρτάται από την κατάσταση οξείδωσης του συμπλέγματος, όπως διαπιστώσαμε σε προηγούμενες μελέτες με τη μεταφορά του συμπλέγματος για να απο-φερρεδοξίνη [22, 23]. Η μειωμένη φάσμα NEET έχει δύο διακριτές κορυφές (S3 Εικ), σε αντίθεση με την featureless φάσμα των μειωμένων Anamorsin [27]. Όταν η συστάδα ΝΕΕΤ 2Fe-2S είναι προ-ανάγεται με διθειονώδες νάτριο καμία μεταφορά προς απο-Anamorsin παρατηρήθηκε (Σχήμα 2). Αυτό το εύρημα δείχνει ότι ΝΕΕΤ μεταφορά του συμπλέγματος να Anamorsin απαιτεί οξειδωμένη 2Fe-2S συστάδες όπως έχουμε διαπιστώσει στο παρελθόν για τη μεταφορά από τις πρωτεΐνες ΝΕΕΤ να απο-φερρεδοξίνη, καθώς παρατηρήθηκε για μεταφορά από το σίδηρο-θείο ISCU πρωτεΐνης συναρμολόγησης για να απο-Fd [32] .

Δοκιμάσαμε επιπλέον τη σημασία της ενιαίας συνδέτη του mNT και NAF-1 για την αποτελεσματική μεταφορά του συμπλέγματος. Αντικατάσταση των συντονιστικών υπολείμματα His με Cys στις NAF-1 (H114C) και σε MNT (H87C) ανέστειλαν μεταφορά σε Αρο-φερρεδοξίνη [22, 23, 33, 34]. Τα φάσματα του NAF-1 H114C μεταλλαγμένο και ΜΝΤ H87C μεταλλαγμένο μπορεί να φανεί στο S4 Σχ. Ομοίως διαπιστώνουμε ότι η μεταφορά συμπλέγματος σε Αρο-Anamorsin ανεστάλη επίσης κατά περισσότερο από 10 φορές σε αυτά τα μεταλλάγματα (Σχήμα 2).

ποσοστά Μεταφορά πρωτεϊνών ΝΕΕΤ είναι παρόμοια με εκείνα των γνωστών ανθρώπινων πρωτεϊνών σύμπλεγμα μεταφοράς

Μεταφορά 2Fe-2S clusters σε apo-δέκτη πρωτεϊνών έχει περιγραφεί ως δεύτερης τάξης [32, 35]. Ως εκ τούτου δοκιμάστηκε μεταφορά σύμπλεγμα από MNT ή NAF-1 με Αρο-Anamorsin σε διαφορετικές συγκεντρώσεις των ΝΕΕΤ διμερούς δότες (3.13 μΜ, 6.25 μΜ, 12.5 μΜ και 25 μΜ). Ο παρατηρούμενος ρυθμός για κάθε συγκέντρωση (k

obs) ήταν γραμμικά εξαρτάται από τη συγκέντρωση της πρωτεΐνης NEET (Σχήμα 3). Η φαινόμενη σταθερά ρυθμού δεύτερης τάξης (

k

2) για κάθε προσδιορίστηκε από τη γραμμική ταιριάζει με το k

obs τιμές. Η

k

2 τιμές υπολογίστηκαν για NAF-1 και MNT είναι 600 ± 90 Μ

-1 min

-1 και 460 ± 60 Μ

-1 min

-1 αντίστοιχα, τα οποία είναι παρόμοια με βαθμολογήσουν σταθερές μετρήθηκε για το ανθρώπινο 2Fe-2S πρωτεΐνες μεταφοράς σύμπλεγμα ISCA και ISCU [32, 35] (Πίνακας 1). Οι ταχύτητες μεταφοράς ορισμένων πρωτεϊνών μεταφοράς 2Fe-2S ενισχύεται από ΑΤΡ-εξαρτώμενη συνοδοί. ISCU από

Azotobacter vinelandii

παρουσία του συστήματος cochaperone HscA /HscB και αναγκαίο συμπαράγοντες μεταβιβάσεις με ένα σταθερό ρυθμό που αναφέρθηκαν που είναι μόνο ελαφρώς μεγαλύτερες από εκείνες των πρωτεϊνών ΝΕΕΤ [36] (Πίνακας 1). Μια πρόσθετη ομοιότητα μεταξύ των ΝΕΕΤ και ISCU είναι η απαίτηση για την οξείδωση του συμπλέγματος 2Fe-2S για τη μεταφορά [32]. Στο σύνολό τους, η μεταφορά και ISCU αποτελεσματικά ΕΑΕΚ και είναι πιθανό να λειτουργούν με παρόμοιο τρόπο.

