Αφηρημένο

Η συσχέτιση επιδημιολογικές μεταξύ της χρήσης στατινών και μειωμένο κίνδυνο προχωρημένου καρκίνου του προστάτη δείχνει ότι οι στατίνες μπορεί να αναστέλλει την ανάπτυξη του καρκίνου του προστάτη ή /και της προόδου. Πραγματοποιήθηκαν μελέτες για τον προσδιορισμό των αποτελεσμάτων ενός μοντέλου στατίνη, ατορβαστατίνη (ΑΤΟ), επί του πολλαπλασιασμού και της διαφοροποίησης των κυττάρων καρκίνου του προστάτη, και να εντοπίσει πιθανές μηχανισμούς δράσης ΕΦΕ. ΑΤΟ ανέστειλε την

in vitro

πολλαπλασιασμό τόσο LNCaP και PC3 κυττάρων καρκίνου του προστάτη στον άνθρωπο σε μια δόση και το χρόνο εξαρτώμενο τρόπο. Η μεγαλύτερη ανασταλτική δράση του ΑΤΟ σε κύτταρα PC3 συνδέθηκε με επαγωγή αυτοφαγία στην εν λόγω κυτταρική γραμμή, όπως αποδεικνύεται από την αυξημένη έκφραση του LC3-ΙΙ. miR-182 ρυθμίζεται αυξητικά με συνέπεια από ΑΤΟ σε κύτταρα PC3, αλλά όχι σε κύτταρα LNCaP. ATO ρύθμιση προς τα άνω του miR-182 σε κύτταρα PC3 ήταν p53-ανεξάρτητη και ανατράπηκε από geranylgeraniol. Η επιμόλυνση των αναστολέων miR-182 μειωμένη έκφραση του miR-182 με (D) Κύτταρα PC3 διαμολύνθηκαν με αρνητικό έλεγχο (NegCon), miR-182 μιμούνται (miR182-mi), ή miR-182 αναστολέα (miR182-in) για 24 ή /και 48 ώρες, που ακολουθείται από ανάλυση της έκφρασης του miR -182 (C), Bcl2 και p21 (D). C επιβεβαιώνει την επιτυχή επιμόλυνση miR182-mi και miR182-in με ανίχνευση αυξημένη ή μειωμένη έκφραση του miR-182. D δείχνει την κατάσταση έκφρασης Bcl2 και p21 στο mRNA (επάνω) και τα επίπεδα πρωτεΐνης (κάτω) στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. miR-182 υπερέκφραση μειωμένη έκφραση Bcl2 mRNA, αλλά είχε ελάχιστη επίδραση στην έκφραση της πρωτεΐνης του? ενώ miR-182 knock-down δεν είχε καμία επίδραση στην έκφραση Bcl2 mRNA, αλλά αυξημένη έκφραση της πρωτεΐνης του. ρ21 συσχετίστηκε θετικά με την έκφραση miR-182 τόσο σε mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης. Ακτίνης ή α-τουμπουλίνης χρησίμευσαν ως μάρτυρες φόρτωσης για έκφραση πρωτεΐνης.

Η

Βρήκαμε επίσης ότι ο αναστολέας ρ21 CDK, ένα σημαντικό αρνητικό ρυθμιστή του κυτταρικού κύκλου, είναι σταθερά επάνω ρυθμισμένη σε κύτταρα PC3 που εκτίθενται σε ΑΤΟ , up-ρύθμιση του p21 με την ATO αποδείχθηκε τόσο σε επίπεδο mRNA και πρωτεΐνης (Εικ. 5Β).

Μια σειρά από μελέτες επιμόλυνσης έγινε για να διευκρινιστεί η σχέση μεταξύ της έκθεσης ATO, miR-182 έκφρασης, και mRNA Bcl2 και ρ21 και η έκφραση πρωτεΐνης σε κύτταρα PC3. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5C, η επιμόλυνση του miR-182 μιμούνται αυξημένη miR-182 έκφραση με 400-500 φορές και στα δύο 24 ώρες και 48 ώρες μετά την επιμόλυνση? Αντιθέτως, η επιμόλυνση του αναστολέα miR-182 κατασταλεί η έκφραση του miR-182 με & gt? 98%. Η υπερέκφραση του miR-182 μείωσε τα επίπεδα Bcl2 mRNA κατά 26% (ρ & lt? 0,05), αλλά δεν είχε καμία σημαντική επίδραση στην έκφραση πρωτεΐνης Bcl2 στις 48 ώρες. Η επιμόλυνση του αναστολέα miR-182 δεν είχε καμία επίδραση στην έκφραση Bcl2 mRNA, αλλά αύξησε σημαντικά την έκφραση πρωτεΐνης Bcl2 (Σχ. 5D). Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι Bcl2 είναι ένας άμεσος στόχος του miR-182 σε κύτταρα PC3? δεδομένου ότι το βασικό επίπεδο της πρωτεΐνης της Bcl2 ήταν ήδη χαμηλό, υπήρχε μικρή έκφραση της πρωτεΐνης να δείχνουν πιο κάτω ρύθμιση μέσω miR-182 υπερέκφραση. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν επίσης ότι το miR-182 δεν μπορεί να συνεισφέρει σε BCL2 κάτω ρύθμιση για την αντιμετώπιση της ΑΤΟ σε κύτταρα PC3.