NAF-1 (Α) και MNT (Β) μεταφορά σε apo-Anamorsin παρακολουθήθηκε με φασματοσκοπία απορρόφησης UV-Vis για μια σειρά συγκεντρώσεων ΝΕΕΤ. Για κάθε συγκέντρωση ΝΕΕΤ διατηρήθηκε η αναλογία 1 ΝΕΕΤ διμερές ανά 2 apo-anamorisn. Η σταθερά ρυθμού, k

obs, προσδιορίζεται από την προσαρμογή των δεδομένων σε εκθετική άνοδος και παριστάνεται γραφικά έναντι της συγκέντρωσης για NAF-1 (C) ή MNT (D). Η κλίση της καλύτερης γραμμής ταιριάζει αυτή χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό φαινομένων σταθερών ρυθμού δεύτερης τάξης (

k

2) για NAF-1 και MNT, τα οποία είναι 600 ± 90 Μ

-1 min

-1 και 460 ± 60 Μ

-1 min

-1, αντίστοιχα.

η

Εδώ έχουμε αποδείξει ότι οι 2Fe-2S clusters μεταφέρθηκε στο Anamorsin από τις πρωτεΐνες ΝΕΕΤ. Για να αντιμετωπίζεται το ενδεχόμενο ότι οι ΕΑΕΚ είναι απλά προμηθευτές του σιδήρου και θειούχου μέσω ενός μηχανισμού απελευθερώσεως και σύλληψη, πραγματοποιήσαμε μεταφορά με την παρουσία του EDTA (ενός χηλικοποιητή του σιδήρου η οποία απομονώνει τον ελεύθερο σίδηρο και έτσι αναστέλλει τη συναρμολόγηση σύμπλεγμα). Ενώ το ελεύθερο σίδηρο και σουλφίδιο μπορεί να σχηματιστεί αυθόρμητα συστάδες στις Anamorsin [24, 27], EDTA καταργεί τη διάταξη. Ωστόσο, μεταφορά από κάθε μία από τις ΕΑΕΚ να απο-Anamorsin προχωρά αποτελεσματικά σε παρουσία EDTA (S5 Εικ). Ως εκ τούτου, ο ρόλος των ΕΑΕΚ »σε αυτή τη διαδικασία είναι πέρα ​​από την απλή παροχή σιδήρου και θειούχου και άμεση αλληλεπίδραση είναι απαραίτητη για την αποτελεσματική μεταφορά.

NAF-1 ή MNT συνδέονται άμεσα με apo-Anamorsin

Για να διερευνήσουν η δυνατότητα για αλληλεπίδραση πρωτεΐνης-πρωτεΐνης μεταξύ των πρωτεϊνών ΝΕΕΤ και Anamorsin χρησιμοποιήσαμε βιοστρώματος συμβολομετρίας (BLI). Τόσο NAF-1 και ΜΝΤ δεσμεύονται άμεσα με ακινητοποιημένο απο-Anamorsin. Οι καμπύλες σύνδεσης και αποσύνδεσης φαίνεται στο σχήμα 4. On-(

k

σχετικά) και off-ποσοστά (

k

off) που μετράται για κάθε αλληλεπίδραση που φαίνεται στο Πίνακας 2. η on-τιμές για NAF-1 και mNT διαφέρουν κατά έναν παράγοντα δύο, ενώ το off-ρυθμό του ΝΑΡ-1 είναι ~ 18 φορές πιο γρήγορα από ό, τι εκείνη του mNT. Αναλύσαμε επίσης την πρόσδεση των ολο-ΕΑΕΚ να ολο-Anamorsin (S6 Σχήμα).

Σενσογράμματα για την πρόσδεση του ολο-NAF-1 (Α) και ολο-ΜΝΤ (Β) σε βιοτινυλιωμένη απο-Anamorsin ακινητοποιημένη σε επικαλυμμένα με στρεπταβιδίνη βιοαισθητήρες απεικονίζονται. Η ένωση ακολουθήθηκε για 900 δευτερόλεπτα (η αύξηση του σήματος) που ακολουθείται από 1.800 δευτερόλεπτα της διάστασης (σήμα σάπια). Τα δεδομένα ταιριάζουν με ένα πρότυπο ενός-προς-ένα (μαύρο καμπύλες). Εντός και εκτός τιμές προσδιορίστηκαν από τις κρίσεις για κάθε συγκέντρωση ΝΕΕΤ-Anamorsin (όπως φαίνεται στον Πίνακα 2).

Η

ΝΕΕΤ πρωτεΐνες μπορεί να μεταφέρει σε κάθε μία από τις θέσεις του συμπλέγματος δέσμευσης Anamorsin

Anamorsin έχει δύο 2Fe-2S θέσεις δέσμευσης του συμπλέγματος και

in vitro

χημική ανασύσταση έδειξε ότι κάθε ιστοσελίδα σύμπλεγμα θα μπορούσε να ανασυσταθεί, αλλά η σύνδεση του συμπλέγματος ήταν αμοιβαία αποκλειόμενα [27]. Αναφερόμαστε στην πρώτη θέση ως C1 και η δεύτερη ως C2 (Σχήμα 5Α). Anamorsin μεταλλάκτες που περιέχουν μόνο μια μονή θέση σύμπλεγμα δέσμευσης παρήχθησαν στα οποία όλα τα τέσσερα υπολείμματα κυστεΐνης από την άλλη τοποθεσία αντικαταστάθηκαν με σερίνες για τη δοκιμή για πιθανή προτιμησιακή μεταφορά από MNT ή NAF-1 με Αρο-Anamorsin. Το φάσμα απορρόφησης για κάθε μεταλλάκτη μπορεί να φανεί στο S7 Σχ. Όπως φαίνεται στο σχήμα 5, κάθε μεταλλαγμένο Anamorsin έλαβε συστάδες από κάθε πρωτεΐνη δότη NEET δείχνει λίγο προτίμηση για μεταφορά είτε στις θέσεις δέκτη C1 ή C2

Anamorsin μεταλλάκτες που περιέχει μία μοναδική θέση συμπλέγματος δέσμευσης απεικονίζονται.? η άλλη θέση σύμπλεγμα διαταράχθηκε με αντικατάσταση όλων των υπολειμμάτων Cys με Ser. (Α) Σχηματικά της Anamorsin-C1 (πράσινο) και Anamorsin-C2 (ματζέντα) παρουσιάζονται. 2Fe-2S μεταφορά σύμπλεγμα από NAF-1 (Β) ή MNT (C) σε κάθε μονό δέσμευσης Apo-Anamorsin μεταλλαγμένο σύμπλεγμα παρακολουθήθηκε με φασματοσκοπία απορρόφησης UV-Vis. Ίχνη ελήφθησαν με 25 μΜ NAF-1 ή MNT (50 μΜ 2Fe-2S clusters) και 50 μΜ apo-Anamorsin.