Αντίθετα, ρ21 δεν αναγνωρίστηκε ως άμεσο στόχο miR-182 είτε με TargetScan ή PicTar . Είναι ενδιαφέρον ότι, η έκφραση ρ21 συσχετίστηκε θετικά με την έκφραση miR-182 τόσο σε mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης (Εικ. 5D). Η υπερέκφραση του miR-182 αυξημένη έκφραση του mRNA p21 κατά 57% (p & lt? 0,05), ενώ το knock-down του miR-182 με επιμόλυνση αναστολέας miR-182 μειωμένη έκφραση του mRNA p21 κατά 36% (p & lt? 0,05). Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η p21 είναι μια έμμεση στόχος του miR-182, και ότι miR-182 μπορεί να συμβάλλει με κάποιο τρόπο να p21 πάνω ρύθμιση από την ATO στα κύτταρα PC3.

Επίδραση του Mir-182 Έκφραση επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε απάντηση στην ATO τον Pc 3 κύτταρα

Για να εξετάσει το λειτουργικό ρόλο του miR-182 ως μεσολαβητής των απαντήσεων ATO, miR-182 έκφρασης χειραγωγείται από την επιμόλυνση miR-182 μιμούνται ή miR-182 αναστολέα σε κύτταρα PC3 . Τα επιμολυσμένα κύτταρα εκτέθηκαν σε χαμηλή συγκέντρωση ΑΤΟ (2,5 μΜ) για 4 ημέρες, ακολουθούμενη από ποσοτικοποίηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού με ΜΤΤ (Εικ. 6Α) ή δοκιμασίας CV (Εικ. 6Β). Η συγκέντρωση 2,5 μΜ ΑΤΟ χρησιμοποιήθηκε προκειμένου να καταστεί δυνατή η μελέτη των διαφορικών αποκρίσεων που προκύπτουν από τη χειραγώγηση της έκφρασης miR-182. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6Α, η υπερέκφραση του miR-182 σε μη επεξεργασμένα κύτταρα ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό κατά 36% (p & lt? 0.001)? knock-down του miR-182 σε κατά τα άλλα μη επεξεργασμένα κύτταρα αυξημένο πολλαπλασιασμό κατά 43% (p & lt? 0.001). miR-182 υπερέκφραση δεν μετέβαλε PC3 κυττάρων απαντήσεις σε ATO? Ωστόσο, knock-down του miR-182 μείωσε την δραστικότητα του ΑΤΟ ως αναστολέας του πολλαπλασιασμού των κυττάρων (Σχ. 6Α). Με την παρουσία του ΑΤΟ, η απορρόφηση παράγεται από miR-182 αναστολέα-επιμολυσμένων κυττάρων αυξήθηκε κατά 89% (ρ & lt? 0.001, η = 8) σε σύγκριση με κύτταρα αρνητικού ελέγχου επιμολυσμένα. Σύκο. 6Β δείχνει τις εικόνες της χρώσης CV σε 4 ημέρες μετά την επιμόλυνση του miR-182 μιμούνται και ο αναστολέας miR-182 σε κύτταρα PC3. Η δοκιμασία CV έδειξαν παρόμοια αποτελέσματα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται), όπως ΜΤΤ δοκιμασία. Αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι miR-182 αναστέλλει άμεσα τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων PC3, και μπορεί επίσης να μεσολαβήσει στην καταστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων που προκαλείται από ΕΦΕ.

(Α) κύτταρα PC3 διαμολύνθηκαν με miR-182 μιμούνται (miR182-mi , 20 ηΜ) και miR-182 αναστολέα (miR182-in, 20 ηΜ) σε 48 φρεατίων αντίστοιχα με miRNA μιμητικό που έχει επιβεβαιωθεί ότι έχουν ελάχιστη ταυτότητα αλληλουχίας με miRNAs σε ανθρώπινο ως αρνητικός έλεγχος (NegCon, 20 ηΜ) και στη συνέχεια κατεργάζεται με 2.5 μΜ ΑΤΟ για 4 ημέρες, ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός εκτιμήθηκε με δοκιμασία ΜΤΤ. Οι τιμές απορρόφησης εκφράζονται ως μέση ± SD, *** ρ & lt? 0.001, η = 8. (Β) κύτταρα PC3 διαμολύνθηκαν όπως περιγράφεται στο Α, και καλλιεργήθηκαν για άλλες 4 ημέρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες χρησιμοποιώντας πρότυπες διαδικασία δοκιμασίας CV? εικόνες κατάστασης πολλαπλασιασμού των κυττάρων καταγράφηκαν με μικροσκοπία. (Γ) Κύτταρα PC3 διαμολύνθηκαν με ένα αρνητικό μάρτυρα ή αναστολέα miR-182, στη συνέχεια κατεργάζεται με 2,5 μΜ ΑΤΟ για 48 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν για ανάλυση Western blot της έκφρασης LC3-ΙΙ. Ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Μια αντιπροσωπευτική κηλίδα western δείχνεται. Οι τιμές κάτω από κάθε ζώνη αντιπροσωπεύει την κανονικοποιημένη ένταση LC3-II (συνολικά pixels) του παρουσιάζονται Western Blot, όπως καθορίζεται από το UN-SCAN-IT λογισμικού (Silk Scientific Inc., Orem, UT).

Η

από ATO προκαλεί αυτοφαγία στα κύτταρα PC3, χρησιμοποιήσαμε δυτική κηλίδες και το λογισμικό του ΟΗΕ-SCAN-IT για να προσδιοριστούν τα αποτελέσματα του miR-182 στην έκφραση LC3-II. Η επιμόλυνση με miR-182 αναστολέα (MIR-182-in) μείωσε τη βασική έκφραση LC3-II από -30% (n = 3, ένας εκπρόσωπος κηλίδα western φαίνεται στο Σχ. 6C).