Η

NAF-1 ομοδιμερή μπορεί να παρέχει και τις δύο συστάδες 2Fe-2S να Anamorsin

Λαμβάνοντας υπόψη τα πιο πάνω αποτελέσματα, αποφασίσαμε να ελέγξετε αν είναι είτε ένα ομοδιμερές ΝΕΕΤ θα μπορούσε να προμηθεύσει 2Fe-2S συσπειρώσεις και στις δύο θέσεις δέκτη C1 και C2 του ενιαίου apo-Anamorsin. Cluster μεταφορά μετρήθηκε για NAF-1 με σύμπλεγμα στοιχειομετρική δότη σε θέσεις δέκτη (50 μΜ NAF-1 διμερές και 50 μΜ apo-Anamorsin) (Σχήμα 6Α). Εστιάσαμε στην NAF-1, γιατί μόνο NAF-1 έδειξε πλήρη μεταφορά με περίσσεια apo-Anamorsin (Σχήμα 2). Μεταφορά των ~ 1,5 2Fe-2S συστάδες ανά Anamorsin βρέθηκε, αναπάντεχα δείχνουν ότι τουλάχιστον το ήμισυ των πρωτεϊνών Anamorsin δεκτές δύο συστάδες μετά από επώαση με NAF-1. Δεν παρατηρήσαμε καμία απώλεια της διασποράς να λύση (φασματικό πλάτος). Καθώς τα δεδομένα είναι καλά ταιριάζει σε ένα μόνο εκθετικής φάσης, οι δύο συστάδες μεταφέρονται σε κινητικά δυσδιάκριτες βήματα. Η απλούστερη εξήγηση είναι ότι και οι δύο συστάδες μεταφέρονται σε ένα ενιαίο δεσμευτικό γεγονός, αν και μπορεί να βρίσκονται σε ελαφρώς διαφορετικά ποσοστά λόγω της διαφορετικής σύνθεσης αμινοξέων γύρω από τις δύο θέσεις του συμπλέγματος δέσμευσης Anamorsin. Η ελλιπής μεταφορά μπορεί να οφείλεται σε σχηματισμό ενδομοριακών δισουλφιδικών δεσμών σε apo-Anamorsin ή πιθανόν λόγω τροποποιημένη κυστεΐνη πλευρικές αλυσίδες σε apo-Anamorsin. Ο πρώην προτάθηκε προηγουμένως για ελλιπή μεταφορά από ISCU να απο-φερρεδοξίνη [32]. Για να επιβεβαιώσετε το σχηματισμό πλήρως κατεχόμενη ολο-Anamorsin μετά τη μεταφορά από NAF-1 που χρησιμοποιείται ηλεκτροψεκασμού ιονισμού φασματομετρία μάζας (ESI-MS). Η ολο-Anamorsin σχηματίζεται με μία αντίδραση μεταφοράς με NAF-1 καθαρίστηκε από NAF-1 χρησιμοποιώντας χρωματογραφία ανταλλαγής ανιόντων. Το προκύπτον ολο-Anamorsin αναλύθηκε με ESI-MS. Επιπλέον, έχουμε αποκτήσει ESI-MS φάσματα για apo-Anamorsin και Anamorsin όπως καθαρίζεται από το

E

.

coli

. Οι προκύπτουσες φάσματα φαίνεται στο Σχ 6Β. Η αναμενόμενη μάζα για την απο-Anamorsin κατασκευή είναι 35.614 Da και η αναμενόμενη μάζα ενός συμπλέγματος 2Fe-2S είναι 176 Da. Θεωρούμε ότι η Anamorsin καθαρίζεται από

E

.

coli

είναι κατά κύριο λόγο περιέχει ένα ενιαίο σύμπλεγμα, ενώ το μεγαλύτερο μέρος της Anamorsin μετα-μεταφοράς περιέχει δύο 2Fe-2S clusters? προηγουμένως χημική ανασύσταση αναφερθεί χωρητικότητα διασποράς να είναι αμοιβαία αποκλειόμενα [27]. Το αποτέλεσμα αυτό δείχνει την αναγκαιότητα της άμεσης μεταφοράς για να ενεργοποιήσετε Anamorsin.

(Α) 2Fe-2S μεταφορά από 50 μΜ διμερή NAF-1-50 μΜ apo-Anamorsin (δύο 2Fe-2S συστάδες ανά Anamorsin) (φαίνεται στο κόκκινο) συγκρίνεται με 25 μΜ NAF-1 έως 50 μΜ apo-Anamorsin (μία 2Fe-2S συστάδα ανά Anamorsin) (που φαίνεται στο μπλε). Transfer είναι σχεδόν πλήρης για το ένα σύμπλεγμα 2Fe-2S ανά δείγμα Anamorsin και είναι περίπου 75% πλήρης για τις δύο σύμπλεγμα 2Fe-2S ανά δείγμα Anamorsin. Το τελευταίο αποτέλεσμα δείχνει ότι τουλάχιστον το ήμισυ του Anamorsin είναι ικανό να λαμβάνει δύο 2Fe-2S συστάδες από ένα μόνο NAF-1 ομοδιμερές. (Β) Anamorsin μετά από αντίδραση μεταφοράς με NAF-1 καθαρίστηκε και αναλύθηκε με ESI-MS (φαίνεται σε κόκκινο). Φάσματα μάζας των apo-Anamorsin (στερεά μαύρη γραμμή) συγκρίνεται με την κύρια αιχμή για την μετα-μεταφορά Anamorsin (στερεά κόκκινη γραμμή), που δείχνει μια αύξηση στην μάζα που αντιστοιχεί στην ενσωμάτωση των δύο 2Fe-2S clusters. Υπάρχει επίσης μια μικρή κορυφή στα 35.856 Da που πιθανότατα αντιστοιχεί σε Anamorsin με ένα ενιαίο σύμπλεγμα 2Fe-2S και ενός ιόντος σιδήρου δεσμεύεται ότι μπορεί να είναι ένα απομεινάρι του ένα σύμπλεγμα που αποδομούνται κατά τη διάρκεια της διαδικασίας προετοιμασίας του δείγματος.

E

.

coli

θραύσματα κατσικίσιας Anamorsin παρουσιάζεται για σύγκριση (διακεκομμένη γραμμή), που δείχνει Anamorsin που περιέχει ένα ενιαίο σύμπλεγμα 2Fe-2S.

Η

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, προσδιορίζονται Anamorsin ως το πρώτο ανθρώπινο 2Fe-2S πρωτεΐνη υποδοχέα συμπλέγματος τόσο για τον σχετίζονται με τον καρκίνο OMM mNT και πρωτεΐνες NAF-1. Πρόσφατα, Ferecatu

et al

. [37] διαπίστωσε ότι MNT αποκτά 2Fe-2S συστάδες του από το μιτοχονδριακό σύστημα ISC. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι από τη στιγμή που λαμβάνονται, MNT (και NAF-1) μπορεί να μεταφέρει 2Fe-2S συμπλέγματα της να Anamorsin παρέχοντας έτσι μια καλά καθορισμένη διαδρομή από την ISC με τη CIA μέσω της εξωτερικής μεμβράνης δεμένοι MNT (Σχήμα 7).

mNT στο OMM και NAF-1 στο MAM λαμβάνουν 2Fe-2S συστάδες που παράγονται στο εσωτερικό των μιτοχονδρίων από το σύστημα ISC. Τόσο MNT και NAF-1 μεταφορά αυτά 2Fe-2S clusters σε Anamorsin. Anamorsin δέχεται ηλεκτρόνια από το diflavin αναγωγάσης NDOR1 και να τους προμηθεύει με το σύστημα της CIA ως ένα πρώιμο βήμα απαραίτητο για την παραγωγή των 4Fe-4S clusters. Αυτό το βήμα απαιτεί την ολο μορφή Anamorsin. Τόσο MNT και NAF-1 μπορεί να παρέχει παράλληλα δρομολόγια που συνδέουν CIA στην ISC. CIA παράγονται συστάδες απευθύνονται σε πρωτεϊνών στο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα και είναι σημαντικές για το μεταβολισμό των κυττάρων, τη συντήρηση και τον πολλαπλασιασμό.

Η

Anamorsin, η οποία αποτελεί βασική συνιστώσα της CIA, λιμάνια σύμπλεγμα δύο Fe-S που δεσμεύουν χώρους και βρήκαμε ότι mNT ή NAF-1 μπορεί να μεταφέρει 2Fe-2S clusters σε δύο τοποθεσίες συμπλέγματος δέσμευσης. Οι πρωτεΐνες ΝΕΕΤ μπορεί να παρέχει όλες τις απαραίτητες clusters για την ενεργοποίηση Anamorsin για τη λειτουργία μεταφοράς ηλεκτρονίων του. Αυτό συνδέει τώρα την ανάγκη για μιτοχονδριακή συναρμολόγηση συμπλέγματος Fe-S με τη λειτουργία της κυτοσολικής CIA [37, 38].

Η τοποθεσία του NEET κατά τη OMM /ΜΑΜ και μεταφορά του συμπλέγματος λειτουργία ομοιότητες τους να ISCU δείχνουν ότι μπορεί να είναι μέρος ενός μονοπατιού που συνδέει μιτοχονδριακού συναρμολόγηση 2Fe-2S στο σύστημα CIA. Ενώ Ferecatu

et al

. έδειξαν ότι knockdown του ΜΝΤ δεν είχε σημαντική επίδραση στην ωρίμανση του CIA που εξαρτώνται από πρωτεΐνες Fe-S [37], δείχνουμε ότι NAF-1 είναι πιο αποτελεσματική στη μεταφορά προς Αρο-Anamorsin και μπορεί να είναι μία παράλληλη διαδρομή με την CIA .

Οι ιδιότητες των πρωτεϊνών ΝΕΕΤ δείχνουν ότι εκτός από την μιτοχονδριακή 2Fe-2S μεταφορές, που λειτουργούν ως ταμιευτήρες επιτρέποντας 2Fe-2S clusters να συναρμολογούνται υπό ευνοϊκές συνθήκες στο εσωτερικό των μιτοχονδρίων και αποθηκεύονται για ταχύτερη διαθεσιμότητα κατά του κυτταροπλάσματος 2Fe οι -2S συμπλέγματα χρειάζονται. Αυτό θα επιτρέψει την ταχύτερη απόκριση στις άμεσες ανάγκες από ό, τι θα ήταν δυνατόν εάν μιτοχονδριακή συναρμολόγησης και μεταφορών μέσω δύο μεμβράνες να κυτταροπλασματικών πρωτεϊνών. Προς υποστήριξη αυτής της λειτουργίας, MNT βρέθηκε πρόσφατα να ανασυνθέσει /επισκευή του συμπλέγματος 4Fe-4S της κυτοσολικής σιδήρου ρυθμιστικής πρωτεΐνης 1 (IRP1? Κυτοσολικής ακονιτάση) μετά από οξειδωτική βλάβη [37]. Έτσι, οι ΕΑΕΚ μπορεί να λειτουργήσει σε μεταφορά 2Fe-2S συστάδες έξω από τα μιτοχόνδρια, καθώς και μια δεξαμενή άμεσα διαθέσιμες συστάδων 2Fe-2S.

NAF-1, ΜΝΤ και Anamorsin έχουν κάθε ενοχοποιηθεί στον καρκίνο [15 , 39-41]. Και οι δύο πρωτεΐνες ΝΕΕΤ είναι υπερ-εκφράζεται σε επιθηλιακά κύτταρα καρκίνου του μαστού, και μειώνοντας την έκφρασή τους μέσω shRNA knockdowns αποτέλεσμα μειωμένο πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και μειωμένη ανάπτυξη του όγκου. Όπως Fe-S πρωτεΐνες είναι απαραίτητες για την αντιγραφή του DNA και την κυτταρική ανάπτυξη, η ανάγκη για γρήγορη παροχή συμπλεγμάτων Fe-S συνδέει βολικά τις πρωτεΐνες NEET σε πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων. Επιπλέον, το ομόλογο ζυμομύκητα Anamorsin (Dre2) απαιτείται για τη συναρμολόγηση του διφερρική-τυροσυλ ρίζα συμπαράγοντα αναγωγάσης ριβονουκλεοτιδίου [42], η οποία είναι απαραίτητη για την παραγωγή των δεοξυνουκλεοτιδίων. Μια περιορισμένη διαθεσιμότητα δεοξυνουκλεοτιδίων θα αναστέλλουν επίσης την αντιγραφή του DNA και έτσι τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων. Στόχευση των πρωτεϊνών NEET μπορεί να είναι ένα βολικό μέσο για τον έλεγχο πολλών διαδικασιών που απαιτούνται για την ταχεία εξάπλωση των καρκινικών κυττάρων με τη δυνατότητα να ρυθμίζουν τη χρήση μικρών μόριο στόχευσης των πρωτεϊνών ΝΕΕΤ [43].

Σε αυτή τη μελέτη, παρέχουμε μια καλά καθορισμένη σχέση μεταξύ της ISC και τα συστήματα της CIA μέσω mNT και NAF-1, τα οποία είναι τα μόνα γνωστά 2Fe-2S πρωτεϊνών που σχετίζονται με την OMM. Θα δείξουμε ότι οι πρωτεΐνες ΝΕΕΤ μπορεί να μεταφέρει δύο 2Fe-2S συστάδες τους μέσω ενός άμεση αλληλεπίδραση πρωτεΐνης-πρωτεΐνης για να ενεργοποιήσετε την απαραίτητη πρωτεΐνη CIA, Anamorsin.

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 Εικ.